Artykuł metodologiczny

Modyfikacja enzymatyczna i cytometria przepływowa oceny białek powierzchniowych drożdży

DOI:

10.3791/68208

⸱

30 maja 2025

 ,  , 
1Department of Chemical, Biological, and Materials Engineering, University of South Florida

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj wprowadzamy protokół do używania substratów z powierzchni drożdży do testów modyfikacji enzymatycznej. Platformę zademonstrowano, wykorzystując analizę aktywności defosforylacji fosfatazy tyrozynowej SHP-2 w stosunku do jednego z jej substratów jako reprezentatywny test modyfikacji enzymatycznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyświetlanie powierzchni drożdży to strategia łączenia genotypu z fenotypem, która umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe funkcji białek. Tradycyjnie, wyświetlanie powierzchni drożdży było stosowane do ewolucji nowych białek wiążących, przy czym cytometria przepływowa była wykorzystywana do oceny i sortowania według poziomów siły wiązania. W ostatnim czasie rośnie zainteresowanie zastosowaniem wyświetlacza powierzchni drożdży do przesiewowej modyfikacji enzymatycznej wariantów substratu, z modyfikacjami addytywnymi (np. fosforylacja) lub subtraktywnymi (np. proteoliza) zapewniającymi fenotyp czytelny za pomocą cytometrii przepływowej. Takie modyfikacje są regularnie stosowane przy użyciu kolokalizacji wewnątrzkomórkowej, ale zdolność do uzyskania zewnątrzkomórkowej modyfikacji enzymatycznej wyświetlanych substratów może otworzyć wiele innych reakcji do zbadania. W tym miejscu opisano techniki projektowania i stosowania testów przesiewowych do zewnątrzkomórkowej modyfikacji enzymatycznej substratów kandydujących wyświetlanych na powierzchni drożdży i późniejszej oceny za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Przedstawiamy te protokoły w kontekście fosfataz defosforylujących drożdży wyświetlanych substratów zawierających fosforylowane reszty tyrozyny i komentujemy, w jaki sposób ten zastosowany framework można dostosować do opracowania testów przesiewowych dla innych par enzym-substrat.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie interakcji między enzymami i ich celami staje się coraz bardziej interesującym obszarem badań ze względu na jego konieczność w biologicznej charakterystyce szlaków kontrolujących homeostazę komórkową i rozwój choroby1,2. Enzymy są odpowiedzialne za katalizę wielu reakcji, które utrzymują życie biologiczne, kontrolując niezbędne szlaki, takie jak metabolizm komórkowy3,4, signaling5, a nawet podstawowe procesy, takie jak naprawa genomu6,7. Ze względu na ich rolę w tych procesach, ich interakcje odgrywają również rolę w rozwoju wielu chorób, ponieważ odchylenia w ich aktywności mogą powodować poważne rozregulowanie aktywności komórek, powodując apoptozę lub proliferację szkodliwych komórek nowotworowych2. Badania nad aktywnością enzymatyczną miały ważne zastosowania w opracowywaniu nowych środków terapeutycznych8,9, wymagających testów dostosowanych do każdej konkretnej interakcji enzym-substrat10. Wiele testów enzymatycznych zostało ustalonych jako standardowe protokoły oceny i charakterystyki tych interakcji. Testy opracowane do analizy interakcji enzymatycznych są klasyfikowane jako testy detekcyjne, które monitorują wiązanie w celu aktywacji/hamowania11 lub testy, które monitorują modyfikację substratu przez enzymy12.

Jedną z głównych ról enzymów jest regulowanie zachowania komórek. Transdukcja sygnału, wewnątrzkomórkowa odpowiedź komórki na zewnątrzkomórkowy wyzwalacz13, jest odpowiedzialna za przetrwanie i funkcjonalność komórki. Proliferacja, różnicowanie i wiele innych procesów funkcjonalnych komórek obejmuje szlaki sygnałowe, którymi rządzą interakcje enzymatyczne14,15. Enzymy katalizują modyfikacje potranslacyjne, które często modulują masywne sieci sygnalizacyjne odpowiedzialne za prawidłowe przekazywanie wiadomości zewnątrzkomórkowych16. Fosforylacja białek jest najczęstszą modyfikacją potranslacyjną, wszechobecną w sygnalizacji komórkowej i wielu innych szlakach komórkowych. W związku z tym kinazy białkowe stały się znaczącą częścią potencjalnych celów terapeutycznych ze względu na ich krytyczną rolę regulacyjną17. Fosfatazy są naturalnymi cząsteczkami modulującymi dla komórkowych kompleksów sygnalizacji opartej na fosforanach18,19, posiadające zdolność usuwania reszt fosforanowych z białek docelowych20. W ciągu ostatniej dekady fosfatazy stały się głównym celem terapeutycznym w leczeniu nowotworów 21 i chorób zapalnych22 w oparciu o ich udział w regulacji dalszych szlaków sygnałowych w wielu typach komórek. Razem kinazy białkowe i fosfatazy zapewniają szeroki zakres interakcji, które można badać poprzez opracowanie specyficznych protokołów testów enzymatycznych.

Wyświetlanie powierzchni drożdży zostało użyte jako narzędzie do charakterystyki i oceny aktywności enzymatycznej23,24. Stanowi wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych procesów modyfikacji potranslacyjnej w połączeniu ze strategiami sekwestracji retikulum endoplazmatycznego25,26. Pozwala to na kolokalizację i zatrzymanie par kinaza-substrat w retikulum endoplazmatycznym poprzez wiązanie z receptorami KDEL27, gdzie fosforylacja substratu może zachodzić ze zwiększoną szybkością ze względu na bliskość między kinazami a ich celami. Wiązanie receptora KDEL odbywa się za pośrednictwem C-końcowej sekwencji retencji retikulum endoplazmatycznego FEHDEL, która wykazuje silniejszą zdolność zatrzymywania niż inne sekwencje HDEL25,28. Ufosforylowany substrat jest następnie zakotwiczony na powierzchni drożdży w celu jego późniejszej oceny za pomocą cytometrii przepływowej29. Obecnie nie ma uogólnionych protokołów ustalonych dla enzymatycznej modyfikacji substratów wyświetlanych na powierzchni drożdży. Rozszerzamy możliwości wyświetlania powierzchni drożdży, wykorzystując pozakomórkowo wyrażane warianty fosforylowanych substratów i modyfikując je poprzez defosforylację przez znaną fosfatazę. Analiza cytometrii przepływowej stanowi następnie platformę do oceny fenotypowej wyżej wymienionych substratów poprzez pomiar zmian mediany fosforylacji w wyniku inkubacji ze znaną fosfatazą. Zapewnia to adaptowalną metodę potranslacyjnej modyfikacji białek wyświetlanych powierzchniowo, a jednocześnie zapewnia metodę analizy modyfikacji enzymatycznych interakcji podczas korzystania z platformy wyświetlania powierzchni drożdży.

Prezentujemy techniki rozwoju i zastosowania testu modyfikacji enzymatycznej, który opisuje wprowadzenie interakcji kinaza-substrat do platformy wyświetlania powierzchni drożdży, koinkubację wyrażonego fosforylowanego substratu z rekombinowaną fosfatazą, a następnie analizę aktywności defosforylacji za pomocą cytometrii przepływowej. W tym raporcie osiąga się to poprzez kolokalizację domeny cytoplazmatycznej CD28 z kinazą limfocytów (LCK) w retikulum endoplazmatycznym drożdży, a następnie wyświetlanie fosforylowanego CD28 na powierzchni drożdży, a następnie defosforylację przez Src homologię regionu 2 zawierającą domenę fosfatazy-2 (SHP-2). Przeciwciało antyfosfotyrozynowe (w tym badaniu 4G10), które wykrywa fosforylowane reszty tyrozyny w szerokiej gamie sekwencji peptydowych, służy do ilościowego oznaczania poziomu fosforylacji w funkcji leczenia fosfatazą. Szczegółowy proces zapewnia uogólnione podejście do badania interakcji enzym-substrat; Prospektywny sposób badania enzymów i substratów w sposób oczyszczony.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost komórek drożdży zawierających plazmid i indukcja ekspresji białek

  1. Postępując zgodnie z recepturą opisaną w Tabeli 1, należy przygotować pożywkę wymaganą do wzrostu drożdży niezawierających plazmidu (YPD), wzrostu komórek drożdży zawierających plazmid (SD-CAA) i indukcji ekspresji białek (SRG-CAA), a także płytek SD-CAA.
  2. Przekształć plazmidowe DNA drożdży zawierające parę kinaza-substrat w komórki drożdży EBY-100 za pomocą metody opartej na kationach litu30,31, powszechnie przyjętej do stosowania w zestawach do transformacji drożdży różnych producentów.
    UWAGA: Electroporation32 lub inne preferowane techniki transformacji plazmidu drożdży mogą być stosowane w zależności od przekształcanego konstruktu plazmidu.
  3. Przygotować probówkę hodowlaną o pojemności 14 ml z 10 ml pożywki YPD. Zaszczepić komórki EBY-100 i hodować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C, 300 obr./min, aż kultura osiągnie gęstość optyczną (OD600nm) 0,8-1,0 (8 x 106-1 x 107 komórek/ml).
    UWAGA: OD600nm mierzy się, przygotowując 3 ml kuwet na próbki zawierające 1:10 rozcieńczenia kultur drożdży w odpowiednich pożywkach oraz 3 ml ślepe kuwety zawierające pożywkę używaną do rozcieńczania próbek. Program OD600nm na spektrofotometrze służy najpierw do pomiaru ślepej kuwety, a następnie każdej kuwety próbki, ustawiając odpowiednie rozcieńczenie przygotowane dla każdej próbki. 1 OD600nm odpowiada 1 × 107 drożdży / ml.
    4. Zbierz komórki, odwirowując kulturę przy 1 000 x g przez 3 minuty i przemyj pierwszym roztworem myjącym dostarczonym w zestawie do transformacji drożdży lub TE (10 mM Tris-HCl i 1,0 mM EDTA)31.
  5. Ponownie zagnieździć komórki w temperaturze 1 000 x g przez 3 minuty i ponownie zawiesić w 1 ml buforu transformacyjnego dostarczonego w zestawie do transformacji drożdży lub sterylnej wodzie. Komórki powinny być podzielone na podwielokrotności 50 μl i mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.
  6. Do transformacji plazmidu przygotowuje się jedną porcję na plazmid i rozmraża się ją na lodzie, a następnie bezpośrednio do komórek dodaje się 0,5-1,5 μg plazmidowego DNA zawierającego konstrukt wyświetlacza drożdży. Dodaje się 0,5 ml roztworu transformacyjnego znajdującego się w zestawie do transformacji drożdży lub 0,5 ml sterylnego 50% glikolu polietylenowego i 0,1 M roztworu LiOAc31. Połączyć mieszaninę komórek, plazmidowego DNA i roztworu transformacyjnego dokładnie przez pipetowanie.
  7. Mieszaninę transformacyjną inkubować statycznie przez 30-60 minut w temperaturze 30 °C, mieszaninę wirową w odstępach 15 minut. Zbieraj komórki przez odwirowanie z prędkością 1 000 × g przez 3 minuty.
  8. Przygotuj probówkę hodowlaną o pojemności 14 ml z 4,5 ml pożywki SD-CAA. Ponownie zawiesić komórki zawierające pożądany plazmid w 500 μl SD-CAA i zaszczepić przygotowane 4,5 ml.
  9. Uważając, aby nie przebić agaru, rozprowadzić 50 μl z 5 ml zaszczepionej kultury na płytce SD-CAA i inkubować statycznie w temperaturze 30 °C przez 48 godzin w celu określenia wydajności przemiany.
  10. Inkubować 5 ml kultury komórkowej SD-CAA w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C, 300 obr./min przez co najmniej 18 godzin. Monitorować gęstość optyczną (OD600 nm) po 16 godzinach i 20 godzinach. Gdy próbka osiągnie wystarczającą gęstość optyczną nieprzekraczającą 6, odwirować kulturę przez 3 minuty w temperaturze 2 500 × g. Wyrzucić supernatant bez naruszania osadu drożdży.
  11. Zawiesić osad drożdżowy w SRG-CAA do końcowego OD600 nm mniej niż 1 (<1 × 107 drożdży / ml).
  12. Inkubować kulturę drożdży w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C, 300 obr./min przez co najmniej 8 godzin, ale nie dłużej niż 24 godziny
    UWAGA: Indukcja ekspresji białek w komórkach drożdży może być różna w zakresie od 20 do 37 °C. 30 °C jest odpowiednia do syntezy par kinaza/substrat 29,33, ale może być dostosowana, jeśli uzna to za konieczne dla określonych badanych białek.
  13. Zmierz OD600nm, aby określić gęstość komórek.
    UWAGA: Protokół można zatrzymać w tym momencie, przechowując kultury drożdży w temperaturze 4 °C.

2. Biotynylacja przeciwciała antyfosfotyrozynowego 4G10

  1. Zawiesić fiolkę 2 mg PEG4-NHS-Biotyna do końcowego stężenia 5 mM poprzez dodanie 680 μl sterylnego PBS.
    UWAGA: Ponowne zawieszenie PEG4-NHS-Biotyny powinno być wykonane na świeżo bezpośrednio przed przeprowadzeniem reakcji biotynylacji. NHS hydrolizuje w roztworze wodnym. Stosowanie sterylnych PBS i fiolek jest ważne dla przygotowania odczynników do długotrwałego przechowywania oraz do stosowania w testach komórkowych w celu złagodzenia potencjalnego wpływu zanieczyszczeń na żywotność odczynników lub wykonywane czułe testy.
  2. W oparciu o stężenie przeciwciała 4G10 dodać 100 μg przeciwciała do sterylnej fiolki o pojemności 1,7 ml.
  3. Dodać 1 μl przygotowanych 5 mM PEG4-NHS-Biotyny z kroku 2.1 do fiolki zawierającej 100 μg przeciwciała 4G10, aby uzyskać stosunek molowy biotyny do przeciwciała wynoszący 7,5:1. Delikatnie odpipetować mieszaninę, aby ujednorodnić reakcję.
  4. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej ze stałą rotacją przez co najmniej 2 godziny.
  5. Postępuj zgodnie z protokołem producenta dla wirowych kolumn odsalających o pojemności 0,5 ml, aby wymienić bufor z biotynylowanego 4G10 (B-4G10) na PBS.
    UWAGA: Kolumny odsalające z odcięciem masy cząsteczkowej (MWCO) wynoszącym 7 kDa są powszechnie stosowane do biotynylacji przeciwciał, aby umożliwić usunięcie nieprzereagowanej biotyny i innych małych cząsteczek przy zachowaniu większego przeciwciała.
  6. Rozcieńczyć przeciwciało B-4G10 do końcowego stężenia 1 μM w PBSA (PBS z 1 g/l albuminy surowicy bydlęcej). Podwielokrotnić przeciwciało B-4G10 na mniejsze objętości, aby zapobiec powtarzającym się cyklom zamrażania/rozmrażania.
    UWAGA: Biotynylowane przeciwciała mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C do codziennego użytku przez okres do 3 miesięcy bez utraty znacznej wydajności. Pozostałe nieużywane porcje należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 2 lata.

3. Defosforylacja substratów wyrażonych na powierzchni komórek drożdży

  1. Przygotuj 2x działający roztwór buforowy, jak opisano wcześniej w literaturze34.
    UWAGA: Zalecane jest 2x, aby ułatwić odmierzanie potrzebnych składników.
  2. Przygotować bufor roboczy dla próbek w fiolce o pojemności 1,7 ml, rozcieńczając 2x roztwór buforowy przygotowany w kroku 3.1 1:2 w wodzie dejonizowanej.
    UWAGA: Całkowita objętość reakcji dla każdej próbki wyniesie 20 μl, a każda próbka będzie wymagała od 10 μl do 18 μl buforu roboczego. Przygotować wystarczającą ilość buforu roboczego dla wszystkich próbek lub prób kontrolnych.
  3. Postępując zgodnie z zalecanym przygotowaniem próbki opisanym w Tabeli 2, oznaczyć fiolki o pojemności 1,7 ml odpowiednią nazwą kontrolną lub nazwą próbki.
  4. Na podstawie OD600 nm mierzonego w kroku 1.9 oblicz objętość kultury niezbędną do odzyskania dwóch milionów (2 × 106) komórek drożdży z odpowiedniej kultury drożdży dla każdej próbki.
  5. Dodać objętość kultury drożdży obliczoną w poprzednim kroku do fiolki o pojemności 1,7 ml dla każdej próbki.
  6. Odwirować fiolkę przez 1 minutę przy stężeniu 4 500 × g. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety i wyrzucić jako odpad niebezpieczny biologicznie.
  7. Zawiesić granulowane komórki w 1 ml PBSA i powtórzyć krok 3.6.
    UWAGA: Ważne jest, aby usunąć jak najwięcej supernatantu bez naruszania granulowanych komórek.
  8. Na podstawie jego stężenia podstawowego obliczyć objętość rekombinowanego ludzkiego SHP-2 wymaganą do uzyskania końcowego stężenia 1 000 nM w całkowitej objętości reakcyjnej 20 μl.
    UWAGA: Rekombinowany SHP-2 powinien być podawany w małych objętościach, tak aby żadne białko użyte w każdym teście nie przeszło więcej niż dwóch cykli zamrażania i rozmrażania. Wszelkie resztki SHP-2 z podwielokrotności po przygotowaniu wszystkich próbek do oznaczenia należy wyrzucić.
    Stężenia rekombinowanych enzymów mogą się różnić w zależności od numeru partii. Rekombinowany SHP-2 jest zwykle formułowany w stężeniu podstawowym 0,2-0,4 mg/ml. Dla stężenia podstawowego 0,324 mg/ml SHP-2 odpowiada to stężeniu podstawowemu 4,696 μM (SHP-2 ma masę cząsteczkową 69 kDa). 4,26 μl materiału podstawowego SHP-2 w reakcji 20 μl daje końcowe stężenie reakcji 1 000 nM SHP-2.
  9. Dodaj 7,7 mg DTT do 10 ml dejonizowanej wody przygotowanej w stożkowym 15 ml, aby uzyskać 5 mM roztworu DTT. Jeśli ograniczenia sprzętowe utrudniają ważenie miligramów, dodaj 0,77 g DTT do 10 ml wody dejonizowanej, a następnie wykonaj 100-krotne rozcieńczenie, aby uzyskać 5 mM roztwór DTT używany do testu.
    UWAGA: Roztwór naziemnej telewizji cyfrowej można przygotować w roztworach podstawowych o wyższym stężeniu, które należy rozcieńczyć do 5 mM, jeśli nie jest możliwe zmierzenie ilości w skali miligramowej za pomocą dostępnego sprzętu. Roztwór naziemnej telewizji cyfrowej musi być przygotowany na świeżo przed ponownym zawieszeniem komórek w buforze roboczym ze względu na jego skłonność do hydrolizy, co czyni go niestabilnym przez długi czas po rozcieńczeniu w wodzie.
  10. Zawiesić granulowane komórki w buforze roboczym przygotowanym w kroku 3.2 tak, aby końcowa objętość reakcji w każdej próbce lub próbce kontrolnej wynosiła 20 μl,
    UWAGA: Ilość dodanego buforu roboczego należy obliczyć na podstawie ilości DTT (2 μL) i SHP-2 (obliczonej w kroku 3.8), które będą znajdować się w każdej próbce.
  11. Dodać 2 μl roztworu 5 mM DTT przygotowanego w kroku 3.9 do każdej próbki lub próby kontrolnej, aby uzyskać końcowe stężenie reakcji 0,5 mM DTT.
  12. Dodać objętość SHP-2 obliczoną w kroku 3.8 do każdej próbki, aby uzyskać końcową objętość 20 μl i delikatnie wymieszać za pomocą mikropipety.
  13. Owinąć pokrywki fiolek z próbką w parafilm, aby zapobiec wyciekom lub zanieczyszczeniu krzyżowemu.
  14. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny na wirniku ze stałą prędkością.
  15. Usunąć próbki z wirnika i zatrzymać reakcję, dodając 1 ml PBSA do każdej próbki.
  16. Powtórz krok 3.6.

4. Znakowanie komórek i analiza metodą cytometrii przepływowej defosforylowanych substratów

  1. Zawiesić próbki z etapu 3.16 w mieszaninie 20 μl odpowiadających im odczynników pierwotnych, jak opisano w tabeli 2. Próbki inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Wszystkie użyte stężenia odczynników zostały obliczone jako zawyżone w stosunku do liczby białek wyrażonych na powierzchni komórek drożdży. W obliczeniach założono ekspresję 10 000 białek/komórkę ze wszystkich drożdży 2 x 106 w próbce35, podczas gdy rutynowo tylko ~50% z nich to robi. Tabela 3 pokazuje stosunek nadmiaru odczynnika do znakowania dla każdego z odczynników wyrażony w Tabeli 2, obliczony w następujący sposób:
    figure-protocol-1
  2. Odwirować próbki o masie 4 500 × g przez 1 minutę i odrzucić supernatant jako odpady niebezpieczne biologicznie.
  3. Umyj komórki raz, ponownie zawieszając w 1 ml PBSA. Powtórz krok 4.2.
  4. Zawiesić próbki w mieszaninie 20 μl odpowiadających im odczynników wtórnych, jak opisano w tabeli 2. Próbki należy inkubować przez 15 minut przy braku światła.
  5. Powtórz krok 4.2.
  6. Powtórz krok 4.3.
  7. Ponownie zawiesić umyte próbki w 300-500 μl PBSA i przenieść do probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml w celu natychmiastowej analizy przy użyciu odpowiedniego cytometru przepływowego.
    UWAGA: Jeśli konieczne jest przetransportowanie próbek, należy je przechowywać na mokrym lodzie. Nie jest to zalecane, ale próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez 2 godziny w postaci mokrych granulek.
  8. Po wykonaniu niezbędnego uruchomienia i przygotowaniu cytometru do nowego eksperymentu, kliknij przycisk Nowy eksperyment w menu Plik, nazwij eksperyment i kliknij Zapisz, aby upewnić się, że uzyskane dane zostały zapisane w żądanej ścieżce do pliku.
  9. Wybierz ikonę wykresu kropkowego na górnym pasku narzędzi, aby utworzyć co najmniej dwa wykresy kropkowe dla każdej próbki, która ma zostać uruchomiona. Dla jednego z wykresów kropkowych wybierz nazwę osi X, aby wyświetlić kanał FSC-A, oraz nazwę osi Y, aby wyświetlić kanał SSC-A. Ten wykres przedstawia rozproszenie boczne - obszar i rozproszenie do przodu - obszar i służy do bramkowania komórek drożdży do dalszej analizy.
  10. Na innym wykresie kropkowym wybierz nazwę osi X, aby wyświetlić kanał, w którym fluoryzuje odczynnik wtórny skierowany do pierwszorzędowego przeciwciała ze znacznikiem antyepitopowym. Wybierz nazwę osi Y, aby wyświetlić kanał, w którym odczynnik wtórny streptawidyny fluoryzuje. Ten wykres pokaże tylko zdarzenia bramkowane z boku i wykresu punktowego do przodu jako komórki drożdży i służy do wyświetlania fosforylacji tyrozyny na osi Y i wyrażenia powierzchni substratu na osi X.
    UWAGA: W tym przykładzie odczynnik wtórny skierowany do pierwszorzędowego przeciwciała znacznika antyepitopowego fluoryzuje w kanale FITC (AF-488), a odczynnik wtórny streptawidyny fluoryzuje w kanale AF-647. Używane kanały mogą się różnić w zależności od odczynników pierwotnych i wtórnych używanych podczas etykietowania.
  11. Umieść każdą probówkę z próbką w uchwycie probówki cytometru i wybierz Uruchom, aby cytometr rozpoczął ładowanie próbki i pobieranie danych. W razie potrzeby dostosuj zdarzenia do wyświetlenia, zdarzenia do zarejestrowania, czas do zarejestrowania i natężenie przepływu próbki.
  12. Zdefiniuj bramkę otaczającą zdrowe komórki drożdży na wykresie SSC-A vs FSC-A utworzonym w kroku 4.9. Rysunek 1 ilustruje opisową reprezentację strategii bramkowania, którą należy zastosować.
    UWAGA: Na wykresie SSC-A w porównaniu z FSC-A 100 000 zdarzeń do wyświetlenia i 50 000 zdarzeń do zarejestrowania w zdefiniowanej bramce drożdży jest dobrą wskazówką do wizualizacji i zebrania wystarczających danych do dalszej analizy. Bardziej rygorystyczne strategie bramkowania przy wyborze drożdży singletowych można zastosować na podstawie wykresu wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia do przodu, jak ostatnio zgłoszono36. Strategia bramkowania pokazana w Rysunek 1 odpowiada mniej rygorystycznemu podejściu, w tym drożdżom singletowym i trochę dubletowym poprzez bramkowanie rozproszone.
  13. Zarejestrować fluorescencję wszystkich próbek kontrolnych za pomocą analizatora cytometrii przepływowej. Próbki kontrolne są rutynowo zbierane w pierwszej kolejności, aby pomóc w zdefiniowaniu strategii bramkowania, jak opisano poniżej w kroku 4.14.
  14. Zdefiniuj strategię bramkowania dla swojej powierzchni utworzoną w kroku 4.10 przed analizą próbek poddanych działaniu substancji. Rysunek 1 ilustruje opisową reprezentację strategii bramkowania, którą należy zastosować.
  15. Odnotować fluorescencję próbek odfosforylowanych za pomocą cytometru przepływowego i strategii bramkowania określonej w krokach 4.12 i 4.14.
  16. Analizuj dane cytometrii przepływowej uzyskane za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
  17. Oceń defosforylację, mierząc i porównując medianę osi Y komórek wyrażających białko na swojej powierzchni oraz podstawową fosforylację zapewnianą przez komórki niewyświetlające między próbkami a kontrolą. Oblicz procentową średnią różnicę fosforylacji w następujący sposób:
    figure-protocol-2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza cytometrii przepływowej z pojedynczej repliki naszego systemu modelowego inkubowanej przez 2 godziny bez (Rysunek 1A) i z (Rysunek 1B) 1,000 nM SHP-2 ujawnia medianę różnicy fosforylacji wynoszącą 63,6%, która jest zdefiniowana jako stosunek mediany (fosforylacji) osi Y od wszystkich zdarzeń wyświetlanych na powierzchni minus podstawowy sygnał fosforylacji zdefiniowany jako mediana osi Y niewyświetlanych zdarzeń między próbkę poddaną działaniu substancji i kontrolę niepodda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony protokół pozwala na analizę oddziaływań enzymatycznych z wykorzystaniem zewnątrzkomórkowego wyświetlania białek na powierzchni drożdży. Włączenie sekwestracji retikulum endoplazmatycznego do zastosowanego plazmidu z wyświetlaczem powierzchniowym wprowadza zdolność do analizy specyficznych interakcji między enzymami a substratami zmodyfikowanymi potranslacyjnie zewnątrzkomórkowo ze względu na interakcje wewnątrzkomórkowe, które można zaprojektować do występowania27,29

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów związanych z tą pracą.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta nagrodą NSF CAREER dla L.A.S. (CBET - 2339172) oraz funduszami startowymi z University of South Florida.

Na rysunku 2A, ikona mikrorurki otwartej-półprzezroczystej firmy Servier https://smart.servier.com/ jest licencjonowana na licencji CC-BY 3.0 Unported https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/. Modyfikacje obejmują dodanie buforu i komórki drożdży (po lewej) oraz dodanie przeciwciała (w środku po prawej).

Probówka, inkubator i cytometr przepływowy na rysunku 2A zostały dostarczone przez www.bioicons.com w ramach otwartego dostępu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Butelki na media o pojemności 1 l Corning06-414-1D
1,7/2,0 ml mikroprobówkiAxygenMCT-175-C
10 i mikro; L Końcówki do pipet SureOneFisher Scientific02-707-438
1000 µ L Końcówki do pipet SureOneFisher Scientific02-707-408
12 ml polistyrenowe probówki okrągłodenneGreiner07-000-212
Kuwety z tworzywa sztucznego 3 mlBRAND759076D
300 µ L Końcówki do pipet SureOneFisher Scientific02-707-411
Pipety serologiczne 5 mlFisher Scientific13-678-11D
Kazeina kwasowa (kazeiny kazaminowe)Fisher ScientificBP-1424-500
Waga analityczna 30243397METTLER TOLEDO
 SzafyFalcon 351008
LabconcoLogic Class II, typ A2  302310102
BiospektrometrEppendorfKinetic 6136000010
Albumina bydlęcaBioreaktory FisheraBP1600-100
Kwas cytrynowyFisher ScientificA940-500
CytoFLEX Cytometria przepływowa Analizator Beckam CoulterCytoflex C09745Oprogramowanie CytExpert
DekstrozaFisher ScientificD16-1
DitiothreitolFisher bioodczynnikiBP172-5
Osioł anty-kozy FITCInvitrogenA16000
EDTAAlfa AesarH56165.30
Ez-Link PEG4-NHS-BiotinThermo ScientificA39259
Zestaw do transformacji drożdży Frozen-EZ II Zymo ResearchT2001
GalactoseFisher ScientificBP656-500
Lodówka ogólnego przeznaczeniaMarvel ScientificMS24RAS4RW
Przeciwciało anty-myc tag Wirówka mikrorurkowa BethylA190-104A
 Eppendorf5425 R 5406000313
Mini niskotemperaturowy inkubator z chłodzeniemFisher Scientific15-015-2632
Mysie przeciwciało antyfosfotyrozynowe 4G10BioXcellBE0194
Parafilm MBemisM PM999
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Odczynniki FisherBP399-500
Kontroler pipet Eppendorfeasypet 3 4430000018
RafinozaThermo ScientificJ21060-36
Rekombinowane ludzkie aktywne białko SHP-2R& D Systems1894-SH
Wirówka z chłodzeniem Eppendorf5910 R
Saccharomyces cerevisiae drożdży szczep powierzchniowy EBY 100ATCCMYA-4941
Inkubator wytrząsarkiEppendorfM1335-0002 Nowy Brunszwik Innova 42 
Zestaw pipet jednokanałowych Eppendorf05-403-151
Chlorek soduFisher ScientificS671-500
Cytrynian sodu dwuwodnyFisher ScientificS279-500
Fosforan sodu dwuwodny siedmiowodnyFisher ScientificS373-500
Jednowodny fosforan soduFisher ScientificS468-500
Streptawidyna Alexa Fluor 647InvitrogenS32357
Waga ładowana od góryChlorowodorek Mettler Toledo
TrisEMD Millipore648317-100GM
Rotator rewolwerowy rurkowyFisher Scientific11-676-341
Papier do ważenia Fisher Scientific09-898-12B
Drożdżowa baza azotowaBD Difco291940
Kolumny odsalające Zeba Spin Thermo Scientific89883
Bakteriologiczna szalka Petriego bezpieczeństwa biologicznego Corning

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lea, M. A., Weber, G. Role of enzymes in homeostasis: VIII. Inhibition of the activity of glycolytic enzymes by free fatty acids. J Biol Chem. 243 (6), 1096-1102 (1968).
  2. Mahé, M., Rios-Fuller, T. J., Karolin, A., Schneider, R. J. Genetics of enzymatic dysfunctions in metabolic disorders and cancer. Front Oncol. 13, 1230934(2023).
  3. Fernandez-de-Cossio-Diaz, J., Vazquez, A. A physical model of cell metabolism. Sci Rep. 8 (1), 8349(2018).
  4. Metallo, C. M., Vander Heiden, M. G. Understanding metabolic regulation and its influence on cell physiology. Mol Cell. 49 (3), 388-398 (2013).
  5. Mildvan, A. S. Mechanisms of signaling and related enzymes. Proteins. 29 (4), 401-416 (1997).
  6. Frosina, G. Overexpression of enzymes that repair endogenous damage to DNA. Eur J Biochem. 267 (8), 2135-2149 (2000).
  7. Schärer, O. D. Chemistry and biology of DNA repair. Angew Chem Int Ed. 42 (26), 2946-2974 (2003).
  8. de la Fuente, M., et al. Enzyme therapy: Current challenges and future perspectives. Int J Mol Sci. 22 (17), 9181(2021).
  9. Robertson, J. G. Enzymes as a special class of therapeutic target: clinical drugs and modes of action. Curr Opin Struct Biol. 17 (6), 674-679 (2007).
  10. Goddard, J. -P., Reymond, J. -L. Enzyme assays for high-throughput screening. Curr Opin Biotechnol. 15 (4), 314-322 (2004).
  11. Helm, J. S., Hu, Y., Chen, L., Gross, B., Walker, S. Identification of active-site inhibitors of MurG using a generalizable, high-throughput glycosyltransferase screen. J Am Chem Soc. 125 (37), 11168-11169 (2003).
  12. Veldhuyzen, W. F., Nguyen, Q., McMaster, G., Lawrence, D. S. A light-activated probe of intracellular protein kinase activity. J Am Chem Soc. 125 (44), 13358-13359 (2003).
  13. Torres, M., Forman, H. J. Encyclopedia of Respiratory. Laurent, G. J., Shapiro, S. D. , Academic Press. 10-18 (2006).
  14. Blume-Jensen, P., Hunter, T. Oncogenic kinase signalling. Nature. 411 (6835), 355-365 (2001).
  15. Martin, G. S. Cell signaling and cancer. Cancer Cell. 4 (3), 167-174 (2003).
  16. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  17. Graves, J. D., Krebs, E. G. Protein phosphorylation and signal transduction. Pharmacol Ther. 82 (2), 111-121 (1999).
  18. Hafen, E. Kinases and phosphatases--A marriage is consummated. Science. 280 (5367), 1212-1213 (1998).
  19. Westphal, R. S., Anderson, K. A., Means, A. R., Wadzinski, B. E. A signaling complex of Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase IV and protein phosphatase 2A. Science. 280 (5367), 1258-1261 (1998).
  20. Barford, D., Das, A. K., Egloff, M. -P. The structure and mechanism of protein phosphatases: Insights into catalysis and regulation. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 27, 133-164 (1998).
  21. Liu, Q., Qu, J., Zhao, M., Xu, Q., Sun, Y. Targeting SHP2 as a promising strategy for cancer immunotherapy. Pharmacol Res. 152, 104595(2020).
  22. Pan, J., Zhou, L., Zhang, C., Xu, Q., Sun, Y. Targeting protein phosphatases for the treatment of inflammation-related diseases: From signaling to therapy. Signal Transduct Targeted Ther. 7 (1), 177(2022).
  23. Denard, C. A., et al. YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants. ACS Synth Biol. 10 (1), 63-71 (2021).
  24. Lim, S., Glasgow, J. E., Filsinger Interrante, M., Storm, E. M., Cochran, J. R. Dual display of proteins on the yeast cell surface simplifies quantification of binding interactions and enzymatic bioconjugation reactions. Biotechnol J. 12 (5), (2017).
  25. Yi, L., et al. Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (18), 7229-7234 (2013).
  26. Yi, L., et al. Yeast endoplasmic reticulum sequestration screening for the engineering of proteases from libraries expressed in yeast. Methods Mol Biol. 1319, 81-93 (2015).
  27. Semenza, J. C., Hardwick, K. G., Dean, N., Pelham, H. R. ERD2, a yeast gene required for the receptor-mediated retrieval of luminal ER proteins from the secretory pathway. Cell. 61 (7), 1349-1357 (1990).
  28. Mei, M., et al. Characterization of aromatic residue-controlled protein retention in the endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 292 (50), 20707-20719 (2017).
  29. Ezagui, J., Russell, B., Mairena, Y., Stern, L. A. Endoplasmic reticulum sequestration empowers phosphorylation profiling on the yeast surface. AIChE J. 68 (12), e17931(2022).
  30. Kawai, S., Murata, K. Genetic Transformation Systems in Fungi. van den Berg, M. A., Maruthachalam, K. 1, Springer International Publishing. 187-192 (2015).
  31. Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
  32. Loock, M., et al. High-efficiency transformation and expression of genomic libraries in yeast. Methods Protoc. 6 (5), 89(2023).
  33. Huang, D., Gore, P. R., Shusta, E. V. Increasing yeast secretion of heterologous proteins by regulating expression rates and post-secretory loss. Biotechnol Bioeng. 101 (6), 1264-1275 (2008).
  34. Yu, B., et al. Targeting protein tyrosine phosphatase SHP2 for the treatment of PTPN11-associated malignancies. Mol Cancer Ther. 12 (9), 1738-1748 (2013).
  35. Stern, L. A., et al. Geometry and expression enhance enrichment of functional yeast-displayed ligands via cell panning. Biotechnol Bioeng. 113 (11), 2328-2341 (2016).
  36. Pan, X., et al. Optimized single-cell gates for yeast display screening. Protein Eng Design Sel. 38, gzae018(2025).
  37. Margittai, É, et al. Production of H2O2 in the endoplasmic reticulum promotes in vivo disulfide bond formation. Antioxid Redox Signal. 16 (10), 1088-1099 (2012).
  38. Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev. 57 (2), 383-401 (1993).
  39. Ezagui, J., Stern, L. A. Tyrosine phosphorylation screening on the yeast surface by magnetic bead selection and FACS. Methods Mol Biol. 2681, 275-290 (2023).
  40. Yarnall, M. T. N., Kim, S. H., Korntner, S., Bishop, A. C. Destabilization of the SHP2 and SHP1 protein tyrosine phosphatase domains by a non-conserved “backdoor” cysteine. Biochem Biophys Rep. 32, 101370(2022).
  41. Dustin, C. M., Heppner, D. E., Lin, M. J., van der Vliet, A. Redox regulation of tyrosine kinase signalling: more than meets the eye. J Biochem. 167 (2), 151-163 (2020).
  42. Stern, L. A., Csizmar, C. M., Woldring, D. R., Wagner, C. R., Hackel, B. J. Titratable avidity reduction enhances affinity discrimination in mammalian cellular selections of yeast-displayed ligands. ACS Comb Sci. 19 (5), 315-323 (2017).
  43. Waldman, A. C., Rao, B. M., Keung, A. J. Mapping the residue specificities of epigenome enzymes by yeast surface display. Cell Chem Biol. 28 (12), 1772-1779.e4 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Yeast Surface DisplayFlow CytometryEnzymatic ModificationProtein DephosphorylationSubstrate ScreeningPhosphorylation AnalysisSHP 2 PhosphataseExtracellular Enzyme AssayHigh Throughput ScreeningGating Strategy

Powiązane artykuły