Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Podsumowanie

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (<1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Streszczenie

Kriogeniczne skierowanie wiązką jonów z mikroskopią skaningową (CryoFIB-SEM) stało się dominującym podejściem do przygotowywania lamel komórek o grubości poniżej 200 nm do tomografii elektronowej kriogenicznej (CryoET). Ostatnio mikroskopia fluorescencyjna została włączona do systemów CryoFIB-SEM, aby kierować produkcją lamelli w kierunku celów znakowanych fluorescencjo. Jednak w większości zastosowań systemy obrazowania optycznego i wiązki jonowej mają odrębne płaszczyzny ogniskowe w różnych rejonach komory próżniowej — działając skutecznie jako dwa oddzielne mikroskopy. Ta konfiguracja wymaga rejestracji obrazu pomiędzy modalnościami, co często nie jest wystarczające do niezawodnego celowania małych, rzadkich struktur in situ. Przedstawiamy workflow oparty na spersonalizowanej platformie obrazowania trójkobiegowego (trójkobiegowego), która umożliwia jednoczesne obrazowanie fluorescencyjne i frezowanie wiązką jonową o skupieniu. Pozwala to na uzyskanie sprzężenia zwrotnego fluorescencji w czasie rzeczywistym, które pozwala określić, kiedy zakończyć mielenie, aby zachować fluorescencyjne struktury, które są interesujące w końcowej lameli. Stosując to podejście, celowaliśmy w centrum organizujące mikrotubule (MTOC) w zsztartych makrofagach i osiągnęliśmy skuteczność >60%, potwierdzoną przez późniejszą kriogeniczną tomografię elektronową oraz korelacyjne mikroskopię świetlną i elektronową.

Wprowadzenie

Kriogeniczna tomografia elektronowa (CryoET) umożliwia wizualizację próbek biologicznych w stanie bliskim naturalnym z rozdzielczością makrocząsteczkową 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Jednak grubość komórek eukariotycznych — często kilka mikronów — przekracza średnią drogę wolną (~300 nm) elektronów o napięciu 300 kV, co ogranicza głębokość penetracji elektronów nierozproszonych, a tym samym ogranicza użyteczną grubość próbki. Aby temu zaradzić, można użyć wiązki jonów skupionych (FIB) do ablacji większości ogniwa zachowanego kriogenicznie w procesie zwanym młynem CryoFIB, co pozwala uzyskać lamele wystarczająco cienkie do obrazowania^CryoET 12,13,14,15,16.

W wcześniej raportowanych procesach próbki są najpierw konserwowane w zwitrzanym lodzie poprzez zanurzanie^{17, 18, 19, 19, a} następnie ładowane do instrumentu dwuwiązkowego wyposażonego zarówno w krioFIB, jak i skaningowy mikroskop elektronowy (SEM). Obrazowanie SEM może być wykorzystywane do identyfikacji cech podkomórkowych, takich jak organelli, a nawet niektórych struktur białkowych^20,21. Informacje te mogą być wykorzystywane do kierowania procesem mielenia CryoFIB, w którym próbka jest ablowana stopniowo, z zamiarem uzyskania lamelli o grubości poniżej 200 nm odpowiedniej do CryoET 13,14,22. Jednak to podejście stawia przed sobą dwa kluczowe wyzwania, które rozwiązuje obecny protokół. Po pierwsze, często konieczne jest uzyskanie CryoET konkretnych struktur białkowych, ale SEM może być szkodliwy, a większość struktur białkowych nie jest widoczna przez SEM podczas obrazowania niebarwionego materiału biologicznego. Jak można precyzyjnie kierować mielenie do konkretnych obszarów subkomórkowych lub obszarów zawierających określone biomolekuły w sposób wolny od uszkodzeń? Po drugie, nawet po produkcji cienkich lamel i późniejszym CryoET, identyfikacja konkretnych biomolekuł w końcowych rekonstrukcjach może być trudna ze względu na niewystarczającą rozdzielczość, stosunek sygnału do szumu i/lub kontrast wymagany do jednoznacznej identyfikacji. Jak można określić położenie przestrzenne tych biomolekuł w rekonstrukcjach krio-ET?

Aby sprostać obu wyzwaniom, dziedzina coraz częściej zwraca się ku mikroskopii fluorescencyjnej. Genetycznie kodowane fluorescencyjne białka lub egzogenne barwniki wiążące białka docelowe są rutynowo używane do oznaczania konkretnych biomolekuł interesujących ^5,23,24. Kriogeniczna mikroskopia fluorescencyjna komórek szklistych wykonana po mieleniu może być powiązana z uzyskanymi tomogramami. To podejście, znane jako kriogeniczna korelacja mikroskopia świetlno-elektronowa (CryoCLEM), jest dobrze ugruntowane i szeroko stosowane do lokalizacji specyficznych białek w rekonstrukcjach CryoET 5,12,23,24. Najnowsze osiągnięcia obejmują zastosowanie fluorescencyjnych biosensorów oraz metod superrozdzielczości w celu zwiększenia informacji uzupełniających i precyzji przestrzennej 25,26,27,28,29.

CryoCLEM jest jednym ze sposobów na pokonanie drugiego wyzwania wskazanego powyżej, umożliwiającego określenie lokalizacji konkretnych białek w lamelach. Jednak CryoCLEM nie działa na korzyść, jeśli ostatnia lamella nie zawiera interesujących go białek. Na szczęście mikroskopia fluorescencyjna może być również wykorzystywana do kierowania mielenia do oznakowanych obszarów zainteresowania. Chociaż frezowanie FIB kierowane fluorescencją jest nowszym rozwiązaniem niż CryoCLEM, a pierwsze procesy powstały około dekady^temu, szybko i szeroko się przyjęły. Wczesne protokoły opierały się na zewnętrznych mikroskopach świetlnych do pozyskiwania zbiorów danych fluorescencyjnych 2D lub 3D, które następnie rejestrowano na obrazach SEM i wiązki jonowej po przeniesieniu próbki do CryoFIB-SEM. W ostatnich latach mikroskopy fluorescencyjne zostały zintegrowane bezpośrednio z komorami próżniowymi CryoFIB-SEM. Ta integracja zmniejsza zanieczyszczenie lodem podczas transferów i ułatwia obrazowanie końcowej lamelli. Opracowano już kilka platform łączących mikroskopię fluorescencyjną z CryoFIB-SEM do frezowania sterowanego fluorescencją. Skutecznie ukierunkowały się na organelle i duże kompleksy białkowe ^5,23,24. Jednak z nielicznymi wyjątkami³⁰, ścieżka optyczna tworzy oddzielną płaszczyznę ogniskową w innym obszarze fizycznym komory próżniowej niż FIB-SEM. W rezultacie do kierowania frezowaniem nadal wymagana jest precyzyjna rejestracja między obrazami fluorescencyjnymi a jonowymi, podobnie jak w przypadku samodzielnych mikroskopów optycznych.

Proces rejestracji jest podatny na niedokładności z powodu trzech kluczowych czynników: niezgodności współczynnika załamania (powodujące pozorne przesunięcia ogniskowej)^31,32, ruchu próbki podczas frezowania oraz błędu lokalizacji. Ponadto rejestracja jest zazwyczaj wspomagana przez fluorescencyjne fiduciale o wielkości mikrona, widoczne zarówno w modalnościach jonowych, jak i optycznych, i wykorzystywane jako pary punktów wyrównania do obliczania przekształceń między obrazami jonowymi a optycznymi. Jednak te kulki mogą zaciemniać lub konkurować z sygnałem fluorescencji z próbki, a ich lokalizacja i wyrównanie na obrazach optycznych i jonowych jest powolne i wymagające dla użytkownika. Te ograniczenia utrudniają rutynowe celowanie małych i rzadkich obiektów. Chociaż trudno jest precyzyjnie określić granicę struktur, które można obecnie zachować w cienkich lameli, podejścia oparte na rejestracji są zazwyczaj uważane za nieskuteczne w łapaniu celów o wymiarach osiowych poniżej jednego mikrona³³.

Tutaj opisujemy użycie systemu obrazowania trójkobiegowego, który integruje mikroskopię FIB, SEM i fluorescencję w jednej pozycji ogniskowej^34,35. Ta konfiguracja pozwala na prostsze i dokładniejsze frezowanie sterowane fluorescencją w porównaniu z niezbieżnymi całowaniami, eliminując konieczność rejestrowania obrazów optycznych i jonowych. W idealnych warunkach niskiego tła i wysokiego sygnału można osiągnąć dokładność naprowadzania rzędu 10 nm na^{poziomie 36}. Umożliwia także pozyskiwanie wielokolorowych danych z kriogenicznej mikroskopii fluorescencyjnej przez cały proces frezowania, w tym z końcowej cienkiej lameli, co umożliwia analizę korelacji i lokalizację celów ograniczonych subdyfrakcją³⁵. Aby to osiągnąć, stosujemy spersonalizowany zestaw narzędzi do transformacji obrazów, aby precyzyjnie wyrównać te obrazy fluorescencji z mikroskopią transmisyjną o niskim powiększeniu, aby określić, gdzie pobrać CryoET, usprawniając zbieranie danych i zapewniając przechwycenie celów w końcowych rekonstrukcjach tomograficznych.

Aby kierować frezowaniem, wykorzystujemy zdolność systemu do monitorowania zmian intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym. Zamiast próbować wyrównywać obrazy optyczne i jonowe, aby znaleźć cel, użytkownik po prostu obserwuje sygnał fluorescencjonalny z próbki. W miarę postępu mielenia fluorescencja zachowuje się bardzo charakterystycznie: najpierw staje się jaśniejszy, gdy usuwana jest warstwa podtrzymująca węgla między obiektywem mikroskopu a fluorescencyjnie oznakowaną próbką, następnie stopniowo maleje, gdy materiał autofluorescencyjny jest frezowany, a ostatecznie gwałtownie maleje, gdy sama oznaczona struktura jest częściowo usuwana. Ten sygnał w czasie rzeczywistym precyzyjnie określa, na jakim etapie frezowania znajduje się proces frezowania i kiedy należy go zatrzymać, zapewniając, że docelowy obiekt pozostaje w końcowej lamelli³⁷. W szczegółowym protokole omówimy również bardziej zaawansowane podejście, które wykorzystuje oscylacje jasności fluorescencji spowodowane efektami interferometrycznymi do kierowania frezowaniem do obiektów o zasięgu osiowym <300 nm.

Demonstrujemy użyteczność platformy, celując w centrum organizowania mikrotubul (MTOC)³⁸. MTOC jest kluczowym organellem zaangażowanym w podział i różnicowanie komórek. W komórkach ssaków mikroskopia fluorescencyjna znakowanej tubuliny ujawnia MTOC jako pojedynczy fluorescencjonujący punkt o średnicy około 1 μm w komórkach żywych. To podejście zostało wykorzystane do skutecznej lokalizacji MTOC z wysoką wiernością do cienkich lamel komórek witryfikowanych. Szczegółowa organizacja mikrotubul w MTOC oraz ich interakcje z innymi organellami ujawniają kolejne rekonstrukcje tomograficzne. Ten workflow umożliwia precyzyjną mikroskopię fluorescencyjną korelację i CryoFIB-SEM bez rejestracji, ograniczając dane wejściowe użytkownika i rozszerzając dostęp do struktur komórkowych, które wcześniej były zbyt małe do solidnego rejestrowania przy nieprzypadkowych podejściach.

Definicje i opis instrumentów
Zintegrowany mikroskop optyczny jest szczegółowo opisany w Boltje i in. ³⁵, a dalsze szczegóły dotyczące użycia mikroskopu zintegrowanego można znaleźć w niedawno opublikowanym protokole³⁴. Obiektyw jest zintegrowany od dołu i wyposażony w funkcje pozycjonowania x, y i z, umożliwiające wyrównanie z punktem zbieżności FIB-SEM. Obecnie działa z obiektywem 100x, 0,85 NA z korektorem pokrywy. Obrazowanie optyczne odbywa się za pomocą szkła osłonowego, które chroni obiektyw przed pryskającymi materiałami oraz napromieniowaniem zarówno z FIB, jak i SEM. Oświetlenie szerokokątne zapewnia zestaw diod LED obejmujących wiele długości fal widzialnych. Detekcja fluorescencji realizowana jest za pomocą detektora sCMOS. Istnieją trzy określone pozycje etapu: obciążenie: pozycja etapu, do której załadowana jest próbka; powłoka: pozycja etapu do powlekania przez system wtrysku gazu; 3-wiązka: pozycja sceniczna, dla której wszystkie trzy mikroskopy (FIB, SEM i optyczne) mogą być współwyrównane.

Protokół

UWAGA: System trójkobiegowy używany tutaj to spersonalizowany komponent obrazowania fluorescencyjnego kriogenicznego zintegrowany z komercyjnie dostępnym, dwuwiązkowym systemem FIB-SEM. Zasada i kolejność operacji mogą być ogólnie dostosowane do przyszłych implementacji trójkobiegielnych.

1. Przygotowanie

1. Schłodzić system do temperatury kriogenicznej. Monitoruj temperaturę za pomocą dwóch czujników: jednego umieszczonego na stopniu próbkowym, a drugiego wewnątrz komory. Utrzymuj etap próbki około 20 °C cieplejszy niż komora (np. stopień ~-170 °C, komora ~-190 °C), aby zminimalizować nagromadzenie się lodu na próbce. Proces chłodzenia zazwyczaj trwa około 1,5 godziny.

2. Ładowanie próbki

1. Do ręcznego chłodzenia stacji transferowej używaj ciekłego azotu, gdy temperatura systemu zbliża się do temperatury kriogenicznej (około -167,5 °C). Temperatura systemu jest wyświetlana w lewym górnym rogu oprogramowania do mikroskopii świetlnej.
2. Załaduj jedną przypiętą Autosiatkę do kasety próbkowej przeznaczonej do systemu kriogenicznej mikroskopii świetlnej. Kaseta składa się z klejonego pokrywa pokrywowego i dystansu, z Autogridem umieszczonym pomiędzy nimi. Zamknij kasetę, dokręcając śrubę pierścieniową, a następnie włóż ją do szczeliny na stacji transferowej³⁴.
3. Podłącz stację transferową do systemu i użyj kamery w wewnętrznej komorze, aby naprowadzić kasetę próbkową na scenę próbkową.

3. System wtrysku gazu (GIS) do powlekania próbek

1. Otwórz oprogramowanie do sterowania mikroskopią świetlną i przesuń etap próbki z pozycji Ładowanie do Powłoki .
2. Włóż igłę GIS za pomocą oprogramowania sterującego FIB-SEM, klikając ikonę Snowflake. W sterowaniu GIS wybierz opcję wkładania igły GIS.
3. Pozwól na osadzanie GIS przez 30 sekund, otwierając przepływ gazu.
   UWAGA: Czas ten waha się od 20 sekund do 1 minuty w zależności od typu próbki. Celem tego etapu jest odpowiednia ochrona próbki podczas kolejnego procesu mielenia FIB.
4. Chując iglicę GIS, przesuń etap próbki z powrotem do zdefiniowanej pozycji ładowania .

4. Wyrównanie systemu trójwiązkowego

UWAGA: Ta część jest adaptacją Wang³⁹.

1. W oprogramowaniu mikroskopii świetlnej przesuwaj etap próbki z pozycji ładowania do zdefiniowanej pozycji 3-wiązki .
2. W oprogramowaniu FIB-SEM kliknij w okno w lewym górnym rogu i ustaw powiększenie SEM na 100x.
3. W zakładce Alignment w oprogramowaniu mikroskopii świetlnej kliknij funkcję Widok, aby pobrać atlas siatki SEM. Ten obraz atlasu wykorzystuje wcześniej ustalone parametry.
4. Zidentyfikuj kwadratowy obszar z uszkodzoną folią węglową i kliknij dwa razy, aby przenieść etap próbki w to miejsce.
5. Wracam do oprogramowania sterującego FIB-SEM i ustawiam SEM na większe powiększenie , aby skupić się na wybranym obszarze kwadratowym, wyśrodkowanym w polu widzenia.
6. Powtarzaj kroki 4.4 i 4.5 według potrzeby, aż SEM skoncentruje się na wyraźnym wzorze, takim jak ostra krawędź pękniętej folii węglowej.
7. Włącz mikroskop fluorescencyjny i dostosuj współrzędne x, y, z, aby pasowały do widoku SEM.
8. Na przykład wyfrezuj mały wzór za pomocą FIB, na przykład mały prostokąt lub koło.
9. Potwierdź, że wzór jest widoczny zarówno w ujęciu z mikroskopu FIB, jak i fluorescencyjnego. Jeśli to konieczne, dostosuj wyrównanie, stosując kroki 4.3-4.7, jeśli to konieczne.
   UWAGA: Ustawienie i rejestracja mikroskopów optycznych i jonowych są zakończone.

5. Lokalizacja i frezowanie celów

UWAGA: Ta część jest adaptacją Wang³⁹.

1. Przejdź do zakładki Lokalizacja w oprogramowaniu do mikroskopii świetlnej i ustaw kanały fluorescencyjne, aktywując odpowiednie warunki wzbudzania i filtrowania. Przypisz każdemu fluoroforowi osobny kanał i dodaj dodatkowy kanał dla światła przepuszczonego (lub jasnego pola).
2. Zidentyfikuj interesujący obiekt, dostrojąc moc LED i czas naświetlania dla każdego kanału fluorescencyjnego. Dla porównania, podczas obrazowania SiR-tubuliny używaj ekspozycji 1,2 s przy stałym ustawieniu mocy diody LED 30 mW.
   UWAGA: Parametry mogą się różnić w zależności od fluoroforów. Natężenie optyczne powinno pozostać poniżej ~25-50 W/^cm2 w próbce. Większa intensywność może skutkować znacznym nagrzewaniem i devitryfikacją próbki^37,40.
3. Po spełnieniu parametrów należy uzyskać wstępnie frezujący fluorescencyjną warstwę Z, która przechodzi przez kierunek osiowy. Następnie oznacz cel jako zwrot z inwestycji.
4. Przełącz się na oprogramowanie FIB-SEM, aby narysować lamellę przy ROI.
5. Wykonaj surowe frezowanie, aby usunąć masę materiału około 3 μm powyżej i poniżej ROI. Jednocześnie podczas mielenia należy mieć włączony mikroskop fluorescencyjny, aby monitorować ewentualny spadek sygnału fluorescencyjnego.
6. Rozcieńcz zwrot z inwestycji do ~2 μm w trybie przekroju czyszczącego.
7. Otwórz zestaw narzędzi interferometrycznych oparty na Pythonie na terminalu, aby monitorować sygnał fluorescencjonalny podczas przerzedzania lamelli (https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite)³⁶.
8. Przy kolejnym frezowaniu i polerowaniu należy stosować jedno z dwóch opisanych poniżej podejścia w krokach 5.9 lub 5.10, aby precyzyjnie frezować na podstawie wymiarów wybranych tarcz.
   1. Zasięg osiowy celu > 300 nm
      UWAGA: Tutaj zastosujemy półdestrukcyjne podejście do bezpośredniego mielenia.
      1. W interfejsie Python-GUI wybierz obiekt zainteresowania na mikrografie fluorescencyjnej. Oprogramowanie automatycznie zacznie wyznaczać jasność w zależności od czasu przy każdej nowej klatce.
      2. Monitoruj intensywność fluorescencji za pomocą zestawu narzędzi Python. Zmiełek w trybie czyszczenia przekroju od dołu, aby usunąć wszelkie pozostałe materiały z folii nośnej, jeśli to możliwe.
         UWAGA: Po usunięciu folii nośnej należy zaobserwować wzrost fluorescencji.
      3. Użyj szybkich spadków intensywności fluorescencji — wskazujących na utratę materiału fluorescencyjnego — jako sygnału, kiedy zmienić kierunek frezowania. Na przykład, jeśli frezujesz od dołu do góry i zaobserwuje się gwałtowny spadek fluorescencji, przestań mieleczenie i przełącz się na frezowanie od góry w dół.
         UWAGA: Jeśli konstrukcja zostanie usunięta zbyt szybko, zmniejsz prąd frezowania w oprogramowaniu FIB-SEM, aby spowolnić usuwanie celu.
   2. Zasięg osiowy celu ≤ 300 nm
      UWAGA: Tutaj użyjemy efektu interferometrycznego do kierowania frezowaniem³⁶.
      1. W interfejsie Python-GUI wybierz obiekt zainteresowania na mikrografie fluorescencyjnej. Oprogramowanie automatycznie zacznie wyznaczać jasność w zależności od czasu przy każdej nowej klatce.
      2. Zacznij od frezowania od góry do dołu przez cel testowy. Monitoruj kontrast prążków tuż przed przejściem przez cel przez intensywność fluorescencji. Cel fluorescencyjny jest stale dopasowywany do dwuwymiarowego Gaussa, a dopasowanie to służy do uzyskania całkowitej intensywności, która jest następnie wykreślana.
      3. Po przejściu celu dopasuj oscylacje w ścieżce intensywności do następującej funkcji modelu za pomocą interfejsu Pythona:
         
         Gdzie A to amplituda oscylacji, λ długość fali wzbudzenia, k to wyraz tłumiący reprezentujący długość koherencji źródła światła, czynnik fazowy Φ, a d to odległość do obiektu przechwytu. Z celu testowego wszystkie składniki można przewidzieć w rozsądnych granicach, tak że odległość d, jest jedyną wolną zmienną używaną do wskazania użytkownikowi, gdzie znajduje się obiekt fluorescencjonujący względem jego frezowania. Zobacz Sica i in. po więcej szczegółów³⁶.
         UWAGA: Dla kolejnych celów zestaw narzędzi dopasowuje ścieżkę intensywności tą samą funkcją modelu i oszacuje, gdzie zatrzymać frezowanie od góry w dół. Wszystkie złączki wykonywane są jednocześnie z frezowaniem. Celem jest zatrzymanie frezowania, gdy cel leży na głębokości równej połowie pożądanej grubości lameli poniżej górnej powierzchni.
      4. Po zakończeniu frezowania odgórnego do dołu finalizuj lamelę, frezując od dołu do góry w trybie przekroju czyszczącego aż do osiągnięcia pożądanej grubości.
9. Zrób zdjęcie fluorescencji po frezowaniu.

6. Mikroskopia świetlna korelacja i kolekcja serii tilt

1. Po przeniesieniu próbki do CryoTEM pobierz atlasowy przegląd siatki o prędkości 182x, aby zapewnić wystarczające pokrycie całej siatki.
2. Przy odpowiednim pośrednim powiększeniu od 6 500x do 11 000x pobierz serię montażowych zdjęć ostatniej lamelli pod kątem 0°.
3. Przeczytaj post frezowanie wielokanałowych obrazów fluorescencyjnych oraz obraz projekcji z kroku 6.2 do niestandardowego oprogramowania do transformacji rzutowej do rejestracji zwrotu z inwestycji (https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git).
4. Wybierz łącznie 8-10 par punktów odniesienia, aby precyzyjnie obliczyć transformację obrazu rzutowego.
   UWAGA: Te punkty mogą być oczywistymi cechami (np. krawędziami lameli, widocznym zanieczyszczeniem lodem lub otwartymi otworami w siatce), które występują zarówno w mikroskopii optycznej w jasnym polu, jak i w mikroskopii elektronowej.

7. Kolekcja serii przechyleń o wysokim powiększeniu

1. Wykorzystaj ten nałożony obraz z mikroskopii fluorescencyjnej i transmisyjnej jako punkt odniesienia, aby użytkownicy mogli wybrać obszar obrazowania mieszczący się w granicach rozmiaru klatki kamery do zbierania serii z dużą powiększeniem tilt.
2. Wybierz powiększenie i parametry serii przechylenia w zależności od zagadnienia biologicznego.
   UWAGA: Do demonstracji zebraliśmy dane z 54° z przyrostami o 2° przy rozmiarze piksela 3,5 Å^41,42,43.

Wyniki

Przed zamrożeniem oznaczaliśmy zróżnicowane komórki makrofagów markerem tubulinowym SiR-tubuliną. Zgodnie z protokołem zidentyfikowaliśmy MTOC jako pojedynczy fluorescencjonalny punktum o średnicy ~ 1 μm pod mikroskopem fluorescencyjnym (rysunek 1A). Dodatkowo zaobserwowaliśmy fluorescencyjne struktury przypominające włókna promieniujące z MTOC w kierunku obwodów komórek, zgodne z siecią mikrotubul (Rysunek 1A). Zdjęcia stopniowego frezowania o różnych grubościach próbek pokazano na Rysunku 1B. Co istotne, gdy lamella osiągnęła grubość około 800 nm, pojedynczy punkt MTOC rozdzielał się na dwie sąsiadujące plamki, każda o średnicy około 700 nm. Późniejsza analiza potwierdziła, że każda plamka odpowiadała pojedynczemu centriole.

Jednoczesne obrazowanie i frezowanie pozwoliły nam monitorować zmiany intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym. Warto zauważyć, że zaobserwowaliśmy wzrost fluorescencji po usunięciu masowego materiału niefluorescencyjnego oraz absorpcyjnej folii nośnej (Rysunek 1B-D). W miarę jak lamella była przerzedzona z 2 μm do 800 nm, intensywność fluorescencji gwałtownie spadała, odzwierciedlając stopniowe usuwanie oznakowanych struktur. Spadek ten trwał dalej, gdy lamella była jeszcze bardziej przerzedzona poniżej 200 nm (Rysunek 1B-D). Skorelowany obraz fluorescencyjny i atlas mikroskopii elektronowej pokazują, że nasz sposób pracy umożliwia precyzyjne celowanie do frezowania (Rysunek 2A). Rekonstruowane tomogramy i modele segmentowane pokazują, że centriole składają się z trójek mikrotubul, co jest zgodne z wcześniejszymi raportami 42,43,44,45 (Rysunek 2A,B). W przypadkach, gdy w końcowej lamelli zachowana jest tylko jedna fluorescencja plamka, obserwujemy pojedynczy centriol w odpowiadającym tomogramie (rysunek 2B).

Rysunek 1: Przepływ pracy trójkobiegowego CryoFM-FIB-SEM do precyzyjnej lokalizacji centrum organizującego mikrotubule. (A) (po lewej) Mikroskopia komórek na żywo oraz (po prawej) CryoFM MTOC. Skala = 10 μm. (B) Krokowe migawki CryoFM i CryoFIB do precyzyjnego frezowania. Zbliżenie FM oznaczone jest żółtymi przerywanymi ramkami. Centriole oznaczone są żółtymi strzałkami. Skala = 5 μm. (C) Intensywność fluorescencji MTOC podczas mielenia krioFIB. (D) Profil linii fluorescencyjnej na MTOC wykonany na różnych etapach podczas frezowania krioFIB. Skróty: CryoFM-FIB-SEM = Kriogeniczna mikroskopia fluorescencyjna z koncentrowanym frezowaniem wiązką jonową oraz skaningową mikroskopią elektronową; MTOC = centrum organizujące mikrotubule; ROI = region zainteresowania. Ta figura została zaadaptowana z Wang³⁹. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Szczegóły molekularne MTOC ujawnione przez trójkobiegowy przepływ pracy CryoFM-FIB-SEM. (A) Skorelowane modele FM, EM i segmentacji MTOC. (a) Obraz FM po frezowaniu. To ten sam obraz z ostatniego panelu Rysunku 1B , oznaczony jako 180 nm, ale obrócony, aby odpowiadał rekonstrukcji i segmentacji CryoET. Pasek skali = 5 μm; (b) Powiększony widok przerywanego obszaru na żółto z (a). (c) skorelowana projekcja FM i TEM obszaru przerywanego w cyjanie, wskazana w (2). Pasek skali = 1 μm. (d) Model segmentowany rekonstrukcji tomograficznej w obszarze zainteresowania (żółty, centriol; zielony, mikrotubula). Skala = 100 nm. (B) Reprezentatywne obrazy FM i tomograficzne przekroje dwóch różnych lamel o różnych orientacjach centrioli. FM: Pasek skali = 5 μm. Przekrój tomograficzny: Skala = 200 nm. Skróty: CryoFM-FIB-SEM = kriogeniczne frezowanie wiązką jonów z mikroskopią skaningową elektronową; MTOC = centrum organizujące mikrotubule; FM = mikroskopia fluorescencja; ET = transmisja elektronów; TEM = transmisyjna mikroskopia elektronowa. Ta figura została zaadaptowana z Wang³⁹. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

Nasze wyniki podkreślają użyteczność platformy obrazowania trójkobiegielnego, która umożliwia jednoczesne obrazowanie fluorescencyjne i frezowanie. Wykorzystując tę informację zwrotną, demonstrujemy dwie strategie frezowania kierowane fluorescencją — półdestrukcyjną i interferometryczną — które eliminują konieczność uciążliwych i rejestracyjnych podejść napotykających fundamentalne ograniczenia dokładności związane z niedopasowaniem współczynnika załamania światła i ruchem podczas frezowania 12,33,46. Ponadto, ponieważ precyzyjne naprowadzanie opiera się na mikroskopii fluorescencyjnej, a nie SEM, promieniowanie optyczne nie powoduje wykrywalnych uszkodzeń, o ile intensywność pozostaje poniżej progu prowadzącego do dewitryfikacji^37,47. Przedstawione tutaj możliwości rozszerzają dostępne próbki biologiczne o rzadkie i małe (<300 nm w zasięgu osiowym) interesujące cele, jednocześnie usprawniając przepływ pracy.

Kluczowym krokiem w tym protokole jest określenie, kiedy zaprzestać mielenia na podstawie zmian jasności jarzeniówek interesującego go obiektu. Obecnie wymaga to szybkiej ręcznej interwencji, aby zatrzymać frezowanie w pożądanych momentach. Ta metoda okazała się wystarczająca dla obecnie badanych celów, ale przyszłe modyfikacje mogą dodatkowo zintegrować zestaw narzędzi Pythona z systemem FIB, aby bezpośrednio zatrzymać frezowanie. Ta modyfikacja może być konieczna, jeśli wymagane są szybsze tempo frezowania, ponieważ pozwoli to na mniej czasu na ręczną interwencję. Alternatywnie, jeśli wolniejsze tempo mielenia można tolerować, da to więcej czasu na ręczną interwencję w razie potrzeby.

Po wygenerowaniu interesujących się struktur biologicznych zawierających lamelę, nasze spersonalizowane oprogramowanie do transformacji obrazów umożliwia korelację na poziomie CryoTEM, wykorzystując przeglądy atlasowe lamel do prowadzenia zbierania danych CryoET. Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony tutaj protokół jest niezbędny do obrazowania fluorescencyjnie oznakowanych, małych i rzadkich celów biologicznych za pomocą tomografii elektronowej kriogenicznej w grubych próbkach komórek eukariotycznych. W porównaniu z istniejącymi nieprzypadkowymi systemami krio-FIB, takimi jak Aquilos 2 z iFLM, nasz workflow osiąga wyższy wskaźnik skuteczności w realizacji tych funkcji.

Ta wysoka precyzja celowania odbywa się kosztem efektywności. Ponieważ frezowanie odbywa się ręcznie, a nie automatycznie, przepustowość wytwarzania lameli jest ograniczona. W 8-godzinnej sesji mielenia zazwyczaj produkujemy 6-8 lameli, z czego około pięć zawiera interesujący cel. Jednak uważamy, że ten przepływ pracy może zostać w przyszłości zautomatyzowany, aby poprawić przepustowość. Automatyzacja wymagałaby niestandardowych skryptów do ciągłego monitorowania aktywnych obszarów frezowania na obrazie FIB oraz śledzenia intensywności fluorescencji w czasie rzeczywistym, aby zapewnić retencję docelową. Pozostają kluczowe wyzwania, w tym zapewnienie skutecznej komunikacji między wszystkimi niestandardowymi skryptami a oprogramowaniem sterującym zarówno dla CryoFIB-SEM, jak i mikroskopu fluorescencyjnego.

Patrząc w przyszłość, przed nami wiele prac nad wdrożeniem innych zaawansowanych technik mikroskopii fluorescencyjnej omawianych wcześniej, w tym fluorescencyjnego biosensorów, obrazowania superrozdzielczości oraz mikroskopii konfokalnej. Niemniej jednak przewidujemy, że geometrie trójzbiegowe staną się standardem w przyszłych instrumentach, a jednoczesne obrazowanie fluorescencyjne podczas frezowania stanie się rutyną. Jeśli tak, protokół ten może służyć jako cenny przewodnik dla badaczy dążących do uchwycenia szczegółów molekularnych małych i rzadkich struktur biologicznych, które mimo swojego rozmiaru i liczności są kluczowe dla biologii komórki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Krio-FIB Aquilos 2	ThermoFisher Scientific		https://www.thermofisher.com/us/en/home/electron-microscopy/products/dualbeam-fib-sem-microscopes/aquilos-cryo-fib.html?cid=msd_ls_xseg_xmkt_sdb-aquilos_285811_na_pso_gaw_pei90m & gad_source=1& gad_campaignid=12 764255901& gbraid=0AAAAADxi_GS s7OvZmg4cgCUm0PjSiq9X9& gclid= Cj0KCQjwh5vFBhCyARIsAHBx2w xlIfYHMvqY3sSWu6oEAdUynCSf9 KRg9Jhjp7l0Dot9qTl6GyQaEo8aAiy 2EALw_wcB
Kryokratka kompatybilna z Autogrid	Nauki o mikroskopii elektronowej		https://www.emsdiasum.com/autogrid -compatible-cryo-grid-box?srsltid= AfmBOorQAd3esD8fLmnDDO2TvrNk cj4UINXFnPSMgrpEmkWd0H7ImUq7
Pierścienie autosiatki i klipsy C	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/100-pack-autogrid-rings-c-clips
Pakiet oprogramowania CLEM	Grupa Badawcza Dahlberga na Stanford/SLAC		https://github.com/pdahlb/CLEM_software_suite.git
Ważka 2022.1	Systemy badań obiektowych		https://dragonfly.comet.tech/
ENZEL	Delmic B. V.		System ENZEL jest instrumentem dostosowanym do spersonalizacji i obecnie nie jest dostępny komercyjnie
IMOD 4.12	Uniwersytet Kolorado		https://bio3d.colorado.edu/imod/
LD4 dewar ciekłego azotu	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/ld4-liquid-dewar-4-liters
MATLAB 2023	MathWorks		https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Narzędzie do manipulacji pokrywką kołka	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/pin-lid-manipulator-tool
Zestaw narzędzi Pythona	Grupa Badawcza Dahlberga na Stanford/SLAC		https://github.com/pdahlb/trico_softwaresuite
Quantifoil R2/2, LF, siatka 200, siatka Au EM	Nauki o mikroskopii elektronowej		https://www.emsdiasum.com/quantifoil-r-22-lf-200-mesh-gold
Serial EM	Uniwersytet Kolorado w Boulder		https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/
Standardowy statek z włóczniami (transfer Dewar)	Nanosoft		https://www.nanosoftmaterials.com/product-page/spearlab-standard-vessel
Pęseta	Nauki o mikroskopii elektronowej		https://www.emsdiasum.com/style-3sa