Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68284

⸱

1 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral & Maxillofacial Surgery, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Endodontics, School of Dentistry, University of Alabama at Birmingham, 3Division of Life Sciences, College of Life Sciences and Bioengineering, Incheon National University, 4Programs in Integrated Biomedical Sciences, Translational Sciences, Biomedical Engineering, Radiological Sciences, University of Texas Health Science Center at San Antonio

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

Streszczenie

Obrazowanie wapnia jest ważnym narzędziem do monitorowania mechanizmów sygnalizacyjnych, które albo napływająCa2+ do cytozolu, albo uwalniają Ca2+ z wewnątrzkomórkowych zapasów Ca2+ . Zastosowanie myszy Pirt-GCaMP3, które mają czujnik Ca2 + GCaMP3 wstawiony poniżej regionu promotora Pirt i ulegający ekspresji w prawie wszystkich (>95%) pierwotnych neuronach czuciowych, pozwala na jednoczesne monitorowanie aktywności >3 000 neuronów poprzez obrazowanie Ca2 + pierwotnych neuronów czuciowych zwoju nerwu trójdzielnego (TG). Dzięki temu badacze mogą badać reakcje sieci neuronowych na szkodliwe bodźce oraz reakcje somatosensoryczne i hormonalne in vivo, które w przeciwnym razie byłyby bardzo trudne do wykrycia innymi metodami.

W szczególności możliwość monitorowania obszaru TG unerwiającego twarz i innych obszarów głowy oddzielnie pozwala na monitorowanie pierwotnych neuronów czuciowych aktywowanych przez bodźce obszaru twarzy przed późniejszymi warstwami przetwarzania neuronów. Można również zaobserwować liczbę neuronów generujących stany przejściowe Ca2+ i amplitudę stanów przejściowych Ca2+ , które wskazują na ich wrażliwość na różne modalności sensoryczne. Dodatkowo badacze mogą mierzyć średnicę neuronów, co jest wskaźnikiem rodzaju aktywowanego włókna (nieszkodliwe włókna mechaniczne kontra szkodliwe włókna nocyceptywne, włókna Aβ, Aδ i C). Dlatego obrazowanie wapnia TG metodą Pirt-GCaMP3 byłoby potężnym narzędziem do analizy określonych modalności sensorycznych i typów komórek neuronalnych w celu zbadania bólu pochodzenia trójdzielnego (ustno-twarzowego i czaszkowego, bólu zębów i/lub zębów, bólu głowy, migreny, bólu stawu skroniowo-żuchwowego, neuralgii nerwu trójdzielnego), swędzenia i dotyku oraz wszelkich innych somatosensacji, a także odpowiedzi hormonalnych.

Wprowadzenie

Pierwotne neurony czuciowe bezpośrednio unerwiają tkanki, w tym skórę, i przekazują sygnały czuciowe do ośrodkowego układu nerwowego (rdzenia kręgowego lub pnia mózgu). Neurony zwoju nerwu trójdzielnego (TG) unerwiają głowę i reagują na bodźce czuciowe, w tym ból zębów, okolice okołooczodołowe, ustno-twarzowe i twarzoczaszkowe, staw skroniowo-żuchwowy 1,2 i opony mózgowo-rdzeniowe 3,4,5. Neurony TG różnią się wielkością, poziomem mielinizacji i profilami ekspresji genów 6,7,8,9. Mniejsze neurony są nocyceptywne, podczas gdy większe neurony na ogół reagują na niebolesne bodźce mechaniczne10,11. Dysfunkcja neuronów zwojowych nerwu trójdzielnego może uwrażliwiać zarówno same neurony, jak i neurony czuciowe ośrodkowego układu nerwowego (OUN)11,12.

W normalnym kontekście fizjologicznym w warunkach niepatologicznych, neurony odpalające się in vivo są niezbędne do odczuwania bólu, ale do ostatnich dwóch dekad narzędzia do badania nienaruszonych zwojów czuciowych in vivo ograniczały się do monitorowania stosunkowo niewielu neuronów jednocześnie. Ze względu na normalnie niskie stężenia wapnia w cytoplazmie, napływ wapnia podczas potencjałów czynnościowych i wykorzystanie wapnia jako sygnału cytoplazmatycznego, dynamika wapnia jest potężnym substytutem monitorowania potencjałów czynnościowych lub aktywności komórkowej in vivo przy użyciu wrażliwych na wapń wskaźników fluorescencyjnych. Uzasadnieniem tej metody jest to, że mikroskopia fluorescencyjna może jednocześnie monitorować te wskaźniki w setkach do tysięcy neuronów jednocześnie w obwodowych zwojach czuciowych myszy 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24 i szczury 25,26. Jest to potężna przewaga nad metodami, które mogą monitorować bardziej ograniczoną liczbę neuronów in vivo.

Celem tej metody jest bezpośrednia obserwacja cytoplazmatycznej dynamikiCa2+ in vivo w TG w odpowiedzi na bodźce mechaniczne, temperaturowe, chemiczne i hormonalne w modelach bólu głowy 19,23,24. Metoda ta może być stosowana jako uzupełnienie badań bólowych lub innych badań somatosensorycznych w okolicy ustno-twarzowej. Obrazowanie Ca2+ in vivo trójdzielne zostało wykorzystane do scharakteryzowania kodowania termicznego i sensorycznego19,22, zbadania klas mechanoreceptorów27, odkrycia nowej klasy neuronów mechanowrażliwych28, monitorowania odpowiedzi nerwu trójdzielnego na normalne naprężenia mechaniczne na oponach mózgowych29, badania wpływu hormonów na wrażliwość na ból24, scharakteryzowania modeli bólu ustno-twarzowego30oraz badania przyczyniające się do bólu wywołanego odstawieniem alkoholu23.

Myszy Pirt-GCaMP3 umożliwiają monitorowanie aktywności neuronalnej in vivo, ponieważ mają czujnik Ca2 + GCaMP3 wstawiony do regionu promotorowego genu Pirt, który ulega silnej ekspresji we wszystkich (>95%) pierwotnych neuronach czuciowych12,18. W artykule przedstawiono technikę wykonywania chirurgicznej ekspozycji na TG in vivo oraz gromadzenie i analizę danych z mikroskopii wskaźnikowej wapnia dla prawej strony TG myszy Pirt-GCaMP3 przy użyciu konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w niniejszym dokumencie są wykonywane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania. Operacja nie daje szans na przeżycie. Sekcje 1 i 2 tej procedury należy wykonać natychmiast po jej rozpoczęciu. Sekcja 3 może zostać wykonana w późniejszym terminie.

1. Zabezpieczenie i operacja myszy do obrazowania TG po prawej stronie

UWAGA: Myszy Pirt-GCaMP3 C57BL/6J18 muszą mieć dorosły rozmiar ciała (zwykle 8 tygodni lub więcej), niezależnie od płci. Możliwe jest obustronne obrazowanie TG. Podane tutaj czasy są szacunkowe przez doświadczonego technika. Jeśli krwawienie jest większe niż normalnie, może trwać kilka minut dłużej za każdym razem.

  1. Przygotować sterylny roztwór soli fizjologicznej z 40 mg/ml ketaminy i 6 mg/ml ksylazyny. Przygotuj wystarczającą objętość do operacji i eutanazji po obrazowaniu (minimum 9 μl na gram masy ciała myszy).
    UWAGA: Podczas obrazowania in vivo stosuje się wiele rodzajów znieczulenia. Uwaga: Ketamina jest szkodliwa w przypadku wstrzyknięcia, połknięcia lub kontaktu z oczami. Obchodź się ostrożnie.
  2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w sterylizatorze koralików. Umyj narzędzia 70% etanolem.
    UWAGA: Alternatywnie, należy wcześniej autoklawować instrumenty.
  3. Wstrzyknąć 2,25 μl ketaminy/ksylazyny na gram masy ciała (odpowiednio 90 mg/kg i 13,5 mg/kg ketaminy i ksylazyny) i.p. myszom Pirt-GCaMP3 15-25 minut przed zabiegiem. Nie przekraczać dawki 120 mg/kg ketaminy.
  4. Po 15-25 minutach wstrzyknięcia środka znieczulającego (krok 1.3) uszczypnij tylną łapę kleszczami, aby upewnić się, że mysz znajduje się na płaszczyźnie znieczulenia chirurgicznego.
    UWAGA: Szczypanie powinno być wystarczająco intensywne, aby wywołać wokalizację u przytomnej myszy, ale nie na tyle intensywne, aby spowodować obrażenia. Ważne jest, aby nie zostawiać myszy na tym etapie dłużej niż to konieczne, aby uniknąć spadku temperatury ciała. Utrzymywanie klatki w cieple jest pomocne, jeśli to możliwe.
  5. Umieść mysz na poduszce grzewczej, aby upewnić się, że temperatura ciała jest utrzymywana na poziomie 37 °C i umieść głowę myszy w masce stereotaktycznej (Rysunek 1A,B), z głową pochyloną około 15° w lewo (Rysunek 1B).
    UWAGA: Maska stereotaktyczna, która zarówno stabilizuje głowę, jak i zapewnia drogę do podania izofluranu, jest opisana tutaj. Jeśli w zabiegu nie stosuje się izofluranu lub nie stosuje się maski stereotaktycznej, należy zastosować inną metodę stabilizacji głowy, aby zapobiec ruchomości.
  6. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu i podrażnieniu, ponieważ podrażnienie wywołuje aktywność nerwu trójdzielnego.
  7. Ogol prawą stronę głowy myszy.
    UWAGA: Ten krok trwa 90 sekund. Badacz może na krótko usunąć zwierzę z poduszki grzewczej w celu ogolenia.
  8. Wykonaj prostokątne nacięcie o wymiarach 9 mm x 5 mm między prawym uchem a prawym okiem (ryc. 2A). Zatamuj krwawienie za pomocą wacika hemostatycznego lub chusteczki laboratoryjnej.
    UWAGA: Ten krok trwa 2 minuty. Badacz może użyć kleszczy hemostatycznych lub retraktora, aby utrzymać nacięcie otwarte. Jest to procedura nieprzeżyciowa, co oznacza, że dodatkowe czyszczenie nie jest konieczne. Badacz może jednak pobrać wymaz z miejsca operowanego z jodowidonem. Podany jest największy dopuszczalny rozmiar nacięcia. Jeśli chirurg jest wystarczająco wykwalifikowany, mniejsze nacięcie jest lepsze niż większe nacięcie, aby zminimalizować uszkodzenie tkanki. TG unerwia tę tkankę i może zostać uszkodzony.
  9. Przeciąć tkankę (okostną) na powierzchni czaszki tuż brzusznie do oka (ryc. 2B).
  10. Za pomocą wiertła dentystycznego i szczeliny stożkowej TNT BUR 31p wywierć otwór o wymiarach około 9 mm x 5 mm w czaszce grzbietowej wyśrodkowany w miejscu nacięcia (ryc. 2C). Przyłóż wiertło tak lekko, jak to możliwe do powierzchni czaszki.
    UWAGA: Ten krok zajmuje około 2 minut. Jeśli chirurg jest wystarczająco wykwalifikowany, mniejszy otwór jest lepszy niż większy.
  11. Przechyl głowę, aż TG będzie wyraźnie widoczny (Rysunek 2C). Jeśli występuje krwawienie do TG, odessać krew lub usunąć krew, odprowadzając wilgoć za pomocą wacika hemostatycznego lub chusteczki laboratoryjnej. Upewnij się, że TG jest wyraźnie widoczny bez usuwania tkanki korowej (ryc. 2C).
    UWAGA: Rutynowo obrazujemy TG przez 3-6 godzin lub dłużej bez oznak niepokoju w neuronach, ale badacz może zdecydować się na umieszczenie szkiełka nakrywkowego lub innego pokrycia, aby zapobiec wysychaniu TG.
  12. Przenieś zwierzę i poduszkę grzewczą do stolika mikroskopowego i umieść nos myszy w stereotaktycznym stożku nosowym. Podłącz przewody tlenu/izofluranu tak, aby mysz otrzymywała ciągłe znieczulenie izofluranem (ryc. 3A).
    UWAGA: Ten krok trwa 3 minuty. Ciągły izofluran wymaga butli z tlenem, rurek doprowadzających gaz i parownika anestezjologicznego. Możliwe jest również utrzymanie znieczulenia przez cały czas trwania zabiegu poprzez okresowe iniekcje środka znieczulającego.
  13. Ustawić ramę stereotaktyczną tak, aby obiektyw mikroskopu znajdował się 9 mm bezpośrednio nad otworem czaszki (ryc. 3B).
    UWAGA: Dokładna odległość zależy od obiektywu, mikroskopu i myszy.
  14. Włóż termometr doodbytniczy. Podłącz przewód zasilający do termometru doodbytniczego i poduszki grzewczej. Połączyć maskę anestezjologiczną z izofluranem w przewodzie tlenowym z 1% izofluranem.

2. Obrazowanie TG

UWAGA: Użyj ustawienia zielonego (FITC) 495 nm, emisja 519 nm, długość fali detekcji 500-580 nm, urządzenie do obrazowania GaAsP-Pmt1, detektor GaAsP-PMT lub użyj zalecanych ustawień dla mikroskopu. Tabela 1 zawiera podsumowanie ustawień oprogramowania.

  1. Użyj obiektywu 5x/0,25 M27, oprogramowania producenta mikroskopu i pionowego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego. Zlokalizuj powierzchnię TG za pomocą mikroskopu.
    UWAGA: Wybór obiektywu zależy od mikroskopu i preferencji badacza.
  2. Wyreguluj obiektyw i stożek nosowy tak, aby powierzchnia TG była jak najbardziej płaska i miała jak największą powierzchnię w płaszczyźnie ogniskowej.
    UWAGA: Bardziej płaska TG zapewnia ostrzejszy obraz, powoduje, że oprogramowanie komponuje ostrzejsze filmy, obrazuje więcej neuronów oraz upraszcza i poprawia dokładność analizy w porównaniu z bardziej nachylonym TG.
  3. Utrzymuj mysz w znieczuleniu, aplikując 1-1,5% izofluranu na przepływ tlenu przez maskę anestezjologiczną.
    UWAGA: Zwierzę musi być ściśle monitorowane przez cały czas trwania zabiegu, szczypiąc tylną łapę co 20-30 minut, aby upewnić się, że zwierzę pozostaje pod narkozą. Procentowa zawartość izofluranu wymagana do utrzymania znieczulenia zależy od konkretnej myszy. Jeżeli zwierzę porusza się podczas próbnego uszczypnięcia, należy zwiększyć stężenie izofluranu. Jeśli oddech staje się płytki, izofluran musi być zmniejszony. UWAGA: Izofluran jest szkodliwy w przypadku wdychania i może powodować zawroty głowy lub senność. Unikaj wdychania i upewnij się, że miejsce pracy ma odpowiednią wentylację.
  4. Załaduj protokół szybkiego skanowania mikroskopu: rozmiar woksela 4,160 μm x 4,160 μm x 14 μm, 512 x 512 pikseli, 10 warstw optycznych Z-stack, 1,02 jednostki przewiewne (AU)/33 μm, 15% moc lasera 488 nm/75 mW, czas piksela 1,52 μs, czas linii 0,91 ms, czas klatki 465 ms, prędkość skanowania LSM 8, skanowanie dwukierunkowe, wzmocnienie detektora GaAsP-PMT 550 V, wzmocnienie cyfrowe 1.
    UWAGA: Optymalne ustawienia mogą się różnić w zależności od mikroskopu i zwierząt.
  5. Skanuj TG w krótkich seriach po 6-8 cykli. Utwórz ortogonalne rzuty skanów (jeden skan tworzy jedną klatkę filmu), aby utworzyć film i sprawdzić klarowność i spójność obrazu między klatkami. W razie potrzeby dostosuj pozycję klatki stereoskopowej i grubość sekcji optycznej, a następnie powtarzaj ten krok, aż powstanie wyraźny, spójny film.
    UWAGA: Ten krok należy powtórzyć, jeśli głowa myszy porusza się lub badacz zmienia położenie myszy lub dostosowuje płaszczyznę ogniskowej.
  6. Załaduj protokół skanowania mikroskopu w wysokiej rozdzielczości: rozmiar woksela 0,520 μm x 0,520 μm x 14 μm, 4096 x 4096 pikseli, 6 warstw optycznych Z-stack, 1,02 jednostki przewiewnej (AU)/33 μm, 20% mocy lasera 488 nm/100 mW, czas piksela 0,52 μs, czas linii 4,95 ms, czas klatki 20,26 s, prędkość skanowania LSM 6, skanowanie dwukierunkowe, wzmocnienie detektora GaAsP-PMT 550 V, wzmocnienie cyfrowe 1.
    UWAGA: Optymalne ustawienia zależą od mikroskopu i zwierzęcia. Jeśli komórki są oznaczone td-Tomato, ustaw mikroskop tak, aby skanował czerwony kanał 592 nm wzbudzenie / emisja 614 nm, długość fali wykrywania 600-700 nm oprócz zielonego kanału.
  7. Utwórz obraz TG w wysokiej rozdzielczości.
    UWAGA: Ten obraz może być przydatny do liczenia neuronów, mierzenia średnicy przyciemnionych neuronów lub dostarczania szczegółowego obrazu w celu odróżnienia, czy ten sam neuron zareagował na dwa różne bodźce, czy odpowiedziały dwa różne neurony.
  8. Załaduj protokół szybkiego skanowania mikroskopu (patrz krok 2.4).
  9. Rejestruj spontaniczną aktywność przez 80 cykli (około 10 minut). Utwórz film z projekcją ortogonalną i sprawdź, czy obrazy są wystarczająco wyraźne i spójne, aby można je było przeanalizować.
    UWAGA: Spowoduje to wygenerowanie wystarczającej liczby klatek, aby przeanalizować spontaniczną aktywność. Liczba ta może być zmniejszana lub zwiększana w zależności od tego, jak ważna jest spontaniczna aktywność w danym eksperymencie.
  10. Aby zastosować stymulację, ustaw mikroskop na skanowanie 15-20 cykli.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas stosowania bodźców, aby nie poruszać głową myszy. Przesunięcie TG nawet o mikrony podczas bodźca może zakłócić obrazowanie. Skanowanie pozwala cyklom ustalić linię bazową, bodziec i obserwować neurony po usunięciu bodźca.
  11. Poczekaj, aż cykle 1-5 zostaną zakończone, aby wygenerować linię bazową. Zastosuj stymulację podczas skanów 6-10. Odczekaj co najmniej 5 minut po każdym bodźcu, aby uniknąć znieczulenia neuronów.
    UWAGA: Każdy bodziec wymaga osobnego skanowania w ciągu 15-20 cykli. Najpierw zastosuj stymulację mechaniczną, a następnie stymulację zimnem, ciepłem i chemiczną. Zastosuj stymulację o niskiej częstotliwości (np. mała siła mechaniczna, temperatura zbliżona do temperatury pokojowej) przed stymulacją o wysokiej częstotliwości (duża siła mechaniczna, temperatura daleka od temperatury pokojowej). Uważaj, aby nie poruszać TG podczas stosowania stymulacji. Jeśli skany są wyraźnie słyszalne, stymulację można zastosować natychmiast po skanowaniu 5. Jednak każda metoda, która zapewnia stały czas stymulacji, będzie działać. Zobacz dyskusję na temat kolejności bodźców.
  12. W przypadku von Freya w obszarze unerwionym przez część V2 TG, przytrzymaj filament i nakładaj go wielokrotnie na obszar ipsilateralny poniżej oka i powyżej ust od bezpośrednio po skanie 5 do bezpośrednio po skanie 10.
  13. W przypadku von Freya w obszarze unerwionym przez część V3 TG, przytrzymaj filament i kilkakrotnie nakładaj na obszar ipsilateralny tuż pod uchem od razu po zakończeniu skanowania 5 do bezpośrednio po zakończeniu skanowania 10.
  14. W przypadku bodźców zimnych i cieplnych ostudź lub podgrzej zlewkę z wodą do temperatury nieco poniżej (w przypadku zimna) lub powyżej (w przypadku ciepła), a następnie rozpocznij skanowanie za pomocą plastikowej pipety transferowej. Zastosuj bodziec za pomocą pipety transferowej natychmiast po skanie 5 do obszaru ipsilateralnego tuż pod okiem, nad ustami (dla V2) lub tuż pod uchem (dla V3).
    UWAGA: Upewnij się, że temperatura mieści się w zakresie 1 °C od żądanej temperatury dla skanowania 5. Aby uniknąć odczulania neuronów, nie stosuj bodźca, jeśli temperatura zlewki nie jest prawidłowa. Zamiast tego ponownie ostudź lub podgrzej wodę i spróbuj ponownie.
  15. Pod koniec eksperymentów wstrzyknij podskórnie 50 mM chlorku potasu w obszary V2 lub V3, zaczynając od cyklu 6, aby aktywować i zidentyfikować wszystkie reagujące neurony.
  16. Po podaniu i zarejestrowaniu wszystkich bodźców, należy poddać zwierzę eutanazji przez przedawkowanie ketaminy/ksylazyny (300 mg na kg ketaminy, 30 mg na kg ksylazyny lub 5 μl na g roztworu przygotowanego w kroku 1.1), a następnie odciąć głowę.

3. Protokół analizy

  1. Otwórz plik rzutowania ortogonalnego, korzystając z opcji przeciągnij i upuść . Wybierz typ obrazu z menu Obraz | Rodzaj | Kolor RGB. Opcjonalnie: Użyj wtyczki StackReg31 w sekcji Wtyczki | słoiki | StackReg do korygowania artefaktów ruchu i wyrównywania.
    UWAGA: Badacz może wybrać typ obrazu w oparciu o preferencje. RGB upraszcza tworzenie kolorowych obrazów do publikacji.
  2. Otwórz Menedżera zwrotu z inwestycji za pomocą opcji Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji.
  3. Wybierz aktywne neurony, rysując ROI za pomocą narzędzia Elipsa lub Prostokąt na pasku narzędzi, a następnie umieść go w pliku ROI, klikając przycisk Dodaj w oknie Menedżera ROI lub naciskając "t".
    UWAGA: Często zapisuj pliki ROI. Zwrot z inwestycji można przywrócić, przeciągając i upuszczając plik ROI do ImageJ i klikając pole Pokaż wszystko u dołu okna Menedżera ROI. Zapisanie pliku .zip ROI upraszcza analizę w porównaniu z zapisywaniem ROI jako nakładki. Neuron, który ulega wahaniom w okresie wyjściowym, powinien być wykluczony jako spontanicznie aktywny, a nie reagujący na bodziec.
  4. W Analiza | Ustawienia pomiaru, zaznacz opcję Średnia wartość szarości (opcjonalnie, ale zalecane: odznacz wszystkie inne pola w sekcji Ustawienia pomiaru).
  5. Korzystanie z okna ROI w obszarze Więcej | Multi-Measure do pomiaru intensywności.
    UWAGA: Czasami sąsiednie neurony są zbyt blisko, aby narysować oddzielny ROI. Neurony te mogą być uwzględnione w liczbie aktywnych neuronów, ale nie mogą być uwzględnione w pomiarach intensywności przejściowej.
  6. Funkcja Multi-Measure generuje plik CSV w nowym oknie o nazwie "Wyniki". Zapisz plik CSV, klikając Plik | Zapisz jako. Otwórz plik .csv za pomocą oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych i zapisz plik jako arkusz kalkulacyjny.
    UWAGA: Zobacz Plik uzupełniający 1 , aby zapoznać się z szablonem analizy.
  7. Oblicz intensywność przejściową Ca2+ jako ΔF/F0 = (Ft- F0)/F0, gdzie Ft to intensywność pikseli w ROI w punkcie zainteresowania, a F0 to intensywność wyjściowa określona przez średnią intensywność 2-4 klatek poprzedzających stan przejściowy Ca2+ dla spontanicznej aktywności lub pierwsze 1-5 klatek dla stanów przejściowych Ca2+ wywołanych bodźcem. Wyklucz wszystkie neurony, które generują piki Ca2+ przed stymulacją i nie analizuj aktywności po stymulacji.
  8. W przypadku analizy intensywności przejściowej Ca2+ losowo pobieraj próbki mniej więcej takiej samej liczby neuronów z każdego zwoju, aby zapobiec zdominowaniu analizy przez zwoje, które generują największą liczbę odpowiadających neuronów. Wykluczyć piki z ΔF/F0 < 0,15.
    UWAGA: Istnieją alternatywne opublikowane metody analizowania oraz uwzględniania i wykluczania neuronów 15,16,19,22,32,33,34,35.
  9. Zmierz średnicę neuronu, obliczając średnią długość linii narysowanej w ImageJ wzdłuż najdłuższej i najkrótszej średnicy za pomocą narzędzia Linia na pasku narzędzi.
    UWAGA: Badacz może również zmierzyć obszar i eliptyczne parametry ROI, aby oszacować średnicę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Obrazowanie dużej liczby neuronów i specyficznych gałęzi nerwu trójdzielnego za pomocą skanowania konfokalnego zwoju trójdzielnego Pirt-GCaMP
Po chirurgicznej ekspozycji na TG u myszy Pirt-GCaMP3, mikroskopia konfokalna umożliwia obrazowanie ponad >3000 neuronów jednocześnie (ryc. 4). Daje to potężną zaletę w postaci jednoczesnej obserwacji tysięcy neuronów TG w ich normalnym kontekście fizjologicznym. Spontaniczne stany przejściowe Ca2+ można monitorować pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zaburzenia bólowe stawu skroniowo-żuchwowego i zapalenie przyzębia wierzchołkowego dotykają odpowiednio około 5%36 i 30-70%37,38 populacji ogólnej. Pierwotne neurony czuciowe wykrywają szkodliwe bodźce w skórze, błonie śluzowej jamy ustnej, zębach i obszarach okołooczodołowych, a ich plastyczność przyczynia się do uporczywego bólu. Hodowle komórkowe i eksplantaty mogą być wykorzystywane do badania neuronów, ale są usuwane z ich normalnego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

Badania te były wspierane przez National Institutes of Health Grants R01NS0128574 i R01DE031477 (dla Y.S.K.) oraz nagrodę Rising STAR Award przyznawaną przez University of Texas (Y.S.K.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Wstrzyknięcie w zniekojeniu (ksylazyna)Covetrus, Akorn33197
Flurar 5x/0.25 M27 obejctiveCal Zeiss420130-9900-000
Aplikatory z bawełnianą końcówkąMcKesson powiedział:24-106-1S
Zakrzywiony hemostatNarzędzia naukowe13007-12
Regulator temperatury DCFHC (Szpital Rolny)40-90-8D
Poduszka grzewcza regulatora temperatury DCFHC (Szpital Rolny)40-90-2-05
Kleszcze Dumont z powłoką ceramicznąNarzędzia naukowe11252-50
Regulator temperatury FHC DCFHC (Szpital Rolny)40-90-8D
Fluriso (Izofluran)MWI Zdrowie Zwierząt, Grupa Piramal501017
Friedmana-Pearsona RongeursaNarzędzia naukowe16221-14
Pianka żelowaPfizer09-0353-01
ObrazJNarodowe Instytuty Zdrowiaij153 powiedział:
Ketaset (ketamina)Urządzenie ZoetisKET-00002R2
Model 923-B Uchwyt na głowę do znieczulenia gazem myszy (mysz dla dorosłych)Instrumenty KopfZobacz materiał 923-B
Luminescencyjna zielona taśma scenicznaJSITON/ AmazonkaB803YW8ZWL
Kompaktowy elektryczny system rękojeści laboratoryjnej M35Buffalo Dental Manufacturing Co., Inc.Zobacz materiał M35
Waporyzator izofluranowy Matrx VIP 3000Znak środkowy91305430
Nożyczki do mikro preparacjiRoboz powiedział:Złącze RS-5882
Nożyczki sprężynowe do mikro preparowaniaNarzędzia naukowe15023-10
Nożyczki sprężynowe do mikro preparowaniaRoboz powiedział:Złącze RS-5677
Mini sonda termistora doodbytniczegoFHC (Szpital Rolny)40-90-5D-02
Nożyczki operacyjneRoboz powiedział:Złącze RS-6812
Myszy Pirt-GCaMP3 C57/BL/6JUniwersytet Johnsa HopkinsaN/AKażda płeć może być równie dobrze zobrazowana. Myszy powinny mieć co najmniej 8 tygodni ze względu na słabą lub przerywaną ekspresję promotora Pirt u młodszych myszy.
Chlorek potasuFisher NaukowyZobacz materiał BP366-500
Ramka stereotaktycznaKopf Typ 923-BZobacz materiał 923-B
Maska sterotaktyczna (aktywna) dla myszy < 30g z tubkamiRWD Nauki Przyrodnicze68663
Wiertło TNT ze szczeliną stożkową (31P)Buffalo Dental Manufacturing Co., Inc.31P-ZŁOTO
Myszy td-Tomato C57BL/6JLaboratorium Jacksona7909
Płyta górna, 6 cali x 10 caliNewportZobacz materiał 290-TP
Pipeta transferowa, 3 mlCole'a ParmeraUX-06226-23
Myszy TrpV1-CRE C57BL/6JLaboratorium Jacksona17769
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 800Cal ZeissZobacz materiał LSM800
Oprogramowanie Zeiss Zen 2.6 Blue EditionCal ZeissZen (Niebieska Edycja) 2.6

Bibliografia

  1. Kuramoto, E., et al. Three-dimensional topography of rat trigeminal ganglion neurons using a combination of retrograde labeling and tissue-clearing techniques. J Comp Neurol. 532 (2), e25584(2024).
  2. Chung, M. K., Wang, S., Oh, S. L., Kim, Y. S. Acute and chronic pain from facial skin and oral mucosa: Unique neurobiology and challenging treatment. Int J Mol Sci. 22 (11), 5810(2021).
  3. Levy, D., Burstein, R., Kainz, V., Jakubowski, M., Strassman, A. M. Mast cell degranulation activates a pain pathway underlying migraine headache. Pain. 130 (1-2), 166-176 (2007).
  4. Moskowitz, M. A., Macfarlane, R. Neurovascular and molecular mechanisms in migraine headaches. Cerebrovasc Brain Metab Rev. 5 (3), 159-177 (1993).
  5. Strassman, A. M., Raymond, S. A., Burstein, R. Sensitization of meningeal sensory neurons and the origin of headaches. Nature. 384 (6609), 560-564 (1996).
  6. Avraham, O., et al. Profiling sensory neuron microenvironment after peripheral and central axon injury reveals key pathways for neural repair. Elife. 10, e68457(2021).
  7. Bhuiyan, S. A., et al. Harmonized cross-species cell atlases of trigeminal and dorsal root ganglia. Sci Adv. 10 (25), eadj9173(2024).
  8. Chu, Y., et al. Single-cell transcriptomic profile of satellite glial cells in trigeminal ganglion. Front Mol Neurosci. 16, 1117065(2023).
  9. Mapps, A. A., et al. Diversity of satellite glia in sympathetic and sensory ganglia. Cell Rep. 38 (5), 110328(2022).
  10. Basbaum, A. I., Woolf, C. J. Pain. Curr Biol. 9 (12), R429-R431 (1999).
  11. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
  12. Kim, Y. S., et al. Central terminal sensitization of trpv1 by descending serotonergic facilitation modulates chronic pain. Neuron. 81 (4), 873-887 (2014).
  13. Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. Calcium imaging for analgesic drug discovery. Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).
  14. Chen, Z., et al. Adjacent intact nociceptive neurons drive the acute outburst of pain following peripheral axotomy. Sci Rep. 9 (1), 7651(2019).
  15. Chisholm, K. I., Khovanov, N., Lopes, D. M., La Russa, F., Mcmahon, S. B. Large scale in vivo recording of sensory neuron activity with GCaMP6. eNeuro. 5 (1), (2018).
  16. Emery, E. C., et al. In vivo characterization of distinct modality-specific subsets of somatosensory neurons using GCaMP. Sci Adv. 2 (11), e1600990(2016).
  17. Ishida, H., et al. In vivo calcium imaging visualizes incision-induced primary afferent sensitization and its amelioration by capsaicin pretreatment. J Neurosci. 41 (41), 8494-8507 (2021).
  18. Kim, Y. S., et al. Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
  19. Leijon, S. C. M., et al. Oral thermosensing by murine trigeminal neurons: Modulation by capsaicin, menthol and mustard oil. J Physiol. 597 (7), 2045-2061 (2019).
  20. Macdonald, D. I., et al. Silent cold-sensing neurons contribute to cold allodynia in neuropathic pain. Brain. 144 (6), 1711-1726 (2021).
  21. Wang, F., et al. Sensory afferents use different coding strategies for heat and cold. Cell Rep. 23 (7), 2001-2013 (2018).
  22. Yarmolinsky, D. A., et al. Coding and plasticity in the mammalian thermosensory system. Neuron. 92 (5), 1079-1092 (2016).
  23. Son, H., et al. Mast-cell-specific receptor mediates alcohol-withdrawal-associated headache in male mice. Neuron. 112 (1), 113-123.e4 (2024).
  24. Son, H., Zhang, Y., Shannonhouse, J., Gomez, R., Kim, Y. S. PACAP38/mast-cell-specific receptor axis mediates repetitive stress-induced headache in mice. J Headache Pain. 25 (1), 87(2024).
  25. Hartung, J. E., Gold, M. S. GCaMP as an indirect measure of electrical activity in rat trigeminal ganglion neurons. Cell Calcium. 89, 102225(2020).
  26. Kucharczyk, M. W., et al. The impact of bone cancer on the peripheral encoding of mechanical pressure stimuli. Pain. 161 (8), 1894-1905 (2020).
  27. Moayedi, Y., et al. The cellular basis of mechanosensation in mammalian tongue. Cell Rep. 42 (2), 112087(2023).
  28. Ghitani, N., et al. Specialized mechanosensory nociceptors mediating rapid responses to hair pull. Neuron. 95 (4), 944-954.e4 (2017).
  29. Blaeser, A. S., et al. Trigeminal afferents sense locomotion-related meningeal deformations. Cell Rep. 41 (7), 111648(2022).
  30. Son, H., et al. Elucidation of neuronal activity in mouse models of temporomandibular joint injury and inflammation by in vivo GCaMP Ca2+ imaging of intact trigeminal ganglion neurons. Pain. 165 (12), 2794-2803 (2024).
  31. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  32. Barretto, R. P., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  33. Sekiguchi, K. J., et al. Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice. Nat Commun. 7, 11450(2016).
  34. Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nat Commun. 6, 8171(2015).
  35. Ran, C., Hoon, M. A., Chen, X. The coding of cutaneous temperature in the spinal cord. Nat Neurosci. 19 (9), 1201-1209 (2016).
  36. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine 2020. Temporomandibular disorders: Priorities for research and care. Yost, O., Liverman, C. T., English, R., Mackey, S., Bond, E. C. , The National Academic Press. Washington, DC. (2020).
  37. Eriksen, H. M. Endodontology--epidemiologic considerations. Endod Dent Traumatol. 7 (5), 189-195 (1991).
  38. Sidaravicius, B., Aleksejuniene, J., Eriksen, H. M. Endodontic treatment and prevalence of apical periodontitis in an adult population of vilnius, lithuania. Endod Dent Traumatol. 15 (5), 210-215 (1999).
  39. Luiz, A. P., et al. Cold sensing by Nav1.8-positive and Nav1.8-negative sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (9), 3811-3816 (2019).
  40. Shannonhouse, J., Gomez, R., Son, H., Zhang, Y., Kim, Y. S. In vivo calcium imaging of neuronal ensembles in networks of primary sensory neurons in intact dorsal root ganglia. J Vis Exp. (192), e64826(2023).
  41. Shannonhouse, J., et al. Meclizine and metabotropic glutamate receptor agonists attenuate severe pain and Ca2+ activity of primary sensory neurons in chemotherapy-induced peripheral neuropathy. J Neurosci. 42 (31), 6020-6037 (2022).
  42. Zheng, Q., et al. Synchronized cluster firing, a distinct form of sensory neuron activation, drives spontaneous pain. Neuron. 110 (2), 209-220.e6 (2022).
  43. Mahadevan, A. S., et al. Cytonet: Spatiotemporal network analysis of cell communities. PLoS Comput Biol. 18 (6), e1009846(2022).
  44. Chen, C., et al. Long-term imaging of dorsal root ganglia in awake behaving mice. Nat Commun. 10 (1), 3087(2019).
  45. Yoshihara, K., et al. Astrocytic Ca2+ responses in the spinal dorsal horn by noxious stimuli to the skin. J Pharmacol Sci. 137 (1), 101-104 (2018).
  46. Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
  47. Li, J., et al. Engineering of nemo as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).
  48. Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nat Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
  49. Tan, C. H., Mcnaughton, P. A. The TRPM2 ion channel is required for sensitivity to warmth. Nature. 536 (7617), 460-463 (2016).
  50. Akemann, W., Mutoh, H., Perron, A., Rossier, J., Knöpfel, T. Imaging brain electric signals with genetically targeted voltage-sensitive fluorescent proteins. Nat Methods. 7 (8), 643-649 (2010).
  51. Gong, Y., et al. High-speed recording of neural spikes in awake mice and flies with a fluorescent voltage sensor. Science. 350 (6266), 1361-1366 (2015).
  52. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  53. Zhang, Y., et al. Imaging sensory transmission and neuronal plasticity in primary sensory neurons with genetically-encoded voltage indicator, ASAP4.4-kv. bioRxiv. , (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Zwoj znerwienia trójdzielnegoobrazowanie in vivomyszy GCaMP3obrazowanie konfokalnemodalności sensorycznestymulacja włóknami Von Freyprzejściowe wzrosty poziomu wapnia
In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.