Opracowanie modelu szczura dla choroby afektywnej dwubiegunowej

Summary

W artykule przedstawiono protokół indukcji unikalnego szczurzego modelu choroby afektywnej dwubiegunowej, który obejmuje zarówno zachowania podobne do manii, jak i depresyjne.

Abstract

Choroba afektywna dwubiegunowa to stan zdrowia psychicznego charakteryzujący się ekstremalnymi wahaniami nastroju, w tym okresami emocjonalnych wzlotów (mania) i upadków (depresja). Chociaż dokładna neurobiologia leżąca u podstaw neurobiologii nie jest jeszcze w pełni poznana, nierównowaga w systemach neuroprzekaźników, zwłaszcza dopaminy, wydaje się odgrywać kluczową rolę. Z tego powodu manipulacje szlakami dopaminergicznymi zostały wykorzystane do modelowania manii lub depresji u gryzoni. Jednak modele, które dokładnie reprezentują typowe przełączanie między tymi dwoma epizodami, są rzadkie, co ogranicza trafność twarzy. W unikalnym modelu stosuje się nowoczesne techniki w celu tymczasowego zwiększenia ekspresji receptora dopaminy D1, który jest związany z patologią choroby afektywnej dwubiegunowej. Konstrukt lentiwirusowy indukowany tetracykliną, który wyraża receptor dopaminy D1 pod kontrolą promotora kinazy kalmodulinowej II alfa, jest stereotaktycznie wstrzykiwany do przyśrodkowej kory przedczołowej dorosłych szczurów. Nadekspresję receptora dopaminy D1 osiąga się poprzez dodanie analogu tetracykliny doksycykliny do wody pitnej zwierząt, co prowadzi do wzrostu zachowań związanych z nagrodą, impulsywnych i ryzykownych oraz zmniejszenia lęku. Zachowania te przypominają fenotyp podobny do manii. Usuwając doksycyklinę z wody pitnej, u tego samego zwierzęcia można wywołać fenotyp podobny do depresji, charakteryzujący się zwiększoną bezradnością i anhedonią. Ten artykuł zawiera protokół krok po kroku do wykonania operacji, a także procedury indukowania fenotypu podobnego do choroby afektywnej dwubiegunowej. Dodatkowo opisano rozważania dotyczące oceny zmian behawioralnych związanych z zachowaniem podobnym do manii i depresji. Ten obiecujący model, który wykazuje dobrą konstrukcję i trafność twarzy, stanowi cenne narzędzie do dalszego badania patofizjologicznych mechanizmów choroby afektywnej dwubiegunowej.

Introduction

Choroba afektywna dwubiegunowa (ChAD) to poważne zaburzenie nastroju dotykające około 1% światowej populacji¹. Charakteryzuje się epizodami skrajnego nastroju, depresją i manią, a także stanami eutymicznymi. Objawy epizodów depresyjnych w ChAD przypominają objawy depresji jednobiegunowej. Pacjenci wykazują zmniejszone zainteresowanie i przyjemność z działań oraz poczucie smutku, beznadziejności i bezwartościowości. Dodatkowo często można zaobserwować zmiany apetytu, zachowań związanych ze snem, a także upośledzenia poznawcze². Epizody maniakalne charakteryzują się nienormalnie podwyższonym nastrojem, zmniejszoną potrzebą snu, odhamowaniem społecznym, zwiększoną samooceną i poczuciem wielkości, a także zwiększonym podejmowaniem ryzyka i drażliwością².

Etiologia choroby ChAD wydaje się być złożoną interakcją czynników genetycznych i rozwojowych³, ale dokładne mechanizmy zaangażowane w jej patofizjologię nadal nie są w pełni poznane. Uważa się, że objawy wynikają z braku równowagi w układach neuroprzekaźników⁴ , a w szczególności badania koncentrujące się na układzie dopaminowym miały wpływ⁵. Na przykład Berk i ^wsp.6 postulowali hipotezę dopaminy, zakładając, że stan hiperdopaminergiczny leży u podstaw manii, podczas gdy depresja wynika z hiodopaminergii. Od tego czasu dowody z modeli zwierzęcych, a także badania farmakologiczne i obrazowe, zebrały silne poparcie dla związku między objawami maniakalnymi a hiperdopaminergią. Można również znaleźć związek między zmniejszoną sygnalizacją dopaminergiczną a epizodami depresyjnymi, choć w mniejszym stopniu⁷. Ponadto wyniki badań genetycznych wzmocniły ideę hipotezy dopaminowej BD⁸.

Aby jeszcze bardziej rzucić światło na rolę układu dopaminowego w ChAD, modele zwierzęce mogą być wykorzystane do zbadania mechanizmów neurobiologicznych, które leżą u podstaw objawów. Zastosowania i ograniczenia modeli chorób są często oceniane na podstawie trzech kryteriów walidacji, pierwotnie zaproponowanych przez^{Willnera 9}. Należą do nich trafność twarzy, konstrukcji i predykcji. Trafność twarzy opisuje zdolność modelu do naśladowania cech behawioralnych zaburzenia. Trafność konstruktu jest osiągana, gdy patofizjologia i etiologia zaburzenia są podstawą modelu, podczas gdy trafność predykcyjna oznacza, że leczenie farmakologiczne zaburzenia można odtworzyć w ramach modelu.

Do tej pory różne modele gryzoni przyczyniły się do zrozumienia BD¹⁰ i obejmują szeroki zakres modyfikacji genetycznych, interwencji farmaceutycznych, a także manipulacji środowiskowych¹¹.

Wykazano na przykład, że eksperymentalne manipulacje genem Clock indukują fenotyp podobny do manii u myszy. Czynnik transkrypcyjny CLOCK odgrywa ważną rolę w regulacji rytmów okołodobowych, a genetycznie zmienione myszy, wyrażające białko, które nie może aktywować transkrypcji zegara, charakteryzują się nadpobudliwością i zwiększonymi odpowiedziami na nagrodę¹². Powstały fenotyp wydaje się być pośredniczony przez różnie regulowane geny sygnalizacji dopaminergicznej w brzusznym obszarze nakrywki mózgu¹³.

Wykazano, że bezpośredni wpływ na sygnalizację dopaminy poprzez podawanie leków zwiększających dopaminę, takich jak psychostymulant amfetamina, wywołuje hiperlokomocję, a późniejsze odstawienie wiąże się z objawami podobnymi do depresji, w tym anhedonią^. Wykazano również, że prowokacje farmakologiczne związane z ketaminą lub agonistą receptora dopaminy D2 / D3 kwalpinrolem indukują zachowanie istotne dla BD^15,16.

Oprócz interwencji farmakologicznej, manipulacje środowiskiem, takie jak deprywacja snu, mogą być stosowane w celu wywołania fenotypów behawioralnych istotnych dla BD¹⁷. Zwierzęta pozbawione snu wykazują fenotyp podobny do manii, charakteryzujący się zwiększoną lokomocją, emisją wokalizacji ultradźwiękowych, które są związane ze zmianami w sygnalizacji^dopaminy18.

Istnieje wiele innych modeli gryzoni do badania zachowań depresyjnych¹⁹ lub maniaków²⁰ . Jednak, chociaż wszystkie te modele w znacznym stopniu przyczyniły się do zrozumienia patologii ChAD, są one ograniczone przez badanie tylko jednego epizodu na raz lub krótkoterminowych skutków. Natomiast modelowanie charakterystycznego przełączania między stanami afektywnymi było trudne do osiągnięcia.

W tym miejscu przedstawiono protokół dla unikalnego modelu szczura dla BD. Wykazuje zwiększoną trafność twarzy poprzez wywołanie obu epizodów u jednego zwierzęcia przy użyciu pojedynczej ukierunkowanej manipulacji układu dopaminowego, tj. warunkowej nadekspresji receptora dopaminy D1 (DRD1) w przyśrodkowej korze przedczołowej (mPFC) z konstruktu lentiwirusowego indukowanego tetracykliną. Kierując transkrypcją genów pod kontrolą promotora kinazy kalmodulinowej II alfa (CamKIIa), DRD1 ulega ekspresji głównie w neuronach glutaminergicznym, zwiększając w ten sposób specyficzność manipulacji genetycznej.

Oryginalny szkielet lentiwirusa pRRL.cPPT.WPRE.Sin został dostarczony przez dr Didiera Trono (Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Szwajcaria)²¹ i zmodyfikowany przez zastąpienie minigenu GFP miejscem polilinkera (wektor lentiwirusa PL13). PL13 został następnie wykorzystany do wytworzenia PL13.pTRE2.DRD1.CamKIIa.rtTA3 lub PL13.pTRE2.dsRedExpress.CamKIIa.rtTA3. CDNA szczurzego DRD1 uzyskano od dr Davida Sibleya (NINDS/NIH)²², a cDNA aktywatora 3 kontrolowanego przez odwróconą tetracyklinę (rtTA3) od dr Atze Dasa i Bena Berkhouta (Akademickie Centrum Medyczne, Uniwersytet w Amsterdamie)²³. DNA promotora CamKIIa zostało dostarczone przez dr Karla Deisserotha (Uniwersytet Stanforda, Kalifornia), a sekwencje dsRedExpress i elementu odpowiedzi tetracykliny 2 (pTRE2) zostały sklonowane z wewnętrznych plazmidów pcDNA3.1-dsRedExpress i pcDNA3.1-pTRE2, odpowiednio. Wektory wirusowe zostały wygenerowane przez subklonowanie sekwencji DNA amplifikowanych PCR otoczonych miejscami restrykcyjnymi.

Model wykorzystujący ten wektor wirusowy wykazał, że nadekspresja DRD1 w neuronach mPFC CamKIIa-dodatnich prowadzi do fenotypu podobnego do manii^24,25, podczas gdy późniejsza regulacja ekspresji genów indukuje zachowanie podobne do depresji²⁶. Ponieważ fenotyp podobny do choroby może być wielokrotnie indukowany u jednego zwierzęcia²⁷, model odzwierciedla wysoki poziom trafności twarzy. Ponadto, manipulacje układu dopaminowego mają silną wartość konstruktu dla zwierzęcych modeli BD⁷, ponieważ zmiany poziomów DRD1^28,29 lub polimorfizmów DRD1 są związane z patologią BD 30,31,32.

Inne badania na zwierzętach również doprowadziły do lepszego zrozumienia funkcji przedczołowego DRD1. Na przykład, spadek DRD1 był konsekwentnym odkryciem w modelach depresji^33,34, podczas gdy optogenetyczna stymulacja DRD1 w neuronach glutaminergicznym mPFC zmniejsza lęk i indukuje działanie przeciwdepresyjne³⁵. W niedawnej publikacji Wu i ^wsp.36 wykazano rolę mPFC DRD1 w afektywnych przejściach stanów. Badanie to podkreśla, że receptory te mają kluczowe znaczenie dla podstawowych zmian w plastyczności synaps pobudzających.

Podsumowując, zastosowanie szczurzego modelu BD, który składa się z ukierunkowanej i warunkowej manipulacji DRD1 w neuronach CamKIIa-dodatnich mPFC, stanowi system modelowy o wysokiej trafności konstrukcyjnej i twarzy, a tym samym wykazuje duży potencjał dla badań translacyjnych nad BD.

Poniżej opisano procedury chirurgiczne związane z generowaniem modelu. Ponadto przedstawione zostaną rozważania metodologiczne dotyczące indukcji modelu i ocen behawioralnych wraz z reprezentatywnymi wynikami uzyskanego fenotypu podobnego do choroby. Omówiono możliwe przeszkody i czynniki wpływające na tworzenie modeli i ocenę behawioralną, a także przedstawiono perspektywy przyszłych kierunków.

Protocol

Opisany tutaj protokół iniekcji stereotaktycznej został zatwierdzony przez LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nadrenia Północna-Westfalia, Niemcy). Wykorzystano dorosłe samce szczurów rasy Sprague Dawley (350-650 g masy ciała). Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Konstrukty lentiwirusowe

UWAGA: System lentiwirusowy trzeciej generacji jest używany do warunkowej ekspresji DRD1 lub białka czerwonej fluorescencji (dsRed) jako warunku kontrolnego^25,27.

1. Wyprodukuj lentiwirusa w oparciu o protokół Stewarta i ^wsp.37 z plazmidami pakującymi 8454 i 8455 z repozytorium Addgene.
   UWAGA: Jeśli produkcja wirusa nie jest planowana niezależnie, wiele głównych zakładów zapewnia lentiwirus o wysokim mianie, np. Charité Berlin w Niemczech.
2. Miano skoncentrowanych wirusów i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
3. Przygotować 2 × 10⁷ jednostek przetwornikowych (TU) na μl do wstrzykiwań.
4. Transport wirusów na salę operacyjną na suchym lodzie.

2. Zwierzęta

UWAGA: Model szczurzy dla ChAD został ustalony u dorosłych samców szczurów Sprague Dawley (350-650 g masy ciała). W przypadku badań samic szczurów lub wcześniejszych punktów czasowych rozwoju ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że ekspresja DRD1 w mPFC zmienia się podczas rozwoju i może na nią wpływać cykl rujowy 38,39,40.

1. Szczury trzymane w parach ze zwierzętami w tym samym stanie z jedzeniem i wodą ad libitum w stałych warunkach temperatury i wilgotności (45%-65% wilgotności względnej, temperatura 22 °C ± 2 °C).
2. Utrzymuj szczury w odwróconym 12-godzinnym cyklu światło-ciemność (światła wyłączają się o 11 rano), ponieważ badanie behawioralne powinno być przeprowadzane podczas aktywnej fazy zwierząt w ciemności.
3. Dać zwierzętom co najmniej siedem dni na zaaklimatyzowanie się w obiekcie i postępowanie z nimi przez eksperymentatorów przed rozpoczęciem jakichkolwiek doświadczeń.

3. Stereotaktyczne wstrzyknięcie konstruktu wirusowego

UWAGA: Operację należy wykonywać pod kapturem ochronnym (środki ostrożności przy pracy z lentiwirusem) i w warunkach aseptycznych.

1. Preparat
   1. Upewnij się, że wszystkie niezbędne materiały są dostępne, sterylne i funkcjonalne (Tabela materiałów).
   2. Ustaw ramkę stereotaktyczną z uchwytem strzykawki przymocowanym do ramienia stereotaktycznego. Podłączyć uchwyt strzykawki do pompy strzykawkowej.
   3. Ustaw wiertarkę dentystyczną i zamontuj zadzior 0.9 mm.
   4. Połóż poduszkę grzewczą i ustaw ją na 37 °C. Podnieś poduszkę grzewczą na odpowiednią wysokość, aby ułatwić ustawienie szczura.
   5. Przykryj poduszkę grzewczą chłonną zasłoną.
   6. Przygotuj autoklawizowane narzędzia chirurgiczne na sterylnej powierzchni.
   7. Zamontować stereotaktyczną strzykawkę o pojemności 10 μl z igłą do wstrzykiwań 33 G do uchwytu strzykawki.
   8. Pobrać 2,3 μl zawiesiny wirusa do wstrzyknięć obustronnych po 1 μl każdy. Wizualnie potwierdź pomyślną wypłatę. Upewnij się, że wykonałeś ten krok jako ostatni krok przygotowawczy, aby zminimalizować czas potrzebny do osiągnięcia temperatury pokojowej przez lentiwirusa.
2. Analgezja i indukcja znieczulenia
   1. Rano w dniu zabiegu należy podać meloksykam (1 mg/kg masy ciała, p.o.).
   2. Dwadzieścia minut przed rozpoczęciem zabiegów chirurgicznych w celu znieczulenia należy wstrzyknąć szczurowi buprenorfinę (0,5 mg/kg masy ciała, s.c.).
   3. Włącz aparat anestezjologiczny o przepływie tlenu 0,8-1 l/min.
   4. Zalać komorę indukcyjną 4 % izofluranem i umieścić szczura w komorze indukcyjnej.
   5. Po udanej indukcji znieczulenia, widocznej spowolnieniem oddechu i utratą przytomności, należy wyjąć szczura z komory indukcyjnej i przenieść go do ramy stereotaktycznej.
3. Pozycjonowanie szczura
   1. Upewnij się, że przepływ znieczulenia jest przełączony na maskę na nos.
   2. Przenieś szczura z komory indukcyjnej do ramy stereotaktycznej, umieszczając jego przednie zęby w uchwycie.
   3. Prawidłowo umieść maskę anestezjologiczną na nosie i przekręć izofluran na 1,5-2,3% w celu konserwacji.
   4. Chroń oczy za pomocą sterylnego kremu pod oczy.
   5. Co najmniej 10 minut przed wykonaniem jakiegokolwiek nacięcia należy miejscowo wstrzyknąć szczurowi lidokainę (10 mg/kg masy ciała, s.c.) bezpośrednio poniżej planowanego miejsca nacięcia.
   6. Zabezpiecz szczura w ramie stereotaktycznej za pomocą pasków nausznych. Upewnij się, że nauszniki są równe i znajdują się w poziomej pozycji głowy.
   7. Przytnij futro wokół miejsca nacięcia za pomocą nożyczek. Ułóż miejsce przycinania, aby zapobiec zanieczyszczeniu miejsca operacji przez sierść. Usuń kawałki futra za pomocą celulozowej podkładki zwilżonej środkiem antyseptycznym do skóry.
   8. Zdezynfekuj pole operacyjne za pomocą środka antyseptycznego do skóry. Usuń potencjalnie zanieczyszczoną serwetę i zastąp ją nową sterylną.
4. Kraniotomia i wstrzyknięcie konstruktu wirusowego
   1. Zapewnij odpowiednie znieczulenie, sprawdzając, czy nie ma odruchu u stóp.
   2. Zdezynfekuj ręce i zmień rękawiczki na sterylne przed dotknięciem jakiegokolwiek sprzętu.
   3. Wykonaj małe przyśrodkowe nacięcie (~1,5 cm) za pomocą ostrza skalpela.
   4. Zabezpiecz dostęp do pola operacyjnego, dociskając skórę na boki za pomocą zacisków typu bulldog.
   5. Oczyść pole operacyjne z krwi i pozostałych tkanek za pomocą sterylnych zamian. Zapewnij prawidłowe widzenie bregmy i wystarczającą przestrzeń przednią.
   6. Ustaw współrzędne A/P i M/L na zero na podstawie bregma.
   7. Przesuń ramię stereotaktyczne do współrzędnych A/P + 2,7 i M/L ± 0,4 i wizualizuj za pomocą zdezynfekowanego ołówka.
   8. Wywierć otwór o średnicy ~1 mm, zakrywający boki iniekcji dla obu półkul.
   9. Usuń krew za pomocą sterylnej zamiany.
   10. Ustaw współrzędne D/V na zero na powierzchni mózgu i powoli obniż igłę do -2,8, aby wstrzyknąć do obszaru przedlimbicznego mPFC.
   11. Odczekaj 5 minut, aby umożliwić rozluźnienie tkanki.
   12. Wstrzyknąć 1 μl zawiesiny wirusa z szybkością 0,1 μl/min.
   13. Odczekać 5 minut do wchłonięcia przed powolnym wyjęciem igły.
   14. Powtórzyć wstrzyknięcie w drugą półkulę.
5. Zamknięcie i opieka pooperacyjna
   1. Wyjąć igłę i zamknąć otwór w czaszce za pomocą wosku kostnego.
   2. Usuń zaciski buldoga i zszyj skórę (szew chirurgiczny 3-0).
   3. Wstrzyknąć szczurowi meloksykam (1 mg/kg s.c.) w celu znieczulenia pooperacyjnego.
   4. Wyłącz znieczulenie, wyjmij zwierzę z ramy stereotaktycznej i umieść je w klatce domowej. Upewnij się, że szczur w pełni się obudzi.
   5. Przepłukać strzykawkę 100% etanolem w celu dezaktywacji pozostałego lentiwirusa, a następnie destylować_H2Ow celu przygotowania do następnego wstrzyknięcia.
   6. Wykonuj znieczulenie pooperacyjne meloksykamem (1 mg/kg, p.o.) co 24 godziny przez 3 dni i oceniaj stan zdrowia zwierząt przez 1 tydzień.
   7. Pojedyncze zwierzęta domowe przez pierwsze 24 godziny po operacji, aby zapobiec ingerencji innych osób w miejsce operacji. Następnie umieść je z powrotem z ich kolegami z klatki.
   8. Usuń szwy 10-14 dni po zabiegu, jeśli nie zostało to wcześniej wykonane przez same szczury.

4. Leczenie doksycykliną w celu indukcji modelu

UWAGA: Rozpocznij indukcję modelu już po 24 godzinach od wstrzyknięcia. Można również odczekać dłuższe okresy czasu między wstrzyknięciem a indukcją, nawet do kilku miesięcy, np. w celu przetestowania większych kohort zwierząt w tym samym czasie. Wykazano, że nie wpływa to na funkcjonalność konstruktu wirusowego.

1. Wywołanie epizodu podobnego do manii
   1. Aby wywołać fenotyp podobny do manii, podaj zwierzętom hykulat doksycykliny o stężeniu 0,5 g / l, dodając go do wody pitnej. Indukuje to transkrypcję wirusa i nadekspresję dodatkowego DRD1.
   2. Wodę zawierającą doksycyklinę należy przygotowywać świeżo co 48 godzin do 72 godzin, przy czym nie ma to wpływu na stabilność doksycykliny, nawet w nieprzezroczystych butelkach na wodę⁴¹.
      UWAGA: Po leczeniu doksycykliną przez siedem dni, nadekspresja za pośrednictwem wirusa osiągnie maksimum i można przeprowadzić badanie behawioralne podczas epizodu podobnego do manii.
2. Indukcja epizodu depresyjnego
   1. Przełącz zwierzęta z powrotem na normalną wodę pitną, aby wywołać epizod podobny do depresyjnego.
   2. Odczekaj 4 dni, aż transkrypcja wirusa zostanie zatrzymana, a następnie przeprowadź ocenę behawioralną epizodu podobnego do depresji.
   3. Wykonuj kolejne indukcje epizodów według tego samego schematu.

5. Ocena behawioralna

UWAGA: Po indukcji modelu można ocenić zachowanie podobne do dwubiegunowego. Zaproponowano różne ramy translacji od objawów klinicznych do wzorców zachowań obserwowanych u gryzoni. Jednym z najbardziej wpływowych jest Research Domain Criteria⁴², w którym badane są zmiany w domenach funkcjonowania i zachowania, które mogą mieć wpływ na zaburzenia psychiczne. Należy jednak zauważyć, że ze względu na barierę gatunkową niektóre objawy, np. skłonności samobójcze, nie mogą być badane u gryzoni⁴³. Ze względu na ich zaawansowane zdolności poznawcze i emocjonalne, modele szczurów mają szczególnie duży potencjał do translacyjnej oceny objawów⁴⁴, co pozwala na bardziej skomplikowane procedury testowe. Zagadnienia dotyczące oceny behawioralnej opisano w tabeli 1.

1. Zaplanuj badanie behawioralne jako baterię testów behawioralnych⁴⁵, aby zapewnić kompleksowy obraz wynikowego fenotypu.
2. Zwróć uwagę na wykonanie bardziej inwazyjnych testów na końcu.
3. Weź pod uwagę zmiany w zachowaniu, które mogą wynikać z wcześniejszych doświadczeń testowych, gdy próbujesz przetestować jedno zwierzę w obu epizodach podobnych do choroby.
   UWAGA: W zależności od pytania, korzystne może być testowanie różnych grup szczurów podczas epizodu mania- lub epizodu depresyjnego, co pozwoliłoby również na pobranie tkanek podczas danego epizodu. Doświadczenie pokazuje, że testowanie zwierząt niezachowalnie nieżyjących może skutkować bardziej widocznym fenotypem w niektórych testach behawioralnych.
4. Weź również pod uwagę inne czynniki, takie jak warunki mieszkaniowe⁴⁶ lub płeć eksperymentatora⁴⁷.
5. Przyjęcie wszelkich możliwych środków w celu zmniejszenia niezamierzonego stresu u zwierząt, nie tylko ze względu na dobrostan zwierząt, ale także w celu wykluczenia możliwych interakcji fenotypów psychiatrycznych ze stresem⁴⁸.
6. Zwróć szczególną uwagę na rytm okołodobowy, ponieważ zaburzenia rytmu okołodobowego są objawem BD¹⁷. Ponieważ szczury są najbardziej aktywne o zmierzchu i świcie, należy testować w słabym czerwonym świetle ze zwierzętami trzymanymi w odwrotnym cyklu światło-ciemność⁴⁹.
   UWAGA: Większość prezentowanych tutaj reprezentatywnych wyników została zebrana zgodnie z tym podejściem. Fenotyp podobny do choroby jest jednak nadal obserwowalny, jeśli ocena behawioralna jest przeprowadzana bez przełączania cyklu dnia i nocy zwierząt²⁷.
7. Zawsze należy wstępnie zarejestrować eksperyment oraz przeprowadzić i opisać zgodnie z wytycznymi PREPARE⁵⁰ i ARRIVE⁵¹ .

Results

Gdy doksycyklina zostanie dodana do wody pitnej zwierząt, zostanie wyrażony dodatkowy DRD1, a po 7 dniach nastąpi wystarczająca nadekspresja, aby przetestować zwierzę pod kątem zachowania podobnego do manii. Do tej pory wykazano wzrost zachowań związanych z nagrodą. Zwierzęta podobne do manii piją więcej roztworu sacharozy w stosunku do wody w teście wyboru dwóch butelek w porównaniu z grupą kontrolną²⁵. Po umieszczeniu w pudełku obserwacyjnym z otwartą samicą i obserwacji przez 25 minut, zwierzęta podobne do manii wykazują więcej wierzchowców seksualnych w porównaniu z grupą kontrolną²⁷ (ryc. 1A). W paradygmacie samodzielnego podawania kokainy podają więcej kokainy zgodnie ze schematem o ustalonym stosunku i wykazują wyższy punkt przerwania w schemacie o stałym stosunku. Ich krzywa dawka-odpowiedź jest przesunięta w kierunku wyższej wrażliwości na niskie dawki²⁵. Ta zmiana wrażliwości jest również obserwowana w zwiększonym znaczeniu motywacyjnym w kilku paradygmatach warunkowania miejsc. Zwierzęta podobne do manii spędzały więcej czasu w kondycjonowanych stronach na nikotynę, alkohol i kokainę w porównaniu^{z grupą} kontrolną. Stwierdzono również zwiększone poszukiwanie nowości i bardziej impulsywne wybory w teście opóźnionego rabatowania opartym na labiryncie T²⁵. W operacyjnej szczurzej wersji Iowa Gambling Task, zwierzęta podobne do manii częściej decydują się na niekorzystne wybory (wysokie ryzyko, wysoki zysk) w porównaniu z grupą kontrolną²⁴ (Ryc. 1B). Lęk u zwierząt podobnych do manii jest zmniejszony, na co wskazuje więcej czasu spędzonego na otwartych ramionach w podwyższonym labiryncie^{plus 25}.

Fenotyp podobny do depresji może być wywołany przez zakończenie nadekspresji DRD1. W epizodzie depresyjnym można było zaobserwować wzrost bezradności. W triadycznym paradygmacie bezradności grupa, która po raz pierwszy została poddana wstrząsowi elektrycznemu (ryc. 1C), a także grupa, która nauczyła się kontrolować wstrząs, były bardziej bezradne ze zwiększonymi opóźnieniami ucieczki w porównaniu z ich^{odpowiednimi grupami} kontrolnymi. Grupy, w których indukowano bezradność, nie wykazywały różnic między zwierzęciem doświadczalnym a kontrolnym. Anhedonię stwierdzono w teście wyboru dwóch butelek na sacharozę²⁷ oraz w zachowaniach seksualnych (dane niepublikowane). W teście zakopywania marmuru zwierzęta podobne do depresji były również bardziej niespokojne²⁶ (ryc. 1D).

Opisany model zwierzęcy nie tylko daje możliwość zbadania zachowań podobnych do manii lub depresji, ale także daje unikalną możliwość zaobserwowania zmiany zachowania po zakończeniu nadekspresji DRD1, przypominającej przejście od manii do depresji u pacjentów. W tym przypadku ważne jest, aby pamiętać o przyzwyczajeniu do pewnych zachowań i wybierać testy z minimalnym przyzwyczajeniem. Na przykład, wykazano wzrost zachowań seksualnych w epizodzie podobnym do manii i epizodzie depresyjnym, redukcję takich zachowań do poziomów obserwowanych u zwierząt kontrolnych. W tym eksperymencie trzy cykle podobne do manii/depresji zostały wywołane u tego samego zwierzęcia²⁷. W przypadku picia sacharozy preferencja dla roztworu sacharozy w stanie podobnym do manii nie tylko zmniejszyła się do poziomu kontrolnego po przełączeniu w stan podobny do depresji, ale zmniejszyła się²⁷. W szczurzej wersji zadania hazardowego w stanie Iowa liczba niekorzystnych wyborów była zwiększona u zwierząt podobnych do manii, ale nie różniła się znacząco od grupy kontrolnej, gdy zwierzęta były w stanie podobnym do depresji. W tym ostatnim stanie liczba ogólnie zdobytych granulek została zmniejszona w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi²⁴.

Ogólnie rzecz biorąc, zwierzęta wykazują silny fenotyp podobny do choroby afektywnej dwubiegunowej, który można zaobserwować w różnych domenach behawioralnych podczas obu epizodów. Przełączanie między epizodami w tym modelu przyczynia się do zwiększenia trafności twarzy. Przegląd dotkniętych nimi domen behawioralnych przedstawiono na rysunku 2.

Rycina 1: Zmiany behawioralne w stanach podobnych do manii i depresji po nadekspresji wirusa DRD1. Podczas nadekspresji wirusa DRD1, w stanie podobnym do manii, zwierzęta wykazują więcej wierzchowców seksualnych (A) i wzrost ryzykownych wyborów w Iowa Gambling Task (B) w porównaniu z grupą kontrolną. Po ustaniu nadekspresji zwierzęta przechodzą w stan podobny do depresyjnego. Wykazują wzrost bezradności (C) i lęku (D). *p < 0,05; **p < 0,01; Słupki błędów wskazują błąd standardowy średniej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Fenotyp behawioralny modelu. W epizodzie podobnym do manii następuje wzrost zachowań związanych z nagrodą (np. zachowań seksualnych), impulsywności i podejmowania ryzyka. Lęk został zmniejszony w teście podwyższonego plusa labiryntu. Podczas epizodu depresyjnego lęk był zwiększony w teście zakopywania marmuru, zachowania seksualne były zmniejszone, a zwierzęta wykazywały większą bezradność. Wizerunek szczura na rysunku został zaczerpnięty z Servier Medical Art i jest dostępny na licencji CC BY 4.0. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Rozważania dotyczące oceny zachowania. W tabeli przedstawiono ważne kwestie dotyczące głównych etapów eksperymentalnych podczas oceny behawioralnej. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

W tym miejscu przedstawiono nowatorski model szczura dla BD o zwiększonej trafności twarzy. Ukierunkowana manipulacja DRD1 w mPFC pozwala na indukcję fenotypu podobnego do manii i depresji u tego samego zwierzęcia. Reprezentatywne wyniki wskazują na obserwowalny fenotyp podobny do choroby w obu epizodach. Model jest stosunkowo łatwy w aplikacji. Potrzebne są dwa indukowalne wektory lentiwirusowe wykazujące ekspresję DRD1 lub dsRed jako kontrola. Do produkcji i stosowania systemów lentiwirusowych u zwierząt wymagane są pewne poziomy bezpieczeństwa, które muszą być zapewnione. Jeśli sprzęt niezbędny do produkcji wirusa nie jest dostępny, doświadczenia w pracy z głównymi obiektami są pozytywne.

Najważniejszym etapem generowania modelu jest stereotaktyczne wstrzyknięcie układu lentiwirusowego. Operacje stereotaktyczne są dobrze ugruntowanymi procedurami w neurobiologii, a wskaźniki sukcesu wśród wyszkolonych badaczy są wysokie. Istnieją dwa główne możliwe źródła błędów. Problemy ze znieczuleniem mogą prowadzić do zgonów podczas zabiegu chirurgicznego. W tym przypadku zastosowanie znieczulenia wziewnego izofluranem, jak opisano w protokole, okazało się najlepszym podejściem, ponieważ łatwo regulowane poziomy leku stanowią wyraźną korzyść w porównaniu ze znieczuleniem iniekcyjnym. Ponieważ izofluran nie daje żadnego działania przeciwbólowego, a nocyceptory opon mózgowo-rdzeniowych są wrażliwe na stymulację⁵², zaleca się stosowanie opioidów w analgezji śródoperacyjnej. W połączeniu z odpowiednimi lekami pooperacyjnymi, jak opisano w protokole, nie ma zauważalnych objawów bólu pooperacyjnego. Należy jednak zawsze brać pod uwagę możliwe wpływy na pytania badawcze, np. w odniesieniu do interakcji dopaminy z układem opioidowym, i odpowiednio dobrać odpowiedni schemat leczenia⁵³. Jeśli zabieg jest wykonywany w warunkach aseptycznych, występowanie infekcji lub upośledzenie gojenia się ran jest rzadkie. Jeśli wystąpią problemy podczas operacji lub rekonwalescencji, rozwiązywanie problemów powinno skupić się na prawidłowym wykonaniu opisanego protokołu. Niezbędne jest zapewnienie aseptycznych warunków pracy i precyzyjne dozowanie leków. Podawanie płynów lub roztworów glukozy może dodatkowo wspomóc powrót do zdrowia. Jeśli dojdzie do infekcji, leczenie nie powinno obejmować tetracyklin, ponieważ będą one wchodzić w interakcje z transkrypcją systemów wirusowych. Leczenie pierwszego rzutu w przypadku zakażeń ran pooperacyjnych to enrofloksacyna, ewentualnie w połączeniu z karprofenem.

Innym możliwym źródłem błędu podczas operacji jest umieszczenie iniekcji poza obszarem docelowym. Zdarza się to jednak rzadko, gdy protokół jest przestrzegany prawidłowo i zapewnione jest prawidłowe ułożenie głowy zwierzęcia. Udane umieszczenie powinno być zawsze weryfikowane. Podczas gdy umieszczenie wirusa z ekspresją dsRed jest łatwe do wykrycia u zwierząt kontrolnych, weryfikacja rozmieszczenia wirusów wykazujących ekspresję DRD1 wymaga dodatkowych kroków. Barwienie przeciwciałami przeciwko różnym częściom konstruktu wirusa nie przyniosło zadowalających wyników. Zaleca się sprawdzenie rozmieszczenia wirusa poprzez rozebranie mPFC i wykonanie PCR w celu wykrycia transkryptów rtTA3, jak opisano w Beyer i ^wsp.24. Ważne jest również, aby pamiętać, że wstrzyknięcie wirusa powinno być obustronne z równą ilością wirusa. Wykazano, że lateralizacja mózgowa i behawioralna różni się u pacjentów z chorobą afektywną dwubiegunową^54,55, a jednostronne zastrzyki wirusowe mogą nie wywołać pożądanego fenotypu behawioralnego.

Indukcja ekspresji wirusa DRD1 i epizodu maniopodobnego poprzez dodanie doksycykliny do wody pitnej działa bardzo dobrze. Udowodniono, że zastąpienie normalnej wody pitnej doksycykliną nie powoduje wyraźnych zmian w zachowaniach związanych z piciem. Należy jednak monitorować zużycie płynów. Modulacje są możliwe, jeśli inne substancje, np. leki, mają być podawane z wodą pitną . Podawanie doksycykliny może być również wykonywane za pomocą granulek spożywczych. Ale nie zostało to jeszcze potwierdzone.

W przypadku badań behawioralnych w tabeli 1 wymieniono kilka kwestii. Szczególnie podczas planowania eksperymentu należy ocenić wymagania specyficzne dla modelu. Na przykład należy zdecydować, czy dwie grupy zwierząt będą testowane, czy też jedno zwierzę zostanie poddane ocenie behawioralnej podczas obu epizodów, co może wymagać ponownego przetestowania. Jeśli fenotyp podobny do choroby afektywnej dwubiegunowej nie jest wykrywalny podczas badania behawioralnego, chociaż umiejscowienie można zweryfikować, rozwiązywanie problemów może koncentrować się na różnych czynnikach, które mogą wpływać na wynik behawioralny. Zmiany w eksperymentatorach lub rytmie okołodobowym powinny być krytycznie oceniane podczas procesu, ponieważ stresujące warunki w środowisku mogą wpływać na wyniki behawioralne.

Chociaż model wykazuje dobrą trafność konstrukcji i twarzy, trafność predykcyjna nadal wymaga oceny. Przewlekłe podawanie litu, jako leczenie pierwszego rzutu BD⁵⁶, powinno być skuteczne w zapobieganiu zmianom w zachowaniu wywołanym przez model. Odpowiedzi na inne leki stosowane w ChAD, takie jak leki przeciwpsychotyczne lub przeciwdrgawkowe, mogą być badane w celu pełnego przetestowania trafności predykcyjnej modelu.

Ponadto obecnym ograniczeniem jest to, że trafność modelu u samic nadal musi zostać oceniona w przyszłych badaniach. Chociaż istnieje tendencja do włączania samic do badań przedklinicznych, często jest to nadal zaniedbywane. W przedstawionym modelu należy spodziewać się oddziaływań układu dopaminowego z cyklem rujowym. Nie jest jednak jasne, w jakim stopniu do nich dojdzie. Ważne jest również, aby pamiętać o ogólnych ograniczeniach psychiatrycznych modeli zwierzęcych. Podczas gdy możliwość wywołania obu epizodów podobnych do choroby u jednego szczura zapewnia zwiększoną trafność twarzy, zmiany wywołane zewnętrznie nadal różnią się od spontanicznego występowania i cyklu epizodów choroby u pacjentów z ChAD. Ponieważ model opiera się wyłącznie na ukierunkowanej manipulacji układem dopaminy, główne efekty będą spowodowane zmianami w transmisji dopaminy i związanymi z tym efektami wtórnymi. W związku z tym nie uwzględnia się udziału innych systemów w symptomologii ChAD.

Podsumowując, prezentowany model ma duży potencjał do badania ChAD, ponieważ oba epizody choroby można badać na jednym zwierzęciu. Stwarza to unikalne możliwości badania przejść między epizodami w porównaniu z większością uznanych modeli. Prezentowany protokół wymaga sprzętu i umiejętności technicznych, które są dostępne w większości laboratoriów badań przedklinicznych, dzięki czemu ma szerokie zastosowanie. Do tej pory uzyskany fenotyp behawioralny był solidny w różnych zachowaniach. Inne dziedziny, takie jak zachowania społeczne⁵⁷ lub funkcje poznawcze, nie zostały jeszcze zbadane. Chociaż zaprezentowany protokół koncentrował się na wynikach behawioralnych, istnieją różne możliwości przyszłych zastosowań w celu dalszego badania mechanizmów molekularnych. Rozszerzenie badań w celu zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw patogenezy ChAD, zwłaszcza w odniesieniu do przejścia między epizodami, może doprowadzić do identyfikacji celów terapeutycznych, które ostatecznie mogą zostać przełożone na przyszłe zastosowania kliniczne.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Frez 0,9 mm	Certyfikat FST	19007-09	Zadzior do kraniotomii
10 &mikro; l Strzykawka Neuros	Hamilton	65460-06	Zamontowany do pompy strzykawkowej do wstrzykiwań
1 ml strzykawki jednorazowego użytku	Braum Braum powiedział:	9166017V	Podawanie leków
Igły 33 g	Hamilton	65461-02	Igły zamienne do strzykawki do nerwicy
Zawór 4-drogowy	ONZ	180000259	Do jednoczesnego podłączenia komory indukcyjnej i maski ochronnej
Chłonna serweta	Sabanindas powiedział:	1834014	Przykrywanie sprzętu przed umieszczeniem zwierzęcia
Filtr gazów anestetycznych	ONZ	180000140	Zbieranie oparów anestezjologicznych
Maska anestezjologiczna do stereotaktycznego	Hugo Sachs Elektroniczny	73-4922	Podawanie znieczulenia podczas zabiegu
Parownik anestezjologiczny	ONZ	180000002	Dostarczanie i regulacja poziomów odparowanego izofluranu
Wosk kostny	SMI	Z046 powiedział:	Zamykanie w czaszce
Zaciski Bulldog	Certyfikat FST	18038-45	Aby zatrzymać skórę i umożliwić dostęp do pola operacyjnego
Buprenorfina	Elanco powiedział:	18760711	Analgezja międzyoperacyjna
Kaniuli	Tegler powiedział:	T138339	Podawanie leków
Waciki celulozowe	Meditrade (Meditrade)	1177	Oczyszczanie skóry
Złącze	ONZ	180000005	Podłączanie rurki anestezjologicznej do maski na twarz
Jednostka sterująca poduszką grzewczą	ONZ	180000122	Sterowanie poduszką grzewczą
Dril dentystyczny	Saeyang powiedział:	SMT K-38	Wiertło dentystyczne do kraniotomii; Wyposażony w drobne frezy dentystyczne
Biurkowy cyfrowy instrument stereotaktyczny	RWD	E03135-002	W pełni wyposażona ramka stereotaktyczna z cyfrowym manipulatorem
Destylowany H2O	-	-	Płukanie strzykawki
Hykulat doksycykliny	Sigma aldrich	Zobacz materiał D9891	Do indukcji modelu
Suchy lód	-	-	Transport zawiesiny wirusowej
Nauszniki	RWD	68302	Mocowanie głowy w ramie stereotaktycznej
Etanol	-	-	Płukanie strzykawki i dezaktywacja wirusa
Przepływomierz	ONZ	Zobacz materiał CM2	Sprawdź i dostosuj natężenie przepływu
Kleszcze - anatomiczne	Certyfikat FST	11000-12	Trzymanie skóry
Kleszcze - chirurgiczne	Certyfikat FST	11027-12	Trzymanie skóry
Poduszka grzewcza	ONZ	180000028	Poduszka grzewcza do utrzymywania zwierzęcia w cieple podczas operacji
Komora indukcyjna	ONZ	180000233	Komora do wstępnej indukcji znieczulenia
Izofluran	CP Pharma	V7005232.00.00	Znieczulenie
Zawiesina lentiwirusowa	-	-	Kodowanie konstruktu lentiwirusowego dla DRD1 lub dsRed do indukcji modelu
Lidokainy	Spalanie	8780701	Znieczulenie miejscowe
Meloksykam	Boehringer Ingelheim	7578423	Analgezja przed- i pooperacyjna
Uchwyt na igłę	Certyfikat FST	91201-13	Suszenie
Koncentrator tlenu	ONZ	180000399	Dostarczanie tlenu do znieczulenia
Rurki PE	-	-	Łączenie elementów aparatu anestezjologicznego z komorą indukcyjną i Maska
Ołówek	-	-	Oznaczenie właściwej strony do kraniotomii
Uchwyt na ostrze skalpela	Certyfikat FST	10003-12	Do trzymania ostrza skalpela
Ostrza Scapel	Certyfikat FST	10011-00	Cienkie ostrze chirurgiczne do nacięcia
Jednostka zbieracza	ONZ	180000260	Regulacja wydajności odpylacza oparów
Środek do dezynfekcji skóry	Bode	975042	Odcinanie skóry przed nacięciem
Sterylne waciki bawełniane	Böttger	1102241	Czyszczenie pola operacyjnego
Sterylny krem pod oczy	Bayer	1578675	Ochrona oczu podczas zabiegu
Nożyczki chirurgiczne	Certyfikat FST	14000-12	Przycinanie futra i cięcie materiału szwowego
Szew 3-0 kwas poliglikolowy	SMI	11201519	Szycie skóry
Pompa strzykawkowa	KdScientific	788130	Pompa strzykawkowa z uchwytem do podłączenia