Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens w Solanum nigrum

Podsumowanie

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół metody transformacji genetycznej, w której pośredniczy Agrobacterium tumefaciens w celu wytworzenia transgenicznego Solanum nigrum.

Streszczenie

Solanum nigrumto sierocy krewny psiankowatych ziemniaków i pomidorów, a jego świeże owoce to pożywna i pyszna jagoda. Cała roślina S. nigrum może być stosowana jako lekarstwo. Jednak dziki S. nigrum ma pewne niepożądane cechy. Na szczęście techniki inżynierii genetycznej, zwłaszcza technologie edycji genów, takie jak CRISPR/Cas9, oferują cenne możliwości szybkiej poprawy S. nigrum poprzez zajęcie się tymi niedoborami. W większości roślin ulepszanie roślin za pomocą technologii edycji genów osiąga się poprzez transformację genetyczną za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens. W tym artykule szczegółowo opisaliśmy protokoły transformacji genetycznej, w których pośredniczy A. tumefaciens w S. nigrum. Liścienie i hipokotyle siewek S. nigrum zostały użyte jako eksplantaty do transformacji genetycznej. Ponieważ S. nigrum jest oporny na kanamycynę, gen DsRed został wykorzystany jako marker wizualny do identyfikacji roślin transgenicznych. Transformacja genetyczna S. nigrum może być skutecznie zakończona zgodnie z tymi protokołami operacyjnymi. Wykrycie roślin transgenicznych T1 można bezpośrednio zidentyfikować na podstawie tego, czy emitują one czerwoną fluorescencję, bez konieczności identyfikacji PCR.

Wprowadzenie

Solanum nigrum (znany jako psiankowata, 2n = 6x = 72) jest psiankowatym krewnym ziemniaka i pomidora¹. Owocem jest kulista jagoda, która po dojrzewaniu staje się. Świeży owoc to pożywna i pyszna jagoda. Cała roślina S. nigrum może być stosowana jako lekarstwo, z efektami rozpraszania zastoju krwi, zmniejszania obrzęków, usuwania ciepła i detoksykacji. S. nigrum syntetyzuje dwie odrębne klasy wyspecjalizowanych metabolitów z powszechnego prekursora cholesterolu: saponiny steroidowe w liściach i glikoalkaloidy steroidowe (SGA) w jagodach. Uttroside B, saponina steroidowa pochodząca z S. nigrum, została niedawno zatwierdzona przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków jako lek sierocy do leczenia raka wątrobowokomórkowego². Nokaut genu GAME15 u S. nigrum spowodował, że roślinom brakowało zarówno saponin, jak i alkaloidów steroidowych, a także ujawnił, że saponiny steroidowe kontrolują poważne szkodniki owadzie w rolnictwie². Polifenole zawarte w S. nigrum redukują masę ciała i tkankę tłuszczową poprzez wpływ na adipocyty i metabolizm lipidów³. S. nigrum może wzbogacać kadm i jest używany jako modelowa roślina do badania wzbogacania kadmu^4,5. S. nigrum jest rośliną nieudomowioną, a jej podstawy badawcze są stosunkowo słabe. Inspirujące jest to, że w ostatnich latach stopniowo nasila się liczba badań nad S. nigrum. Genom heksaploidalnego S. nigrum został niedawno zebrany, a S. nigrum mógł wyewoluować z jego diploidalnego Solanum americanum (2n = 2x = 24)^6,7. Dlatego S. nigrum jest rośliną, która ma zarówno wartość leczniczą, jak i jadalną. Badania nad S. nigrum nie tylko przyczyniają się do głębszego zrozumienia jego potencjalnych zastosowań w leczeniu chorób u ludzi, ale także dostarczają cennych informacji na temat poprawy produkcji rolnej. Tak więc ustanowienie systemu transformacji genetycznej u S. nigrum jest podstawą do doskonalenia genetycznego poprzez technologię transgeniczną i edycję genów.

Istnieje kilka raportów, które koncentrują się na genetycznej transformacji S. nigrum za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens^8,9,10,1¹. W naszej poprzedniej pracy ustaliliśmy system transformacji genetycznej S. nigrum za pośrednictwem A. tumefaciens LBA4404 i przekształciliśmy AcMYB110 w S. nigrum, uzyskując nowe plazmy zarodkowe S. nigrum o zwiększonej zawartości antocyjanów¹. Transgeniczne i edytowane genetycznie rośliny S. nigrum uzyskano za pomocą transformacji genetycznej za pośrednictwem A. tumefaciens EHA105 ¹⁰. Różne białka fluorescencyjne emitują zieloną, czerwoną, żółtą, pomarańczową i niebieską fluorescencję i są szeroko stosowane do wskazywania aktywności życia komórkowego¹². W procesie transformacji genetycznej roślin, geny czerwonej fluorescencji są często używane jako geny reporterowe do odróżniania zdarzeń zmodyfikowanych genetycznie od zdarzeń niezmodyfikowanych genetycznie¹³. Wykorzystanie genu DsRed jako genu reporterowego pozwala na wygodną dyskryminację zdarzeń transgenicznych, podczas gdy użycie czynnika transkrypcyjnego R2R3-MYB jako genu reporterowego może mieć wpływ genotyp roślin¹⁴. W przypadku potomstwa transgenicznego rośliny transgeniczne można również łatwo odróżnić od roślin nietransgenicznych za pomocą instrumentów optycznych (np. mikroskopów fluorescencyjnych lub systemów obrazowania), eliminując potrzebę identyfikacji opartej na PCR. Poprzez integrację genu reporterowego białka fluorescencyjnego z technologią edycji genów CRISPR, geny płodności w kukurydzy zostały precyzyjnie usunięte, co zaowocowało stworzeniem sterylnej linii jądrowej i kontrolowanej linii do konserwacji sterylnej jądrowej ¹⁵. Samozapylenie i owocowanie roślin utrzymujących się wytworzy potomstwo 1:1 z linii utrzymujących i sterylnych. Opierając się na różnych charakterystykach luminescencyjnych, nieniszczące sortowanie nasion z linii konserwatorskiej i sterylnej można osiągnąć poprzez rozpoznawanie wizualne lub maszynowe¹⁵. W związku z tym zastosowanie genu białka fluorescencyjnego jako genu reporterowego upraszcza identyfikację transgenicznych nasion lub roślin bez konieczności przeprowadzania analizy PCR. Stanowi to istotną zaletę w dziedzinie transformacji genetycznej. Metoda ta ma na celu opisanie protokołu transformacji genetycznej za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens u S. nigrum, przy użyciu genu czerwonej fluorescencji, DsRed, jako genu reporterowego.

Protokół

1. Aseptyczne uprawa sadzonek

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane na super czystym stole.

1. Zbierz dzikie nasiona S. nigrum w mieście Liaocheng w Chinach i nazwij je Snlc1. Weź 50 dzikich nasion S. nigrum i umieść je w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Po namoczeniu w 1 ml 5% gibereliny przez 30 minut wyrzuć roztwór gibereliny.
2. Dodaj 1 ml 75% etanolu, wstrząsaj przez 1 minutę, a następnie wyrzuć etanol.
3. Dodać 1 ml 2% roztworu podchlorynu sodu i dezynfekować powierzchnię nasion przez 10 minut. Dokładnie wstrząsnąć probówką wirówkową, aby wysterylizować powierzchnię nasion. Po 10 minutach wyrzuć podchloryn sodu.
4. Umyj nasiona 5x wysterylizowaną wodą, aby usunąć resztki podchlorynu sodu. Umieść nasiona na szalkach Petriego o średnicy 90 mm zawierających 1/2 MS stałego podłoża. Hoduj płytki w komorze wzrostu roślin w fotoperiodzie 16 godzin światła/8 godzin ciemności w temperaturze 25 °C (Rysunek 1A).

2. Kultura A. tumefaciens LBA4404

1. Przekształć wektor binarny pRed1305¹⁶ z genem czerwonej fluorescencji, DsRed2, w A. tumefaciens LBA4404 przez elektroporację za pomocą MicroPulsera o parametrach: Napięcie 1800 V, Pojemność 25 μF, Rezystancja 200 Ω, Kuweta 1 mm. Hoduj bakterie na stałym podłożu LB z 50 mg/l kanamycyną i 50 mg/l ryfampicyną w temperaturze 28 °C przez 48 godzin.
2. Pobrać jeden klon LBA4404 zawierający pRed1305 i hodować go w 1 ml płynnej pożywki LB z 50 mg/l kanamycyny i 50 mg/l ryfampicyny w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w koncentratorze stołowym o prędkości 180 obr./min w temperaturze 28 °C przez 12 godzin.
3. Dodać 50 ml płynnego LB z tym samym antybiotykiem do 1 ml roztworu bakteryjnego, a następnie hodować w koncentratorze stołowym z prędkością 200 obr./min w temperaturze 28 °C przez 6 godzin.
4. Przerwać hodowlę, gdy OD₆₀₀ pożywki bakteryjnej wynosi 0,4, a następnie odwirować roztwór bakteryjny o stężeniu 2200 x g przez 10 minut w temperaturze 25 °C.
5. Zawiesić odwirowane bakterie roztworem infekcyjnym (IS: M519 4,43 g/L, sacharoza 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, AS, 100 μmol/L, pH 5,8) i dostosować stężenie roztworu bakteryjnego do OD₆₀₀= 0,6 za pomocą spektrofotometru.

3. Zakażenie eksplantatem A. tumefaciens

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane na super czystym stole.

1. Hoduj nasiona przez 7 dni, aż rozwiną się liścienie (Rysunek 1B). Odciąć dwa liścienie i hipokotyl o długości około 1 cm od sadzonek za pomocą wysterylizowanego, ostrego skalpela w naczyniu hodowlanym z bibułą filtracyjną zwilżoną bakteryjnym IS i wyrzucić pierwotne korzenie. Zachowaj ostrożność podczas używania skalpela.
2. Umieść eksplantaty w roztworze infekcyjnym przez 30 minut. Umieść eksplantaty na suchej bibule filtracyjnej, aby umożliwić wchłonięcie roztworu bakteryjnego na powierzchni eksplantatu.
3. Umieść eksplantaty w stałym podłożu IS (0,7% agaru; Rysunek 1C). Umieść eksplantaty w komorze wzrostu roślin bez światła w temperaturze 19 °C i hoduj je przez 3 dni.

4. Zróżnicowanie eksplantatów

UWAGA: Następujące kroki są wykonywane na super czystym stole.

1. Zebrać eksplantaty z komory wzrostu roślin w temperaturze 19 °C. Umyj eksplantaty wysterylizowaną wodą 5x i umieść eksplantaty na suchej, wysterylizowanej bibule filtracyjnej.
2. Umieść eksplantaty w pożywce do różnicowania pędów (SD) (SD: M519 4,43 g/L, sacharoza 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0,5 mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0,7 g/L Agar, pH 5,8) i hoduj w temperaturze 25 °C przez 4 tygodnie (Rysunek 1D,E).
3. Odetnij kalusy/pąki eksplantatów wykazujące czerwoną fluorescencję pod zielonym światłem wzbudzenia ręcznej lampy fluorescencyjnej za pomocą skalpela, a następnie przenieś je na nową pożywkę SD i kontynuuj hodowlę przez 4 tygodnie w temperaturze 25 °C (Rysunek 1F, G).

5. Ukorzenianie i przeszczepianie

1. Odetnij pąki wykazujące czerwoną fluorescencję za pomocą ręcznej lampy fluorescencyjnej, przenieś je do podłoża ukorzeniającego (RM: M519 4,43 g/L, sacharoza 30 g/L, 6-BA 2 mg/L, ZT 0,5 mg/L, Cef 100 mg/L, Carb 100 mg/L, 0,7 g/L Agar, pH 5,8) i hoduj je przez 2-4 tygodnie w temperaturze 25 °C, aby pobudzić produkcję korzeni.
2. Przeszczep do gleby siewki wykazujące czerwoną fluorescencję o długości korzeni większej niż 2 cm ( Rysunek 1H-K). Przed przeszczepem należy ręcznie usunąć agar z korzeni, aby uniknąć nadmiernego rozwoju bakterii w korzeniach.

6. Testowanie genetycznie modyfikowanych roślin T0 z amplifikacją PCR

1. Ekstrakcja genomowego DNA niezależnej linii transgenicznej przy użyciu metody bromku cetylu trimetyloamoniowego (CTAB)¹⁷.
2. Amplifikuj gen DsRed za pomocą zestawu starterów, RedF (5'-TGGCCTCCTCCGAGAAC-3') i RedR (5'-CGGAGGGGAAGTTCACG-3') przy użyciu 10 ng genomowego DNA jako matrycy w 15 μL objętości reakcyjnej zawierającej 7,5 μl 2x PCR Master Mix i 0,3 μL każdego startera (10 μmol/L). Oczekiwany fragment DNA wynosił 393 pz. Poddaj produkty PCR 1% elektroforezie w żelu agarozowym, aby ustalić, czy są to rośliny transgeniczne.

7. Identyfikacja roślin transgenicznych w pokoleniu T1 za pomocą lampy fluorescencyjnej

1. Zbierz owoce transgenicznych roślin T0 S. nigrum, które całkowicie zmieniły kolor na czarno-fioletowy, a następnie ręcznie wyciśnij nasiona z wnętrza owocu. Naturalnie suszyć nasiona na powietrzu w temperaturze pokojowej przez około 1 tydzień.
2. Wyhodować suszone nasiona w pożywce 1/2 MS zgodnie z krokami od 1.1 do 1.4 niniejszego protokołu i umieścić w komorze wzrostu roślin na 1 tydzień. Rozróżnij sadzonki transgeniczne i sadzonki nietransgeniczne za pomocą ręcznej lampy fluorescencyjnej.

Wyniki

Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens w celu wytworzenia transgenicznego S. nigrum.
Po zainfekowaniu liści zakotwiczycielnych i podkotyledonów siewek S. nigrum przy użyciu A. tumefaciens, mogliśmy określić, czy infekcja Agrobacterium przebiegła pomyślnie, ponieważ jako gen reporterowy wykorzystano DsRed. Czerwona fluor...

Dyskusja

Do tej pory metody transformacji genetycznej S. nigrum, w której pośredniczy A. tumefaciens, zostały ustalone w różnych laboratoriach 8,9,10,11. Większość z tych metod przemian wykorzystuje kanamycynę jako substancję selekcyjną 8,9,10,11. Jednak

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2X SanTaq PCR Master Mix (z niebieskim barwnikiem)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B532061	2X SanTaq PCR Mix zawiera MgCl?, dNTPs, polimerazę DNA Taq, bufor PCR, barwnik ładujący i wzmacniacz PCR.
6-BA	Sangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.	C14819266	Sztuczne cytokininy
Agar	Tianjin Damao Odczynnik chemiczny Przedsiębiorstwo partnerskie (spółka komandytowa)	Nr CAS: 9002-18-0	Ciała stałe
AS	Sangon Biotech (Szanghaj) Co., Ltd.	K914BA0002	Indukuj efektywną ekspresję Agrobacterium
Carb	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Antybiotyk Cef	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	I526BA0010	Antybiotyk
giberelina	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	K514BA0009	Wspomaga kiełkowanie nasion
kanamycyna	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	I614BA0013
Antybiotyk LB medium	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113	Hoduj bakterie
MicroPulser ( Gene Pulser Xcell)	Bio-Rad, US	617BR1 06783	Gene Pulser Xcell
MS solid medium	phytotech Co., Ltd., US	HCA0519228A	Murashige & Skoog Basal Medium z witaminami, plastikowe pudełko M519
	LiaoSu, Chiny	T909H	Pudełko do sadzenia roślin
ryfampicyna	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	S180305
Antybiotyk sacharoza	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	Nr CAS: 57-50-1	Jako źródło węgla
Tanon-5200Multi machine	Tanon Co., Ltd., Chiny	5200Multi	Przyspieszona separacja
dzikiego Solanum nigrum			zebranego w mieście Liaocheng
ZT	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	J921BA0014	Regulatory wzrostu roślin