Artykuł metodologiczny

Model myszy dotyczący zaburzenia metabolicznego związane ze steatotyczną chorobą wątroby z włóknieniem

DOI:

10.3791/68294

⸱

18 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Brooklyn College, City University of New York

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model myszy choroby wątroby związanej z zaburzeniami metabolicznymi (MASLD) z zaburzeniami metabolicznymi, zmianami ekspresji genów wątroby oraz zmianami histologicznymi przypominającymi ludzkie MASLD, w tym zwłóknieniem przechodzącym do zaawansowanego stadium 3. Model ten może być wykorzystywany w badaniach patofizjologii MASLD oraz w przedklinicznych badaniach nowych terapii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Włóknienie wątroby jest najważniejszym czynnikiem predyktorującym niepożądane skutki w steatotycznej chorobie wątroby związanej z zaburzeniami metabolicznymi (MASLD). W przedklinicznych badaniach MASLD najczęściej stosowanym modelem choroby są myszy. Jednak w tych modelach włóknienie wątroby jest trudne do wywołania. Protokół ten opisuje myszy model MASLD, w którym hiperfagiczne myszy Ay są karmione dietą bogatą w tłuszcze i fruktozę, co przypomina przeciętną dietę w USA. Myszy rozwijają steatozę wątroby, urazy, stan zapalny i włóknienie. Włóknienie przechodzi od włóknienia okołokomórkowego, stadium 1 po 16 tygodniach, do pomostowania, stadium 3 po 12 miesiącach. U tych myszy rozwijają się także otyłość, hipertriglicerydemia, nietolerancja glukozy oraz hiperinsulinemia. Model choroby odzwierciedla histopatologię wątroby, zmiany w ekspresji genów wątroby oraz zaburzenia metaboliczne choroby człowieka. Protokół ten obejmuje dwie metody ilościowego określania włóknienia: histologiczne barwienie kolagenu przez pikro-sirius red oraz ilościowe określenie zawartości hydroksyproliny w wątrobie. Metody te mogą być wykorzystywane do badań patofizjologii MASLD oraz do badań przedklinicznych potencjalnych terapii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Steatotyczna choroba wątroby związana z zaburzeniami metabolicznymi (MASLD) jest najczęstszą chorobą wątroby, z częstością występowania od 31% do 40% w USA oraz 42% na świecie 1,2,3,4. Pacjenci z MASLD mogą rozwinąć steato-wątroby związane z zaburzeniami metabolicznymi (MASH), wcześniej nazywane niealkoholowym steato-wątroby (NASH), marskość wątroby oraz raka wątrobowokomórkowego 5,6. MASLD zwiększa ryzyko raka wątrobowokomórkowego, a w związku z niedawnym wzrostem częstości występowania MASLD stał się najczęstszą chorobą wątroby u pacjentów rozwijających raka wątrobowokomórkowego 7,8. W MASLD włóknienie jest głównym czynnikiem predyktorującym postęp marskości i niekorzystnych wyników klinicznych, w tym zachorowalności wątroby (dekompensacja wątroby, niewydolność wątroby lub rak wątroby) oraz śmiertelności związanej z wątrobą 6,9,10,11. W związku z tym Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zachęca do rozwoju terapii skupionych na MASH/NASH z włóknieniem oraz do stosowania odpowiednich modeli zwierzęcych12.

W przedklinicznych badaniach leków oraz w badaniach mechanistycznych MASLD najczęściej stosuje się modele mysie13. Opisano tysiące myszowych modeli MASLD, co sugeruje brak konsensusu co do optymalnego modelu 13,14. Ustanowienie optymalnych modeli napotyka kilka wyzwań. Chociaż stosunkowo łatwo jest wywołać otyłość i steatozę u myszy, karmiąc je dietą bogatą w tłuszcze, to włóknienie wątroby jest trudniejsze do wywołania 13,14,15,16. W modelach MASLD opartych na dietach otyłych włóknienie rozwija się powoli17 Chociaż ten powolny postęp może lepiej naśladować chorobę u ludzi18, wydłuża czas trwania i koszt badań na zwierzętach. Diety o wysokiej zawartości cholesterolu (np. 2%) sprzyjają rozwojowi włóknienia; Jednak zmniejszają także endogenną syntezę cholesterolu, co jest przeciwieństwem wzrostu opisanego u choroby człowieka15,16. Niektóre modele MASLD wykorzystują mutowane lub genetycznie modyfikowane myszy; Jednak mogą mieć pewne zastrzeżenia: myszy u ob/ob/ob-a rozwijają otyłość, steatozą i insulinooporność, ale brakuje im leptyny, która jest mediatorem włóknienia; Myszy z PTEN Null rozwijają steatozę, ale nie rozwijają insulinooporności15,17. Dlatego modele mysie MASLD często wymagają długich badań, diety o wysokiej zawartości cholesterolu lub modyfikacji genetycznych, aby rozwinąć znaczące włóknienie14. Aby rozwiązać niektóre z tych problemów, opracowaliśmy model myszy, w którym zwierzęta rozwijają MASLD z włóknieniem przechodzącym od fazy pericellowej/perisinusoidalnej (stadium 1) do pomostkowej fibrozy (stadium 3)19.

Celem tego artykułu jest opisanie tego modelu MASLD z włóknieniem wątroby oraz dwoma metodami ilościowego określenia włóknienia: histologiczne barwienie kolagenu przez czerwień picro-sirius oraz ilościowe określenie zawartości hydroksyproliny wątroby.

Uzasadnieniem opracowania tego modelu było to, że najbardziej użyteczne modele zwierzęce to te, które najlepiej oddają ludzką chorobę, zarówno pod względem czynników napędzających chorobę, jak i zmian w histopatologii i ekspresji genów. Dlatego stosowaliśmy dietę podobną do przeciętnej diety w USA, obejmującą umiarkowanie wysokie ilości tłuszczu i fruktozy19,20. Podaliśmy tę dietę myszom noszącym mutację Agouti yellow (A y), które były szeroko wykorzystywane jako modele otyłości21. Te myszy wszechobecnie ekspresują białko agouti, antagonistę receptorów melanokortynowych, w tym MC4R, powodując hiperfagię i powtarzając zwiększoną ilość pokarmu, która jest częsta w otyłości u ludzi 21,22,23. Model ten odtwarza zmiany definiujące MASH, w tym steatozę, uszkodzenia wątrobłonowe, stan zapalny, włóknienie oraz zaburzenia przemiany.

Główne zalety tego modelu to cechy zbliżające go do ludzkiej choroby. Model wykorzystuje dietę typu zachodniego, zaprojektowaną tak, aby przypominała typową dietę amerykańską i okazała się najskuteczniejszą dietą w odwzorowaniu fenotypu ludzkiego MASLD14,20. Myszy rozwijają histopatologiczne zmiany wątroby podobne do tych opisanych w wątrobach ludzi za pomocą MASH 19,24. Myszy rozwijają zaburzenia metaboliczne, co jest kluczowym kryterium do rozpoznania MASLD5. Wątroby myszy z MASH wykazują zmiany w ekspresji genów, które powtarzają te u ludzi z MASH/NASH19. Niedawne badanie porównało 39 mysich modeli MASLD pod kątem ich podobieństwa do choroby u ludzi. Obejmowało myszy z wyłączeniem MC4R, które mają ten sam mechanizm hiperfagii i otrzymały tę samą dietę co model, który opisujemyw 14. Model ten zajął piąte miejsce (na 39) pod względem podobieństwa do ludzkiego MASLD ocenianego przez fenotyp, histopatologię wątroby i transkryptomikę14.

Dodatkowe zalety tego modelu to: myszy Ay są dostępne komercyjnie w Jackson Laboratory oraz w szczepie C57BL/6J, który jest powszechnie stosowany w badaniach metabolicznych21,25; Mutantowe myszy łatwo rozpoznać po kolorze sierści; model ten można łączyć z modelami zysku lub utraty funkcji, aby badać rolę konkretnych genów w rozwoju MASLD; i wreszcie, model nie wykorzystuje niedoborów składników odżywczych (niedobór choliny lub metioniny), nietypowych składników spożywczych (kwas cholowy, etionina), wyjątkowo wysokiej zawartości określonych składników odżywczych (tłuszcze trans) ani hepatotoksyn (czterochlorek węgla), które nie są częstymi przyczynami MASLD i mogą nie odzwierciedlać choroby ludzkiej 13,14,17.

Metoda ta jest odpowiednia do badania mechanizmów przyczyniających się do rozwoju i postępu MASLD oraz do oceny interwencji w leczeniu lub zapobieganiu. Model ten jest szczególnie przydatny, ponieważ zwierzęta nie tylko rozwijają zarówno steato-zapalenie wątroby, jak i zaburzenia metaboliczne, ale także fibrozę, która przechodzi do stadium 3. Model ten może nie być odpowiedni do badania mechanizmów wpływających na zachowania żywieniowe (np. agonistów GLP1R), ponieważ te myszy mają hiperfagię.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami Brooklyn College; Protokół IACUC numer 318.

1. Model myszy MASLD z włóknieniem

  1. Hoduj myszy, aby wydawać potomstwo Ay. Ustaw pary hodowlane z myszami Ay (B6. Cg-Ay/J). Zanotuj datę narodzin szczeniąt.
  2. Upewnij się, że mioty mają podobną liczbę szczeniąt, aby zapewnić odpowiednie i równomierne karmienie oraz wzrost. Staraj się, aby w miocie było od pięciu do sześciu szczeniąt, ponieważ to średnia wielkość miotu dla myszy C57BL/6J. Dodatkowe szczenięta, najlepiej te płci niepotrzebnej, mogą zostać uśpione lub oddane do rodziny tymczasowej.
    UWAGA: Użycie samców Ay i samic typu dzikiego (C57BL/6J Jax 0000664) może poprawić efektywność hodowli, ponieważ samice typu dzikiego typu C57BL/6J są łatwe do pozyskania i mogą lepiej się rozmnażać niż samice Myszy Ay.
  3. Rozstaw klatki do eksperymentów, jak opisano poniżej.
    1. Rozpoznawaj myszy Ay po żółtym kolorze sierści. Przypisz każdej myszy unikalną identyfikację i oznacz lub oznacz myszy.
      UWAGA: Allel agauti żółty (Ay) genu agouti nadaje żółty kolor sierści. Allel ten jest półdominujący u heterozygot. Homozygotyczność powoduje śmiertelność embrionalną. Dlatego myszy o żółtej sierści są heterozygotyczne dla genu Ay.
    2. Myszy odstawiają, gdy mają 21 dni. Grupuj myszy, które będą trzymane w tej samej klatce podczas badania. Trzymaj trzy lub cztery myszy Ay w klatce, zgodnie z przewidywaną masą ciała i wytycznymi instytucjonalnymi.
    3. Karm standardowe jedzenie i wodę. Myszy domowe w temperaturze standardowej (20-23 °C) i wilgotności względnej (40% do 60%) z 12-godzinnym światłem i 12-godzinnym cyklem ciemności.
  4. Karm myszy Ay dietą bogatą w tłuszcze i fruktozę (dieta wysokotłuszczowa i fruktoza, HFFD) od 8. tygodnia życia, jak opisano poniżej.
    1. Zapewnij myszom Ay dietę zachodnią, która jest bogata w tłuszcze i sacharozę (Adjusted calories Western Diet Inotiv TD.88137) ad libitum.
    2. Przygotuj roztwór zawierający fruktozę (23 g/L) i glukozę (19 g/L) w wodzie pitnej. Sterylizuj roztwór przez filtr o średnicy 0,2 μm i przechowuj w sterylnych butelkach. Po otwarciu trzymaj roztwór w lodówce.
    3. Dostarczaj myszom roztwór zawierający fruktozę i glukozę do picia, w sterylnych butelkach do picia. Wymieniaj roztwór i butelki co najmniej raz w tygodniu, kontrolując rozwój mikroorganizmów.
    4. Używaj klatkowej ściółki bez wartości odżywczej (np. zrębki drzewne).
  5. Karm myszy kontrolne dietą niskotłuszczową i fruktozą, jak opisano poniżej.
    UWAGA: Rodzaj myszy kontrolnych do zastosowania zależy od projektu badania: Jeśli do oceny efektu leków stosuje się myszy Ay-HFFD, myszy kontrolne mogą być myszami Ay-HFFD leczonymi placebo. Jeśli model zostanie użyty do badania wpływu modyfikacji genetycznej na rozwój włóknienia, myszy Ay-HFFD bez modyfikacji genetycznej mogą być stosowane jako kontrola. Jeśli pożądane są sterowanie bez MASH, postępuj zgodnie z opisanymi tutaj krokami.
    1. Używaj dzikich myszy, które są rodzeństwem myszy Ay. Można je rozpoznać po czarnym kolorze sierści.
    2. Karm myszy dietą kontrolną (Low Fat Control Diet Inotiv TD.08485; określaną jako dieta niskotłuszczowa i fruktozowa, LFFD) zaczynając od tego samego wieku. Zapewnij myszom regularną wodę pitną.
  6. Monitoruj rozwój otyłości, ważąc myszy co tydzień, umieszczając przytomne zwierzęta w tarowanym pojemniku na wagi laboratoryjnej i rejestrując ich wagę.
  7. Upewnij się, że myszy zawsze mają odpowiednią ilość jedzenia i picia. Monitoruj i rejestruj spożycie produktów spożywczych i napojowych, aby oszacować spożycie kalorii, jeśli chcesz.
  8. Zbieraj chusteczki zgodnie z opisaniem poniżej.
    1. Pobieranie tkanek wykonuj po 16 tygodniach stosowania diety HFFD. Uśpij mysz poprzez inhalację dwutlenkiem węgla (lub innymi metodami zatwierdzonymi przez IACUC instytucji).
      UWAGA: Po 16 tygodniach myszy Ay karmione dietą HFFD zwykle mają zwłóknienie w stadium 1; Wydłużenie tego czasu prowadzi do większego włóknienia, które przechodzi do stadium 3 po 9 do 12 miesiącach.
    2. Zważ myszkę i zapisz wagę19.
    3. Pobieraj krew, jeśli trzeba. Aby to zrobić, pobierz krew z żyły głównej dolnej za pomocą strzykawki o pojemności 1 mL i igły 27G po otwarciu jamy brzusznej i przed rozcięciem wątroby (lub użyj innej metody zatwierdzonej przez IACUC).
    4. Rozcinaj wątrobę, otwierając brzuch nacięciem w linii środkowej, trzymając wątrobę za hilum za pomocą kleszczy i przecinając więzadła łączące wątrobę z przeponą i otrzewną za pomocą nożyczek. Zważ wątrobę i zapisz wagę.
    5. Przepłucz wątrobę w lodowatym roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Sfotografuj wątrobę i dołącz linijkę lub inny przedmiot jako odniesienie rozmiaru na obrazie. Włóż wątrobę do szalki Petriego, która jest umieszczana na lodzie.
    6. Rozcinamy próbki (około 100 do 150 mg na próbkę) kilku płatów, w tym płata środkowego, lewego i prawego. Upewnij się, że próbki mają grubość nie większą niż 4 mm, aby ułatwić utrwalenie. Umieść je w roztworze utrwalającym (formalina 10% lub formaldehyd 4%) na 24 godziny i przetworz do analizy histopatologicznej (patrz niżej).
    7. Rozciął dodatkowe próbki kilku płatów. Umieść je w probówkach (1,5 lub 2 mL), zamroz przez zanurzenie w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C. Te próbki będą używane do pomiaru zawartości hydroksyproliny.
    8. Pobieraj próbki innych narządów, jeśli chcesz (tkanki tłuszczowej, mięśni itp.)

2. Histochemiczne barwienie kolagenu i morfometryczna ilościowość

UWAGA: Kroki wymagające użycia niebezpiecznych i/lub lotnych chemikaliów powinny być wykonywane w okapie spalinowym. Wszystkie preparaty powinny być przetwarzane równolegle, używając naczyń do bejcowania i uchwytów na preparaty.

  1. Przygotuj cięcia wątroby zgodnie z opisaniem poniżej.
    1. Napraw tkankę wątroby, utrzymując ją w formalinie (lub formaldehydzie) przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Użyj objętości utrwalacza 20 razy większej niż objętość tkanki. Następnie przenieś tkanki do 70% etanolu. Protokół można w tym momencie wstrzymać.
      UWAGA: Tkanki można umieszczać w kasetach histologicznych, które następnie umieszcza się w pojemniku z utrwalaczem lub, alternatywnie, w pojedynczych pojemnikach lub rurkach.
    2. Obuduj tkanki w parafinie. Zazwyczaj odbywa się to w placówce lub placówce histopatologicznym.
    3. Uzyskaj przekroje o grubości 0,5 μm zamontowane na prowadnicach (odpowiednie są prowadnice nienaładowane). Pozwól wyschnąć fragmentom, wystawiając je na działanie powietrza w temperaturze pokojowej. Zazwyczaj tak robi podstawowa placówka lub usługa histopatologiczna. Protokół można w tym momencie wstrzymać.
  2. Odparaffiniuj i nawodnij fragmenty, jak opisano poniżej.
    1. Odparafinuj sekcje, zanurzając je w dwóch odmianach roztworu deparafinyzującego/oczyszczającego (ksylen lub citrisolv), przez 5-15 minut w każdej.
    2. Rehydratuj się, zanurzając kolejne preparaty w 100% etanolu, 95% etanolu, 70% etanolu i wodzie, przez 5 minut w każdej.
  3. Barwi fragmenty na czerwień picro-sirius, jak opisano poniżej.
    1. Zanurz fragmenty w roztworze Sirius Red (direct red 80) 1 g/L w kwasie pikrynowym 1,3% na 1 godzinę. Nie barwi się dłużej, ponieważ bezpośrednia czerwień może barwić struktury inne niż kolagen (np. jądra). Dodaj szybki zielony (1 g/L) do roztworu barwiącego, jeśli zależy na kolorze kontrbarwnym:26. Alternatywnie, barw jądra hematoksyliną Weigerta27.
    2. Zwróć roztwór pikro-sirius red do zamkniętego, ciemnego szklanego lub plastikowego pojemnika do przechowywania. Rozwiązanie można wielokrotnie używać (przez co najmniej 20 lati 27).
  4. Zanurz próbki w etanolu (100%) na 5 minut, aby się odwodniły. Powtórz z drugą zmianą etanolu.
  5. Zanurz w roztworze ksylowym (ksylenie lub cytryrozpuszcze), aż zostaną one indywidualnie usunięte do montażu.
  6. Zdejmuj po jednym szkiełku z roztworu klarowego i usuwaj nadmiar płynu, wycierając go ręcznikami papierowymi. Dodaj medium montażowe (około 50 do 100 μL). Przykryj ten fragment pokrywką i delikatnie dociśnij ją w dół, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Pozwól wyschnąć na powietrzu.
    UWAGA: Protokół można w tym momencie wstrzymać.
  7. Obserwuj przekroje za pomocą mikroskopu świetlnego z jasnym oświetleniem i obiektywami 4 do 20 razy – kolagen pojawia się na czerwono na tle jasnożółto-pomarańczowym. Obszary zainteresowania kolorowym aparatem, zgodnie z instrukcjami aparatu.
  8. Wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopii światła spolaryzowanego zgodnie z opisaniem poniżej.
    1. Włącz i reguluj filtry polaryzatora i analizatora ortogonalnie, aby upewnić się, że kolagen jest widoczny, a sygnał tła minimalny. Kolagen jest widoczny jako biały, żółty lub pomarańczowy na ciemnym tle. W przekrojach z niewielką lub żadną fibrozą widoczny będzie kolagen w ścianach naczyń krwionośnych. Zachowaj takie same ustawienia, w tym natężenie oświetlenia, dla wszystkich porównywanych próbek.
    2. Obraz wykonany za pomocą aparatu monochromatycznego lub trybu monochromatycznego w kamerze kolorowej. Użyj obiektywu z 4x powiększeniem. Zrób kilka zdjęć na sekcję. Unikaj miejsc w pobliżu hilum, jeśli mają duże naczynia krwionośne. Używaj tych samych ustawień do porównania wszystkich obrazów.
  9. Wykonaj morfometryczną ilościowość w Photoshopie (alternatywa a), jak opisano poniżej.
    1. Ilościowo określ biały obszar na obrazach, który odpowiada kolagenowi. W Photoshopie kliknij Wybierz > Zakres kolorów, następnie wybierz Rozświetlenia i dostosuj parametry Rozmycia i Zakresu, aby wybrać piksele białe, odpowiadające kolagenowi. Następnie wybierz Okno > Histogram > rozszerzonym widoku i zapisz liczbę wybranych pikseli, wyświetlaną obok parametru Piksele. Używaj tych samych parametrów do porównania wszystkich obrazów.
    2. Określ całkowitą powierzchnię obrazu. W Photoshopie kliknij Wybierz > Wszystko, a następnie zapisz łączną liczbę pikseli jak wcześniej.
    3. Oblicz procent powierzchni obrazu odpowiadającej kolagenowi, dzieląc liczbę białych pikseli przez liczbę wszystkich pikseli. Wartości są zwykle wyrażane jako procenty powierzchni.
  10. Wykonaj kwantyfikację morfometryczną za pomocą ImageJ (alternatywa b), jak opisano poniżej.
    1. Wybierz białe obszary na obrazach odpowiadające kolagenowi. Otwórz narzędzie Threshold, klikając Obraz > Dostosuj > Threshold (lub naciśnij Shift + T). Ustaw zakres progów, aby tylko obszary zabarwione kolagenem (obszary białe) były podświetlone na czerwono (np. minimalny próg 64; maksymalny próg: 255) i kliknij Zastosowaj. To zbinarizuje obraz, przekształcając region kolagenu w czerń, a tło w białe.
    2. Zmierz całkowity obszar obrazu, klikając Analizuj > ustaw pomiary. Sprawdź obszar i etykietę wyświetlania. Kliknij OK. Kliknij Analizuj > Mierz (lub naciśnij M na klawiaturze). Okno Wyniki pokaże całkowity obszar obrazu.
    3. Aby zmierzyć powierzchnię i procent kolagenu, najpierw włącz Limit to Threshold, klikając Analizuj > Ustaw pomiary. Sprawdź powierzchnię, ułamek powierzchni (ImageJ automatycznie obliczy procent kolagenu), limit do progu oraz wyświetl etykietę. Kliknij OK. Następnie kliknij Analizuj > Zmierz (lub naciśnij M). Okno Wyniki pokaże: Powierzchnię kolagenu (bezwzględną liczbę pikseli) oraz Ułamek powierzchni (kolagen% całkowitego obrazu).
    4. Zapisz wyniki, wybierając Zapisz jako lub kopiuj je do schowka i wklej do arkusza kalkulacyjnego.

3. Ilościowa analiza hydroksyproliny wątroby

UWAGA: Kroki wymagające użycia silnych zasad i kwasów powinny być wykonywane z odpowiednim środkiem ochrony osobistej.

  1. Waż próbki wątroby przygotowane w kroku 1.8.7 i zapisuj wagi. Umieść aliquoty tkanek w probówce odpowiedniej do homogenizacji. Dodaj wodę dejonizowaną, stosując stosunek wody do tkanki 900 μL na 100 mg tkanki.
  2. Ujednolicaj przez ubijanie kulek lub inną metodę zgodnie z instrukcjami producenta, aż tkanka stanie się całkowicie ujednolicona, co oceniamy na podstawie obserwacji wzrokowej. Protokół można zatrzymać w tym momencie, a homogenity przechowywać w temperaturze -20 °C.
  3. Wykonaj wytrącanie białka zgodnie z opisaniem poniżej. Następujące kroki wykonuje się w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem sytuacji, gdy podana jest inna temperatura.
    1. Przelej około 500 μL do 1000 μL rurek do wirówek homogenicznych do 1,5 mL. Przenieś tę samą objętość dla wszystkich próbek.
    2. Dodaj kwas trichlorooctowy dla końcowego stężenia 12% (np. dodaj 120 μL kwasu trichlorooctowego do 880 μL homogenatu)28. Krótko zmieszać wir.
    3. Inkubuj próbki w kąpieli lodowo-wodnej przez 30 minut. Wirówka w 6 000 x g w 4 °C przez 10 minut. Tworzy się osad zawierający białko. Usuwam nadmiar przez aspirację. Trzymaj rurki na lodzie.
    4. Dodaj 1 ml lodowatego etanolu (100%) do przemycia granulki. Ponownie zawiesij pellet za pomocą sonifikacji (lub innej metody) i sprawdź wizualnie, czy materiał jest ponownie zawiesowany. Wirówka w 6 000 x g w 4 °C przez 10 minut i usuwa supernatant przez aspirację. Stosuj ustawienia sonifikacji zgodnie z instrukcją sprzętu (np. używając sonifikatora Branson SFX 150 z mikrokońcówką o średnicy 3,2 mm, amplituda 70% przez 10 s jest skuteczna dla większości próbek). Powtarzaj mycie 2 razy.
    5. Pozwól pelletowi wyschnąć na powietrzu przez 10 minut, a jeśli trzeba, nawet dłużej.
  4. Wykonaj hydrolizę białek zgodnie z opisaniem poniżej.
    1. Dodaj 800 μL kwasu solnego 6 N do rurek zawierających osad białkowy. Ponownie zawiesij pellet za pomocą soniki (lub innej metody), stosując te same ustawienia co w kroku 3.3.4.
    2. Przenieś zawiesinę białkową do szklanych probówek lub fiolek z nakrętkami; Zamknij się mocno. Inkubuj rurki w piekarniku w temperaturze 110 °C przez 22 ± 2 godzinyi 29.
    3. Rurki wirówkowe o pojemności 16 000 x g przez 10 minut; cząstki tworzą granulkę. Zazwyczaj wymaga to przeniesienia hydrolizatu ze szklanych fiolek do rurek wirówek przed wirowaniem.
    4. Przelej supernatant, który zawiera hydroksyprolinę, do probówek o pojemności 1,5 mL. Protokół można w tym momencie wstrzymać. Hydrolizaty można przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotuj standardową krzywą stężenia hydroksyproliny. Dla próbek wątroby o stadiach włóknienia od 1 do 3, przy użyciu ilości tkanki wskazanej w tym protokole, standardowe stężenia do 125 μg/mL są wystarczające (np. seryjne rozcieńczenia 125, 62,5, 31,3, 15,6, 7,81, 3,91, 1,95 oraz 0 μg/mL). Przygotuj standardy, rozcieńczając hydroksyprolinę w kwasie solnym 6 N.
  6. Przelej 40 μL każdej próbki i standardu do 1,5 mL oznaczonych probówek wirówek. Dodaj do każdego 10 μL wodorotlenku sodu 10 N i krótko wymieszaj w wirze.
  7. Wykonaj utlenianie hydroksyproliny, jak opisano poniżej.
    1. Przygotuj bufor octanowo-cytrynianowy zawierający kwas octowy 1,2% v/v, kwas cytrynowy 46 g/L, trójwodny sodu 120 g/L oraz wodorotlenek sodu 34 g/L w wodzie dejonizowanej i dostosuj pH buforu do 6,5.
    2. Przygotuj roztwór 12,7 g/l chloraminy T w wodzie:n-propanol:acetan-cytrynian bufor (1:1:8 v:v:v). Najpierw rozpuszcz chloraminę T w wodzie przez mieszanie, następnie dodaj n-propanol, wymieszaj, a następnie dodaj bufor octanowo-cytrynianowy i wymieszaj.
    3. Dodaj 450 μL roztworu chloraminy do probek z próbkami i standardami. Mieszaj przez wirowanie. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 25 minuti 30 minut.
  8. Przygotuj odczynnik Ehrlicha z 1 M benzaldehydu 4-(dimetyloamino) w kwasie perchlorowym: propanol 1:2 (v/v). Dodaj 500 μL odczynnika Ehrlicha do próbek i standardów. Mieszaj przez wirowanie.
  9. Inkubuj w temperaturze 65 °C przez 20 minut w bloku grzewczym, kąpieli wodnej lub inkubatorze. Po zakończeniu inkubacji pozwól próbkom i standartom ostygnąć do temperatury pokojowej.
  10. Zmierz absorpcję próbek i standardów przy długości fali 550 nm za pomocą spektrofotometru.
  11. Rysuj absorpcję względem wartości standardowych i użyj regresji liniowej, aby stworzyć krzywą standardową. Do obliczenia stężenia hydroksyproliny w próbkach użyj parametrów ze standardowej krzywej.
  12. Oblicz ilość hydroksyproliny w próbkach wątroby na podstawie całkowitej objętości hydrolizatu (krok 3.4) i znormalizuj przez masę tkanki odpowiadającą objętości homogenitu użytej do wytrącania białka (krok 3.3.1). Wyniki wyrażaj jako ng hydroksyproliny na mg tkanki. Alternatywnie, stężenie białka w homogenatach można zmierzyć i wyrazić wyniki jako masę hydroksyproliny na masę białka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Myszy karmione HFFD przybierały na wadze niż myszy typu dzikiego karmione LFFD i rozwijały otyłość (Rysunek 1A). Przybierają na wadze szybciej w ciągu pierwszych 4 tygodni karmienia HFFD, przybierając około 3-4 g tygodniowo. Po 8 tygodniach przybierają na wadze w tempie podobnym do myszy kontrolnych (około 0,6 g/tydzień)19. Po 16 tygodniach myszy Ay karmione HFFD ważyły około 45 g do 50 g (średnio z trzech oddzielnych eksperymentów) i ważyły o około 40% do 80% więcej ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje myszy model MASLD z włóknieniem wątroby, który replikuje chorobę u ludzi 5,6. Myszy rozwijają steatozę wątroby, co potwierdzają mieszane mikro- i makropęcherzykowe steatozy w histologii oraz podwyższona zawartość triacylogliceroluwątrobowego 19. Myszy rozwijają także otyłość, hipertriglicerydemię, nietolerancję glukozy oraz zgłaszano nadciśnienie, które w połączeniu ze steatozą wątroby odpowiada kryteriom diagnostyczny...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktu interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health K22CA178098, R03DK101863 i R15DK131627 oraz fundusze początkowe od Brooklyn College (dla JMC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-(Dimetyloamino)benzaldehydSigma-AldrichD2004
Kwas octowyRóżneNA
Dieta dostosowana kalorii Dieta zachodniaInotivTD.88137Dieta zawiera tłuszcz (42 % kcal) i sacharozę (34 % t/tydzień). Inni dostawcy oferują diety o tym samym składzie
B6. Cg-Ay/JLaboratorium Jacksona000021Odmiana ma śmiertelną żółtą mutację Agouti oraz tło C57BL6/J. Obecnie w The Jackson Laboratory szczep jest kryprokonserwowany.
C57BL/6JLaboratorium Jacksona000664
WirówkaRóżneNAZ wirnikem do lamp 1,5 mL, chłodzony, zdolny do osiągnięcia 16 000 xg.
WirówkaRóżneNA
Chloramina-T hydratSigma-Aldrich857319
Kwas cytrynowyRóżneNA
Direct Red 80Sigma365548-5G
EtanolDecon Laboratories2701
Roztwór formaliny, buforowany neutralnieSigmaHT501128
FruktozaSigma-AldrichF0127
GlukozaSigma-AldrichG8270
Sprzęt do przetwarzania histologicznegoNANAOsadzanie i sekcjonowanie mogą być wykonywane w laboratorium badawczym lub w zewnętrznej placówce
HomogenizatorRóżneNABijaczki do koralików są wydajne do przetwarzania wielu próbek. Można stosować inne metody homogenizacji
Kwas solnyRóżneNA
HydroksyprolinaSigmaH5534
Dieta kontrolna niskotłuszczowaInotivTD.08485Dieta kontrolna, niskotłuszczowa (13% kcal) i sacharoza (12% t/w)
Mikroskop wyposażony do mikroskopii światła spolaryzowanegoRóżneNA
N-propanolRóżneNA
Kwas nadchlorowyRóżneNA
Medium z permountemFisher ScientificSP15-100
Kwas pikrynowy, nasycony roztwór wodnisty, SpectrumFisher18612375
Trihydrat octana soduRóżneNA
Wodorotkowodlak soduRóżneNA
SonicatorRóżneNASonicator jest przydatny do ponownego zawieszenia granulek w kroku 2.5, ale nie jest absolutnie konieczny
Kwas trichlorooctowyRóżneNA
Okulary VWR Micro Cover, prostokątneVWR 48393-081
Szkiełka mikroskopowe VWR Premium Superfrost Plus | VWRVWR 48311-703
Woda, zdejonizowanaRóżneNAWoda zdejonizowana z systemu oczyszczania wody lub zakupiona od dostawcy.
KsylenyFisher ScientificX3FAgent Clearing Citrisolv  (Fisher 22-143-975) sprzedawana jako alternatywa przyjazna środowisku

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ciardullo, S., Carbone, M., Invernizzi, P., Perseghin, G. Exploring the landscape of steatotic liver disease in the general US population. Liver Int. 43 (11), 2425-2433 (2023).
  2. Lee, B. P., Dodge, J. L., Terrault, N. A. National prevalence estimates for steatotic liver disease and subclassifications using consensus nomenclature. Hepatology. 79 (3), 666-673 (2024).
  3. Kalligeros, M., et al. Prevalence of Steatotic Liver Disease (MASLD, MetALD, and ALD) in the United States: NHANES 2017-2020. Clin Gastroenterol Hepatol. 22 (6), 1330-1332.e4 (2024).
  4. Younossi, Z. M., Kalligeros, M., Henry, L. Epidemiology of Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease. Clin Mol Hepatol. 31 ((Suppl)), S32-S50 (2024).
  5. Rinella, M. E., et al. A multisociety Delphi consensus statement on new fatty liver disease nomenclature. Hepatology. 78 (6), 1966-1986 (2023).
  6. Rinella, M. E., et al. AASLD Practice Guidance on the clinical assessment and management of nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology. 77 (5), 1797-1835 (2023).
  7. Friedman, S. L. Hepatic Fibrosis and Cancer: The Silent Threats of Metabolic Syndrome. Diabetes Metab J. 48 (2), 161-169 (2024).
  8. Phoolchund, A. G. S., Khakoo, S. I. MASLD and the Development of HCC: Pathogenesis and Therapeutic Challenges. Cancers. 16 (2), 259(2024).
  9. Taylor, R. S., et al. Association Between Fibrosis Stage and Outcomes of Patients With Nonalcoholic Fatty Liver Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Gastroenterology. 158 (6), 1611-1625.e12 (2020).
  10. Younossi, Z. M., et al. Liver histology is associated with long-term clinical outcomes in patients with metabolic dysfunction-associated steatohepatitis. Hepatol Commun. 8 (6), e0423(2024).
  11. Dulai, P. S., et al. Increased risk of mortality by fibrosis stage in nonalcoholic fatty liver disease: Systematic review and meta-analysis. Hepatology. 65 (5), 1557-1565 (2017).
  12. Noncirrhotic Nonalcoholic Steatohepatitis With Liver Fibrosis: Developing Drugs for Treatment; Draft Guidance for Industry. The Federal Register / FIND. , Food and Drug Administration. (2018).
  13. Im, Y. R., et al. A Systematic Review of Animal Models of NAFLD Finds High-Fat, High-Fructose Diets Most Closely Resemble Human NAFLD. Hepatology. 74 (4), 1884-1901 (2021).
  14. Vacca, M., et al. An unbiased ranking of murine dietary models based on their proximity to human metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD). Nat Metab. 6 (6), 1178-1196 (2024).
  15. Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Animal Models of Fibrosis in Nonalcoholic Steatohepatitis: Do They Reflect Human Disease. Adv Nutr. 11 (6), 1696-1711 (2020).
  16. Wang, S., Friedman, S. L. Found in translation-Fibrosis in metabolic dysfunction-associated steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 15 (716), eadi0759(2023).
  17. Farrell, G., et al. Mouse Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Toward Optimization of Their Relevance to Human Nonalcoholic Steatohepatitis. Hepatology. 69 (5), 2241-2257 (2019).
  18. Santhekadur, P. K., Kumar, D. P., Sanyal, A. J. Preclinical models of non-alcoholic fatty liver disease. J. Hepatol. 68 (2), 230-237 (2018).
  19. St Rose, K., et al. Mouse model of NASH that replicates key features of the human disease and progresses to fibrosis stage 3. Hepatol Commun. 6 (10), 2676-2688 (2022).
  20. Hintze, K. J., Benninghoff, A. D., Cho, C. E., Ward, R. E. Modeling the Western Diet for Preclinical Investigations. Adv Nutr. 9 (3), 263-271 (2018).
  21. Kennedy, A. J., Ellacott, K. L. J., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Dis Model Mech. 3 (3-4), 156-166 (2010).
  22. Okumura, K., et al. Exacerbation of dietary steatohepatitis and fibrosis in obese, diabetic KK-A(y) mice. Hepatol Res. 36 (3), 217-228 (2006).
  23. Lin, X., Li, H. Obesity: Epidemiology, Pathophysiology, and Therapeutics. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 706978(2021).
  24. Brunt, E. M. Pathology of fatty liver disease. Mod Pathol. 20 Suppl 1, 40(2007).
  25. Ibrahim, S. H., Hirsova, P., Malhi, H., Gores, G. J. Animal Models of Nonalcoholic Steatohepatitis: Eat, Delete, and Inflame. Dig Dis Sci. 61 (5), 1325-1336 (2016).
  26. Caviglia, J. M., et al. MicroRNA-21 and Dicer are dispensable for hepatic stellate cell activation and the development of liver fibrosis. Hepatology. 67 (6), 2414-2429 (2018).
  27. Kiernan, J. Histological and histochemical methods. , Scion Publishing Ltd. (2015).
  28. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. S. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Sci. 18 (5), 980-993 (2009).
  29. Davidson, I. Hydrolysis of samples for amino acid analysis. Methods Mol Biol. 211, 111-122 (2003).
  30. Reddy, G. K., Enwemeka, C. S. A simplified method for the analysis of hydroxyproline in biological tissues. Clin Biochem. 29 (3), 225-229 (1996).
  31. Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
  32. Mark, A. L., et al. Contrasting blood pressure effects of obesity in leptin-deficient ob/ob mice and agouti yellow obese mice. J Hypertens. 17 (12 Pt 2), 1949-1953 (1999).
  33. Luo, Y., et al. Metabolic phenotype and adipose and liver features in a high-fat Western diet-induced mouse model of obesity-linked NAFLD. Am J Physiol Endocrinol Metab. 310 (6), 418(2016).
  34. Lonardo, A., Suzuki, A. Sexual Dimorphism of NAFLD in Adults. Focus on Clinical Aspects and Implications for Practice and Translational Research. J Clin Med. 9 (5), 1278(2020).
  35. Lonardo, A., Ballestri, S., Mantovani, A., Targher, G., Bril, F. Endpoints in NASH Clinical Trials: Are We Blind in One Eye. Metabolites. 14 (1), 40(2024).
  36. Giles, D. A., et al. Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling. Nat Med. 23 (7), 829-838 (2017).
  37. Hao, L., Khan, M. S. H., Zu, Y., Liu, J., Wang, S. Thermoneutrality Inhibits Thermogenic Markers and Exacerbates Nonalcoholic Fatty Liver Disease in Mice. Int J Mol Sci. 25 (15), 8482(2024).
  38. Horakova, O., et al. Thermoneutral housing promotes hepatic steatosis in standard diet-fed C57BL/6N mice, with a less pronounced effect on NAFLD progression upon high-fat feeding. Front Endocrinol. 14, 1205703(2023).
  39. Suzuki, A., Diehl, A. M. Nonalcoholic Steatohepatitis. Annu Rev Med. 68, 85-98 (2017).
  40. Arrese, M., et al. Insights into Nonalcoholic Fatty-Liver Disease Heterogeneity. Semin Liver Dis. 41 (4), 421-434 (2021).
  41. Wentworth, B. J., Caldwell, S. H. Pearls and pitfalls in nonalcoholic fatty liver disease: tricky results are common. Metab Target Organ Damage. 1 (1), 2(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Choroba zwi zana z dysfunkcj metaboliczn w trobymysi model w knieniast uszczenie w trobyw knienie w trobybarwienie kolagenubarwienie czerwieni Sirius Redoznaczanie zawarto ci hydroksyprolinydieta wysokot uszczowahistopatologia w trobymikroskopia w wietle spolaryzowanym

Powiązane artykuły