Technika biopsji spojówki i bezpośredniej immunofluorescencji w diagnostyce pemfigoidu błony śluzowej

Podsumowanie

W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania i przetwarzania biopsji spojówki w celu identyfikacji pemfigoidu błony śluzowej.

Streszczenie

Pemfigoid błony śluzowej oka (MMP) objawia się przewlekłym bliznowaceniem spojówek, które, jeśli nie jest leczone, może powodować ślepotę. Szybka diagnoza i terapia immunosupresyjna zapobiegają postępowi choroby. Bezpośrednie barwienie immunofluorescencyjne (DIF) biopsji spojówki w celu osadzania się kompleksu immunologicznego w błonie podstawnej jest diagnostyką MMP. Wskaźnik dodatnich wyników biopsji zależy od charakterystyki biopsji, lateralizacji, podeszłego wieku i aktywności choroby. Aktualny artykuł metodowy opisuje technikę pobierania biopsji spojówki i stosowania wkładów wypełnionych pożywką o optymalnej temperaturze cięcia do przenoszenia próbek i przygotowania bloków. Biopsję wykonuje się z niebliznowatego, niezaangażowanego lub stosunkowo mniej zaangażowanego obszaru spojówki w obu oczach. Zwykły rozmiar biopsji to 4-5 mm długości, 2-3 mm szerokości i powinien mieć maleńką tkankę podspojówkową, aby nie pominąć błony podstawnej. Zalecamy wykonanie okresowego barwienia kwasem Schiffa w celu potwierdzenia obecności błony podstawnej. Stosując określony protokół, kriosekcje z biopsji są barwione przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją IgG, IgM, IgA oraz czynnikami dopełniacza C3c i C4c. Dodatnia biopsja wykazuje zieloną dodatnią fluorescencję w błonie podstawnej, a nawet jeśli jedno z przeciwciał jest dodatnie, jest MMP dodatnie. Ujemna biopsja nie wyklucza pemfigoidu; jednak pozytywny potwierdza MMP i odróżnia go od wywołanego lekami bliznowacenia spojówek lub pseudopemphigoidu.

Wprowadzenie

Pemfigoid błony śluzowej (MMP) jest przewlekłą bliznowatą chorobą spojówek o etiologii autoimmunologicznej i atakuje błony śluzowe w organizmie ^1,2. Przewlekłe bliznowacenie spojówek ma różną etiologię i konieczne jest różnicowanie MMP od SJS, sarkoidozy, neoplazji płaskonabłonkowej oka i pseudopemfigoidu, ponieważ to pierwsze wymaga ogólnoustrojowej immunosupresji ^3,4. Co więcej, MMP jest chorobą potencjalnie powodującą ślepotę, w której pacjenci często zgłaszają się późno i są początkowo błędnie diagnozowani ^1,2,5. Tylko zajęcie oka bez zajęcia ogólnoustrojowego można zaobserwować u 27,4% pacjentów z MMP oka⁶. Rozpoznanie MMP wymaga biopsji spojówki w celu wykazania obecności autoprzeciwciał w błonie podstawnej ^2,5. Immunofluorescencja bezpośrednia (DIF) jest kluczowym narzędziem diagnostycznym do identyfikacji chorób autoimmunologicznych wpływających na spojówki, takich jak MMP. DIF pomaga wykrywać odkładanie się immunoglobulin i składników dopełniacza in situ w strefie błony podstawnej (BMZ), co jest charakterystyczne dla MMP. Wskaźniki dodatniości DIF wahają się od 30% do 80%^1,5. Jednak niektórzy pacjenci mogą mieć ujemną biopsję, zwłaszcza ci z MMP tylko ocznej, ale dokumentacja kliniczna progresji choroby jest traktowana podobnie jak w przypadku MMP z dodatnim wynikiem biopsji^{oka 7,8}. W związku z tym Dart i wsp. podkreślili potrzebę oddzielnych kryteriów diagnostycznych dla MMP⁸ tylko w gałce ocznej.

Proponowane przyczyny niskiego wskaźnika dodatnich wyników we wszystkich badaniach to zaawansowana choroba z rozległymi bliznowaceniami na powierzchni oka, nieodpowiednie techniki przetwarzania lub barwienia tkanek oraz wariant choroby z ujemnym wynikiem biopsji 8,9,10,11. Retrospektywna analiza biopsji od 27 pacjentów z podejrzeniem MMP oka wykazała tylko 30% wskaźnik dodatniości, a 63,7% miało zajęcie tylko oka¹². DIF wymaga określonego protokołu; Nie każde laboratorium diagnostyczne jest do tego przystosowane. Istnieją różnice dotyczące miejsca biopsji, tego, czy należy wykonać biopsję z jednego lub obu oczu oraz roztworów do przenoszenia próbek 13,14,15. W retrospektywnej analizie biopsji spojówek w naszym ośrodku, wskaźnik dodatniej DIF wynosił 54,1%, z większą liczbą pozytywnych wyników w przypadku biopsji obustronnej (59% w porównaniu z 45%)⁸. Chociaż biopsja ma kluczowe znaczenie, objawy kliniczne i postępujące bliznowacenie powierzchni oka pomagają w rozpoznaniu MMP. Łatwiej jest zdiagnozować, gdy zajęte jest miejsce pozagałkowe, takie jak jama ustna lub skóra, zgłoszone odpowiednio u 40% i 18% pacjentów⁵.

W istniejącej literaturze istnieją różnice, a przedstawiony tutaj protokół może służyć jako przewodnik referencyjny z modyfikacjami wprowadzonymi w celu zmniejszenia potrzeby stosowania unikalnego medium transferowego¹⁴. Biopsje są przenoszone w pożywce o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i zamrażane zatrzaskowo w tym samym kartridżu transferowym w laboratorium patomorfologicznym, co eliminuje potrzebę stosowania dodatkowego podłoża transferowego. W niniejszym artykule przedstawiono metodologię barwienia DIF tkanki spojówki, pobierania tkanek i protokołu transferu próbki.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi komisji etycznej ds. badań na ludziach komisji etycznej ds. badań na ludziach LV Prasad Eye Institute.

1. Technika biopsji spojówki

1. Zaplanuj biopsję z obu oczu pacjenta z podejrzeniem pemfigoidu w znieczuleniu miejscowym lub miejscowym i pod mikroskopem operacyjnym.
2. Uzyskaj świadomą zgodę od pacjenta i wymień możliwe skutki uboczne krwawienia, bliznowacenia i konieczności rozpoczęcia miejscowego przyjmowania sterydów po operacji.
3. Umieść 1-2 krople 0,5% proparakainy w obu oczach i odczekaj 5 minut przed rozpoczęciem zabiegu.
4. Upewnij się, że pacjent nie odczuwa bólu podczas dotykania spojówki drobnymi kleszczami. Jeśli pacjent nadal odczuwa ból po zastosowaniu miejscowej proparakainy, wstrzyknąć 0,2 ml 2% lidokainy podspojówkowej za pomocą strzykawki tuberkulinowej o pojemności 1 ml.
5. Umieść wziernik w prawym lub lewym oku, w zależności od tego, co zostanie wybrane jako pierwsze.
6. Zbadaj powierzchnię oka pod kątem obszarów bliznowacenia i rogowacenia. Wybierz obszar biopsji, który nie jest zajęty i nie jest pokryty bliznami ani zrogowaciałością.
   UWAGA: W tym badaniu jako miejsce biopsji preferowana jest spojówka opuszkowa górna z dala od rąbka, a następnie spojówka opuszkowa dolna.
7. Za pomocą kleszczy podnieś twardówkę ze spojówki i liniowo wytnij nożyczkami Westcotta o długości 4-5 mm i szerokości 2-3 mm.
8. Natychmiast przenieść całą biopsję do optymalnego podłoża tnącego (OCT).
   UWAGA: Biopsje można przenosić w zwykłej soli fizjologicznej lub pożywce transportowej Michela.
9. Weź wkład i plastikową foremkę do chusteczek higienicznych z dołkiem pośrodku, wyczyść je solą fizjologiczną i wysusz na powietrzu.
10. Napełnij wkład pożywką OCT oddzielnie dla prawego i lewego oka. Zanurz wyciętą tkankę spojówki w pożywce OCT i wyślij ją do patologii.
11. Powtórz podobne kroki również dla strony przeciwnej.

2. Przenoszenie tkanki

1. Próbki z biopsji spojówki należy umieścić w pożywce OCT, aby zachować architekturę tkanek i antygenowość, jeśli są one podawane w pożywce transportowej Michela lub roztworze soli fizjologicznej.
2. Osadzone próbki należy zamrozić błyskawicznie przy użyciu ciekłego azotu lub suchego lodu i przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc.

3. Przygotowanie i sekcja tkanek

1. Zamrożoną tkankę podzielić na 4–6 μm plastrów (w liczbie 7) za pomocą kriostatu w temperaturze od -20 °C do -25 °C.
2. Zamontuj skrawki na dodatnio naładowanych szkiełkach mikroskopowych pokrytych polilizyną, aby zapewnić przyczepność i przechowuj w temperaturze -80 °C do momentu zabarwienia w folii aluminiowej.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Rozmrażaj szkiełka w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut i utrwalaj w zimnym acetonie (100%) przez 10 minut, aby zachować antygeny i zapobiec uszkodzeniu tkanek.
2. Spłucz trzykrotnie 1x PBS, za każdym razem przez 5 minut, aby usunąć nadmiar pożywki OCT i acetonu.
3. Na szkiełka nanieść sprzężone przeciwciała anty-IgG, anty-IgA, anty-IgM i anty-C3 rozcieńczone (fibrynogen-1:10 [kontrola pozytywna], IgG-1:10, IgA-1:10, IgM-1:10, C3-1:5, C4-1:10).
   UWAGA: Przeciwciała rozcieńcza się w 1x PBS.
4. W przypadku kontroli ujemnych pomiń stosowanie sprzężonych przeciwciał i postępuj zgodnie z pozostałymi krokami wymienionymi poniżej.
5. Postępuj zgodnie z wytycznymi producenta dotyczącymi rozcieńczania przeciwciał i standaryzuj ze znanymi kontrolami dodatnimi i ujemnymi.
6. Inkubować szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C przez 45-60 minut.
7. Przemyć szkiełka PBS (3× przez 5 minut każda) w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.
8. Barwienie przeciwstawne za pomocą pożywki montażowej DAPI (4',6 -diamidino-2-fenylodole) do wizualizacji jądrowej.
9. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełkach i pozwól im utwardzić się przez 20 minut.
10. Zbadać preparaty za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry odpowiednie dla zastosowanych fluoroforów (zielony filtr wzbudzenia dla 488 nm).
11. Udokumentuj wyniki za pomocą mikrofotografii cyfrowych.

5. Szybki kwas okresowy - barwienie Schiffa

1. Przygotowanie kwasu okresowego Schiffa (PAS)
   1. Rozpuścić 1 g zasadowej fuschiny w 100 ml gorącej wody destylowanej.
   2. Dodaj 10 ml kwasu solnego i 2 g dwusiarczynu potasu, aby odbarwić barwnik.
   3. Po schłodzeniu dodać 0,5 g węgla aktywnego, wymieszać i przefiltrować roztwór, aby uzyskać klarowny odczynnik Schiffa w kwasie okresowym. Przechowywać w ciemnej butelce.
      UWAGA: Aby przetestować odczynnik Schiffa, wlej 10 ml 37% formaliny do szkiełka zegarka i dodaj kilka kropli odczynnika Schiffa, który ma być testowany. Dobry odczynnik Schiffa szybko zmieni kolor na czerwono-fioletowy. Pogarszający się odczynnik Schiffa spowoduje opóźnioną reakcję, a produkt będzie miał głęboki niebiesko-fioletowy kolor.
2. Technika barwienia PAS
   1. Nawodnij szkiełka w wodzie.
   2. Utleniać w 0,5% roztworze kwasu okresowego przez 5 min.
   3. Spłucz w wodzie destylowanej.
   4. Umieść w odczynniku Schiffa na 15 minut (na tym etapie skrawki są jasnoróżowe)
   5. Myć w letniej wodzie z kranu przez 5 minut (sekcje zmieniają kolor na ciemnoróżowy).
   6. Barwienie przeciwstawne w hematoksylinie Mayera przez 1 min.
   7. Myć w wodzie z kranu przez 5 min.
   8. Odwodnić szkiełka w następujących roztworach: Jeden raz w 80% alkoholu etylowym przez 1 minutę, dwa razy w 90% alkoholu etylowym przez 1 minutę, dwa razy w 100% alkoholu etylowym przez 1 minutę.
   9. Odwodnić szkiełka trzy razy w ksylenie przez 1 minutę każda.
   10. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełkach za pomocą syntetycznego medium montażowego (np. uchwytu DPX)
   11. Obserwuj wyniki PAS pod mikroskopem jasnego pola.

Wyniki

Interpretacja DIF wymaga potwierdzenia obecności błony podstawnej w skrawkach tkanek (ryc. 1). W szkiełkach zabarwionych PAS błona podstawna pojawi się jako jasnoróżowa błona znajdująca się w obszarze podstawy nabłonka spojówki (ryc. 1C). Należy również skomentować ciągłość i architekturę membrany podstawnej. Dodatni wynik DIF będzie widoczny jako jasnozielony BM (figura 1B), wskazujący na osadzanie się IgM (fig...

Dyskusja

Opisana tutaj technika biopsji spojówki wykorzystuje pożywkę OCT jako pożywkę transferową, eliminując potrzebę dodatkowego podłoża transferowego i unikając obsługi biopsji w celu przeniesienia go na pożywkę OCT w celu kriosekcji. Plastikowa forma kartridża wypełniona pożywką i biopsją jest bezpośrednio zamrażana w celu wytworzenia bloków tkanki, a następnie cięta. Zaletą OCT jest to, że szybko zamarza z minimalnymi uszkodzeniami spowodowanymi tworzeniem się kryształów i otacza próbki tkanek. Najważniejszym krokiem w immu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 N kwas solny	Finanse  chemiczna Limited	7647-01-0
Aceton	Qualigens (Qualigens)	Q33517 powiedział:
Albumina	DAKO	F0117 powiedział:
Podstawowa fuksyna	Qualigens (Qualigens)	Numer katalogowy Q39402 powiedział:
Klasa C3c	Biosystemy diagnostyczne	F003 powiedział:
Klasa C4c	Biosystemy diagnostyczne	F005 powiedział:
Nabój	Nauki polilogiczne	25376-500
Aktywowany węglem drzewnym	Sigma	Silnik C-5260
Kriostat	Leica	CM1860UV
Ostrza do kriotomów	Leica	818
DAPI (interfejs DAPI)	Biblioteka	Zobacz materiał AB104139 powiedział:
Fibrynogen	Biosystemy diagnostyczne	F006 powiedział:
Mikroskop fluorescencyjny	Olympus	CX43
Kleszcze	Joja chirurgiczna	JS1528A
Komora wilgotności	Biosystemy diagnostyczne	Zobacz materiał SM365
IgA	Biosystemy diagnostyczne	F007 powiedział:
IgG (IgG)	Biosystemy diagnostyczne	F008 powiedział:
Igm	Biosystemy diagnostyczne	F009 powiedział:
Szkiełka samoprzylepne IHC	Tomo	33140455
Kleszcze	Żużel	S-7223
Michel's tansport medium	Fisher Scinitics	NC0253304
Mikroskopijne szkło osłonowe	Niebieska gwiazda	https://www.bluestarslides.com
OCT Średnie	Kriomatriks	6769006
PBS	DAKO	DM831 powiedział:
Kwas okresowy	Sigma	Numer telefonu 375810-25G
Dwusiarczyn potasu	Sigma	Zobacz materiał P2522-500G
Proparakaina 0,5%	Sunway Prywatny	G/1118A
Nożyczki Westcotta	Pillig Gurgical Instruments	423480