Dwukierunkowe interfejsy elektryczne i optoelektroniczne w zdrowych i niedokrwionych sercach szczurów ex vivo

Podsumowanie

Protokół ten przedstawia zaawansowane metody wytwarzania materiałów i ex vivo badania serca szczurów do optycznego i elektrycznego dwukierunkowego biointerfejsu, umożliwiając precyzyjną stymulację serca, rejestrację i modelowanie zawału na potrzeby badań bioelektronicznych.

Streszczenie

Badania elektrofizjologiczne mają kluczowe znaczenie w badaniu interakcji między materiałami a biointerfejsami serca. Ostatnie osiągnięcia umożliwiły wprowadzenie różnych nowatorskich materiałów przewodnikowych i półprzewodnikowych do dwukierunkowych interfejsów z modelami serca, ułatwiając stymulację o niskiej intensywności wraz z zapisami o wysokim stosunku czasoprzestrzennym i wysokim stosunku sygnału do szumu (SNR). Model serca gryzoni ex vivo służy jako skuteczna platforma do walidacji funkcjonalności nowych materiałów i urządzeń, łącząc wyniki badań in vitro z wglądem translacyjnym, jednocześnie minimalizując problemy etyczne i administracyjne. W tym protokole szczegółowo opisujemy izolację i perfuzję ex vivo serc dorosłych szczurów za pomocą aparatu Langendorffa, ustanawiając precyzyjną dwukierunkową stymulację i rejestrację za pomocą wysokowydajnych półprzewodników i przewodników, w tym nanoporowatego krzemu, nanoporowatego węgla i elastycznych układów mikroelektrod przypominających siatkę. Dodatkowo przedstawiamy model zawału mięśnia sercowego wywołanego uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym (I/R), oceniany za pomocą wielokanałowego zapisu i mapowania, a także barwienia zawału, umożliwiając badania związane z chorobami serca i potencjalne poszukiwania terapeutyczne. Metodologia ta dostarcza cennych informacji na temat badań nad interfejsem materiałowo-biologicznym oraz rozwoju bioelektroniki serca nowej generacji.

Wprowadzenie

Dziedzina bioelektroniki serca rozwija się szybko, napędzana potrzebą opracowania materiałów i urządzeń, które umożliwiają precyzyjną i wydajną dwukierunkową komunikację z sercem 1,2,3,4. Badania elektrofizjologiczne odgrywają kluczową rolę w tym przedsięwzięciu, dostarczając krytycznych informacji na temat interakcji materiałów z biointerfejsami serca poprzez modulację i wykrywanie. Podczas gdy modele in vitro, takie jak hodowane linie komórkowe HL-1 i pierwotne kardiomiocyty gryzoni, oferują kontrolowane środowisko do wstępnych ocen 5,6,7,8, ich prostota często nie jest w stanie odtworzyć złożonych, dynamicznych warunków życia serca. Modele te nie mają architektury 3D serca, kluczowej dla skoordynowanego przewodnictwa elektrycznego i generowania siły mechanicznej, i nie mogą naśladować rytmicznych cykli skurczowo-relaksacyjnych ani dynamiki perfuzji krytycznej^{dla dostarczania tlenu} i składników odżywczych. Z drugiej strony, modele in vivo dostarczają najbardziej istotnych fizjologicznie informacji, ale wiążą się z poważnymi wyzwaniami etycznymi, administracyjnymi i technicznymi, w tym koniecznością intensywnego szkolenia, wyrafinowanymi konfiguracjami chirurgicznymi i zgodnością z rygorystycznymi ramami regulacyjnymi¹⁰.

Aby wypełnić tę lukę, modele serca ex vivo, takie jak perfundowane przez Langendorffa serce dorosłego szczura, stanowią atrakcyjną alternatywę dla badań naukowych^11,12. Modele te łączą fizjologiczne znaczenie systemów in vivo z kontrolowalnością i dostępnością konfiguracji in vitro. Izolując serce i utrzymując je w stanie funkcjonalnym, aparat Langendorffa umożliwia naukowcom prowadzenie badań elektrofizjologii serca o wysokiej wierności w precyzyjnie kontrolowanych warunkach. Brak zmiennych ogólnoustrojowych, takich jak bodźce nerwowe i krążące hormony, upraszcza interpretację wyników przy jednoczesnym zachowaniu kluczowych aspektów fizjologii serca. Ponadto modele ex vivo łagodzą wiele problemów etycznych i zmniejszają obciążenie zasobów, co czyni je wszechstronną i praktyczną platformą dla badań translacyjnych¹³.

Oprócz potencjału translacyjnego, protokół ten wyznacza punkt odniesienia dla oceny wydajności materiałów. Poprzez włączenie reprezentatywnych strategii materiałowych, takich jak platformy optoelektroniczne do bezprzewodowej fotostymulacji oraz systemy elektroniczne do przewodowej stymulacji i rejestracji, ustanawia powtarzalne ramy dla badań porównawczych. Ta standaryzacja nie tylko ułatwia innowacje, ale także zwiększa odtwarzalność i wiarygodność wyników we wszystkich grupach badawczych. W przeszłości wiele wysokowydajnych fotoelektrod i elektrod okazało się bardzo obiecujących dla badań bioelektrycznych, takich jak PEDOT: PSS¹⁴, MXene¹⁵, tlenki irydu¹⁶, platyna¹⁷, molibden¹⁸, krzem 19,20,21, kropki kwantowe 22,23,24 i półprzewodniki organiczne ²⁵. W tym przypadku protokół ten przedstawia reprezentatywne i najnowocześniejsze materiały, w tym nanoporowaty krzem²⁶, nanoporowaty węgiel²⁷ i elastyczne złote matryce wieloelektrodowe przypominające siatkę (MEA)^28,29, integrując się z protokołem w celu zademonstrowania swoich możliwości w dwukierunkowych interfejsach serca. Materiały te umożliwiają stymulację supraprogową o niskiej intensywności, wysoką rozdzielczość czasoprzestrzenną i zapisy o wysokim SNR, pokazując ich potencjał w zakresie rozwoju bioelektroniki serca. Co więcej, włączenie modelu zawału mięśnia sercowego wywołanego urazem I/R zapewnia solidne ramy dla badań istotnych dla choroby i poszukiwań terapeutycznych.

W pracy przedstawiono szczegółowe metody wytwarzania i stosowania zaawansowanych materiałów do bezołowiowej fotostymulacji oraz elektrostymulacji i wykrywania za pomocą serc szczurów ex vivo (ryc. 1A). Nanoporowate membrany krzemowe wytworzono za pomocą modelowania fotolitograficznego, reaktywnego trawienia jonowego (RIE) i uwalniania buforowanego kwasu fluorowodorowego (HF) z płytek krzemowych na izolatorze (SOI) z warstwą urządzenia o grubości 5 μm, a następnie wytrawiania i przenoszenia do miękkich membran polidimetylosiloksanu (PDMS)²⁶. Na potrzeby stymulacji elektrycznej i rejestracji nanoporowaty węgiel opracowano poprzez ablację laserową inkubowanych w soli substratów celulozowych, a następnie transfer fazy wodnej i laminowanie cieplne, oferując lepsze możliwości magazynowania i wstrzykiwania ładunku w porównaniu z tradycyjnymi elektrodami złotymi²⁷. Dodatkowo, elastyczne MEA wyprodukowano na płytkach krzemowych pokrytych poliimidem przy użyciu fotolitografii, metalizacji wiązką elektronów, trawienia, enkapsulacji i procesów uwalniania, aby umożliwić przestrzennie rozdzielczą rejestrację i mapowanie nasierdzia^28,29.

Poza produkcją, protokół zapewnia protokół krok po kroku do izolacji, perfuzji, monitorowania i łączenia się z urządzeniami optycznymi i elektrycznymi serca dorosłego szczura. Urządzenia przetestowano na izolowanych sercach, wykazując reprezentatywne wyniki w stymulacji i zapisie do oceny elektrofizjologicznej. Protokół ten wprowadza również metodę tworzenia modelu zawału mięśnia sercowego za pomocą I/R, zwalidowanego przez zapisy fizjologiczne, barwienie i oceny morfologiczne. Ta kompleksowa metodologia ustanawia powtarzalne ramy oceny materiałów i urządzeń w biointerfejsach serca. Rysunek 1B-D przedstawia procesy wytwarzania materiałów do oceny w tym modelu serca ex vivo. Rysunek 2A-C przedstawia oczekiwane wyniki na zdjęciach urządzeń w stanie poprodukcyjnym.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Chicago (numer protokołu 72378).

1. Wytwarzanie nanoporowatej membrany krzemowej (rysunek 1B, rysunek 2A, rysunek 3)

1. Zaprojektuj wzór fotomaski w oprogramowaniu AutoCAD (Rysunek 3). Upewnij się, że rozmiar urządzenia jest zgodny ze skalą długości celu biologicznego. W przypadku serca szczura użyj urządzenia o rozmiarze 2 - 10 mm. W projekcie dodaj małe układy otworów o średnicy 20 - 100 μm, aby ułatwić uwalnianie warstwy urządzenia Si w buforowanym HF. Wykonaj trzy duże otwory o średnicy 200 - 1000 μm, tworząc chiralną literę L, aby pomóc zidentyfikować właściwą stronę membrany.
2. Wyczyść wafel SOI acetonem i alkoholem izopropylowym (IPA) przez 3 minuty każdy w kąpieli ultradźwiękowej. Pieczenie odwadniające w temperaturze 200 °C przez 20 minut na gorącej płycie.
3. Wirować gruby dodatni opór AZ40XT-11D przy 3000 obr./min przez 45 s, piec w temperaturze 115 °C przez 3 min. Uważaj, aby nie wylać zbyt dużo fotorezystu na wafel. Po odwirowaniu powłoki usuń pozostałości z tyłu wafla za pomocą wacików acetonowych.
   UWAGA: AZ40XT-11D to bardzo lepki dodatni fotorezyst.
4. Użyj bezpośredniego nagrywarki Heidelberg MLA150, aby naświetlić wzór fotorezystu przy 375 nm i dawce 800 mJ/^cm2. Pieczenie poekspozycyjne należy wykonywać w temperaturze 110 °C przez 2 minuty.
5. Opracuj wzór w wywoływaczu AZ 300MIF przez 2 minuty. Opłucz wafel wodą dejonizowaną (DI) przez 60 s, a następnie wysusz powietrzem_N2 .
6. Wytrawiaj odkryty SOI za pomocą procesu RIE SF₆/CHF₃ (20 sccm:50 sccm) przez 12 minut przy użyciu plazmy sprzężonej indukcyjnie o mocy 600 W i częstotliwości radiowej 60 W w indukcyjnie sprzężonym plazmowym wytrawiaczu fluorkowym o ciśnieniu w komorze 10 mT, co daje szybkość trawienia około 660 nm/min.
7. Usunąć fotorezystu za pomocą AZ NMP w kąpieli ultradźwiękowej o temperaturze 80 °C przez 10 minut i oczyścić płytkę w łaźni ultradźwiękowej przez 3 minuty w acetonie, a następnie 3 minuty w IPA i wysuszyć przy użyciu sprężonego azotu.
8. Zanurz próbkę w buforowanym HF w temperaturze pokojowej, aby wyeliminować zakopane warstwy tlenku. Urządzenie zwalnia się w ciągu 4 - 8 godzin. Nieznacznie zwiększyć temperaturę roztworu (40 °C), aby ułatwić uwalnianie.
9. Ostrożnie przenieś uwolnione membrany z bibułą filtracyjną o wymiarach 1 cm x 1 cm do dwóch oddzielnych łaźni wodnych DI sekwencyjnie, aby usunąć wszelkie pozostałości HF.
   UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Zanurzyć membranę w kąpieli IPA w celu przechowywania w temperaturze 4 °C.
10. Przenieść membranę za pomocą bibuły filtracyjnej na szalkę Petriego z wodą dejonizowaną (DI). Membrana będzie unosić się na powierzchni wody ze względu na hydrofobowość i napięcie powierzchniowe.
    UWAGA: Membrany silikonowe mogą rygorystycznie przemieszczać się z IPA do wody ze względu na efekt Marangoni³⁰.
11. Na oddzielnej szalce Petriego przygotować roztwór do wytrawiania barwiący zawierający stosunek objętościowy stężonego HF i stężonego kwasu azotowego w stosunku 100:1 (np. 10 ml HF i 0,1 ml HNO₃). Dobrze wymieszaj przed wytrawianiem.
12. Przenieść membranę z bibułą filtracyjną do roztworu do wytrawiania i wytrawiać przez 30 s. Zwróć uwagę na stronę membrany Si, zwracając uwagę na orientację litery L utworzoną przez trzy główne otwory. Membrana Si powinna unosić się na wytrawiaczu, gdzie wytrawiona jest tylko jedna strona membrany.
13. Przenieś membranę z bibułą filtracyjną do dwóch oddzielnych naczyń na wodę DI, aby zmyć pozostałości HF.
    UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Przenieść membranę do IPA w celu przechowywania w temperaturze 4 °C.
14. Wykonaj podłoże nośne za pomocą cienkiego PDMS. Wymieszać część A (polimer bazowy) i część B (utwardzacz) w stosunku wagowym 10:1 i odgazowywać przez 30 minut.
15. Warstwa protektorowa z PMMA (495 A6) na szkiełku szkiełkowym z prędkością 2 000 obr./min przez 45 s. Piec w temperaturze 180 °C przez 60 s.
16. Wirowanie PDMS z prędkością 4 500 obr./min przez 45 s na szkle pokrytym PMMA, co powinno skutkować grubością 10 - 20 μm. Utwardzać w piekarniku lub na płycie grzejnej o temperaturze 80 °C przez 2 godziny.
    UWAGA: Aby złagodzić uszkodzenia mechaniczne, PDMS został użyty jako miękkie podłoże do umieszczenia nanoporowatych membran krzemowych, zapewniając ochronę przed potencjalnymi uszkodzeniami spowodowanymi bezpośrednią obsługą pęsetą.
17. Przenieś wytrawioną membranę Si z IPA do PDMS. Użyj czystej chusteczki, aby usunąć nadmiar IPA, a membrana Si mocno przylgnie do PDMS po odparowaniu IPA. Zwróć uwagę na stronę membrany Si, identyfikując orientację litery L utworzoną przez trzy główne otwory. Wytrawiony porowaty Si powinien być skierowany na zewnątrz, a nieusieciowany Si powinien łączyć się z PDMS.
18. Przetnij PDMS obwodowo za pomocą żyletki, która zawiera membranę Si. Pozostaw wystarczająco dużo miejsca i uważaj, aby nie uszkodzić membrany Si.
19. Namocz urządzenie w acetonie, aż Si/PDMS zostanie zwolniony. Unikaj zbyt długiego moczenia, ponieważ może to spowodować obrzęk PDMS. Opłucz go wodą DI i osusz N₂. Wykonać obróbkę plazmową O₂ przy 400 W przez 10 min.

2. Wytwarzanie elastycznych układów mikroelektrod (Rysunek 1C, Rysunek 2B, Rysunek 4)

1. Projektowanie struktury elastycznych MEA w programie AutoCAD (Rysunek 4). Przedstawiamy dwie różne konstrukcje z tym samym obszarem projekcji elektrody, ale różnymi strukturami podłoża (Rysunek 2B, Rysunek 4).
2. Podłoże wafla krzemowego należy oczyścić w acetonie i IPA przez 3 minuty w kąpieli ultradźwiękowej.
   UWAGA: Ten protokół nie wymaga dodatkowej obróbki powierzchni w celu zwiększenia przyczepności między poliimidem (PI) a płytką Si w celu ułatwienia uwalniania urządzenia. W razie potrzeby można zastosować obróbkę plazmą tlenową w celu zwiększenia przyczepności.
3. Wlać 4 ml roztworu prekursora PI poli(piromelitu dianbezwodnika-co-4,4′-oksydianiliny) na płytkę. Wiruj wafel z prędkością 1,500 obr./min przez 45 s. Użyj NMP lub acetonu, aby usunąć prekursor z tyłu płytki.
4. Piec w temperaturze 110 °C przez 3 minuty, a następnie w temperaturze 180 °C przez 3 minuty. Utwardź wafel pokryty PI w piecu rezystancyjnym w trybie profilowym. Zacznij od temperatury pokojowej, podgrzej do 250 °C z prędkością 4 °C/min i przytrzymaj przez 30 minut. Następnie podgrzej wafel do 350 °C z prędkością narastania 2,5 °C/min i utrzymuj w temperaturze 350 °C przez 60 minut, a następnie powoli schładzaj do temperatury pokojowej. Rezultatem jest folia PI o grubości około 5 μm.
5. Wiruj płytkę pokrytą PI za pomocą AZ nlof 2020 z prędkością 2,000 obr./min przez 45 s. Piecz wafelek w temperaturze 110°C przez 2 min. Użyj bezpośredniego nagrywarki Heidelberg MLA150, aby naświetlić wzór fotorezystu przy 375 nm i dawce 200 mJ/^cm2.
6. Pieczenie poekspozycyjne należy wykonywać w temperaturze 110 °C przez 2 minuty. Opracuj wzór w AZ 300MIF Developer przez 1 minutę. Opłucz wafel wodą DI przez 60 s, a następnie wysusz powietrzem_N2 .
7. Osadzanie 10 nm tytanu i 200 nm złota za pomocą parownika z wiązką elektroniczną. Usunąć fotorezyst, używając AZ NMP w kąpieli w temperaturze 80 °C przez 3 godziny i oczyścić płytkę w kąpieli ultradźwiękowej przez 3 minuty w acetonie, a następnie 3 minuty w IPA i wysuszyć przy użyciu sprężonego azotu.
8. Wiruj gruby dodatni rezystor AZ40XT-11D z prędkością 3,000 obr./min przez 45 s. Wyczyść fotorezystor na tylnej stronie wafla za pomocą acetonu. Piecz wafelek w temperaturze 115°C przez 3 min.
9. Użyj bezpośredniego nagrywarki Heidelberg MLA150, aby naświetlić wzór fotorezystu przy 375 nm i dawce 800 mJ/^cm2. Pieczenie poekspozycyjne należy wykonywać w temperaturze 110 °C przez 2 minuty.
10. Opracuj wzór w AZ 300MIF Developer przez 3 minuty. Opłucz wafel wodą DI przez 60 s, a następnie wysusz powietrzem_N2 .
11. Wytrawiaj odkryte PI za pomocą procesu RIE SF₆/CHF₃ (20 sccm:50 sccm) przez 20 minut z plazmą sprzężoną indukcyjnie o mocy 600 W i częstotliwości radiowej 60 W w indukcyjnie sprzężonym plazmowym wytrawiaczu fluorkowym o ciśnieniu w komorze 10 mT.
12. Usunąć fotorezystu za pomocą AZ NMP w kąpieli w temperaturze 80 °C przez 10 minut i oczyścić płytkę łagodną sonikacją przez 3 minuty w acetonie, a następnie 3 minuty w IPA i wysuszyć sprężonym azotem.
    UWAGA: Użyj ultradźwięków o małej mocy, aby uniknąć odłączenia urządzenia. Unikaj sonikacji, jeśli PI wykazuje oznaki odłączenia.
13. Przetwarzaj wafel w piecu do heksametyldisilazanu (HMDS) w celu zastosowania obróbki HMDS. Wirowanie płaszcza SU-8 2002 przy 2 000 obr./min przez 45 s. Daje to grubość SU8 około 2,5 μm.
14. Piecz wafelek w temperaturze 95°C przez 20 min. Użyj bezpośredniego nagrywarki Heidelberg MLA150, aby naświetlić wzór fotorezystu przy 375 nm i dawce 950 mJ/^cm2.
15. Piecz wafelek w temperaturze 95°C przez 12 minut.
16. Rozwijaj wzór w SU-8 Developer przez 1 minutę. Opłucz go wodą IPA i DI i osusz gazem_N2 . Jeśli podczas płukania IPA na wafli pojawią się białe plamy, namocz wafel w wywoływaczu SU8, aż białe plamy znikną.
17. Piecz na twardo w temperaturze 160 °C przez noc. Używaj krótszych czasów pieczenia (~30 min) do ostrych eksperymentów. Nie piec w temperaturze poniżej 150 °C ani powyżej 200 °C. Oderwij elastyczny MEA na podparciu PI od podłoża.

3. Wytwarzanie nanoporowatego węgla ( Rysunek 1D, Rysunek 2C, Rysunek 5)

1. Zaprojektuj wzór folii węglowej w oprogramowaniu do projektowania (rysunek 5).
   UWAGA: Ta metoda zawiera protokół wytwarzania dla dwóch rodzajów elektrod: elektrody stymulacyjnej na bazie nanoporowatego węgla i elektrody czujnikowej.
2. Zaimpregnować bibułę filtracyjną wodnymi roztworami boranu sodu (0,15 M, pH 9,4) przez 1 godzinę, a następnie wysuszyć w temperaturze 60 °C przez noc (rysunek 1D).
   UWAGA: Bibuła filtracyjna Whatman klasy 1 służyła przede wszystkim jako reprezentatywne porowate podłoże na bazie włókien. Boran sodu jest wprowadzany do włókien celulozowych po procesie impregnacji i suszenia. Sól działa jak katalizatory, które ułatwiają fotochemiczną karbonizację podczas syntezy laserowej²⁷.
3. Wykonaj syntezę laserową za pomocą lasera CO₂ z wcześniej zaprojektowanymi wzorami (rysunek 5A). Przeprowadzanie patterningu w trybie rastrowym ze zoptymalizowanymi parametrami: moc = 1,8 W; prędkość = 1,6 cm/s; punktów na cal = 1000.
4. Przygotować folię z politereftalanu etylenu (PET) o grubości 50 μm i oczyścić folię acetonem i alkoholem izopropylowym (IPA) przez 3 minuty każdy w kąpieli ultradźwiękowej.
5. Osadzanie 5 nm tytanu i 100 nm złota za pomocą parownika wiązki elektronicznej. Zastosuj procedurę przenoszenia fazy wodnej, aby przenieść MEA na folię PET (12,5 μm).
   UWAGA: Transfer fazy wodnej przeprowadzono przy użyciu dwóch następujących po sobie procesów: separacji fazy wodnej i transferu kapilarnego.
6. Podłoża papierowe należy stopniowo zanurzać w wodzie demineralizowanej w celu rozwarstwienia podczas separacji faz wodnych.
   UWAGA: Energia odkształcenia wywołana pęcznieniem celulozy ułatwiła oddzielenie membrany węglowej od podłoża nośnego w czasie krótszym niż sekunda, powodując jej unoszenie się na powierzchni wody.
7. Użyj podłoża nośnego, np. folii PET, do przenoszenia wzorów w środowisku wodnym podczas transferu kapilarnego. Zanurz podłoże w wodzie i doprowadź je do kontaktu z jednym końcem pożądanej membrany węglowej, aby utworzyć linię kontaktową (front transferowy). Następnie przytrzymaj podłoże ręką i poruszaj się w kierunku pochylonym lub pionowym z małą prędkością.
   UWAGA: W przypadku hydrofobowych podłoży nośnych można zastosować siłę zewnętrzną lub obróbkę plazmową O₂ , aby pomóc w tworzeniu linii jezdnej.
8. Po przeniesieniu nanieść około 20 μl roztworu polimeru kwasu perfluorosulfonowego (PFSA) (o stężeniu ~5% w mieszaninie niższych alkoholi alifatycznych i wody) na wzory węglowe i pozostawić do wyschnięcia w warunkach temperatury pokojowej (23 °C) i ciśnienia (1 atm) w celu utrwalenia.
9. Zabezpiecz elektrodę stymulacyjną na bazie nanoporowatego węgla, łącząc ją z drutem Cu za pomocą przewodzącego kleju srebrnego. Osłonić odsłonięte połączenie między drutem Cu a elektrodą za pomocą kleju silikonowego, aby zapewnić izolację i stabilność. Po utwardzeniu przez 3 godziny w temperaturze pokojowej elektroda stymulująca jest gotowa do użycia. W tym miejscu eksperyment można wstrzymać.
10. Zaprojektuj wzór węgla i MEA w programie AutoCAD (Rysunek 5B). Wykonaj układy mikroelektrod 4 x 4 na folii PI 25 μm, stosując standardową procedurę fotolitografii opisaną w kroku 2.
    UWAGA: Folię PI można utworzyć za pomocą prekursora PI lub poprzez laminowanie komercyjnej folii PI na płytce Si za pomocą fotorezystu AZ2020. Protokół dla fotolitografii i osadzania metali jest taki sam jak w kroku 2.
11. Stwórz monolityczną membranę węglową (2 cm x 2 cm) na podłożu papierowym po impregnacji solą i pisaniu laserowym, jak w krokach 3.1-3.3. Przenieś wzór węglowy na wstępnie zaprojektowaną folię nośną PET przy użyciu standardowej metody przenoszenia fazy wodnej, jak w krokach 3.6-3.9.
12. Nałożyć 10% wagowy roztwór polietylenu-ko-octanu winylu (EVA) w heksanie na wzór węglowy i poczekać do wyschnięcia w warunkach temperatury pokojowej (23 °C) i ciśnienia (1 atm). Zaprojektuj i wytnij laserowo szablon PET o grubości 10 μm (z powłoką EVA od spodu) z 16 otworami wyrównanymi do wzoru MEA, służącymi jako warstwa enkapsulacji.
13. Dopasuj MEA, warstwę hermetyzacji PET i membranę węglową do wspornika PET. Naciśnij zespół za pomocą dostępnego w handlu gorącego laminatora w temperaturze przetwarzania 120 °C w celu przeniesienia i hermetyzacji.
14. Schłodzić elektrodę detekcyjną z nanoporowatym węglem do temperatury pokojowej, usunąć pozostałości i spłukać ją etanolem i wodą 3x przed użyciem.

4. Izolacja, perfuzja i monitorowanie serca szczura (ryc. 6)

1. Przygotuj szczury przed ekstrakcją serca (ryc. 6A). W protokole tym wykorzystano samce szczurów CD/SD w wieku od 3 do 4 miesięcy, uzyskane z Charles River.
2. Przygotować roztwór Tyrode'a kwasu N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowego (HEPES), rozpuszczając substancje chemiczne zgodnie z tabelą 1. Dostosuj pH do 7,2-7,4 za pomocą 2M NaOH. Wstępnie natlenić przez bulgotanie tlenu gazowego przez 0,5-1 godziny i kontynuować natlenianie do końca eksperymentów.
3. Umieść trzy probówki zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS, bez wapnia, bez magnezu) na lodzie. Przygotuj czyste narzędzia chirurgiczne (ostre nożyczki, wygięte nożyczki, dwa hemostatyki, ostra pęseta, dwie pary małych pęset).
   UWAGA: Operacja nie jest przeznaczona do przeżycia, więc bezpłodność nie jest konieczna.
4. Dorosłe samce szczurów CD/SD o wadze od 400 do 500 g należy odebrać z obiektu dla zwierząt. Podawać 0,5 ml heparyny (1000 j.m./kg) dootrzewnowo do podbrzusza. Użyj grubych rękawiczek, aby przytrzymać szczura dla ochrony.
5. Chrap szczura za górną część pleców, tak aby brzuch był odsłonięty. Trzymaj szczura mocno, ale bez nadmiernej siły, aby nie zranić zwierzęcia. Szybko i dokładnie wstrzyknąć roztwór heparyny. Odczekaj 20-30 minut. W międzyczasie przygotuj aparat Langendorffa.
   UWAGA: Szczura można wcześniej znieczulić, aby zapewnić prawidłowy etap przygotowania do zabiegu chirurgicznego.
6. Przed ponownym napełnieniem roztworu HEPES Tyrode umyj worek do terapii dożylnej (IV) wodą i całkowicie go wysusz, aby zapewnić właściwy ostateczny skład. Napełnij worek wstępnie natlenionym roztworem HEPES Tyrode.
7. Włączyć termostat i cyrkulację wody w aparacie Langendorffa w temperaturze 37 °C (rysunek 6A). Przygotuj kaniulę, zszyj i umieść szalkę Petriego na zimnym opakowaniu w celu wycięcia tkanki. Zagruntuj kaniulę lodowatym HBSS przed cięciem.
8. Przygotuj się do wykonania torakotomii szczura (ryc. 6B). Znieczulij zwierzę izofluranem w konfiguracji słoika dzwonowego. Umieść 8 do 10 ml izofrubranu w 50 ml probówce wypełnionej gazikiem. Zwierzę należy zamknąć w otwartej probówce (z izofluranem) w pojemniku.
9. Obserwuj postęp znieczulenia, testując odruch szczypania palca u nogi. Zwierzęta zostaną poddane narkozie i stracą przytomność w ciągu 2-3 minut. Przenieś go na deskę chirurgiczną natychmiast po utracie przytomności.
10. Przenieś zwierzę na tablicę operacyjną. Połóż go na plecach i umieść 5 ml izofluranu w probówce o pojemności 50 ml wypełnionej gazikiem nad pyskiem szczura. Potwierdź znieczulenie ogólne, szczypiąc jedną z łap. Kontynuuj tylko wtedy, gdy nie odnotowano żadnej odpowiedzi.
11. Przymocuj kończyny górne i dolne do deski chirurgicznej. Wykonaj nacięcie (~ 5 cm), aby otworzyć klatkę piersiową szczura tuż pod klatką piersiową. Ostrożnie przeciąć przeponę, aby odsłonić serce i płuca.
12. Przetnij żebra po obu stronach, aby całkowicie otworzyć klatkę piersiową i zapewnić pełny dostęp. Zabezpiecz klatkę piersiową na mostku za pomocą hemostatu. Przytrzymaj żyłę główną od dołu serca za pomocą hemostatu. Usuń serce, przecinając pod hemostatem zgiętymi nożyczkami jak najbliżej dna klatki piersiowej.
13. Przenieś serce do lodowatego HBSS. Zminimalizuj czas trwania tego kroku, aby zapobiec długotrwałym przerwom w dostarczaniu tlenu do kurczącego się serca.
14. Przygotuj się do wykonania perfuzji Langendorffa i monitorowania. Napełnij całkowicie kaniulę i szalkę Petriego lodowatym HBSS. Upewnij się, że w systemie nie ma pęcherzyków powietrza.
15. Przenieś serce na szalkę Petriego wstępnie wypełnioną HBSS w celu pokrojenia. Za pomocą pęsety i nożyczek usuń płuca i inną tkankę łączną (ryc. 6C).
    UWAGA: rozwarstwienie jest zalecane w procedurze cięcia, aby zapobiec potencjalnym uszkodzeniom serca. Do cięcia sąsiednich tkanek użyj dwóch nożyczek i ostrożnie rozerwij tkankę.
16. Zlokalizuj aortę, naciskając na serce i śledząc ścieżkę krwi wychodzącej. Przeciąć pod pierwszą tętnicą wstępującą i kanulować aortę, jeśli łuk aorty jest zachowany podczas ekstrakcji (ryc. 6D). Przymocuj aortę do kaniuli za pomocą podwójnego węzła.
    UWAGA: Unikaj wkładania kaniuli zbyt głęboko, aby upewnić się, że zawór pozostaje zamknięty. Nie należy umieszczać szwu zbyt nisko, ponieważ może to spowodować zablokowanie tętnic wieńcowych.
17. Zalać aparat Langendorffa wstępnie natlenionym roztworem roboczym. Otwórz przepływ buforowy i przymocuj kaniulę do aparatu (rysunek 6E). Upewnij się, że nie dostały się pęcherzyki powietrza. Na tym etapie serce zaczyna się kurczyć.
    UWAGA: Początkowo z komór może wytrysnąć trochę buforu, ale nie oczekuje się nadmiernego wycieku. W razie potrzeby wyreguluj szew, aby zapobiec wyciekowi bufora. Na tym etapie nie zaobserwuje się migotania serca, jeśli operacja i przygotowanie zostaną przeprowadzone prawidłowo.
18. Odetnij przedsionki. Opróżnij balon przed włożeniem go do lewej komory, a następnie napełnij go wodą za pomocą podłączonej strzykawki.
19. Podłącz sondy BP-100 do linii perfuzyjnej i balonów wypełnionych wodą, aby monitorować odpowiednio perfuzję i ciśnienie w lewej komorze (LVP) (ryc. 6F).
    UWAGA: Sondy BP-100 wymagają kalibracji przed użyciem. Bąbelki w balonach muszą zostać usunięte, aby zapewnić precyzyjne wykrywanie ciśnienia.
20. Monitoruj ciśnienie buforowe HEPES Tyrode i linię bazową LVP. Upewnij się, że ciśnienie buforowe jest utrzymywane w optymalnym zakresie 80-100 mmHg. Dostosuj podstawowy LVP do około 20 mmHg, modyfikując objętość wody wstrzykiwanej do balonu (Rysunek 6F).
21. Podłącz elektrody EKG. Uziemić kaniulę i umieścić elektrodę po bokach, na górze lub na wierzchołku w zależności od preferencji (Rysunek 6F).
22. Wzmocnij wszystkie sygnały (perfuzję, ciśnienie w lewej komorze i EKG) za pomocą wzmacniacza IA-400D i połączonego z komputerem za pomocą digitizera z oprogramowaniem Clampex (Rysunek 6F).

5. Tworzenie zawału mięśnia sercowego za pomocą procesu IR (ryc. 6G, ryc. 7)

1. Napełnij podgrzewaną komorę wstępnie podgrzanym buforem HEPES Tyrode o temperaturze 37 °C. Zanurz serce w buforze w ogrzewanej komorze i wyreguluj kurek, aby zatrzymać przepływ buforu, wywołując globalne niedokrwienie. Dostosuj czas trwania niedokrwienia w oparciu o konkretne cele eksperymentu.
2. Przekręć kurek, aby przywrócić przepływ buforowy do serca po 30 minutach niedokrwienia, inicjując reperfuzję. Pozwól na reperfuzję serca przez 45 minut przed zakończeniem eksperymentu w celu barwienia w celu oceny wielkości zawału (ryc. 6G).
   UWAGA: Czas niedokrwienia lub reperfuzji określa się na podstawie celów eksperymentalnych.
3. Sprawdź powodzenie indukcji niedokrwienia, obserwując zmniejszenie częstości akcji serca i nieregularne wzorce EKG (ryc. 7A). Obserwuje się arytmię lub migotanie komór.
4. Powoli podać 10 ml HBSS o temperaturze 4 °C przez boczny port zaworu odcinającego w celu zatrzymania pracy serca. Wyjmij serce z kolumny perfuzyjnej, odetnij pozostałą tkankę przedsionkową i umieść serce w matrycy do krojenia tkanek.
5. Przykryj matrycę przezroczystą folią i zamroź serce w temperaturze -80 °C przez około 8 minut lub do momentu, gdy osiągnie konsystencję pianki lekarskiej. Wyjmij matrycę do krojenia tkanek z zamrażarki i włóż żyletki, aby pokroić serce na kawałki o grubości 2 mm.
6. Wyjmować plastry tkanek z matrycy do krojenia jeden po drugim i przechowywać je w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne do eksperymentów biochemicznych.
7. Wykonaj barwienie zawału (ryc. 7B). Plastry serca inkubować w 10 ml 1% w/v chlorku trifenylotetrazolu (TTC) w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
8. Przenieś plasterek tkanki do 10% buforowanej formaliny i pozwól jej utrwalić się w temperaturze pokojowej przez noc. Aby uzyskać najlepsze wyniki, usuń serce z formaliny i zobrazuj tkankę w ciągu 24 godzin. Na tym etapie zminimalizuj ekspozycję na światło, aby zapobiec degradacji plamy.
9. Sfotografuj poplamiony plasterek i użyj oprogramowania, takiego jak ImageJ, aby oszacować rozmiar zawału.

6. Ustanowienie dwukierunkowych interfejsów optoelektrycznych między urządzeniami a tkanką serca (ryc. 8, ryc. 9)

1. Umieść silikonową membranę optoelektroniczną w żądanym miejscu w celu stymulacji. Membrana silikonowa samoczynnie przyczepia się do nasierdzia pod wpływem siły kapilarnej (ryc. 8A). Jeśli mocowanie jest trudne, użyj klejów do mokrych tkanek, aby pomóc w mocowaniu.
   UWAGA: Zmniejszenie szybkości perfuzji może zmniejszyć ilość wody na powierzchni serca, co ułatwia przyczepianie. Po przymocowaniu do powierzchni serca membrana silikonowa zazwyczaj przyczepia się do wcześniej określonej pozycji podczas operacji.
2. Podłącz elektrody do systemów RHD lub innych platform elektrofizjologicznych w celu rejestracji danych. MEA wyposażone są w 16-kanałowe pady I/O o rastrze 0,5 mm na jednym końcu, które są połączone za pomocą złącza ZIF (Zero-Insertion-Force) z płytką adaptera. Płytka adaptera jest następnie połączona ze sceną czołową za pomocą złącza Omnetics.
3. Umieść elastyczne MEA na powierzchniach komorowych izolowanego serca szczura (ryc. 8A). Umieść MEA w oknie, jeśli używasz membrany silikonowej w kształcie okna (Rysunek 8B).
4. Zaprogramuj źródło lasera 635 nm z żądaną częstotliwością (np. 4 Hz) i cyklem pracy (np. 0,4%, czas trwania impulsu 1 ms) za pomocą sygnałów logiki tranzystor-tranzystor (TTL). Skoncentruj plamkę lasera na membranie silikonowej, o rozmiarze plamki około 1 mm. Nosić ochronne okulary ochronne do lasera. Zacznij od niskiej intensywności ustawiania ostrości.
5. Uruchom protokół nagrywania i stymulacji. Stopniowo zwiększaj intensywność lasera, aż do momentu zaobserwowania nieprzerwanego tempa nadpisywania (Rysunek 8C).
   UWAGA: W standardach tego protokołu określa on próg intensywności, który umożliwia laser przez 10 s nieprzerwanego stymulacji.
6. Zaprogramuj profil lasera z różnymi czasami trwania impulsów, aby uzyskać intensywność i profil czasu trwania w celu porównania wydajności urządzenia (rysunek 8D). Konfiguracja umożliwia wielokanałowy zapis EKG, TTL i LVP (ryc. 8E).
7. Zmień położenie membrany krzemowej lub lokalizacji plamki świetlnej i powtórz kroki 6.3-6.6, aby zbadać, jak różne lokalizacje stymulacji wpływają na przebiegi w tempie i przewodzenie serca (ryc. 9A).
8. Zidentyfikuj piki QRS w tempie z każdego miejsca nagrywania, aby skonstruować mapę izoochrony lub opóźnienia aktywacji. Zidentyfikuj najwcześniejszy szczyt zespołu QRS i ustaw tę lokalizację jako zerowe opóźnienie, aby wykreślić mapę opóźnienia aktywacji (Rysunek 9B-C).
   UWAGA: Podczas gdy mapa opóźnienia aktywacji w rytmie zatokowym (bez stymulacji) może służyć jako odniesienie, jej wzór może się znacznie różnić w zależności od stanu serca i umiejscowienia MEA^18,30. Wyniki są bardziej znaczące, gdy obecne jest wyraźne źródło stymulacji, takie jak stymulacja zewnętrzna.

7. Ustanowienie dwukierunkowych interfejsów elektrycznych między urządzeniami a tkanką serca ( Rysunek 10)

1. Połącz elektrody stymulacyjne (0,5 cm x 0,5 cm) w konfiguracji dwuelektrodowej, umieszczając elektrodę roboczą na lewej ścianie komory, podczas gdy przeciwelektroda znajduje się na prawej ścianie komory.
2. Przesyłaj przebiegi prądu prostokątnego (np. 1 mA, czas trwania impulsu 1 ms) przez potencjostat aż do pomyślnego stymulacji (Rysunek 10A-B). Wykonaj testy, aby uzyskać wykresy prądu stymulacji w funkcji czasu trwania impulsu i napięcia stymulacji w funkcji czasu trwania impulsu, aby ocenić skuteczność stymulacji materiału (rysunek 10C-D).
3. Wykonaj zapis elektryczny przy użyciu układu mikroelektrod 4 x 4 (odstęp 2 mm między elektrodami) i nagrany za pomocą karty interfejsu USB RHD i 16-kanałowej sceny czołowej RHD wejściowej. Nagrywaj sygnały z prędkością 10 kS/s w paśmie 0,1-100 Hz.
4. Zmierz szum każdej elektrody rejestrującej (rysunek 10E). Oblicz stosunek sygnału do szumu, korzystając z następującego równania (rysunek 10F):
   lub
   gdzie Sygnał to amplituda sygnału, a_szum standardowy to odchylenie standardowe poziomów szumów. W nagraniu filtr wycinający 60 Hz jest wyłączony, aby odzwierciedlić surowe wyniki.
5. Wykonaj dodatkową analizę i narysuj mapy izochronne propagacji elektrycznej za pomocą Pythona.
6. Określ znacznik czasowy szczytowego odchylenia (zespół QRS w stymulacji) dla każdego skurczu i oblicz średnią dla wielu sygnałów. Użyj interpolacji gaussowskiej do renderowania mapy, aby poprawić czytelność.

Wyniki

Elektrofizjologia stymulacji szerokiej gamy materiałów optoelektronicznych i elektronicznych może być skutecznie zwalidowana za pomocą systemu serca ex vivo , który zapewnia wygodną i kontrolowaną konfigurację (ryc. 1A). Materiały o wysokiej iniekcji ładunku, takie jak porowaty krzem i porowaty węgiel, ułatwiają modulację bioelektryczną przy niskiej intensywności optycznej i stymulacji niskonapięciowej, zapewniając bezpieczeństwo i zrównoważoną ładowanie, pojemnościową pracę.

Nanoporowaty krzem wykazuje znacznie wyższe generowanie fotoprądu w porównaniu z konwencjonalnymi strukturami krzemowymi, takimi jak złącza p-n lub p-i-n (rysunek 11A), ze względu na heterozłącze²⁰ z włączoną porowatością, zwiększoną zdolność magazynowania ładunku, zmniejszoną impedancję i lepszą absorpcję optyczną. Te głównie pojemnościowe prądy fotologiczne umożliwiają biologiczną, zrównoważoną pod względem ładunku stymulację³¹ (ryc. 12A-B), osiągając stymulację optyczną serc szczurów ex vivo przy 240 uderzeniach na minutę przy natężeniu światła 0,51 mW/^mm2 i czasie trwania impulsu 1 ms (ryc. 8C) lub zaledwie 0,167 mW/^mm2 przy czasie trwania impulsu wynoszącym 10 ms (ryc. 11B) – wartości porównywalne lub niższe niż metody optogenetyczne i znacznie poniżej progów bezpieczeństwa lasera^{31Rozdział 32}. Poniżej tych intensywności może wystąpić częściowe lub niewychwytywanie impulsów świetlnych. W przeciwieństwie do tego, inne materiały, takie jak membrany krzemowe p-i-n lub membrany krzemowe p-i-n zdobione złotem, wymagają znacznie wyższych intensywności optycznych, aby wywołać stymulację (rysunek 11B). Ciągła stymulacja nanoporowatym krzemem zwiększa skurcz mechaniczny, na co wskazuje podwyższony LVP (ryc. 8E). Ponadto, w swojej monolitycznej formie, urządzenie demonstruje wstrzykiwanie fotoprądu o wysokiej rozdzielczości przestrzennej pod zlokalizowanymi impulsami świetlnymi, umożliwiając wielomiejscowe i potencjalne badania stymulacji o losowym dostępie²⁶.

W dwukierunkowych badaniach membran krzemowych w kształcie okna (ryc. 3D, ryc. 8B) stymulacja wielomiejscowa wytwarza wyraźne profile zapisu wieloelektrodowego i wzorce przewodzenia serca, potwierdzając oryginalność propagacji fal z każdego punktu stymulacji (ryc. 9). Ta funkcja podkreśla zdolność systemu do analizy złożonych ścieżek przewodzenia serca z dużą precyzją oraz zdolność do diagnozowania nieprawidłowych chorób serca, takich jak zawał mięśnia sercowego.

Wykonane MEA mają grubość około 10 μm, zawierają makroporowate struktury lub serpentynowe połączenia w celu zminimalizowania sztywności zginania i zwiększenia elastyczności lub rozciągliwości (Rysunek 4)^33,34. Macierze składają się z 16 niezależnych miejsc nagraniowych ustawionych w konfiguracji 4 x 4, pokrywających obszar 6 mm x 6 mm. Matryce te umożliwiają bezpośredni zapis sygnału nasierdziowego w wielu miejscach na powierzchni serca. Reprezentatywne nagranie 16-kanałowe przedstawiono na rysunku 13. Mapy izochronowe zbudowane na podstawie nagrań wizualizują przewodzenie elektryczne na powierzchni serca, z lub bez stymulacji miejscowej. Miejscowa stymulacja często wywołuje opóźnienia w przewodzeniu, które zastępują wewnętrzny rytm zatokowy serca ex vivo i szlaki przewodzenia (ryc. 9B).

Nanostrukturalne materiały węglowe stanowią skuteczne rozwiązanie zwiększające wydajność urządzeń bioelektronicznych ze względu na ich wysoką zdolność magazynowania ładunku i niską impedancję (ilustracja 14). Nasza metoda transferu laserowego wspomagana solą umożliwia łatwe modelowanie i natychmiastowy transfer nanoporowatych urządzeń węglowych na elastyczne podłoża lub tradycyjne elektrody Au w celu zwiększenia wydajności bioelektroniki. Charakterystyka impedancji potwierdziła ponadto, że powłoka węglowa znacznie zmniejszyła impedancję elektrody Au o około 2 rzędy wielkości, z 7244,4 Ω do 63,1 Ω przy częstotliwości 100 Hz odnoszącej się do sygnałów EKG (rysunek 14A-B). Pojemność Helmholtza elektrody Au znacznie wzrosła po pokryciu węglem, z 0,025 mF/^cm2 do 1,98 mF/^cm2 (rysunek 14C). Zwiększenie pojemności przy użyciu tej strategii powlekania mikrokondensatorów może skutecznie obniżyć napięcie polaryzacji w porównaniu z tradycyjną elektrodą Au (ilustracja 14D).

Protokół ten ustanawia nanoporowatą platformę na bazie węgla dla skutecznych biointerfejsów w kierunku modulacji elektrycznej lub wykrywania układów sercowych (ryc. 10). W celu oceny wydajności nanoporowatej elektroniki węglowej do stymulacji serca, elektrodę Au lub Au-C umieszczono na ścianie lewej komory (LV) w celu wstrzyknięcia ładunku przy dwufazowych przebiegach prądu kwadratowego³⁵ (ryc. 10A). Po stymulacji 4 Hz (1 mA) zarówno elektrody Au, jak i Au-C osiągnęły skuteczne tempo przesterowania (ryc. 10B). Jednak znacznie wyższą amplitudę EKG, wskazującą na siłę skurczu, zaobserwowano w grupie Au-C. Obie elektrody wykazały wykładniczy spadek prądu progowego dla stymulacji o czasie trwania impulsu. Progi stymulacji, które wskazują najniższe napięcia dla efektywnej modulacji częstotliwości, zostały również zmierzone dla różnych szerokości impulsów (rysunek 10C-D). Krzywa siły-czasu trwania została zamodelowana za pomocą równania:

gdzie I(t) odnosi się do prądu bodźca w czasie trwania impulsu (t),_{I. reozasada} jest prądem progowym przy nieskończenie długim czasie trwania impulsu (reozasada), a τ jest stałą czasową błony³⁶. W obliczeniach wykorzystano minimalny ładunek niezbędny do udanej stymulacji w chronaxie jako . Q_min. Wartości określono jako 0,79 i 0,71 μC odpowiednio dla elektrod Au i Au-C (rysunek 10C). Przy prądzie stymulacji wynoszącym 4 mA/^cm2 napięcia progowe dla skutecznej stymulacji obserwowano przy napięciu 1,32 V i 0,90 V odpowiednio dla elektrod Au i Au-C (ilustracja 10D). Obniżenie napięcia progowego o 30,3% sugeruje potencjalny spadek stresu oksydacyjnego podczas długotrwałej stymulacji³¹, ułatwiając w ten sposób bezpieczniejsze zastosowania bioelektroniczne przy minimalnym uszkodzeniu tkanek. Dodatkowo opracowano 16-kanałową elektrodę Au szczepioną węglem w celu poprawy wykrywania sygnału EKG nasierdzia (ryc. 10E-F). Nanostrukturalny transfer węgla znacznie poprawił stosunek sygnału do szumu 8,0-krotnie w porównaniu z tradycyjnymi elektrodami Au, demonstrując skuteczność nanoporowatych powłok na bazie węgla w bioelektronice o wysokiej wierności.

Pomyślna indukcja modeli zawału I/R została zwalidowana na miejscu podczas eksperymentu lub po zakończeniu eksperymentu, odpowiednio poprzez monitorowanie sygnału fizjologicznego lub barwienie TTC. Po pokrojeniu i barwieniu, serce z zawałem będzie wykazywało obszar w kolorze białym, reprezentujący uszkodzenie mięśnia sercowego i odpowiadający rozmiarowi zawału (ryc. 7B). W przeciwieństwie do tego, zdrowe serce będzie pozbawione białych obszarów po barwieniu. Podczas monitorowania w czasie rzeczywistym, udany model niedokrwienia będzie wykazywał znacznie obniżone tętno, widoczne w odczytach LVP i EKG. Dodatkowo, mapowanie MEA niedokrwiennego serca ujawni zmniejszoną prędkość przewodzenia elektrycznego w poprzek nasierdzia, co spowoduje wydłużenie czasu opóźnienia³⁷ (ryc. 7A).

Rysunek 1: Schematyczna ilustracja protokołu i przepływu pracy. (A) Schematyczna ilustracja konfiguracji ex vivo serca szczura i interfejsu urządzenia. (B) Proces wytwarzania porowatej membrany silikonowej (krok 1). Wytwarzanie porowatej membrany Si rozpoczyna się od płytki SOI, w której warstwa fotorezystu jest modelowana za pomocą fotolitografii w celu zdefiniowania cech sześciokątnych. RIE selektywnie usuwa odsłonięty krzem, a następnie następuje proces liftingu w buforowanym HF w celu uwolnienia membran Si. Membrana jest poddawana wytrawianiu w roztworze na bazie HF, tworząc nanoporowatą strukturę Si. Powstała w ten sposób porowata membrana Si jest ostrożnie odłączana i przenoszona na podłoże PDMS w celu mechanicznego wsparcia. Wreszcie, obróbka plazmowa modyfikuje właściwości powierzchni w celu zwiększenia fotoprądów. (C) Proces wytwarzania elastycznych makroporowatych układów wieloelektrodowych (etap 2). Wytwarzanie elastycznych MEA rozpoczyna się od nałożenia powłoki PI na płytkę krzemową, która służy jako elastyczna warstwa podłoża. Fotowzorcowanie odbywa się za pomocą fotorezystu AZ 2020 do definiowania obszarów elektrod. Osadzanie metalu (Au/Ti) odbywa się poprzez odparowanie wiązką elektronów w celu wytworzenia ścieżek przewodzących, po którym następuje kolejny etap fotowzorcowania przy użyciu AZ 40XT-11D w celu ochrony wybranych obszarów przed RIE w celu utworzenia makroporowatego podłoża. Fotowzór SU-8 i etap twardego wypalania dodaje enkapsulację przed ostatecznym procesem startu, który uwalnia elastyczną MEA z płytki Si. (D) Przebieg pracy modelowania i transferu membrany węglowej (krok 3), obejmujący przetwarzanie włókien poprzez impregnację solą, mikrowytwarzanie poprzez syntezę laserową i wspomagane wodą przenoszenie wzoru z podłoża papierowego na inne podłoża. Rysunek 1D został zmodyfikowany w stosunku do²⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obrazy optyczne i SEM urządzeń w stanie poprodukcyjnym. (A) Przekrój poprzeczny SEM (na górze) i mikroskop optyczny (na dole) nanoporowatego Si. (B) Obrazy optyczne makroporowatych układów wieloelektrodowych o konstrukcji pustej (na górze) i serpentynowej (na dole). (C) Przekrojowy optyczny obraz mikroskopowy (na górze) i zdjęcie (na dole) zwęglonych substratów. Rysunek 2A został zmodyfikowany w stosunku do^{rysunku 26}. Rysunek 2C został zmodyfikowany w stosunku do^{rysunku 27}. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Projekty CAD urządzenia membranowego Si. Rysunek zawiera szczegółowe parametry dla (A) małych, (B) średnich, (C) dużych i (D) urządzeń z membraną krzemową w kształcie otwartego okna. Jednostka: mm. Liczba ta została zmodyfikowana z²⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Projektowanie CAD makroporowatych MEA. (A) Rysunki projektowe i adnotacje dotyczące MEA w kształcie wydrążonym. (B) Rysunki projektowe i adnotacje dotyczące MEA w kształcie serpentyny. Jednostka: mm. Rysunek 4A został zmodyfikowany z²⁶. Rysunek 4B został zmodyfikowany w stosunku do²⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Schematy i projekty układów elektrod węglowych do interfejsu serca. (A) Projekt interfejsów elektrod stymulujących (krok 3). Podczas typowej stymulacji elektrody stymulacyjne były połączone w konfiguracji dwuelektrodowej. Elektrodę roboczą (serpentynowy nanoporowaty wzór węglowy) umieszczono na ścianie lewej komory, natomiast przeciwelektrodę umieszczono na ścianie prawej komory i podłączono do podłoża. Przebiegi prądu prostokątnego były dostarczane przez potencjostat. (B) 16-kanałowe MEA do maskowania i przenoszenia elektrod węglowych (krok 3). Warstwa 1 wskazuje wzorzec Au 16-kanałowego MEA na podłożu PI. Warstwa 2 oznacza folię hermetyzacyjną PET. Liczba ta została zmodyfikowana z²⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Schematyczne i fotograficzne przedstawienie konfiguracji ex vivo i procesu eksperymentalnego. (A) Aparatura i narzędzia używane do ustawiania ex vivo , w tym stożkowe pojemniki na kolby, narzędzia chirurgiczne, systemy perfuzyjne i systemy kontroli temperatury (krok 4). (B) Proces ekstrakcji serca szczura: Znieczulić zwierzę izofluranem; Zabezpiecz ramiona szczura; otwórz klatkę piersiową szczura; Zbierz serce szczura. (C) Usunięcie otaczającej tkanki tłuszczowej z wyekstrahowanego serca w celu przygotowania go do eksperymentalnego ustawienia. (D) Przyłączenie pobranego serca do systemu perfuzji ex vivo . (E) Konfiguracja perfuzji pokazująca serce podłączone do systemu w celu symulacji warunków fizjologicznych. (F) Konfiguracja zapisu EKG serca. (G) Procesy niedokrwienno-reperfuzyjne (I/R) są demonstrowane za pomocą konfiguracji (krok 5). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 7: Porównanie zdrowego izolowanego serca z sercem I/R. (A) Opóźnienia w propagacji LVP, EKG i EKG zarejestrowano w przypadku pozorowanych zdrowych serc i serc z niedokrwieniem/reperfuzją (I/R). (B) Reprezentatywne fotografie zdrowych odcinków serca i I/R wycinkowanych chlorkiem trifenylotetrazolu (TTC) i I/R serca. Biały obszar wskazuje rozmiar obszaru zawału. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 8: Dwukierunkowa optoelektroniczna stymulacja i zapis elektryczny serca szczura ex vivo przy użyciu porowatej membrany krzemowej i elastycznych MEA. (A) Fotografia przedstawiająca przyczepienie membrany krzemowej i umieszczenie MEA w kształcie serpentyny obok błony krzemowej na sercu. (B) Fotografia przedstawiająca zamocowanie membrany krzemowej w kształcie otwartego okna oraz MEA w kształcie wklęsłym zamontowanych w okienku krzemowym. (C) Stymulacja optyczna na sercu szczura ex vivo pokazująca niewychwytywanie, częściowe i pełne wychwytywanie przy trzech różnych intensywnościach przy 240 uderzeniach na minutę i czasie trwania impulsu 1 ms. (D) Wykres intensywności w funkcji czasu trwania w celu oceny progu stymulacji urządzenia. (E) Profile stymulacji optycznej przy intensywności 0,24 mW/^mm2 i czasie trwania impulsu 10 ms. Rysunek 8B-D został zmodyfikowany z²⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Stymulacja i mapowanie wielu lokalizacji w interfejsach dwukierunkowych. (A) Położenie miejsc stymulacji i rejestracji. (B) Mapa izochroniczna pokazuje opóźnienie aktywacji sygnału elektrycznego po fotostymulacji ośmiu różnych lokalizacji na monolitycznym urządzeniu Si o strukturze otwartego okna. (C) Przykładowa kontrola i stymulacja 16-kanałowych zapisów EKG w różnych lokalizacjach stymulacji. Poprzez stymulację różnych lokalizacji, aktywacja przestrzenna indukowała czasowe opóźnienia w ewolucji zespołu QRS wykrywane w tkankach w różnych miejscach zapisu. Można je przedstawić jako mapę opóźnienia aktywacji, umożliwiającą badanie ścieżek przewodzenia na powierzchni serca. Liczba ta została zmodyfikowana z²⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 10. Bioelektronika na bazie nanoporowatego węgla do stymulacji i rejestracji pracy serca. (A) Obraz optyczny porowatej elektrody Au (Au-C) szczepionej membraną węglową do stymulacji serca. Obraz we wstawce przedstawia powiększony widok mikrokondensatorów o strukturze serpentynowej na elektrodzie Au. (B) Odpowiedź EKG izolowanego serca szczura na dwufazową stymulację falą prądu prostokątnego o częstotliwości 4 Hz. Przy tej samej gęstości prądu wynoszącej 4,0 mA/^cm2 serce wykazywało różne reakcje EKG pod wpływem stymulacji elektrodami Au lub Au-C. (C) Krzywe czasu trwania i siły elektrod stymulacyjnych Au i Au-C oraz ich dopasowanie do krzywej występują przy częstotliwości stymulacji 4 Hz. (D) Napięcie progowe przyłożone do elektrod w celu skutecznej stymulacji w różnych czasach dla elektrod Au i Au-C. (E) Krzywe podstawowe sygnałów EKG zarejestrowanych za pomocą elektrody Au i elektrody Au-C. (F) Stosunek sygnału do szumu (S/N) oblicza się na podstawie zarejestrowanych krzywych EKG. Rysunki we wstawce przedstawiają obrazy optyczne Au i układu elektrod Au-C używanych do zapisu EKG (rozmiar elektrody: 1 mm; krok 7,5). Liczba ta została zmodyfikowana z²⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Porównanie prądów fotoelektrycznych dla różnych urządzeń Si i ocena progu stymulacji. (A) Porównanie wielkości fotoprądów w czterech urządzeniach opartych na krzemie. Niebieskie ścieżki reprezentują uśrednione fotoprądy z N = 8 niezależnych urządzeń, a nałożone szare ślady ilustrują pomiary poszczególnych urządzeń. Załączony wykres słupkowy pokazuje szczytowe wartości fotoprądów (w kolorze niebieskim) i zintegrowane wstrzyknięcia ładunku (w kolorze pomarańczowym). Wykresy słupkowe są wyrażone jako średnia ± s.d. Pasek skali, 10 ms. (B) Stymulację serca ex vivo wykonano przy użyciu trzech różnych urządzeń. Stymulacja była prowadzona z szybkością 240 uderzeń na minutę i szerokością impulsu 10 ms. Liczba ta została zmodyfikowana z²⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 12: Charakterystyka bilansu ładunku poprzez całkowanie wstrzykniętego i zwróconego ładunku. (A) Ilustracja procesu ładowania i rozładowania w charakterystycznym śladzie fotoprądowym. (B) Obliczanie całkowitych opłat związanych z wstrzykiwaniem i zwracaniem ładunku. Wyniki wykazały ogólnie dobry bilans ładunków przy różnych czasach stymulacji. Liczba ta została zmodyfikowana z²⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 13: reprezentatywne sygnały elektryczne zebrane przez każdą elektrodę w 16-kanałowym MEA. Sygnały elektryczne w 16 kanałach (Ch) pokazują informacje z elektrokardiogramu (EKG) bijącego serca ex vivo. Liczba ta została zmodyfikowana z²⁸. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 14. Właściwości elektrochemiczne bioelektroniki opartej na nanoporowatym węglu. (A) Elektrochemiczny interfejs między pobudliwymi tkankami a wzorzystymi granicami faz węglowych. (B) Widma impedancji i faz elektrod Au i Au-C z dopasowanymi krzywymi zgodnie z obwodem przedstawionym w A. (C) Pomiar CV wzorców Au i C o tej samej geometrii, o zakresie napięcia od -0,2 do 0,4 V w porównaniu ze standardową elektrodą Ag/AgCl. (D) Zmiany napięcia elektrody Au i Au-C podczas dwufazowego cyklu stymulacji galwanostatycznej. Liczba ta została zmodyfikowana z²⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Związek	Zalecana odmiana	Stężenie [mM]	MW	Na 1 l	Na 2 l
Zawartość NaCl	Sigma (S9625)	126	58.4	7.36	14.7
Kcl	Sigma (P4504)	5.4	74.6	0.4	0.8
Glukoza	Sigma (G7021)	10	180	1.8	3.6
HEPESY	Sigma (H4034)	10	238	2.383	4.766
MgCl2.7H2O	Sigma (M9272)	1	203	1 ml	2 ml
				Nr urządzenia 1 m	Nr urządzenia 1 m
CaCl2.2H2O	Sigma (C3881)	2	147	1 ml	2 ml
				Stan magazynowy 2 m	Stan magazynowy 2 m
NaH2PO4	Sigma (S0751)	0.39	120	1 ml	2 ml
				Stan magazynowy 0,39 m	Stan magazynowy 0,39 m

Tabela 1: Składniki rozwiązania HEPES Tyrode.

Dyskusja

W protokole tym wprowadzono platformę ex vivo serca szczura (ryc. 1A) oraz model I/R, aby zaoferować szybkie i wygodne badania elektrofizjologii na poziomie narządów, aby towarzyszyć szybko rosnącym wysiłkom badawczym i wymaganiom w dziedzinie bioelektroniki³⁸. Szczegółowo opisano wytwarzanie i walidację trzech systemów urządzeń, a mianowicie nanoporowatego krzemu, elastycznych układów wieloelektrodowych i nanoporowatego węgla (rysunki 1B-D), jako punktu odniesienia dla dwukierunkowych badań elektrofizjologicznych. Nanoporowaty krzem umożliwia niską intensywność, pojemnościowość i wysoką stymulację czasoprzestrzenną, elastyczne układy wieloelektrodowe umożliwiają wielokanałowe rejestrowanie i mapowanie aktywności nasierdzia, a nanoporowaty węgiel prowadzi do stymulacji niskonapięciowej i zapisu o wysokiej wartości sygnału do szumu (SNR) w połączeniu z MEA²⁷.

Stymulacja optyczna została wcześniej zademonstrowana przy użyciu optogenetyki, metody, która wymaga modyfikacji genetycznej w celu ekspresji wrażliwych na światło kanałów jonowych w tkankach docelowych³³. Chociaż optogenetyka jest skuteczna, wprowadza znaczną złożoność ze względu na potrzebę wektorów wirusowych lub podejść transgenicznych, co budzi obawy dotyczące bezpieczeństwa, etyki i regulacji, szczególnie w przypadku zastosowań klinicznych. W przeciwieństwie do tego, biostymulacja oparta na półprzewodnikach, niegenetyczna oferuje prostszą i bardziej opłacalną translacyjnie alternatywę 39,40,40,42. Materiały takie jak krzem i inne półprzewodniki organiczne umożliwiają bezpośrednią optoelektroniczną modulację tkanek bez zmian genetycznych, wykorzystując pojemnościowe prądy fotologiczne do biobezpiecznej i zrównoważonej stymulacji ładunku. Podejście to osiąga porównywalną lub nawet lepszą wydajność niż optogenetyka pod względem intensywności stymulacji, działając znacznie poniżej progów bezpieczeństwa lasera w celu zminimalizowania uszkodzenia tkanek^31,32 (ryc. 8). Niegenetyczny charakter biostymulacji opartej na półprzewodnikach eliminuje bariery związane z modyfikacją genetyczną, torując drogę do szerszego zastosowania w warunkach klinicznych i różnorodnych zastosowań w inżynierii tkankowej i medycynie bioelektronicznej. Jednak urządzenia muszą być starannie zaprojektowane, aby integrować się z tkanką, gdzie należy dokładnie rozważyć biokompatybilność, a także miejsce połączenia w celu skutecznej stymulacji i rejestracji (ryc. 8A-B). Ponadto obecność materiału na powierzchni tkanki może utrudniać obrazowanie w czasie rzeczywistym, chyba że urządzenie można zaprojektować tak, aby było przezroczyste dla okna wzbudzenia-emisji niektórych czynników obrazujących.

Nanoporowaty krzem wyróżnia się wśród fototymulatorów półprzewodnikowych, ponieważ nie wymaga sztucznej elektrody powrotnej, w przeciwieństwie do wcześniej opisanych materiałów²⁶. Ta wyjątkowa właściwość wynika z jego zdolności do tworzenia przestrzennie rozdzielczych obszarów katody i anody w oparciu o rozmiar i lokalizację plamki świetlnej. Oświetlona powierzchnia służy jako miejsce iniekcji katodowej, podczas gdy otaczające ją obszary peryferyjne ułatwiają powrót prądu anodowego. Mechanizm ten umożliwia wielomiejscową stymulację na monolitycznych, bezpikselowych błonach, co pozwala na precyzyjną i miejscową stymulację. Warto zauważyć, że miejscowa stymulacja światłem, a nie globalne oświetlenie, ma kluczowe znaczenie dla tworzenia wydajnych profili stymulacji bipolarnej. Dodatkowo rozmiar urządzenia znacząco wpływa na wydajność; Większe urządzenia generują wyższe prądy w tych samych warunkach stymulacji, co jeszcze bardziej zwiększa ich funkcjonalną wszechstronność.

Awaria stymulacji optycznej może wynikać z różnych czynników, nawet w zdrowych modelach biologicznych, przede wszystkim związanych z integralnością urządzenia i sprzężeniem biointerfejsu. Po pierwsze, dokładna charakterystyka fotoprądów ma kluczowe znaczenie przed stymulacją serca. Niższe niż oczekiwano prądy fotologiczne mogą powstać w wyniku degradacji materiału⁴³ pasywacji tlenkami po długotrwałym przechowywaniu, nadmiernego trawienia podczas procesu barwienia, pęknięć urządzenia podczas przenoszenia lub przenoszenia lub nieprawidłowej orientacji urządzenia podczas łączenia. Aby złagodzić uszkodzenia mechaniczne, PDMS został użyty jako miękkie podłoże do umieszczenia nanoporowatych membran krzemowych, zapewniając ochronę przed potencjalnymi uszkodzeniami spowodowanymi bezpośrednią obsługą pęsetą. Po drugie, niezbędne jest ustanowienie bezproblemowego interfejsu z nasierdziem, które w tej konfiguracji jest perfundowane płynami biologicznymi. Gruba warstwa płynu biologicznego może utrudniać prawidłowe przyleganie i pogarszać skuteczność stymulacji. Aby wzmocnić sprzężenie biointerfejsu, można zastosować bioadhezje^42,43 lub szycie w celu ustabilizowania połączenia i zapewnienia niezawodnej stymulacji. Warto zauważyć, że nanoporowaty krzem użyty w naszym badaniu jest biodegradowalny, wspiera tymczasowe aplikacje stymulacyjne, ale pogarsza wydajność w ciągu 1-2 dni w warunkach fizjologicznych. W celu uzyskania długoterminowej stabilności należy rozważyć pasywację powierzchni⁴⁴ lub zastosowanie trwalszych materiałów półprzewodnikowych.

Podczas stymulacji ex vivo stopniowy wzrost LVP (ryc. 8E) przy wyższych częstotliwościach (np. 4 Hz) prawdopodobnie wynika ze zwiększonej kurczliwości mięśnia sercowego, akumulacji wapnia i mechanizmu Franka-Starlinga⁴⁵. Podwyższone tempo stymulacji poprawia wewnątrzkomórkowy obieg wapnia i dynamikę napełniania komór, zwiększając napięcie wstępne i siłę skurczu⁴⁶. Chociaż może to zwiększyć zapotrzebowanie na tlen w mięśniu sercowym i ryzyko arytmii, skutki te można złagodzić poprzez wystarczające wstępne natlenienie, ścisłe monitorowanie EKG i kontrolowane parametry stymulacji. W naszych eksperymentach nie zaobserwowano istotnych działań niepożądanych.

W przypadku zapisu wieloelektrodowego określenie lokalizacji elektrod na sercu i ich względnych położeń w stosunku do elektrody stymulującej ma kluczowe znaczenie dla miarodajnej analizy. Konieczne jest wyeliminowanie przesłuchów między elektrodami, aby zapewnić uchwycenie wyraźnych przebiegów i czasowo rozdzielczych wzorców. Elastyczne układy elektrod zazwyczaj zapewniają dobry interfejs z nasierdziem; Jednak przyczepność można jeszcze bardziej zwiększyć za pomocą jonowo przewodzących powłok adhezyjnych, takich jak cienkie warstwy hydrożelu^28,43 w celu poprawy stabilności i jakości sygnału.

Nanostrukturalne materiały grafenowo-węglowe, o dużych powierzchniach do przechowywania i wstrzykiwania ładunku, mogą poprawić wydajność urządzeń bioelektronicznych poprzez zmniejszenie impedancji na złączach elektroda-sól fizjologiczna i zwiększenie możliwości wstrzykiwania ładunku³⁵. Obecne metody wzorowania materiałów grafenowych na elastycznych elektrodach (np. Au) obejmują elektroosadzanie, powlekanie wirowe i sitodruk⁴⁷. Jednak metody te są zwykle związane ze złożonymi procesami produkcyjnymi, ograniczonymi możliwościami modelowania i zmniejszoną wydajnością ze względu na martwą objętość spoiw. Metodę syntezy laserowej wykorzystano do wygenerowania nanostrukturalnych wzorów węgla na podłożu celulozowym, a następnie przeniesienia ich na inne miękkie warstwy w celu stworzenia zgodnego biointerfejsu, który stanowi łatwy i skuteczny sposób wytwarzania bioelektroniki. Połączenie wzorzystych powłok węglowych o małych rozmiarach geometrycznych aż do poziomu pojedynczego ogniwa, które zwiększyłyby zlokalizowane pole elektryczne, oraz wysoce porowatych struktur membrany węglowej w celu zmniejszenia oporu na granicy elektroda-tkanka, synergistycznie osiągną w przyszłości skuteczną stymulację biologiczną i rejestrację⁴⁸.

Chociaż jest to wygodny model choroby, model Langendorff ex vivo I/R nie ma interakcji ogólnoustrojowych, izolując serce od odpowiedzi neurohormonalnych i immunologicznych i opiera się na sztucznej perfuzji z, które mogą zmieniać warunki fizjologiczne, takie jak dostarczanie tlenu i funkcja śródbłonka. Jego ograniczona żywotność ogranicza badania do ostrych zdarzeń. Niemniej jednak model oferuje wysoce kontrolowane środowisko z precyzyjnymi regulacjami parametrów i dobrą odtwarzalnością. Umożliwia również pomiar czynności serca w czasie rzeczywistym, co czyni go cennym narzędziem do badania nowych strategii terapeutycznych w chorobie niedokrwiennej serca. Na przykład, można sobie wyobrazić, że urządzenia elektroceutyczne będą wstępnie kondycjonować serce, trenując je do znoszenia trudnych warunków środowiskowych związanych z reaktywnymi formami tlenu (ROS) lub łagodzić poziomy ROS w celu przyspieszenia regeneracji. Skuteczność takich zabiegów można ocenić za pomocą wskaźników, takich jak wzorce bicia serca, krzywe EKG i prędkość przewodzenia. Co więcej, wieloośrodkowa platforma stymulacyjna może dostarczyć informacji przestrzennych na temat zawału mięśnia sercowego, umożliwiając bardziej szczegółową ocenę dotkniętych nim regionów. Podejście to może również wykazać poprawę progów stymulacji, skorelowanych z ciężkością zawału, oferując kompleksowe ramy oceny i optymalizacji terapeutycznej.

Chociaż w protokole podkreślono zastosowanie tych trzech urządzeń w dwukierunkowych modelach serca ex vivo , ich zastosowanie wykracza daleko poza tkanki serca. Urządzenia te można łatwo przystosować do użytku z innymi tkankami lub narządami pobudzającymi elektrycznie, takimi jak tkanki nerwowe, mięśnie szkieletowe i układy pokarmowe, gdzie precyzyjna modulacja elektryczna ma kluczowe znaczenie, co czyni je wszechstronnymi narzędziami zarówno do badań, jak i zastosowań translacyjnych w medycynie bioelektronicznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
16-kanałowa scena główna	Technologie Intan	Zobacz materiał C3334 powiedział:
Chlorek 2,3,5-trifenylotetrazolu	Sigma Aldrich	T8877-5G	chlorek trifenylotetrazolu
2-propanol (IPA)	Fischer Naukowy	A451-4
Laser 635 nm, 500 mW	Blask laserowy	NIE
Aceton	Fischer Naukowy	A18-4
Parownik Angstrom Evovac z wiązką elektryczną	Angstrem	NIE
Deweloper AZ 300MIF	Mikrochemikalia	18441123163	Wywoływacz
AZ nlof 2020	Mikrochemikalia	Numer katalogowy 1A002020
AZ NMP	Mikrochemikalia	NIE	Środek do usuwania fotorezystu
AZ40XT-11D	Mikrochemikalia	1000300	Fotorezystor
Buforowany HF	Thermo Scientific	AA44627K2
CaCl2.2H2O	Sigma Aldrich	(C3881)
Laser CO2	Uniwersalne systemy laserowe	VLS 4.60
Przewodząca srebrna farba	PELCO	16062	Przewodząca adhezja między elektrodą a łączącym drutem Cu
Drut miedziany w obudowie 0,1 mm	Amazonka	https://www.amazon.com/Enameled-Temperature-Resistance-Transformers-Inductors/dp/ B09TNM51S5/ref=asc_df_B09 TNM51S5?mcid=155de761ea4 c389ea86d45ba61a83e8d& Tag =Hyprod-20& linkCode=df0& hvadid =693675076770& hvpos=& hvnetw =g& hvrand=664358781094905 4431& hvpone=& hvptwo=& hvqmt =& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9021716& hvtargid= pla-1878323158943& psc=1
Digitizer Digidata 1550	Urządzenia molekularne	NIE
Glukoza	Sigma Aldrich	Kontroler G7021
HBSS, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej	Thermo Scientific	14175095
Heidelberg MLA150 bezpośredni pisarz	Heidelberg	NIE
heparyna (1000 j.m./kg)	Sagent Pharmaceuticals	1009655
HEPESY	Sigma Aldrich	(H4034)
Heksan	Sigma Aldrich	Pojemność 52750-10ML	Rozpuszczalnik
HF	Fisher Naukowy	A513-500	Gatunek metalu śladowego
Piekarnik HMDS Vapor Prime	Systemy inżynierii plonów	NIE
HNO3 powiedział:	Fisher Naukowy	A509P500	Gatunek metalu śladowego
Laminator na gorąco	Magazyn biurowy	L410-A	Wielowarstwowa hermetyzacja
Systemy Intan RHD	Technologie Intan	Zobacz materiał C3100
iWorx EKG	iWorx powiedział:	IA-400D
Sonda iWorx LVD	iWorx powiedział:	Zobacz materiał BP-100
Przedwzmacniacz iWorx	iWorx powiedział:	Certyfikat C-ISO-256
Kcl	Sigma Aldrich	(P4504)
Balon lateksowy (rozmiar 4)	Radnoti powiedział:	170404
MgCl2.7H2O	Sigma Aldrich	(M9272)
Zawartość NaCl	Sigma Aldrich	(S9625)
Nafion 117 zawierający roztwór	Sigma Aldrich	31175-20-9	Odczynnik utrwalający do nanoporowatego wzoru węglowego
NaH2PO4 powiedział:	Sigma Aldrich	(S0751)
NaOH powiedział:	Sigma Aldrich	221465
PDMS (system zarządzania zasobami ludzkimi)	Fisher Naukowy	NC9285739
Wytrawiacz fluorkowy plazmowy sprzężony indukcyjnie Plasma-Therm	Plazma-Therm	NIE
PMMA (495 A6)	Mikrochemikalia	M130006
poli(piromelityczna dianhydry-Co-4,4'-oksydianilina)	Sigma Aldrich	575801	Prekursor PI
Poli(etylen-ko-octan winylu)	Sigma Aldrich	Numer katalogowy: 437247-250G	Polimer do infiltracji
Poli(alkohol winylowy)	Sigma Aldrich	341584-25G
Politereftalan etylenu (PET)	Amazonka	Zobacz materiał KS-6304-21-11	Typ D Przezroczysty arkusz PET .0005 "Grubość x 27" Szerokość x 10 stóp Długość 1 szt
Potencjostat	Biologiczne	SP-200 (wersja angielska)	Stymulacja elektryczna
Oprzyj piekarnik	Wysyłki	LCC1-15-5
Skaningowa mikroskopia elektronowa	Carl Zeiss	Drzemlik	Instrument do charakterystyki morfologicznej
wafel krzemowy	Materiały elektroniczne NOVA	HS39626
Klej silikonowy	Wskaźnik WPI	KWIK-SIL-S	Hermetyzacja
Boran sodu	Sigma Aldrich	Zobacz materiał SX0355
Wafel SOI	Ultrasil	3-10541	Orient typu: P/B(100) DT:7+/-1um DR:<. 005 Ohmcm HT: 300 +/- 10um HR: 1-30 Ohm Skrzynka: 1um +/- 5% UD-13998 / UH-13962
SU-8 2002	Mikrochemikalia	Seria SU-8 2000
Deweloper SU-8	Mikrochemikalia	Seria SU-8 2000
Klej do mokrych tkanek	3 mln	1469SB powiedział:
Jakościowa bibuła filtracyjna Whatman, klasa 1	Sigma Aldrich	WHA1001150	Podłoże do modelowania węglowego