Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie bioczujników całokomórkowych do pomiaru rtęci jonowej w próbkach wody

641 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68257

⸱

3 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratorio de Moléculas Individuales, Laboratorios de Investigación y Desarrollo, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Peruana Cayetano Heredia, 2Kenniscentrum AI, Erasmushogeschool Brussel, 3Open BioLab Brussels, Erasmushogeschool Brussel

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia protokoły wykorzystania dwóch biosensorów całokomórkowych (Mer-Blue i Mer-RFP) do wykrywania rtęci jonowej. Zapewniając szczegółowe procedury ich działania i analizy wyników, badanie ma na celu ułatwienie szerszego przyjęcia i dalszego rozwoju tych technologii do monitorowania określonych zanieczyszczeń.

Streszczenie

Biosensory całokomórkowe (WCB) są instrumentalnymi platformami do odkrywania i charakteryzowania elementów regulacyjnych oraz rozwoju bioinżynierii. Są one również niezwykle obiecujące w zakresie monitorowania środowiska i żywności. Chociaż włożono znaczne wysiłki w zwiększenie ich czułości i przenośności, standaryzacja ich obsługi i analizy danych pozostaje stosunkowo słabo rozwinięta. W tym artykule przedstawiono obszerny przewodnik dotyczący wykorzystania dwóch niedawno opracowanych WCB, Mer-Blue i Mer-RFP, które okazały się zdolne do wykrywania rtęci jonowej na poziomach poniżej limitów wody pitnej Światowej Organizacji Zdrowia. Protokoły wyszczególnione w niniejszym dokumencie obejmują przygotowanie hodowli drobnoustrojów, kalibrację czujników, akwizycję i analizę danych. W przypadku biosensora fluorometrycznego Mer-RFP zastosowano nowatorskie twierdzenie o alokacji biosyntezy w celu określenia przedziału czasowego dla wiarygodnych i dokładnych pomiarów dawka-odpowiedź. W przypadku biosensora kolorymetrycznego Mer-Blue niedroga konfiguracja kamery umożliwia rygorystyczne pomiary w warunkach, w których brakuje drogich spektrofotometrów i fluorymetrów, ułatwiając zdecentralizowane monitorowanie zanieczyszczeń. Opisano procedury stosowane do badania próbek słodkowodnych oraz omówiono ograniczenia tych biosensorów w odniesieniu do typów próbek. Dzieląc się tymi technikami obsługi i analizy, zachęcamy szersze grupy badawcze do przyjęcia i ulepszenia tych urządzeń biologicznych w celu opracowania skutecznych rozwiązań do monitorowania środowiska. Ostatecznie badania te mają na celu ułatwienie powszechnego przyjęcia technologii biosensorów w społeczności nauk o środowisku, przyczyniając się do skuteczniejszego i wydajniejszego monitorowania zanieczyszczenia pierwiastkami śladowymi w różnych ekosystemach.

Wprowadzenie

Wraz z rosnącymi obawami dotyczącymi zanieczyszczenia środowiska oraz bezpieczeństwa dostaw wody i żywności, biosensory stały się atrakcyjną, przystępną cenowo alternatywą dla tradycyjnych metod chemii analitycznej. Metale ciężkie to wysoce toksyczne zanieczyszczenia, które stają się coraz bardziej powszechne w wyniku działalności człowieka1,2,3,4. Jednak konwencjonalne metody wykrywania5 są często kosztowne i niedostępne.

Wrażliwe na rtęć WCB wykorzystują niezwykłą specyficzność i czułość czynnika transkrypcyjnego MerR6,7,8. W swojej natywnej funkcji MerR reguluje ekspresję białek efektorowych, których działanie detoksykujące nadaje odporność na rtęć9. Zdolność MerR do regulowania ekspresji genów w sposób zależny od rtęci została ponownie wykorzystana do regulacji białek reporterowych w systemach wykrywania rtęci10,11,12,13,14,15,16. Pomimo obiecujących badań, te WCB nie zostały jeszcze przyjęte do monitorowania w świecie rzeczywistym. Czynniki takie jak kruchość biologiczna, specjalistyczne wymagania dotyczące obsługi oraz brak znormalizowanych protokołów i certyfikowanych materiałów referencyjnych utrudniają praktyczne zastosowanie17,18,19,20.

System WCB do wykrywania rtęci jonowej został opracowany przy użyciu MerR sprzężonego z dwoma różnymi białkami reporterowymi. Mer-Blue ulega ekspresji białka chromogennego i służy jako bioczujnik kolorymetryczny, umożliwiając detekcję wizualną lub za pomocą kamery. Mer-RFP, bioczujnik fluorescencyjny, umożliwia ciągłe monitorowanie akumulacji sygnału. Dzięki dokładnemu kontrolowaniu czasu ekspozycji próbki w fazie wzrostu, osiągnięto solidną odtwarzalność w obu systemach15.

Ten artykuł przedstawia szczegółowe protokoły obsługi zarówno Mer-Blue, jak i Mer-RFP, wraz z obszerną analizą ich sygnałów wyjściowych. W przypadku Mer-RFP analiza opiera się na niedawno wprowadzonym twierdzeniu o alokacji biosyntezy białek21. W przypadku Mer-Blue analizę kolorymetryczną można zdigitalizować za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu, takiego jak ImageJ. Aby zapewnić spójne ustawienia akwizycji obrazu, prezentowana jest tania konfiguracja kamery dla majsterkowiczów o nazwie PelletCam. W obu przypadkach dostarczane jest zautomatyzowane oprogramowanie ułatwiające obsługę. Dzieląc się dostępnymi i ustandaryzowanymi metodologiami eksperymentalnymi i technikami analizy danych, zachęca się do szerszego stosowania WCB w celu opracowania niezawodnych i opłacalnych rozwiązań do monitorowania opartych na bioczujnikach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Odczynniki i sprzęt wykorzystane w niniejszym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie roztworów rtęci jonowej

  1. Odważ niewielką ilość proszku HgBr2 (zazwyczaj od 0,1 do 0,2 g), stosując odpowiednie rękawice ochronne oraz maskę, aby zapobiec inhalacji i kontaktowi ze skórą.
  2. Oblicz ilość wody potrzebną do uzyskania roztworu 4 mM, rozpuszczając odważoną masę proszku w ddH2O zgodnie z wzorem:
    Równanie do obliczania molowości; przedstawia zależność obejmującą masę, objętość w L oraz konwersję na mmol.
    UWAGA: Przewidywana objętość wynosi blisko 100 mL; można zastosować uproszczony wzór:
    Wzór na obliczanie objętości z masą odważoną i współczynnikiem konwersji, przedstawiony w formie równania.
    1. Alternatywnie, w przypadku użycia HgCl2, zastosuj wzór:
      Wzór na obliczanie objętości, równowaga statyczna, równanie w analizie naukowej, metoda pomiaru.
  3. Przechowuj roztwór zapasowy w szczelnie zamkniętym pojemniku w warunkach chłodniczych (4 °C), aby zapobiec odparowaniu.
  4. Przed każdym testem miareczkowym przygotuj rozcieńczenia szeregowe, zaczynając od 1 mL Hg2+ o stężeniu 2 mM i rozcieńczając do poziomu 40 nM, zgodnie z Tabelą 1.
    UWAGA: Stężenie rtęci jonowej może ulec zmianie podczas przechowywania, prawdopodobnie w wyniku spontanicznej redukcji i odparowania rtęci elementarnej (Hg°). Chociaż chłodzenie i stosowanie wysokiej jakości szczelnych pojemników mogą ograniczyć te efekty, należy unikać używania roztworów przechowywanych dłużej niż 6 tygodni – zwłaszcza w przypadku stężeń Hg2+ wynoszących 250 nM lub mniej.

2. Przygotowanie podłoża M9

  1. Rozpuść proszki reagentów w osobnych kolbach, używając wody ultrapurej, aby przygotować następujące roztwory zapasowe: M9 5×, 1 M MgSO4, 1 M CaCl2, 20% (w/v) glukozy oraz 20% (w/v) kwasów Casamino.
  2. W szklanej butelce o pojemności 500 mL lub 1 L wymieszaj 50 mL M9 5×, 2,5 mL 20% (w/v) kwasów Casamino i dodaj wodę ultrapurej do uzyskania całkowitej objętości 246,475 mL.
  3. Autoklawuj mieszaninę oraz wymienione powyżej roztwory zapasowe w temperaturze 121 °C przez 20 min.
  4. Pozostaw wszystkie roztwory do całkowitego ostygnięcia, aby uniknąć wytrącenia się CaCl2.
  5. Do schłodzonej mieszaniny dodaj: 25 µL 1 M CaCl2, 500 µL 1 M MgSO4 oraz 3 mL 20% (w/v) glukozy.
    UWAGA: W ten sposób otrzymuje się bogato suplementowanej pożywkę M9 o następujących stężeniach końcowych: 0,24% (w/v) glukozy, 0,2% (w/v) kwasów Casamino, 2 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 3 g/L KH2PO4, 0,5 g/L NaCl, 6,78 g/L Na2HPO4, 1 g/L NH4Cl.

3. Aktywacja biosensora Mer-Blue / Mer-RFP

  1. Należy użyć komórek Escherichia coli DH5α przekształconych plazmidem pUC-Mer-RFP lub pUC-Mer-Blue (patrz Tabela materiałów).
  2. Przygotować szalkę Petriego z agarem LB zawierającym 100 µg/mL ampicyliny.
  3. Wysiać komórki z kriokonserwowanego zapasu glicerolowego na płytkę z agarem LB metodą posiewu smugowego.
  4. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C.
  5. Następnego dnia pobrać pojedynczą kolonię z płytki z agarem LB w celu zaszczepienia 10 mL hodowli w pożywce M9 (Rysunek 1A).
  6. Inkubować hodowlę w temperaturze 37 °C przy stałym wytrząsaniu z prędkością 220 rpm przez noc (~16 h) (Rysunek 1B).

4. Eksperyment miareczkowania z użyciem Mer-RFP

  1. Zmierz gęstość optyczną nocnej hodowli bakterii przy 600 nm (OD600).
  2. Oblicz objętość nocnej hodowli wymaganą do osiągnięcia OD600 wynoszącej 0,05 w całkowitej objętości 10 mL świeżego podłoża M9, korzystając ze wzoru:
    Wzór obliczeń rozcieńczenia: V₁×C₁=10mL×0,05. Równanie chemiczne.
    gdzie C1 to OD600 nocnej hodowli, a V1 to objętość, którą należy z niej pobrać.
  3. Odwiruj V1 mL pre-inokulum przy 3500 × g przez 5 min. Odlej stare podłoże M9 i resuspenduj osad bakteryjny w 10 mL świeżego podłoża M9 (Rycina 1C).
  4. Dodaj 195 µL resuspenderowanej hodowli do każdego dołka mikropłytki 96-dołkowej. Upewnij się, że każda mikrokultura jest przygotowana w trzech powtórzeniach w celu uzyskania dokładnych pomiarów.
  5. Do każdego dołka dodaj 5 µL roztworów rtęci jonowej o stężeniu od 40 nM do 40 µM, zgodnie z opisem w kroku 1, aby uzyskać stężenia końcowe w zakresie od 1 nM do 1 µM (Rycina 1D).
  6. Umieść mikropłytkę w wielofunkcyjnym czytniku mikropłytek z kontrolą temperatury, ustawiając następujące parametry (Rycina 1E) – Temperatura: 37 °C, Wstrząsanie: Ciągłe wstrząsanie z prędkością 60 rpm, Interwał czasowy: Odczyt co 15 min przez 16 h, Pomiar gęstości optycznej: Odczyt przy 600 nm, Pomiar fluorescencji: Wzbudzenie przy 570 nm i emisja przy 615 nm.
  7. Po zakończeniu 16-godzinnego okresu inkubacji pobierz dane z czytnika mikropłytek (Rycina 1F).

5. Analiza danych dla wyników Mer-RFP

  1. Użyj preferowanego oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych lub narzędzi do zarządzania danymi, aby zwizualizować surowe wartości OD600 w czasie dla wszystkich poszczególnych kultur (Rysunek 1G). Zweryfikuj, czy koniec fazy adaptacyjnej oraz początek fazy stacjonarnej następują mniej więcej w tym samym czasie we wszystkich powtórzeniach dla każdego stężenia rtęci. Wyklucz kultury, których odchylenie przekracza 1 h od średniego czasu.
  2. Oblicz średnią wartość OD600 dla każdego punktu czasowego we wszystkich powtórzeniach dla każdego stężenia rtęci. Dla każdej triplikowanej kultury uzyskano będzie jedną uśrednioną krzywą wzrostu OD600 oraz trzy wyniki intensywności fluorescencji w różnych punktach czasowych.
  3. Nanieś na wykres uśrednione OD600 vs. czas dla kultury bez rtęci. Wizualnie zidentyfikuj i wybierz przedział czasowy, w którym szybkość wzrostu jest dodatnia (patrz Rysunek 2). Wyklucz pozostałe punkty danych ze wszystkich kultur.
  4. Dla każdej kultury oblicz specyficzną szybkość wzrostu w każdym punkcie czasowym, wyznaczając zmianę OD600 względem poprzedniego punktu czasowego i dzieląc tę zmianę przez wartość OD600 w tym punkcie czasowym, korzystając z następującego wzoru:
    Obliczanie specyficznej szybkości wzrostu; wzór przedstawiający analizę szybkości opartą na OD; eksperyment mikrobiologiczny.
  5. Podobnie oblicz specyficzną szybkość produkcji fluorescencji dla każdej kultury, wyznaczając zmianę intensywności fluorescencji względem poprzedniego punktu czasowego i dzieląc tę zmianę przez wartość OD600 w tym punkcie czasowym, korzystając ze wzoru:
    Równanie szybkości produkcji fluorescencji, wzór do obliczania zmian w czasie w badaniach biologicznych.
  6. Dla każdej kultury nanieś specyficzną szybkość wzrostu w funkcji szybkości produkcji fluorescencji (patrz Rysunek 3). Zidentyfikuj zakres liniowy w późniejszych punktach czasowych. Wyklucz wczesne punkty czasowe, aż do uzyskania regresji liniowej z najwyższym R2, w oparciu o minimum 12 punktów (około 3 h).
    UWAGA: Nachylenie tej regresji liniowej reprezentuje frakcję ekspresji, tj. proporcję całkowitej syntezy białek przeznaczoną na białko reporterowe21.
  7. Dla wszystkich kultur wyodrębnij trendy liniowe z mniej więcej tego samego przedziału czasowego i zapisz wartość nachylenia dla każdego warunku.
    UWAGA: Uzyskanie najwyższej możliwej wartości R2 dla wszystkich kultur przy użyciu tego samego przedziału czasowego może wymagać wielokrotnych prób. Do automatycznej analizy dostępny jest następujący Notatnik Jupyter (środowisko Google Colab) pod adresem https://github.com/frank-britto/Mer_RFP. Notatnik ten służy jako szablon do optymalizacji wyodrębniania trendów liniowych i dalszego profilowania odpowiedzi na dawkę.
  8. Oblicz średnie nachylenie z powtórzeń dla każdego stężenia rtęci.
  9. Nanieś uśrednione wartości nachylenia w funkcji stężenia rtęci (patrz Rysunek 4A). Dopasuj do danych funkcję Hilla:
    Równanie przedstawiające powinowactwo wiązania Hg2+ w kinetyce chemicznej.
    Gdzie: fRFP jest frakcją ekspresji dla czerwonego białka fluorescencyjnego (Red Fluorescent Protein), H reprezentuje maksymalną możliwą ekspresję dla obwodu, [Hg2+] jest stężeniem rtęci jonowej, kHg wiąże się z powinowactwem do rtęci jonowej, a n jest współczynnikiem Hilla wyrażającym kooperatywność odpowiedzi na Hg2+.

6. Eksperyment miareczkowy z wykorzystaniem biosensora Mer-Blue

  1. Odwiruj gęstą kulturę z nocnej inkubacji, otrzymaną zgodnie z opisem w kroku 3, z prędkością 3,500 × g przez 10 min.
  2. Odlej zużyte pożywkę M9 i resuspenduj osad bakteryjny w świeżej pożywce M9 do wartości OD600 wynoszącej 1,0. Upewnij się, że uzyskano co najmniej 5 mL kultury o tej gęstości (Rysunek 1C).
    UWAGA: W przypadku braku spektrofotometru można przybliżyć warunki początkowe, resuspendując osad bakteryjny w objętości świeżej pożywki M9 równej dwukrotności pierwotnej objętości gęstej kultury.
  3. Do sterylizowanych szklanych probówek do hodowli dodaj 9,5 mL pożywki M9 oraz 10 µL roztworu zapasu ampicyliny o stężeniu 100 mg/mL (Rysunek 1H).
  4. Zaszczep uzupełnioną pożywkę M9 za pomocą 500 µL kultury biosensora przygotowanej w kroku 6.2 (OD600 = 1,0).
  5. Dodaj 10 µL przygotowanych roztworów jonowej rtęci (patrz krok 1), aby osiągnąć stężenia końcowe 0 nM, 1 nM, 2 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 125 nM i 250 nM.
  6. Inkubuj kultury w temperaturze 37 °C przez 16 h przy intensywnym wytrząsaniu z prędkością 220 rpm (Rysunek 1I).

7. Pozyskiwanie i analiza danych dla wyników Mer-Blue

  1. Przenieś około 1,3 ml każdej kultury do probówki typu microtube o pojemności 1,5 ml (Rycina 1J).
  2. Wirować mikroprobówki z maksymalną prędkością przez 3 min, aby uzyskać zwarty osad. Odpić nadsącz.
  3. (Opcjonalnie) Aby uzyskać większe osady, należy powtórzyć wirowanie i usuwanie nadsączu do sześciu razy.
  4. Wykonaj zdjęcie dna każdej mikroprobówki, koncentrując się na osadzie (Rycina 1K). Należy użyć uchwytu do mikroprobówek i statywu lub urządzenia PelletCam (patrz krok 8), aby zapewnić spójną i powtarzalną orientację, oświetlenie oraz ustawienia kolorów dla wszystkich obrazów (patrz Rycina 5).
  5. Wyznacz wartości intensywności kolorów dla każdego obrazu osadu w kanałach czerwonym, zielonym i niebieskim (RGB).
    1. W przypadku korzystania z programu ImageJ: wczytaj obraz, a następnie przejdź do Obraz > Typ > Stos RGB aby utworzyć stos trzech warstw (kanały czerwony, zielony i niebieski). Użyj narzędzia zaznaczania, aby wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI) wokół obszaru osadu. Przejdź do Analizuj > Pomiar aby uzyskać średnie wartości intensywności dla wybranego obszaru w każdym kanale.
    2. W przypadku korzystania z PelletCam: otwórz plik .csv zawierający średnie wartości intensywności koloru dla reprezentatywnego obszaru dziewięciu pikseli obrazu granulatu.
  6. Oblicz odpowiedź biosensora dla każdej próbki, wyznaczając odległość euklidesową w przestrzeni RGB względem obrazu białej pastylki referencyjnej (nietransformowanego) E. coli), jak opisano wcześniej22korzystując z równania:
    Wzór na różnicę kolorów, obliczanie ΔE, równanie, ΔE=sqrt((Rₛ-Rᵣ)²+(Gₛ-Gᵣ)²+(Bₛ-Bᵣ)²).
    Tutaj, Rpróbka, Gpróbkaoraz Bpróbka reprezentują średnie intensywności kolorów z każdego kanału RGB w wybranym obszarze obrazu osadu z próbki biosensora, podczas gdy Rref, Grefi Bref. oznacz odpowiednie wartości dla pelletu referencyjnego z komórek nietransformowanych *E. coli*.
  7. Nanieś wykresem obliczone odległości euklidesowe w funkcji odpowiadających im stężeń jonowej rtęci (patrz Rycina 6). Dopasuj funkcję Hilla do danych (patrz Rycina 4B) korzystając z następującego równania:
    Równanie przedstawiające stężenie jonów rtęci w równowadze chemicznej.
    Tutaj E oznacza odległość euklidesową, H reprezentuje maksymalne możliwe zabarwienie dla obwodu, [Hg2+] to stężenie jonowej rtęci, kHg odnosi się do powinowactwa do jonowej rtęci, a n jest współczynnikiem Hilla, który wyraża kooperatywność odpowiedzi na Hg2+.

8. Budowa PelletCam

  1. Pobierz z witryny (https://github.com/EhbAIGit/PelletCam-OPENBIOLAB-AI) pliki niezbędne do budowy zamkniętego systemu mikrokontrolera do pomiaru koloru osadów bakteryjnych.
    UWAGA: Przydatna będzie podstawowa wiedza na temat cięcia laserowego, druku 3D, ESP32 oraz Arduino. Wstępny przewodnik po ESP32-CAM jest dostępny pod adresem (https://lastminuteengineers.com/getting-started-with-esp32-cam/?utm_content=cmp-true). Zaleca się zakup modułu ESP32-CAM wraz z adapterem MB w celu ułatwienia programowania. Użytkownikom nieznającym ESP32 zaleca się najpierw zapoznanie z samouczkiem pod adresem https://lastminuteengineers.com/esp32-arduino-ide-tutorial/.
  2. Użyj LasercutterBox.ai plik do wycinania i grawerowania 3 mm pleksi za pomocą wycinarki laserowej.
  3. Buduj części z pliku ESP32SET.stl plik za pomocą drukarki 3D. To .stl Plik ten może być importowany bezpośrednio przez niemal każde oprogramowanie do druku 3D; na przykład Bambu Studio (https://bambulab.com/en/download/studio).
  4. Zainstaluj moduł ESP32 (moduł kamery WiFi Bluetooth ESP32-CAM-MB 2640), umieszczając .cpp i .h i .ino pliki w jednym folderze. Następnie otwórz .ino plik z oprogramowaniem Arduino IDE i kliknij w >PrześlijPo przesłaniu programu moduł ESP32 uruchomi się automatycznie.
  5. W tym momencie użytkownik powinien mieć możliwość połączenia się z punktem dostępu WiFi o nazwie >OSAD i hasło >PELLETCAM, zgodnie z określonym w .ino pliku ESP32. Adres IP urządzenia PelletCam zostanie wyświetlony w monitorze szeregowym środowiska Arduino IDE. Otwórz przeglądarkę internetową i przejdź pod adres: http://192.168.4.1.
    UWAGA: Pozwoli to na wyświetlenie obrazu lub wykonanie nowego zdjęcia (>ZRÓB ZDJĘCIE), obróć obraz (>OBRACAĆ), lub ustawić jasność taśmy LED (>Diody LED).
  6. Podłącz ESP32 Arduino do paska LED (NeoPixel Stick – 8 x 5050 RGB LED ze zintegrowanymi sterownikami) oraz do kabla USB 5V zgodnie ze schematem w pliku Podręcznik instalacji.pptx.
  7. Użyj pistoletu z klejem na gorąco, aby przykleić moduł ESP32 oraz pasek LED do wydrukowanych w technologii 3D wsporników.
  8. Wstaw mikroprobówkę z kolorowym dnem (lub pelletem bakteryjnym) do wydrukowanego w 3D frontu urządzenia PelletCam. Umieść wspornik ESP32-LED-support w odległości około 5 cm dalej i wykonaj zdjęcie. poprzez stronę internetową. Jeśli uzyskano ostry i odpowiednio oświetlony obraz, należy przykleić wspornik ESP32-LED do spodu drewnianego pudełka. W przeciwnym razie należy dostosować odległość między przednim panelem a wspornikiem ESP32-LED i powtórzyć procedurę do momentu uzyskania satysfakcjonującej odległości.
  9. Złożyć pudełko, używając taśmy malarskiej i sklejając wszystkie części klejem do drewna.
  10. Podłącz urządzenie PelletCam za pomocą kabla USB do zasilacza USB, który może dostarczyć prąd o natężeniu co najmniej 1 A.
    UWAGA: Należy upewnić się, że zainstalowano język Python w wersji 3.9 lub nowszej.
  11. Otwórz wiersz poleceń lub okno terminala. Przejdź do katalogu zawierającego pellet.py plik. Uruchom skrypt za pomocą polecenia >python pellet.py.
  12. Jeśli pellet.py skrypt nie może zostać uruchomiony, co może wynikać z braku bibliotek języka Python. Zainstaluj wymagane biblioteki za pomocą polecenia >pip install pillow tkinter pathlib statisticsW celu uzyskania dodatkowych wskazówek dotyczących konfiguracji własnego systemu należy zapoznać się z dokumentem Przykład PelletCam.docx.

9. Pomiar próbek wody środowiskowej

  1. Pobrać próbki z obiektów środowiskowych, takich jak rzeki lub stawy, i przechowywać je w szczelnych pojemnikach w niskich temperaturach, aby zminimalizować parowanie. Szczegóły znajdują się w sekcji Dyskusja.
  2. Odwirować próbki przy 3,500 × g przez 10 min w celu osadzenia piasku i zanieczyszczeń organicznych oraz wyizolowania frakcji wodnej.
  3. Zsterylizować oczyszzczoną próbkę, używając filtra strzykawkowego 0,22 µm.
    UWAGA: Należy unikać sterylizacji termicznej, ponieważ rtęć jest lotna i może odparować podczas tego procesu.
  4. (Opcjonalnie) Przygotować oddzielną zakwaszoną alikwot dodając 5% HCl do niezależnego pomiaru z wykorzystaniem standardowych technik chemii analitycznej. Do analiz biosensorowych używać wyłącznie próbki niezakwaszonej.
  5. Wymieszać 5 mL sterylnie przefiltrowanej próbki środowiskowej z 4,5 mL pożywki 2× M9, co daje rozcieńczenie próbki 1:2.
  6. Zaszczepić rozcieńczoną mieszaninę próbki i pożywki 0,5 mL hodowli nocnej (przygotowanej zgodnie z opisem w kroku 5.4). Inokulacja ta odpowiada 20-krotnemu rozcieńczeniu hodowli, co daje wartość OD600 od 0,05 w celu rozpoczęcia analizy.
    1. W przypadku użycia Mer-RFP: Przenieść 200 µL mieszaniny próbki i pożywki do studzienki mikropłytki i rozpocząć pomiary za pomocą czytnika mikropłytek, zgodnie z opisem w kroku 3.6.
    2. W przypadku użycia Mer-Blue: Inkubować 10 mL mieszaniny próbki i pożywki w temperaturze 37 °C przez 16 h przy intensywnym wytrząsaniu z prędkością 220 rpm, zgodnie z opisem w kroku 5.6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oba biosensory nie wykazują wykrywalnej ekspresji podstawowej dla swoich odpowiednich białek reporterowych w warunkach bez obecności rtęci. Kultury Mer-Blue zazwyczaj zaczynają wykazywać widoczne gołym okiem zabarwienie między 6 a 8 h po inokulacji przy stężeniach HgBr2 wynoszących 25 nM i więcej. Prawidłowo przeprowadzone doświadczenia miareczkowania z użyciem Mer-RFP lub Mer-Blue dają odpowiedzi dopasowane do funkcji Hilla z współczynnikiem Hilla bliskim 1, co wskazuje na brak kooperatywności wiązania

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wykorzystane tutaj obwody biosensorów są identyczne, różnią się jedynie białkiem raportującym. Oba są w całości zakodowane na plazmidach o wysokiej liczbie kopii, co umożliwia ich zastosowanie w komórkach Escherichia coli różnych szczepów. Choć są one funkcjonalne w komórkach szczepu B E. coli, silniejszy sygnał barwny z Mer-Blue zaobserwowano w szczepach K-12, konkretnie w DH5α oraz w chemicznie kompetentnych komórkach E. coli15.

Zaobserwowal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

To badanie jest prezentowane dzięki wsparciu Programa Nacional de Investigación Científica y Estudios Avanzados PROCIENCIA poprzez program EF-041-2024-01 "Proyectos de Investigación aplicada", umowa o grant PE501086520-2024-PROCIENCIA. Opracowanie bioczujników rtęci zostało sfinansowane przez VLIR-UOS za pośrednictwem grantu Inicjatywy Południowej o kodzie PE2020SIN292B122. Dr n. med. dziękuje VLIRUOS, DGD i Radzie Flamandzkich Uniwersytetów Nauk Stosowanych i Sztuki za grant XREI w ramach projektu Global Minds BE2017GMHVLHC106.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Multiplex wood o grubości 3 mmWiele dystrybutorów
USB 5 VWielu dystrybutorów
96-dołkowy przezroczysty polistyren z płaskim dnem Mikropłytki z powłoką TCCorning3599
Proszek agarowyHiMediaGRM026
AmpicillinGold Biotechnology, Inc.A-301-100
CaCl2Millipore208290
Casamino AcidsCalbiochem2040OP
D-(+)-GlucoseCentral Drug House (P) Ltd.506250
ESP32-CAM-MB 2640 Moduł kamery Bluetooth WiFi Płytka rozwojowa USB do portu szeregowego Automatyczne pobieranie (typ C)Wielu dystrybutorów
Szklane probówki hodowlaneCorning9825
HgBr2, bromek rtęci(II)Merck200085
HgCl2, chlorek rtęci(II)Merck21465
Rosół Luria (Miller)Sigma-AldrichL3522
M9 sole minimalneSigma-AldrichM6030
MgSO4HiMediaGRM684
NeoPixel Stick - 8 x 5050 LED RGB ze zintegrowanymi sterownikamiAdafruit1426
Plazmid: pUC-Mer-Blue Nasza grupa-Pełnasekwencja dostępna w
https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1 Plasmid: pUC-Mer-RFP Nasza grupa-Pełnasekwencja dostępna w https://www.mdpi.com/article/10.3390/bios14050246/s1
Filtry strzykawkowe, hydrofilowe, wielkość porów 0,22 mikronaMiliporeSLGV004SLDo sterylizacji próbek środowiskowych.

Bibliografia

  1. Cooke, C. A., Balcom, P. H., Biester, H., Wolfe, A. P. Over three millennia of mercury pollution in the Peruvian Andes. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (22), 8830-8834 (2009).
  2. Gautam, R. K., Sharma, S. K., Mahiya, S., Chattopadhyaya, M. C. Contamination of heavy metals in aquatic media: transport, toxicity and technologies for remediation. Heavy Metals in Water: Presence, Removal and Safety. Sharma, S. K. , Royal Society of Chemistry. Cambridge. 1-24 (2014).
  3. Chen, C. Y., et al. A critical time for mercury science to inform global policy. Environ Sci Technol. 52 (17), 9556-9561 (2018).
  4. Ali, H., Khan, E., Ilahi, I. Environmental chemistry and ecotoxicology of hazardous heavy metals: environmental persistence, toxicity, and bioaccumulation. J Chem. 2019, 6730305(2019).
  5. Gao, Y., et al. Determination and speciation of mercury in environmental and biological samples by analytical atomic spectrometry. Microchem J. 103, 1-14 (2012).
  6. Ralston, D. M., O'Halloran, T. V. Ultrasensitivity and heavy-metal selectivity of the allosterically modulated MerR transcription complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (10), 3846-3850 (1990).
  7. Brown, N. L., Stoyanov, J. V., Kidd, S. P., Hobman, J. L. The MerR family of transcriptional regulators. FEMS Microbiol Rev. 27 (2-3), 145-163 (2003).
  8. Wang, D., et al. Structural analysis of the Hg(II)-regulatory protein Tn501 MerR from Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 6, 33391(2016).
  9. Nucifora, G., Chu, L., Silver, S., Misra, T. K. Mercury operon regulation by the merR gene of the organomercurial resistance system of plasmid pDU1358. J Bacteriol. 171 (8), 4241-4247 (1989).
  10. Cai, S., et al. Engineering highly sensitive whole-cell mercury biosensors based on positive feedback loops from quorum-sensing systems. Analyst. 143 (3), 630-634 (2018).
  11. Guo, M., et al. Using the promoters of MerR family proteins as "rheostats" to engineer whole-cell heavy metal biosensors with adjustable sensitivity. J Biol Eng. 13, 70(2019).
  12. Wang, D., et al. Engineered cells for selective detection and remediation of Hg2+ based on transcription factor MerR regulated cell surface displayed systems. Biochem Eng J. 150, 107289(2019).
  13. Wang, D., et al. Visual detection of Hg2+ by manipulation of pyocyanin biosynthesis through the Hg2+-dependent transcriptional activator MerR in microbial cells. J Biosci Bioeng. 129 (2), 223-228 (2020).
  14. Guo, Y., Hui, C., Liu, L., Chen, M., Huang, H. Development of a bioavailable Hg(II) sensing system based on MerR-regulated visual pigment biosynthesis. Sci Rep. 11, 13516(2021).
  15. Zevallos-Aliaga, D., et al. Highly sensitive whole-cell mercury biosensors for environmental monitoring. Biosensors. 14 (1), 246(2024).
  16. Zhang, N. -X., et al. Versatile artificial mer operons in Escherichia coli towards whole-cell biosensing and adsorption of mercury. PLoS One. 16 (5), e0252190(2021).
  17. Chen, Y., et al. Advances in bacterial whole-cell biosensors for the detection of bioavailable mercury: a review. Sci Total Environ. 868, 161709(2023).
  18. Chen, S., Chen, X., Su, H., Guo, M., Liu, H. Advances in synthetic-biology-based whole-cell biosensors: principles, genetic modules, and applications in food safety. Int J Mol Sci. 24 (7), 7989(2023).
  19. Yu, W., et al. Genetically encoded biosensors for microbial synthetic biology: From conceptual frameworks to practical applications. Biotechnol Adv. 62, 108077(2023).
  20. Zhang, L., Guo, W., Lu, Y. Advances in cell-free biosensors: principle, mechanism, and applications. Biotechnol J. 15 (6), 2000187(2020).
  21. Vaccari, N. A., Zevallos-Aliaga, D., Peeters, T., Guerra, D. G. Biosensors characterisation: Formal methods from the perspective of proteome fractions. Synth Biol. 10 (1), ysaf002(2025).
  22. Liljeruhm, J., et al. Engineering a palette of eukaryotic chromoproteins for bacterial synthetic biology. J Biol Eng. 12, 8(2018).
  23. Alon, U. An Introduction to Systems Biology. , Chapman and Hall/CRC. Boca Raton. (2019).
  24. Lineweaver, H., Burk, D. The determination of enzyme dissociation constants. J Am Chem Soc. 56 (3), 658-666 (1934).
  25. Wyatt, L., et al. Spatial, temporal, and dietary variables associated with elevated mercury exposure in Peruvian riverine communities upstream and downstream of artisanal and small-scale gold mining. Int J Environ Res Public Health. 14 (12), 1582(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie rt ci jonowejAnaliza pr bek wodyMonitoring rodowiskaKalibracja czujnik wPrzygotowanie kultur mikrobiologicznychPomiar zale no ci dawka odpowiedKolorymetryczny biosensorFluorometryczny biosensorMonitoring zanieczyszcze
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.