Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozległa transdukcja mysich neuronów kory nowej przez wstrzyknięcie subbaraczynoidu AAV2

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68235

⸱

23 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Higher Nervous Activity and Neurophysiology, Russian Academy of Sciences, 2Faculty of Biology and Biotechnology, National Research University High School of Economics

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano nową technikę powszechnego dostarczania wirusa związanego z adenowirusem, która wykorzystuje infuzję wirusa podpajęczynówkowego. Metoda ta nie tylko zapewnia szeroką transdukcję mysich neuronów kory nowej w warstwach powierzchownych, ale także powoduje selektywną ekspresję transgenu w neuronach piramidowych warstwy piątej, nawet przy użyciu nieselektywnego promotora.

Streszczenie

Rekombinowane wirusy związane z adenowirusami są elastycznym i potężnym narzędziem do dostarczania i ekspresji różnych genów będących przedmiotem zainteresowania w wielu obszarach biologii eksperymentalnej, szczególnie w neurobiologii. Najpopularniejszą metodą sterowania ekspresją pożądanego transgenu w określonym obszarze mózgu jest wstrzyknięcie wektora AAV bezpośrednio do miąższu mózgu. Jednak ta metoda nie pozwala na rozległą transdukcję neuronalną, która jest wymagana w niektórych eksperymentach in vivo . W tym artykule przedstawiamy nową technikę rozległej ekspresji genów w korze nowej myszy opartą na infuzji wirusa do przestrzeni podpajęczynówkowej mózgu. Ta metoda znakowania neuronów nie tylko zapewnia szeroką transdukcję neuronów w powierzchownych warstwach kory nowej dorosłej myszy, ale także powoduje ekspresję transgenu w dużej populacji neuronów piramidowych warstwy piątej o wysokiej specyficzności, nawet przy użyciu silnego nieselektywnego promotora, takiego jak CAG. Co więcej, ponieważ transdukcja komórkowa odbywa się w znacznej odległości od miejsca wstrzyknięcia, metoda ta może pomóc w zachowaniu tkanki mózgowej do późniejszych optycznych lub elektrofizjologicznych zapisów aktywności neuronalnej.

Wprowadzenie

Mózg ssaków składa się z wielu komórek hamujących, pobudzających i modulujących połączonych w obwody bilionami synaps1. Jednym z głównych wyzwań neuronauki jest rozszyfrowanie roli różnych typów komórek w organizacji i funkcjonowaniu obwodów mózgowych i zachowań. Manipulowanie genetycznie zdefiniowanymi komórkami w mózgu wymaga metod wprowadzania i ekspresji transgenów. Wirusowe systemy dostarczania genów są zdecydowanie najskuteczniejszą i najprostszą metodą dostarczania genów do ośrodkowego układu nerwowego2. Systemy dostarczania wirusów opierają się na replikujących się wirusach (adenowirusy, wirusy związane z adenowirusami (AAV), lentiwirusy i retrowirusy), które mają zdolność dostarczania informacji genetycznej do komórki gospodarza 2,3.

Wektory oparte na AAV stały się obecnie jednym z najczęściej stosowanych narzędzi do dostarczania pożądanych transgenów do komórek w mózgu, zarówno do celów podstawowych badań neurologicznych, jak i do opracowywania terapii genowej w chorobach neurologicznych. W porównaniu z innymi wirusami, AAV z wadliwą replikacją posiadają wiele cech, które czynią je idealnymi wektorami do tych celów. Przede wszystkim wektory AAV skutecznie transdukują niedzielące się (terminalnie zróżnicowane) komórki, takie jak neurony i komórki glejowe, co skutkuje wysokim poziomem ekspresji transgenu in vivo2. Wektory można łatwo wytworzyć przy wysokim mianie funkcjonalnym odpowiednim do stosowania in vivo 3,4,5. Co ważne, dostarczanie genów in vivo za pośrednictwem wirusa związanego z adenowirusem nie powoduje zmian histopatologicznych i toksyczności związanej z wektorem6. W przeciwieństwie do wektorów adenowirusowych, podawanie in vivo wektorów AAV w modelach zwierzęcych zwykle nie wywołuje odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciwko transdukowanym komórkom, umożliwiając stabilną ekspresję transgenu w miąższu mózguprzez dłuższy czas 2,7,8.

Innym powodem popularności wektorów AAV jest szeroki wachlarz serotypów AAV z unikalnymi tropizmami tkankowymi i komórkowymi 9,10,11,12,13,14. Odrębne białka kapsydu ulegające ekspresji przez różne serotypy AAV powodują wykorzystanie różnych receptorów powierzchniowych komórki do wejścia do komórki, a tym samym specyficznych tropizmów10,14.

Tropizm AAV jest determinowany nie tylko przez białka kapsydu, ale także przez wiele innych czynników14. Wykazano, że serotypy AAV 1, 2, 6, 7, 8 i 9 transdukowały zarówno neurony, jak i astrocyty w hodowli pierwotnej 15,16, ale wykazywały silny tropizm neuronalny po wstrzyknięciu do mózgu w mięśnie śródmiąższowe17,18. Metoda stosowana do przygotowania wektora AAV może również wpływać na tropizm komórek nerwowych, nawet dla tego samego serotypu. Na przykład, oczyszczony przez CsCl AAV8 posiadał silny tropizm astroglejowy po wstrzyknięciu do mózgu śródmiąższowego, podczas gdy oczyszczony jodiksanolem AAV8, wstrzyknięty w identycznych warunkach, transdukował tylko neurony19. Tropizm AAV może być również zakłócony przez wstrzykniętą dawkę i objętość14. Na przykład, wysokie miano rAAV2 / 1 skutecznie transdukowało zarówno korowe neurony pobudzające, jak i hamujące, ale zastosowanie niższych mian ujawniło silną preferencję dla transdukcji korowych neuronów hamujących20.

W związku z tym nie jest możliwe osiągnięcie solidnej swoistości komórkowej opartej wyłącznie na serotypie kapsydu. Promotory specyficzne dla typu komórki mogą być stosowane w celu przezwyciężenia szerokiego naturalnego tropizmu kapsydu AAV. Na przykład ludzka synapsyna I jest używana do celowania w neurony21, promotor CaMKII może napędzać ekspresję transgenu w neuronach pobudzających glutaminergiczną o wysokiej swoistości20, promotor ppHcrt jest ukierunkowany na neurony eksprymujące hipokretynę (HCRT) w bocznym podwzgórzu22, promotor PRSx8 jest ukierunkowany na neurony noradrenergiczne i adrenergiczne, które wyrażają beta-hydroksylazę dopaminy23, a promotor GFAP może napędzać ekspresję specyficzną dla astrocytów24. Jednak niektóre promotory specyficzne dla komórek mają słabą aktywność transkrypcyjną i nie mogą napędzać wystarczających poziomów ekspresji transgenu25. Co więcej, krótkie promotory, które pasują do wektorów wirusa AAV, często nie zachowują swoistości typu komórkowego 1,26. Na przykład wykazano, że konstrukt CaMKII również transdukował neurony hamujące12.

Oprócz specyficzności typu komórki (tropizm), kolejną istotną cechą AAV jest wydajność transdukcji. Różne serotypy AAV mają różne właściwości dyfuzyjne. AAV2 i cztery wektory wirusowe wolniej dyfundują przez miąższ mózgu, a zatem pośredniczą w transdukcji na mniejszym obszarze17,27. Najbardziej rozpowszechnioną transdukcję neuronalną obserwuje się w przypadku serotypów AAV 1, 9 i rh.10 11,17,18,19,28.

Najpopularniejszą metodą sterowania ekspresją pożądanego transgenu w określonym obszarze mózgu jest wstrzyknięcie wektora AAV bezpośrednio do obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania (miąższu)3. Po wstrzyknięciu domiąższowym nawet serotypy AAV z bardziej efektywną dyfuzją przez mózg transdukują zazwyczaj tylko lokalny obszar wokół miejsca wstrzyknięcia 12. Co więcej, iniekcja śródmiąższowa jest zabiegiem inwazyjnym i prowadzi do uszkodzenia tkanek sąsiadujących z obszarem zainteresowania. W związku z tym ta metoda wstrzykiwania wirusa nie nadaje się do niektórych zadań eksperymentalnych. Na przykład rozległe znakowanie komórek jest wysoce pożądane w eksperymentach mających na celu badanie funkcji neuronów korowych u swobodnie poruszających się zwierząt, w tym z wykorzystaniem mikroskopii jedno- lub dwufotonowej 29,30,31,32.

W tym miejscu opisujemy nową technikę wstrzykiwania wirusa związanego z adenowirusem, która wykorzystuje infuzję wirusa podpajęczynówkowego w celu zapewnienia szerokiej transdukcji neuronów kory nowej u dorosłych myszy i zachowania tkanki mózgowej do późniejszych optycznych lub elektrofizjologicznych zapisów aktywności neuronalnej. Metoda ta nie tylko zapewniła powszechną transdukcję neuronów w powierzchownych warstwach kory nowej, ale także doprowadziła do ekspresji transgenu w dużej populacji neuronów piramidowych warstwy piątej o wysokiej swoistości, nawet przy użyciu silnego nieselektywnego promotora, takiego jak CAG.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty przeprowadzono na dorosłych myszach C57BL/6 w wieku 2-4 miesięcy obu płci (Centrum Hodowlane Pushchino, Oddział Instytutu Chemii Bioorganicznej RAS im. Szemiakina-Owczinnikowa). Myszy trzymano w wiwarium o kontrolowanej temperaturze (22 °C ± 2 °C, 12 godzin cyklu światło/ciemność, światła włączane o 08:00 godzin) z jedzeniem i wodą ad libitum. Wszystkie procedury doświadczalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE i dyrektywą 2010/63/UE dotyczącą doświadczeń na zwierzętach. Protokół badania został zatwierdzony przez Komisję Etyczną IHNA RAS (protokół N1 z 01.02.2022 r.). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zapewnić wiarygodność wyników.

1. Przygotowanie do zabiegu

  1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne (kawałki papieru i folię z tworzywa sztucznego) przed rozpoczęciem operacji (w autoklawie lub wzmacniaczu UV). Oczyść obszar operacyjny przy użyciu 70% etanolu.
  2. Sprawdź poziom izofluranu w układzie anestezjologicznym i uzupełnij go w razie potrzeby. Umieść czysty ręcznik papierowy na dnie komory indukcyjnej.
  3. Umieść poduszkę grzewczą na ramie stereotaktycznej. Przykryj podkładkę czystym ręcznikiem papierowym.
  4. Przygotuj butelkę z 2% wybielaczem, aby zebrać końcówki do mikropipet, probówki, waciki i inne przedmioty, które mają kontakt z wirusem.
  5. Wyjąć porcję AAV z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieścić ją na lodzie do rozmrożenia.

2. Przygotowanie strzykawki

  1. Wyczyść mikrostrzykawkę Hamiltona o pojemności 5 μl igłą RN o pojemności 33 g. Zassać, a następnie dozować 70% etanolu. Powtórz 3x ze świeżym etanolem. Przepłukać strzykawkę wodą destylowaną w celu usunięcia nadmiaru etanolu. Powtórz 3 razy.
  2. Wyjąć tłok i napełnić beczkę olejem wazelinowym przez kołnierz za pomocą strzykawki insulinowej. Upewnij się, że w mikrostrzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Uwięzione powietrze jest ściśliwe i wpływa na dokładność i precyzję strzykawki.
  3. Umieścić tłok z powrotem w mikrostrzykawce i dozować kroplę oleju. Umieścić strzykawkę w wstrzykiwaczu stereotaktycznym w taki sposób, aby skala była widoczna w celu monitorowania objętości dozowanego roztworu.

3. Przygotowanie myszy do operacji

  1. Zważ mysz. Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia podłączonej do izofluranu. Włącz parownik izofluranu ustawiony na 5% i ustaw natężenie przepływu na 250 ml/min. Odpowiednią głębokość znieczulenia uzyskuje się w ciągu 5 do 7 minut.
  2. Aby zweryfikować chirurgiczny poziom znieczulenia, sprawdź, czy nie ma trzepania i odruchu wycofania podczas bolesnego szczypania tylnej łapy oraz braku mrugania w kontakcie wzrokowym.
  3. Przełącz zawór odpływowy parownika z komory indukcyjnej na maskę stereotaktyczną. Zmniejsz ilość izofluranu do 1,8%-2,0% i ustaw szybkość przepływu w zależności od wagi myszy (70-90 ml/min dla myszy o wadze od 25 do 35 g).
  4. Wyjmij mysz z komory indukcyjnej i umieść ją w aparacie stereotaktycznym na poduszce grzewczej (37 °C), aby zapobiec hipotermii podczas znieczulenia chirurgicznego. Umieść przednie zęby w listwie zębatej, a następnie zamontuj maskę zwierzęcą.
  5. Ostrożnie umieść zwierzę na nausznikach. Prawidłowe ułożenie głowy w aparacie stereotaktycznym umożliwia pionowy, ale nie boczny ruch głowy. Upewnij się, że pozycja zwierzęcia nie powoduje niepokoju. Uważnie monitoruj głębokość znieczulenia, oddech zwierzęcia i temperaturę ciała przez cały czas trwania operacji.
  6. Ogol głowę od oczu do tyłu uszu. Oczyść i usuń całą ogoloną sierść przed kontynuowaniem operacji. Zdezynfekuj ogoloną powierzchnię głowy, przetrzyjując ją 5% alkoholowym roztworem jodu, a następnie 70% etanolem w okrągły wzór. Powtórz 3x.
  7. Nałóż żel okulistyczny, aby zapobiec wysuszeniu oczu. Sterylny 4% roztwór lidokainy nakładać miejscowo na skórę wzdłuż przewidywanej linii nacięcia, a deksametazon (0,02 ml przy 4 mg/ml) podskórnie w okolicy grzbietowej łopatki, aby zapobiec bólowi związanemu z zabiegiem chirurgicznym i zmniejszyć możliwą reakcję zapalną.
  8. Za pomocą sterylnego ostrza skalpela i nożyczek wykonaj nacięcie o długości 4-5 mm wzdłuż linii środkowej głowy, aby otworzyć skórę głowy. Zacznij od małego nacięcia między uszami, a następnie rozszerz je nożyczkami, aby uniknąć uszkodzenia czaszki.
  9. Przetrzyj powierzchnię czaszki niewielką ilością 3% nadtlenku wodoru, aby uwidocznić stereotaktyczne punkty orientacyjne: bregma i lambda. Natychmiast zatrzymaj reakcję za pomocą 0,9% soli fizjologicznej NaCl. Zeskrob tkanki z czaszki za pomocą skrobaka do kości.
  10. Zamontuj wstępnie przygotowany wtryskiwacz z napędem silnikowym ze strzykawką Hamiltona na ramieniu stereotaktycznym. Skieruj chirurgiczne źródło światła na odsłoniętą czaszkę i skup mikroskop na bregmie.
  11. Patrząc przez mikroskop, manipuluj ramieniem aparatu stereotaktycznego, aby wyśrodkować górną część igły bezpośrednio nad bregmą.
  12. Za pomocą końcówki igły wyrównaj bregmę i lambdę w poziomie, a następnie przesuń ramię z powrotem do bregmy i zapisz współrzędne. Użyj tych współrzędnych bregma i współrzędnych atlasu regionu zainteresowania, aby obliczyć względne współrzędne obszaru docelowego.
  13. Przesunąć igłę do docelowego obszaru. Opuść wskazówkę na nowe współrzędne i zaznacz tę pozycję. Należy wybrać miejsce mikroiniekcji wirusa w bliskiej odległości od obszaru docelowego, biorąc pod uwagę rozprzestrzenianie się wirusa.
    UWAGA: Pozwoli to uniknąć uszkodzenia tkanki w obszarze zainteresowania. Użyliśmy następujących współrzędnych dla obszaru zainteresowania: AP-3.4, ML -2.0, oraz dla mikroiniekcji wirusa: AP-2.0, ML -1.4. Powyższe współrzędne są optymalne, jeśli ma dojść do zakażenia pierwotnych neuronów kory wzrokowej.
  14. Jeśli to możliwe, unikaj regionów z dużymi naczyniami krwionośnymi. Pod mikroskopem chirurgicznym, jasnym, zimnym światłem i zanurzeniem w 0,9% roztworze soli fizjologicznej NaCl powinny stać się widoczne duże naczynia krwionośne w czaszce i na powierzchni mózgu.

4. Wstrzyknięcie wirusa

  1. Weź sterylne wiertło dentystyczne (o średnicy 0,5 - 0,8 mm). Oglądając powierzchnię czaszki przez mikroskop operacyjny, wywierć małą kraniotomię ręcznie (ręcznie) lub za pomocą mikrowiertła. Uważaj, aby nie wywierać nadmiernego nacisku na czaszkę.
  2. Odsunąć ramię na bok, aby zapobiec uszkodzeniu igły mikrostrzykawki podczas wiercenia kraniotomii (otworu). Zastosuj 0,9% zanurzenie w soli fizjologicznej NaCl i rób przerwy z przerwami, aby uniknąć podgrzania kości i uszkodzenia opony twardej. Użyj sprężonego powietrza, aby zdmuchnąć pył kostny.
    UWAGA: Aby uzyskać powietrze pod ciśnieniem, należy użyć sprężarki powietrza z wbudowanym filtrem powietrza (10 μm). Do dodatkowego oczyszczania powietrza należy użyć sterylnego filtra strzykawkowego (0,20 μm). Odpowiednie są następujące rodzaje wierteł dentystycznych z węglików spiekanych: w kształcie gruszki (najlepiej), zaokrąglony cylinder i okrągły.
    1. Podczas rozrzedzania kości za pomocą wiertła upewnij się, że przerzedzenie jest równomierne na całym obwodzie. Ułatwi to usunięcie kości bez uszkadzania opony twardej. Aby to zrobić, najpierw użyj wiertła z okrągłą końcówką, a następnie wiertła z płaską końcówką. Trzymaj wiertło prostopadle do kości; W przeciwnym razie jedna strona będzie cieńsza od drugiej.
      UWAGA: Dodatkowo, im mniejszy rozmiar wiertła i im mniejsza wykonana kraniotomia, tym bardziej złożona będzie manipulacja. Zaleca się wykonanie kraniotomii o mniejszej średnicy (0,5-0,6 mm) w przypadku dalszego wykorzystywania zwierzęcia do pracy in vivo . Jeśli planuje się wykorzystanie mózgu zwierzęcia do pracy ex vivo , dopuszczalna jest większa średnica kraniotomii, aby uprościć procedurę.
  3. Gdy przerzedzona kość jest miękka i przezroczysta, przerwij wiercenie. Kiedy w kości utworzy się wystarczająco duże wgłębienie, często zatrzymuj rotację i monitoruj grubość kości. Pojawienie się pęknięć w kości wskazuje, że wystarczy przerzedzenie.
  4. Wykąp otwór sterylną solą fizjologiczną, a następnie usuń nadmiar soli fizjologicznej bawełnianym wacikiem. Usuń pozostałą warstwę kości za pomocą igły 27G z końcówką w kształcie haczyka i/lub pęsety z cienką końcówką. Unikaj uszkodzenia opony twardej.
  5. Przykryj powierzchnię czaszki sterylnym kawałkiem ręcznika papierowego zwilżonego sterylnym solą fizjologiczną. Umieść kawałek sterylnej, przezroczystej folii na powierzchni czaszki myszy nad papierem.
  6. Przesuń ramię stereotaktyczne do tyłu i umieść igłę mikrostrzykawki bezpośrednio nad folią. Nadmiar oleju dozować do uzyskania objętości 2 μl.
    UWAGA: Ostateczna objętość oleju może się różnić w zależności od objętości mikrostrzykawki. Użyliśmy mikrostrzykawki Hamilton o pojemności 5 μl 75-RN.
  7. Odpipetować objętość wirusa równą objętości wstrzykniętej + 2 μl na kawałek przezroczystej folii.
  8. Patrząc przez mikroskop chirurgiczny, opuść ramię w dół, aż końcówka igły znajdzie się w środku kropli wirusa. Załaduj wirusa do mikrostrzykawki za pomocą zmotoryzowanego wtryskiwacza. Wyrzuć końcówkę mikropipety i przezroczystą folię do butelki z 2% wybielaczem.
  9. Usuń papier zwilżony solą fizjologiczną z powierzchni czaszki i osusz czaszkę bawełnianym wacikiem. Użyj ramienia stereotaktycznego, aby umieścić igłę nad miejscem wkłucia.
  10. Dozuj kroplę wirusa, aby upewnić się, że igła nie jest zatkana. Wykonaj małe nacięcie w oponie twardej za pomocą igły 30 G z końcówką w kształcie haczyka.
    UWAGA: Ważne jest, aby wykonać jak najmniejszą szczelinę w oponie twardej, umożliwiając wejście igły bez pozostawiania szczeliny między igłą a oponą twardą, z której wirus mógłby wyciekać.
  11. Opuść igłę strzykawki do opony twardej i wykonaj odpowiednie obliczenia głębokości. Oszacuj głębokość korową wkłucia w stosunku do punktu, w którym igła po raz pierwszy dotknęła powierzchni kory.
  12. Powoli wprowadzić końcówkę igły do kory na głębokość 300 μm. Odczekaj 2-3 minuty, aby opona twarda przylgnęła do igły, a następnie powoli cofnij igłę na głębokość 200 μm. Odczekaj kolejne 2-3 minuty, aby tkanka mózgowa mogła się uspokoić. Powoduje to, że igła ciągnie oponę twardą do góry, tworząc przestrzeń podtwardówkową, w której wirus może się rozprzestrzeniać.
    UWAGA: Aby zminimalizować uszkodzenia kory mózgowej, użyj igły 33 G lub dolnej igły G. Należy pamiętać, że im mniejsza jest wewnętrzna średnica końcówki, tym większa szansa na jej zatkanie przez przepływ wsteczny tkanki. Ważne jest, aby używać igły zamiast fazowanej, ponieważ igła wydala bardziej kontrolowaną kroplę roztworu wirusowego.
    1. Jeśli igła nie przechodzi przez oponę twardą po obniżeniu do 150-200 μm, a zamiast tego zgina ją, przestań obniżać. Podnieś igłę i wykonaj nieco większe nacięcie w oponie twardej, a następnie spróbuj ponownie opuścić igłę.
    2. Jeśli płyn mózgowo-rdzeniowy zacznie aktywnie wyciekać z nacięcia podczas opuszczania igły, poczekaj, aż przestanie przeciekać; W przeciwnym razie trudno jest kontrolować igłę przechodzącą przez oponę twardą. Osusz nadmiar płynu mózgowo-rdzeniowego końcówką tkanki. Gdy płyn przestanie płynąć, podnieś igłę i spróbuj ponownie.
  13. Rozpocząć wstrzykiwanie zawiesiny wirusa z szybkością 0,06 μl/min, monitorując dozowaną objętość. Wstrzyknąć 1 μl wirusa. Wstrzyknąć wirusa na jedną głębokość, aby nie zerwać plomby między igłą a tkanką kory.
    1. Rozwiązywanie problemów: Na początku wstrzyknięcia może wystąpić cofanie się wirusa na powierzchnię mózgu. Przerwij wstrzykiwanie, odczekaj 2-3 minuty, a następnie kontynuuj wstrzykiwanie wirusa. Powtarzaj te czynności (kroki), aż przepływ wsteczny wirusa ustanie. Wirus i płyny mózgowo-rdzeniowe przyklejają się do igły i zapobiegają cofaniu się.
    2. Innym sposobem na zatrzymanie cofania się wirusa jest umieszczenie niewielkiej ilości agarozy na powierzchni kory mózgowej. Stłumi pulsację kory mózgowej, a także pomoże uszczelnić igłę. Ale upewnij się, że pipeta nie jest zatkana przez agarozę.
    3. Ponieważ igła może nie przejść całkowicie przez oponę twardą po opuszczeniu, ale tylko częściowo, jedna strona igły może nie przylegać ściśle do opony twardej, co może spowodować cofanie się wirusa. W takim przypadku należy powoli wyjąć igłę z tkanki i spróbować ponownie ją opuścić.
  14. Po zakończeniu infuzji należy trzymać igłę w miejscu docelowym przez dodatkowe 10 minut. Pozwala to wirusowi na rozproszenie się z dala od miejsca wstrzyknięcia. Powoli wycofuj igłę z mózgu, aby zapobiec wydostaniu się wirusa z powrotem z przewodu igły.
  15. Po zakończeniu wyjmowania igły należy sprawdzić, czy nie jest ona zatkana, dozując niewielką kroplę wirusa. Zamknij nacięcie skóry za pomocą szwów wchłanialnych lub niewchłanialnych 5-0.

5. Opieka pooperacyjna

  1. Po zamknięciu nacięcia należy miejscowo nałożyć maść przeciwbakteryjną. Wstrzyknąć podskórnie mieszaninę soli fizjologicznej (5 ml/kg) i 5% glukozy (5 ml/kg), aby zapobiec odwodnieniu i ułatwić powrót do zdrowia po znieczuleniu. Wstrzyknąć ketoprofen domięśniowo (2,5 mg/kg) w celu zmniejszenia bólu.
  2. Umieść zwierzę w nowej klatce na poduszce grzewczej i monitoruj, aż dojdzie do siebie po znieczuleniu. Po tym, jak mysz zacznie reaktywować, umieść zwierzę w jego domowej klatce.

6. Histologia

  1. Nie wcześniej niż 21 dni po wstrzyknięciu wirusa należy głęboko znieczulić myszy izofluranem, jak opisano w kroku 3. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone, sprawdzając brak trzepania i odruchu wycofywania podczas bolesnego szczypania tylnej łapy i ogona.
  2. Wykonaj nacięcie w linii środkowej (10 -15 mm) wzdłuż klatki piersiowej za pomocą wąskich nożyczek i odsłoń jamę klatki piersiowej. Ostrożnie oddziel membranę i otwórz klatkę piersiową za pomocą nożyczek.
  3. Włóż igłę 22G 1 1/2 do lewej komory i wykonaj nożyczkami nacięcie w prawym przedsionku. Uformuj perfaktorem z 50 ml wstępnie schłodzonego 100 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie 100 ml wstępnie schłodzonej 10% buforowanej formaliny.
  4. Ostrożnie wyodrębnij cały mózg myszy. Aby to zrobić, wykonaj strzałkowe nacięcie wzdłuż środka skóry głowy za pomocą nożyczek. Następnie usuwaj kość czaszki kawałek po kawałku za pomocą szczypiec do kości z płaskimi końcówkami, zaczynając od przecięcia szwów strzałkowych i lambdoidalnych i kierując się do przodu do kości nosowej. Kiedy mózg jest odsłonięty, przetnij opuszki węchowe, uwolnij mózg zakrzywioną szpatułką i wrzuć go do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10% buforowanej formaliny.
  5. Napraw mózg przez noc. Zamontuj tkankę mózgową na metalowej platformie wibratomu za pomocą kleju tkankowego. Ciąć sekcje czołowe o grubości 50 μm za pomocą ostrzy ze stali węglowej.

7. Barwienie immunologiczne

  1. Dzień 1
    1. Umyj plastry mózgu 3x przez 5 minut każdy 1x PBS zawierającym 0,3% Triton X-100 (PBS-T). Inkubować skrawki w PBS-T przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Zablokuj niespecyficzne wiązanie przez 1 godzinę w RT za pomocą buforu blokującego składającego się z 5% normalnej surowicy koziej (NGS) i 0,3% Triton X-100 w 1x PBS.
    3. Skrawki inkubować przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko parwalbuminie lub kalbindynie rozcieńczonymi w stosunku 1:500 w buforze blokującym (5% NGS i 0,3% Triton X-100 w 1x PBS).
  2. Dzień 2
    1. Umyj sekcje 3x przez 10 min w PBS-T. Inkubować w ciemności przez 2 godziny w RT z przeciwciałami drugorzędowymi (kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) z adsorbacją krzyżową, Alexa Fluor 546) rozcieńczonym w stosunku 1:500 w buforze blokującym (5% NGS i 0,3% Triton X-100 w 1x PBS).
    2. Umyj sekcje 3x po 5 minut w 1x PBS. Przenieś wycinki mózgu na szkiełka za pomocą miękkiej szczoteczki.
    3. Natychmiast dodaj 0,1 ml środka montażowego zapobiegającego blaknięciu do każdej sekcji. Przykryj plastry szkiełkiem nakrywkowym o wymiarach 22 mm x 50 mm.
    4. Skonfiguruj mikroskop konfokalny na powiększenie 20x lub 60x (A/1,4, olej). Użyj laserów o długości fali 488 nm i 594 nm, aby uzyskać wielokanałowe obrazy obszarów mózgu będących przedmiotem zainteresowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W pilotacyjnej serii eksperymentów zastosowaliśmy tradycyjną metodę iniekcji wewnątrzkorowej w celu transdukcji neuronów piramidalnych warstwy piątej w neocortex myszy za pomocą AAV2 niosącego gen szybkiej channelrhodopsyny (oChIEF) połączony z białkiem fluorescencyjnym EGFP pod promotorem CaMKII. Zgodnie z charakterystyczną cechą AAV212, uzyskaliśmy stosunkowo niewielki obszar infekcji, nieprzekraczający 1 mm szerokości (Ryc. 1A). Jednak w niektórych ekspery...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowaliśmy nową metodę transdukcji mysich neuronów kory nowej poprzez wstrzyknięcie zawiesiny cząstek wirusa AAV2 do przestrzeni podpajęczynówkowej mózgu. Zapewnia to rozległą dystrybucję wirusa, prawie czterokrotnie większą niż objętość zakażonej tkanki, gdy ta sama ilość wirusa jest wstrzykiwana bezpośrednio do miąższu mózgu.

Wstrzykiwanie wektorów wirusowych bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) różnymi drogami (np. domózgowo-komorowymi, dooponowymi lub doczaszkowymi) jest popu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Prace zostały zrealizowane przy wsparciu finansowym Rosyjskiej Fundacji Naukowej, grant 20-15-00398P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sprzęt
10 &mikro; L Strzykawka gazoszczelna Model 1701 RN (5 uL 75 RN Mikrostrzykawka Hamiltona)Firma HamiltonCzęść/REF # 7634-01, Hamilton lub nr kat. HAM7634-01, Merck
Igła 33 G RN, szpic 3Firma HamiltonCzęść/REF # 7803-05, Hamilton
Mikroskop dwuokularowyNikon lub MicromedModel MC-4 ZOOM
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny oparty na CernaThorLabs powiedział:
Zimne źródło światłaRWDnr wzoru 76312
Leica VT1000 S - Mikrotom z wibrującymi ostrzamiLeica Biosystems76001-014
System anestezjologiczny o niskim przepływie z zestawem startowymKorporacja Naukowa Kent13-005-111 (Model SomnoSuite)
Pipeta mechaniczna 0,1 – 2,5 &mikro; L Eppendorf Research plusEppendorf powiedział:3123000012
Pipeta mechaniczna 10 – 100 &mikro; L Eppendorf Research plusEppendorf powiedział:3123000047
Golarka do myszyRWDmodelu CP-5200
Mikrowiertło z wiertłami (0,5 mm, okrągłe)RWD78001, 78040
lub Desctop Digital Stereotaxic Instrument, Maska anestezjologiczna myszy, Uszniki myszy (60 stopni)RWDModele 68027, 68665, 68306
Sprężarka powietrzaBambiBB8
Pipeta ręczna jednokanałowa 0,5-10 i mikro; LRAINN (DESZCZ)17008649
Instrument stereotaktyczny dla małych zwierzątKOPFwzoru 962
Wtryskiwacz stereotaktycznyStoelting (Stoelting)10-000-004
Narzędzia chirurgiczne
Igła dentystyczna 30 G (Ni-pro)Biodent Sp. z o.o.Aby rozciąć oponę twardą
Skrobak do kościNarzędzia naukowe10075-16
Szczypce do kościNarzędzia naukowe16025-14Aby usunąć kość czaszki
Zakrzywione szpatułkiFabryka Artykułów Medycznych w MożajskuAby usunąć mózg ze sklepienia czaszki
Wiertło dentystyczneDRENDEL + ZWEILINGDo kraniotomii; Kształt: w kształcie gruszki / okrągły cylinder końcowy / okrągły; Średnica końcówki: średnica 0,55-0,8 mm
Uchwyt na igłę (Halsey Micro Needle Holder)Narzędzia naukowe12500-12
Polipropylenowy szew chirurgiczny lub szew chirurgiczny Vicryl (5-0, wchłanialny)Produkty Walter (Ethicon)S139044 (W9442)
Rękojeść skalpela (#3) z ostrzami skalpela (#11)Narzędzia naukowe10003-12, 10011-00
Nożyczki (bardzo wąskie nożyczki)Narzędzia naukowe14088-10do przecięcia skóry
Nożyczki (cienkie nożyczki)Narzędzia naukowe14094-11do przecięcia szwu
Szew chirurgiczny PROLENE (Poliproplen)Ethicon (Johnson & Johnsona)
Pęseta (kleszcze #5)Narzędzia naukowe11252-20
Pęseta (polerowane kleszcze Inox)Narzędzia naukowe11210-20
Jednorazówki
1 ml strzykawki insulinowejSITEKMEDAby załadować olej wazelinowy do mikrostrzykawki, aby podać leki
Płytka do hodowli komórkowejSPL Nauki przyrodnicze
Waciki bawełniane
Okulary nakrywkoweFisher Naukowy12-545E
Igła do strzykawki insulinowej (27 G)SITEKMEDAby usunąć zanieczyszczenia z (kraniotomia)
Niestrzępiące się chusteczki CLEANWIPERŁącze NetLink
Szkiełka mikroskopoweFisher Naukowy12-550-15
Ręczniki papieroweLuscan (Język Ludowy)
ParafilmLaboratorium StatLabSTLPM996
Sterylne rękawice chirurgiczneDermagrip (Chwyt skórny)
Sterylny filtr strzykawkowy (0,2 μ m)Corning431229
Leki/Chemikalia (odczynniki)
10% buforowana formalina lub 4% paraformaldehydChemikalia Thermo ScientificJ61899. AK
Alkoholowy roztwór jodu (5%))Odnowienie
Maść z antybiotykiem Baneocin (bacytracyna + neomycyna)SandozŚrodek przeciwbakteryjny do użytku zewnętrznego
Aqua PolymountNauki politechniczne18606-20
Carbomer Eye Gel Vidisic (żel okulistyczny)BAUSCH+LOMB (Santen)
Mikrosfery FluoSphere modyfikowane karboksylanem (czerwone)Thermo Fisher NaukowyF-8801
Deksametazon (4 mg/ml)Ellara (KRKA)Syntetyczny glikokortykosteroid
Destylowany H2O
Etanol (70%)
Flexoprofen 2,5% (Ketoprofen)VICNiesteroidowe leki przeciwzapalne (NLPZ)
Roztwór glukozy 5%Preparat Solopharm
Kozia anty-królicza IgG (H+L) adsorbowana krzyżowo, Alexa Fluor 546Thermo Fisher NaukowyA-11010
IzofluranKarizoo powiedział:
roztwór lidokainy (2 % / 4%)Preparat Solopharm
Normalna surowica kozia (NGS)Księga Abcamab7481 powiedział:
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Eko-serwis
Przeciwciało przeciwko parwalbuminie królikaMerck MilliporeAB15736
Rekombinowane monoklonalne przeciwciało przeciw kalbindynie królikaKsięga Abcamab108404 powiedział:
Sól fizjologiczna (0,9% NaCl w H2O)Preparat Solopharm
Tryton X-100Sigma-Aldrich50-178-1844
Olej wazelinowyGenel

Bibliografia

  1. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).
  2. Sena-Esteves, M., Gao, G. Introducing Genes into Mammalian Cells: Viral Vectors. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (8), (2020).
  3. Kootstra, N. A., Verma, I. M. Gene Therapy with Viral Vectors. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 43 (1), 413-439 (2003).
  4. Paterna, J. C., Feldon, J., Büeler, H. Transduction profiles of recombinant adeno-associated virus vectors derived from serotypes 2 and 5 in the nigrostriatal system of rats. J Virol. 78 (13), 6808-6817 (2004).
  5. Monahan, P. E., Samulski, R. J. Adeno-associated virus vectors for gene therapy: more pros than cons. Mol Med Today. 6 (11), 433-440 (2000).
  6. Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21 (4), 583-593 (2008).
  7. Jooss, K., Chirmule, N. Immunity to adenovirus and adeno-associated viral vectors: implications for gene therapy. Gene Ther. 10 (11), 955-963 (2003).
  8. Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L. 3rd, Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
  9. Gao, G., Vandenberghe, L., Wilson, J. New Recombinant Serotypes of AAV Vectors. Curr Gene Ther. 5 (3), 285-297 (2005).
  10. Büning, H., Perabo, L., Coutelle, O., Quadt-Humme, S., Hallek, M. Recent developments in adeno-associated virus vector technology. J Gene Med. 10 (7), 717-733 (2008).
  11. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain. PloS One. 8 (9), e76310-e76310 (2013).
  12. Watakabe, A., et al. Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex. Neurosci Res. 93, 144-157 (2015).
  13. de Solis, C. A., et al. Adeno-associated viral serotypes differentially transduce inhibitory neurons within the rat amygdala. Brain Res. 1672, 148-162 (2017).
  14. Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV Tropism in the Nervous System with Natural and Engineered Capsids. Meth Mol Biol. 1382, 133-149 (2016).
  15. Howard, D. B., Powers, K., Wang, Y., Harvey, B. K. Tropism and toxicity of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 6, 7, 8, and 9 in rat neurons and glia in vitro. Virology. 372 (1), 24-34 (2008).
  16. Royo, N. C., et al. Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity. Brain Res. 1190, 15-22 (2008).
  17. Burger, C., et al. Recombinant AAV Viral Vectors Pseudotyped with Viral Capsids from Serotypes 1, 2, and 5 Display Differential Efficiency and Cell Tropism after Delivery to Different Regions of the Central Nervous System. Mol Ther. 10 (2), 302-317 (2004).
  18. Cearley, C. N., Wolfe, J. H. Transduction characteristics of adeno-associated virus vectors expressing cap serotypes 7, 8, 9, and Rh10 in the mouse brain. Mol Ther. 13 (3), 528-537 (2006).
  19. Klein, R. L., Dayton, R. D., Tatom, J. B., Henderson, K. M., Henning, P. P. AAV8, 9, Rh10, Rh43 vector gene transfer in the rat brain: effects of serotype, promoter and purification method. Mol Ther. 16 (1), 89-96 (2008).
  20. Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors. Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).
  21. Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  22. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  23. Abbott, S. B. G., et al. Photostimulation of retrotrapezoid nucleus phox2b-expressing neurons in vivo produces long-lasting activation of breathing in rats. J Neurosci. 29 (18), 5806-5819 (2009).
  24. Lawlor, P. A., Bland, R. J., Mouravlev, A., Young, D., During, M. J. Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates. Mol Ther. 17 (10), 1692-1702 (2009).
  25. Adamantidis, A. R., Zhang, F., de Lecea, L., Deisseroth, K. Optogenetics: Opsins and Optical Interfaces in Neuroscience. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (8), (2014).
  26. Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat Protoc. 5 (3), 439-456 (2010).
  27. Passini, M. A., Watson, D. J., Wolfe, J. H. Gene Delivery to the Mouse Brain with Adeno-Associated Virus. Methods Mol Biol. 246, 225-236 (2004).
  28. Davidson, B. L., et al. Recombinant adeno-associated virus type 2, 4, and 5 vectors: Transduction of variant cell types and regions in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci. 97 (7), 3428-3432 (2000).
  29. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  30. Harris, K. D., Shepherd, G. M. G. The neocortical circuit: themes and variations. Nat Neurosci. 18 (2), 170-181 (2015).
  31. Carrillo-Reid, L., Yang, W., Kang Miller, J., Peterka, D. S., Yuste, R. Imaging and Optically Manipulating Neuronal Ensembles. Ann Rev Biophy. 46 (1), 271-293 (2017).
  32. Smirnov, I. V., et al. Plasticity of Response Properties of Mouse Visual Cortex Neurons Induced by Optogenetic Tetanization In Vivo. Curr Issues Mol Biol. 46 (4), 3294-3312 (2024).
  33. Snyder, B. R., et al. Comparison of Adeno-Associated Viral Vector Serotypes for Spinal Cord and Motor Neuron Gene Delivery. Human Gene Ther. 22 (9), 1129-1135 (2011).
  34. Schuster, D. J., et al. Biodistribution of adeno-associated virus serotype 9 (AAV9) vector after intrathecal and intravenous delivery in mouse. Front Neuroanat. 8, 42(2014).
  35. Bedbrook, C. N., Deverman, B. E., Gradinaru, V. Viral Strategies for Targeting the Central and Peripheral Nervous Systems. Ann Rev Neurosci. 41 (1), 323-348 (2018).
  36. Lo, W. D., et al. Adeno-Associated Virus-Mediated Gene Transfer to the Brain: Duration and Modulation of Expression. Human Gene Ther. 10 (2), 201-213 (1999).
  37. Gray, S. J., Nagabhushan Kalburgi, S., McCown, T. J., Ju de Samulski, R. Global CNS gene delivery and evasion of anti-AAV-neutralizing antibodies by intrathecal AAV administration in non-human primates. Gene Ther. 20 (4), 450-459 (2013).
  38. Del Bigio, M. R. Ependymal cells: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 55-73 (2009).
  39. Daci, R., Flotte, T. R. Delivery of Adeno-Associated Virus Vectors to the Central Nervous System for Correction of Single Gene Disorders. Int J Mol Sci. 25 (2), 1050(2024).
  40. Dasgupta, K., Jeong, J. Developmental biology of the meninges. Genesis. 57 (5), e23288-e23288 (2019).
  41. Mestre, H., Mori, Y., Nedergaard, M. The Brain's Glymphatic System: Current Controversies. Trends Neurosci. 43 (7), 458-466 (2020).
  42. Donsante, A., et al. Intracerebroventricular delivery of self-complementary adeno-associated virus serotype 9 to the adult rat brain. Gene Ther. 23 (5), 401-407 (2016).
  43. Hordeaux, J., et al. Long-term neurologic and cardiac correction by intrathecal gene therapy in Pompe disease. Acta Neuropathol Comm. 5 (1), 66(2017).
  44. Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
  45. Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood-brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. Mol Ther. 19 (8), 1440-1448 (2011).
  46. Radhiyanti, P. T., Konno, A., Matsuzaki, Y., Hirai, H. Comparative study of neuron-specific promoters in mouse brain transduced by intravenously administered AAV-PHP.eB. Neurosci Lett. 756, 135956(2021).
  47. Li, X., et al. Skin suturing and cortical surface viral infusion improves imaging of neuronal ensemble activity with head-mounted miniature microscopes. J Neurosci Meth. 291, 238-248 (2017).
  48. Scala, F., et al. Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas. Nat Comm. 10 (1), 4174(2019).
  49. Thomson, A. M. Neocortical layer 6, a review. Front Neuroanat. 4, 13(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transdukcja AAV2neocortex myszyznakowanie neuronalnedostarczanie wektor w wirusowychneurony piramidowewstrzykni cie stereotaktycznewarstwy koryekspresja gen wznakowanie fluorescencyjne
Rozległa transdukcja mysich neuronów kory nowej przez wstrzyknięcie subbaraczynoidu AAV2
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.