Projektowanie systemów fermentacji w stanie stałym do wytwarzania hydrolitycznych enzymów zewnątrzkomórkowych polimerów przez grzyby strzępkowe

Summary

Protokół ten wykorzystuje otręby pszenne w obrotowym systemie fermentacji w stanie stałym w celu zwiększenia produkcji enzymów. Podłoże, uzupełnione o induktory, takie jak chityna, wspomaga wzrost grzybów w kontrolowanych warunkach. Wyniki pokazują, że wydajność enzymów jest 4-6 razy wyższa w porównaniu z fermentacją zanurzeniową, co pokazuje zdolność adaptacyjną i skuteczność metody w różnych zastosowaniach biotechnologicznych.

Abstract

Fermentacja w stanie stałym (SSF) to proces biokonwersji, w którym wykorzystuje się stały substrat, który nie rozpuszcza się w środowisku wodnym. Mikroorganizmy rosną na powierzchni podłoża i wnikają w jego stałą matrycę, aby wydobyć składniki odżywcze niezbędne do ich rozwoju. SSF charakteryzuje się minimalną ilością wolnej wody, przy wilgotności podłoża utrzymywanej powyżej 70% i składa się z trzech połączonych ze sobą faz - gazowej, ciekłej i stałej. Protokół ten opisuje wykorzystanie otrębów pszennych, agroprzemysłowego produktu ubocznego, jako podstawowego substratu do produkcji enzymów w systemie rotacyjnym. Substrat jest uzupełniany induktorem, takim jak chityna, chitozan, skrobia lub celuloza, w celu pobudzenia syntezy białek hydrolitycznych. System jest wysoce elastyczny, co pozwala na stosowanie różnych form grzybów, w tym grzybni, zarodników lub granulek. W opisanej metodologii induktor i substrat są mieszane w stosunku 1:100 (w/w), sterylizowane w autoklawie i dostosowywane do pożądanego poziomu wilgotności sterylną wodą. Następnie dodaje się inokulum grzybów, a system obrotowy działa z prędkością 10 obr./min, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie i natlenienie. System jest inkubowany przez 6-8 dni w optymalnych warunkach wzrostu dla grzybów mezofilnych lub ciepłolubnych/termotolerancyjnych, co zwiększa jego wszechstronność. Po inkubacji enzym jest łatwo ekstrahowany przy użyciu odpowiedniego zimnego buforu (np. octanu, cytrynianu lub fosforanu), w zależności od rodzaju enzymu. Ekstrakt klaruje się przez odwirowanie i filtrację w celu uzyskania bezkomórkowego supernatantu. Enzym może być następnie dalej zagęszczony lub oczyszczony w zależności od potrzeb. Wyniki wykazały 4-6-krotny wzrost aktywności enzymu w porównaniu z fermentacją zanurzeniową (SmF), co podkreśla skuteczność systemu. Jego zdolność adaptacji do różnych substratów, induktorów i gatunków grzybów sprawia, że jest cennym narzędziem do różnych zastosowań biotechnologicznych.

Introduction

Fermentacja w stanie stałym (SSF) stała się obiecującą i zrównoważoną technologią biokonwersji do produkcji wysokowartościowych enzymów, związków bioaktywnych i metabolitów wtórnych. Technika ta polega na wzroście mikroorganizmów na podłożach stałych z minimalną ilością wolnej wody, symulując ich naturalne środowisko i umożliwiając wydajną aktywność metaboliczną¹. Głównym celem tego protokołu jest optymalizacja produkcji enzymów poprzez obrotowy system SSF, który zapewnia zwiększone wykorzystanie substratu, dyfuzję tlenu i skalowalność procesu. Wykorzystanie otrębów pszennych, obfitego produktu ubocznego rolno-przemysłowego, jako substratu bazowego, przyczynia się do waloryzacji odpadów rolniczych i promuje praktyki biogospodarki o obiegu zamkniętym².

SSF ma znaczące zalety w porównaniu z fermentacją zanurzeniową (SmF), w tym mniejsze zużycie energii i wody, wyższe stężenie produktu i kompatybilność z szeroką gamą niedrogich pozostałości rolniczych, takich jak otręby pszenne, łuski ryżowe i wytłoki z trzciny cukrowej³. W przeciwieństwie do SmF, który wymaga dużych ilości wody i drogich pożywek, systemy SSF wykorzystują stałe matryce, które służą nie tylko jako powierzchnie wzrostu drobnoustrojów, ale także dostarczają składników odżywczych niezbędnych do aktywności mikrobiologicznej. Dodatkowo, ograniczona ilość wolnej wody w SSF minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia, dzięki czemu jest to bardziej niezawodna opcja do produkcji enzymów w warunkach przemysłowych⁴. Oprócz zalet operacyjnych,SSF przedstawia znaczące korzyści środowiskowe i ekonomiczne w porównaniu z fermentacją zanurzeniową (SmF). Badania wykazały, że SSF zmniejsza zużycie wody o 50%-70% i obniża koszty energii o ponad 30% ze względu na brak dużych ilości wody wymagających ciągłego mieszania i napowietrzania. Ponadto wykorzystanie pozostałości rolno-przemysłowych jako substratów minimalizuje koszty surowców i promuje praktyki gospodarki o obiegu zamkniętym poprzez zmianę przeznaczenia produktów ubocznych rolnictwa ^2,4.

SSFzostał szeroko zweryfikowany pod kątem swojej wydajności i skalowalności. Na przykład badania wykazały 4-6-krotny wzrost aktywności enzymatycznej przy użyciu SSF w porównaniu z SmF, podkreślając ekonomiczne i środowiskowe zalety tej techniki ^2,5. Ponadto dalszy proces jest uproszczony, ponieważ ekstrakcja enzymatyczna zazwyczaj wymaga mniej wody i mniej etapów oczyszczania. To sprawia, że SSF jest szczególnie atrakcyjny dla branż dążących do zmniejszenia kosztów operacyjnych i wpływu na środowisko⁶.

Obrotowy system SSF opisany w tym protokole oferuje kilka ulepszeń w porównaniu z tradycyjnymi statycznymi metodami SSF. Podczas gdy systemy statyczne często napotykają wyzwania, takie jak nierównomierna kolonizacja substratu i ograniczenie tlenu, konfiguracja obrotowa zapewnia dokładne mieszanie i napowietrzanie, sprzyjając równomiernemu wzrostowi drobnoustrojów ^7,8,9. Na przykład system ten został z powodzeniem wykorzystany do produkcji enzymów hydrolitycznych, takich jak chitynazy, amylazy i proteazy, przy użyciu gatunków grzybów, takich jak Aspergillus i Trichoderma².

Kluczową cechą tego systemu SSF jest jego zdolność adaptacji. Wykorzystanie otrębów pszennych jako substratu bazowego świadczy o potencjale pozostałości rolno-przemysłowych w zakresie opłacalnej biokonwersji³. Co więcej, suplementacja substratu induktorami, takimi jak chityna, chitozan i skrobia, dodatkowo zwiększa syntezę enzymów poprzez stymulację określonych szlaków metabolicznych ^2,10. System jest również kompatybilny z różnymi formami grzybów, w tym zarodnikami, grzybnią i granulkami, co pozwala użytkownikom dostosować proces do ich konkretnych wymagań².

SSF oferuje szeroki potencjał zastosowania w różnych dziedzinach, takich jak biotechnologia żywności, produkcja biopaliw i remediacja środowiska¹¹. Integracja opłacalnych substratów, wyjątkowa wydajność enzymów i wysoka elastyczność procesu sprawiają, że SSF jest niezbędnym podejściem do innowacji biotechnologicznych na skalę przemysłową.

Protocol

Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie podłoża

UWAGA: Używaj komercyjnej marki otrębów pszennych, aby zminimalizować znaczące różnice w charakterystyce podłoża. Każda partia otrębów pszennych różni się pod wpływem wielu czynników, co sprawia, że jest to materiał niejednorodny, który jest trudny do standaryzacji, co prowadzi do wahań zawartości jego składników. Jeśli wymagany jest znormalizowany materiał, wybierz alternatywną matrycę lub wykonaj przybliżoną analizę chemiczną każdej partii otrębów pszennych, aby dostosować ją do potrzeb.

1. Umyj otręby pszenne trzy razy sterylną wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości materii organicznej, zanieczyszczenia i kurz. Usuwa to również cukry proste, które mogłyby zakłócać fermentację.
2. Umyte otręby rozłóż na aluminiowej blasze i susz w piekarniku w temperaturze 60 °C przez 24 godziny.
3. Po wysuszeniu umieść otręby pszenne w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.

2. Przygotowanie inokulum

UWAGA: Protokół ten opisuje trzy metody przygotowania inokulum: zawiesinę zarodników, bezpośrednią inokulację krążkami grzybni i zawiesinę komórkową. Ustal początkowe stężenie inokulum i określ ilościowo poziomy białka, aby uzyskać dokładne obliczenia plonów.

1. Przygotowanie zawiesiny zarodników
   1. Przenieść krążek agarowy o średnicy 5 mm nasycony grzybnią na płytkę agarową ze świeżym dekstrozą ziemniaczaną. Inkubować płytkę w temperaturze 28 °C przez 5-7 dni lub do momentu, gdy grzybnia nasyci pożywkę. Niektóre grzyby mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji.
   2. Dodać 5 ml sterylnej wody destylowanej do płytki i mechanicznie odłączyć zarodniki za pomocą sterylnej pętli.
   3. Przygotować zawiesinę zarodników w stosunku 1:100. Umieść 10 μl na środku komory Neubauera i policz zarodniki pod mikroskopem. Obliczyć stężenie zarodników (zarodniki/ml) na podstawie współczynnika komory i rozcieńczenia.
2. Uprawa grzybni w płynnym podłożu
   1. Przenieść 5-milimetrowy krążek agarowy nasycony grzybnią na świeżą płytkę z agarem ziemniaczano-dekstrozowym i inkubować w temperaturze 28 °C aż do nasycenia.
   2. Przygotować 25 ml bulionu ziemniaczano-dekstrozowego w sterylnej kolbie o pojemności 125 ml i autoklawie.
   3. Przenieść 5 mm krążek grzybni z nasyconej płytki do sterylnego bulionu.
   4. Inkubować kolbę na wytrząsarce z prędkością 125 obr./min przez 24-48 godzin, w zależności od szczepu grzyba. Wydłuż czas inkubacji wolno rosnących grzybów.
   5. Zebrać 2 ml do inokulum i 2 ml do oznaczenia suchej masy.
3. Bezpośrednia inokulacja krążków grzybni
   1. Umieścić 5 mm krążek agarowy nasycony grzybnią na świeżej płytce z agarem ziemniaczano-dekstrozowym. Inkubować w temperaturze 28 °C aż do nasycenia.
   2. Użyj jednego krążka grzybni jako inokulum, a drugiego do określenia suchej masy.

3. Przygotowanie systemu SSF

UWAGA: Induktory mogą być naturalne lub komercyjne. Oczyszczone induktory komercyjne są preferowane w celu zminimalizowania zanieczyszczeń, które mogłyby zmienić wydajność fermentacji. Dostosuj dodatki wody, aby utrzymać wilgotność względną co najmniej 90%.

1. Połącz następujące składniki w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml: 5 g suchych otrębów pszennych; 0,2 g induktora (np. chityny handlowej); 5,5 ml wody (dostosować w zależności od zdolności wchłaniania wody przez induktor); 5 ml sterylnego roztworu soli zawierającego 16 g/l jednozasadowego fosforanu potasu, 4 g/l siarczanu sodu, 2 g/l chlorku potasu, 1 g/l chlorku wapnia, 400 mg/l chlorku, 60 mg/l kwasu borowego, 40 mg/l molibdenianu sodu, 150 mg/l chlorku magnezu, 100 mg/l chlorku żelaza i 400 mg/l siarczanu miedzi.
2. Zmierz wilgotność względną za pomocą higrometru opartego na elektrodzie, zapewniając wilgotność co najmniej 90%. Włóż sondę elektrody bezpośrednio do reaktora na różnych głębokościach, aby uzyskać reprezentatywny pomiar rozkładu wilgoci.
   1. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby dostosować wilgotność, jeśli jest poniżej 90%:
      1. Stopniowo dodawać sterylną wodę destylowaną w odstępach co 1 ml na 10 g substratu. Po każdym dodaniu dokładnie wymieszaj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wilgoci.
      2. Pozostaw podłoże do wyrównania przez 10-15 minut. Ponownie zmierz poziom wilgotności.
      3. Powtarzaj powyższe kroki, aż do osiągnięcia docelowej wilgotności 90%. Unikaj nadmiernego zwilżania podłoża przez cały proces.
   2. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby dostosować wilgotność, jeśli przekracza 90%:
      1. Rozprowadzić cienko podłoże w sterylnym środowisku. Nadmiar wilgoci usunąć poprzez (1) wystawienie podłoża na laminarny przepływ powietrza lub (2) umieszczenie go w komorze suszącej w temperaturze 30 °C na 10-15 minut.
      2. Alternatywnie, delikatnie wymieszaj podłoże, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wilgoci. Po zabiegu ponownie oceń poziom wilgotności.
      3. W razie potrzeby powtórz etap suszenia lub mieszania, aż wilgotność osiągnie 90%. Kontynuuj fermentację dopiero po osiągnięciu docelowej wilgotności.
3. Autoklawuj rurkę pod ciśnieniem 15 psi przez 15 minut.
4. Po schłodzeniu zaszczepić substrat jednym z poniższych: 1 ml zawiesiny zarodników (1 x 10^6-1 x 10⁷ zarodników/ml), 2 ml zawiesiny komórkowej lub jednym 5 mm krążkiem grzybni.

4. Procedura fermentacji w stanie stałym (SSF)

UWAGA: W przypadku badań kinetycznych lub ocen parametrów w różnym czasie, należy przygotować osobne probówki dla każdego punktu czasowego, aby zapewnić reprezentatywność.

1. Unikaj zbrylania się podłoża, wirując rurki z maksymalną prędkością przez 5 minut w cyklach 1-minutowych.
2. Umieść rurki w mieszalniku obrotowym z osią poziomą. Upewnij się, że podłoże swobodnie porusza się wewnątrz rurek. Ustaw mikser tak, aby działał z prędkością 10 obr./min.
3. Inkubować mieszalnik w inkubatorze w optymalnej temperaturze wzrostu mikroorganizmu. Utrzymuj podawaną temperaturę, aby uzyskać optymalną aktywność enzymatyczną podczas stosowania induktorów wrażliwych na ciepło.

5. Ekstrakcja enzymów

UWAGA: Podstawy ekstrakcji opierają się na rozpuszczalności i maksymalnej aktywności pH enzymu zewnątrzkomórkowego. Ponieważ SSF unika środowiska wodnego, enzym zewnątrzkomórkowy jest zaangażowany w wodę otaczającą stałą matrycę, co oznacza, że stężenie jest wyższe niż w SmF. W tym kontekście wybór najlepszego bufora ekstrakcyjnego zależy od wiedzy na temat pożądanej aktywności. Optymalizacja ekstrakcji zależy od końcowego stężenia enzymu i rodzaju zastosowanego buforu ekstrakcyjnego.

1. Po pożądanym okresie fermentacji ponownie zawiesić substrat w 20 ml wstępnie schłodzonego buforu. Przykłady obejmują: 0,1 M bufor octanowy, pH 5,6, do ekstrakcji chitynazy; 0,02 M bufor fosforanowy, pH 6,9, do ekstrakcji amylazy.
2. Wiruj rurki w cyklach: 1 minuta z maksymalną prędkością, a następnie 1 minuta na lodzie. Powtórz 10 razy.
3. Przefiltrować zawiesinę za pomocą filtrów bibułowych i mechanicznie wyekstrahować supernatant przez prasowanie.
4. Klarować sklarowany sklarowany składnik osadu przez odwirowanie w stężeniu 3000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
5. Ekstrakt surowy należy stosować bezpośrednio lub dalej oczyszczać enzym za pomocą chromatografii kolumnowej lub filtrów odśrodkowych. Zaleca się również badania kinetyczne w celu wyznaczenia stałej Michaelisa (Km) i maksymalnej szybkości przemian enzymatycznych (Vmax)¹².

6. Proces optymalizacji

UWAGA: Zoptymalizuj ten protokół, oceniając i dostosowując jakość i stężenie induktorów, a także rodzaj i stężenie inokulum.

1. Określ idealny czas fermentacji i udoskonal etapy ekstrakcji, aby poprawić wydajność.
2. Kontroluj i dostrajaj warunki środowiskowe, w tym temperaturę, pH i napowietrzanie.
3. Przetestuj różne i warunki ekstrakcji, aby zwiększyć wydajność i stabilność enzymów.
4. Wykonuj analizy statystyczne, takie jak metodologia powierzchni odpowiedzi, w celu zidentyfikowania najbardziej wpływowych zmiennych i osiągnięcia optymalnej produkcji enzymów.

Results

Rysunek 1A przedstawia schematyczne przedstawienie mieszalnika obrotowego zastosowanego w tym systemie, który ma pojemność na sześć stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Rysunek 2B ilustruje zmiany, jakie zachodzą w otrębach pszennych podczas kondycjonowania przed wejściem w proces fermentacji w stanie stałym. Jak widać, nie zaobserwowano istotnych zmian strukturalnych.

Rysunek 2 przedstawia nasycenie o...

Discussion

W badaniu tym przedstawiono odpowiedni protokół optymalizacji produkcji enzymów za pomocą systemów fermentacji w stanie stałym (SSF), zaprojektowanych specjalnie dla grzybów strzępkowych. Poniżej omówiono krytyczne aspekty metodologii, wraz z jej znaczeniem, ograniczeniami i potencjalnymi zastosowaniami.

Powodzenie protokołu w dużym stopniu zależy od kluczowych etapów, takich jak przygotowanie substratu i inokulum. Właściwe mycie i suszenie otrębów pszennych jest niezbędne do wyeliminowania za...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kolba Erlenmeyera o pojemności 125 ml	Sigma-Aldrich	CLS431684	Do hodowli grzybni w płynnym podłożu.
Probówka stożkowa 50 ml	Sigma-Aldrich	CLS430921	Do przechowywania i przygotowywania substratów i inokulum.
Bufor octanowy, pH 5,6	Sigma-Aldrich	320866	Do ekstrakcji chitynazy.
Filtry Centricon	Milipory	UFC905024	Do dalszego oczyszczania enzymów.
Komora zliczania komórek	Sigma-Aldrich	Z359629	Służy do liczenia zarodników pod mikroskopem.
Bibuła filtracyjna	Whatman	1001-110	Do filtrowania ekstraktu enzymatycznego.
Wilgotnościomierz	Todomicro powiedział:	-	Do pomiaru wilgotności względnej podłoża.
Induktor (np. chityna handlowa)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C9752	Służy do zwiększenia produkcji enzymów podczas fermentacji.
Bufor fosforanowy, pH 6,9	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P5379 TGL	Do ekstrakcji amylazy.
Agar ziemniaczano-dekstrozowy	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P2182	Pożywka hodowlana do uprawy grzybni.
Rosół ziemniaczany z dekstrozą	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P6685 powiedział:	Płynna pożywka hodowlana do uprawy grzybni.
Mieszalnik obrotowy	Thermo-Fisher Naukowy	88-861-051	Aby utrzymać substrat w ruchu podczas fermentacji.
Składniki roztworu soli (np. KH2PO4, Na2SO4, KCl itp.)	Sigma-Aldrich	Wielokrotny	Aby przygotować sterylny roztwór soli, zobacz szczegółowy przepis w protokole.
Otręby pszenne	Rynek komercyjny	-	Substrat do fermentacji w stanie stałym.