Artykuł metodologiczny

Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru

DOI:

10.3791/68308

⸱

20 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Translational Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie interakcji neuroimmunologicznych i może być zaadaptowana do badania innych chorób neurodegeneracyjnych, pogłębiając naszą wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych w patologii udaru.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udar mózgu jest główną przyczyną zgonów i długotrwałej niepełnosprawności na całym świecie, przy czym większość przypadków dotyczy udaru niedokrwiennego. Po udarze niedokrwiennym dochodzi do aktywacji rezydentnych i naciekających komórek odpornościowych, co przyczynia się do dalszego uszkodzenia neuronów. Jednak rola układu odpornościowego w patologii udaru niedokrwiennego nie jest w pełni poznana, głównie ze względu na złożoną i dynamiczną regulację odpowiedzi immunologicznych w reakcji na zmiany w mikrośrodowisku podczas zapalenia nerwów. Dlatego ważne jest, aby monitorować i analizować aktywację rezydentnych i infiltrujących komórek odpornościowych w czasie po udarze niedokrwiennym. W tym badaniu przedstawiono protokół oceny funkcji tych komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Mikrodyfundujemy tkankę mózgową po zawale w określonych punktach czasowych, a następnie dysocjujemy ją na zawiesinę jednokomórkową zarówno metodami mechanicznymi, jak i enzymatycznymi. Komórki są przepuszczane przez sitko komórkowe o średnicy 70 μm i znakowane fluorescencyjnie znakowanymi koktajlami przeciwciał przed ilościowym określeniem za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Chociaż test ten został opracowany specjalnie do badania interakcji neuroimmunologicznych po udarze niedokrwiennym, można go również łatwo dostosować do badania mechanizmów neuroimmunologicznych w innych chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane, choroba Parkinsona i choroba Alzheimera.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udar mózgu jest główną przyczyną śmiertelności i długotrwałej niepełnosprawności na całym świecie, przy czym udar niedokrwienny stanowi zdecydowaną większość przypadków 1,2,3. Ogólnym celem tej metody jest pogłębienie naszej wiedzy na temat interakcji neuroimmunologicznych, które zachodzą po udarze niedokrwiennym, poprzez zapewnienie wyrafinowanego podejścia do oceny aktywacji zarówno rezydentnych, jak i naciekających komórek odpornościowych w mysim modelu mini-udaru 4,5. Skomplikowana interakcja między tymi komórkami odpornościowymi a mikrośrodowiskiem neuronalnym ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patofizjologii udaru niedokrwiennego. Jednak dokładne mechanizmy leżące u podstaw tych interakcji neuroimmunologicznych pozostają słabo wyjaśnione, głównie ze względu na dynamiczny i wieloaspektowy charakter odpowiedzi immunologicznych wywołanych przez zapalenienerwów 6. Technika ta ma na celu wyjaśnienie złożonej dynamiki odpowiedzi immunologicznych w kontekście zapalenia układu nerwowego i ich późniejszego wpływu na uszkodzenie neuronów i wyniki regeneracji.

Uzasadnienie rozwoju tej techniki wynika z kluczowej roli, jaką komórki odpornościowe odgrywają w nasilaniu uszkodzeń neuronów i wpływaniu na powrót do zdrowia po zdarzeniu niedokrwiennym. Tradycyjnym metodom badania tych interakcji często brakuje rozdzielczości niezbędnej do uchwycenia czasowych i przestrzennych niuansów aktywacji komórek odpornościowych. Dzięki zastosowaniu analizy cytometrii przepływowej zawiesin jednokomórkowych pochodzących z mikrowypreparowanej tkanki mózgowej po zawale, protokół ten oferuje bardziej szczegółową i dynamiczną ocenę profili komórek odpornościowych w czasie 7,8. Podejście to umożliwia identyfikację określonych populacji komórek odpornościowych i ich stanów funkcjonalnych, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia patofizjologii udaru niedokrwiennego.

W porównaniu z alternatywnymi technikami, takimi jak barwienie histologiczne lub sekwencjonowanie masowego RNA, które mogą dostarczyć ograniczonego wglądu w indywidualny wkład typów komórek odpornościowych, ta metoda cytometrii przepływowej ma kilka zalet. Na przykład wcześniejsze badania wykazały, że cytometria przepływowa pozwala na wysokoprzepustową analizę wielu markerów jednocześnie, ułatwiając bardziej kompleksową charakterystykę fenotypów i funkcji komórek odpornościowych 9,10,11,12,13. Ponadto zdolność tej metody do przystosowania się do różnych schorzeń neurodegeneracyjnych - takich jak stwardnienie rozsiane, choroba Parkinsona i choroba Alzheimera - pokazuje jej wszechstronność i znaczenie w szerszej literaturze dotyczącej interakcji neuroimmunologicznych.

Dla badaczy rozważających zastosowanie tej metody niezbędna jest ocena konkretnych celów ich badania. Technika ta jest szczególnie przydatna w badaniach wymagających szczegółowej analizy czasowej odpowiedzi immunologicznych w kontekście udaru niedokrwiennego lub powiązanych chorób neurodegeneracyjnych. Zaleca się, aby użytkownicy posiadali podstawową wiedzę na temat cytometrii przepływowej i doświadczenie z modelami mysimi, aby skutecznie wdrożyć ten protokół i zinterpretować uzyskane dane. Zapewniając solidne ramy do badania interakcji neuroimmunologicznych, metoda ta w znacznym stopniu przyczynia się do trwających wysiłków na rzecz określenia złożoności udziału układu immunologicznego w patologii udaru.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Pekińskiego Szpitala Przyjaźni Stołecznego Uniwersytetu Medycznego. Zalecamy, aby wszystkie roztwory były poddawane sterylnej filtracji i aby wszystkie używane probówki były sterylne.

1. Przygotowanie odczynników i buforu

  1. Mieszanina enzymów wytrawiających: Rozpuścić kolagenazę IV, aby uzyskać stężenie 0,25% i rozcieńczyć DNazę I, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 U/ml.
  2. Bufor do magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (MACS): Rozpuść albuminę surowicy bydlęcej (BSA) i kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) do osiągnięcia stężeń 0,5% i 2 mM odpowiednio w 1x PBS.

2. Ogniskowy model udaru niedokrwiennego

UWAGA: Myszy C57BL / 6 J (8-10 tygodniowe) zostały wykorzystane do ustalenia ogniskowego modelu udaru niedokrwiennego, jak opisano wcześniej14. Można zastosować wszelkie alternatywne farmaceutyczne środki znieczulające do wstrzykiwań, które są dobrze udokumentowane dla gryzoni.

  1. Wywołać znieczulenie u myszy za pomocą 3% izofluranu podawanego z szybkością przepływu 0,8-1,0 l/min tlenu, a następnie utrzymać znieczulenie za pomocą 1,5% izofluranu. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C przez cały czas trwania zabiegu za pomocą poduszki grzewczej.
    UWAGA: To badanie podkreśla znaczenie sprawdzenia, czy znieczulone zwierzęta osiągnęły chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia przed nacięciem. Osiąga się to poprzez ocenę odruchu wycofania łapy poprzez mocne uszczypnięcie palców kończyn tylnych, aby potwierdzić brak odpowiedzi. Jeśli nie zostaną zaobserwowane, zwierzę jest odpowiednio znieczulane.
  2. Przytnij futro w okolicy między prawym okiem a prawym uchem za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Upewnij się, że skóra jest sterylna, nakładając naprzemiennie chlorheksydynę i alkohol okrężnymi ruchami przez co najmniej trzy aplikacje. Następnie przed wykonaniem nacięcia należy podać podskórnie 5 mg/kg meloksykamu i 3,25 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu. Przed nacięciem należy wykonać śródskórne wstrzyknięcie do 4 mg/kg lidokainy, rozcieńczonej w soli fizjologicznej, wzdłuż linii nacięcia. Następnie nałóż lubrykant okulistyczny na powierzchnię oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki i wykonaj pionowe nacięcie o długości 0,5 cm w wyznaczonym obszarze przylegającym do oczu pod mikroskopem preparacyjnym.
  3. Delikatnie oddziel wszystkie tkanki, aby odsłonić czaszkę i zidentyfikować dystalną gałąź prawej środkowej tętnicy mózgowej (MCA), charakteryzującą się pionową strukturą naczyniową w kształcie litery "Y". Użyj wiertarki elektrycznej, aby przebić czaszkę, uważając, aby ostrożnie ją usunąć.
  4. Delikatnie wytnij opony mózgowe za pomocą mikrokleszczyków.
  5. Odsłonić dystalną gałąź prawej środkowej tętnicy mózgowej (MCA), a następnie wykonać trwałe podwiązanie dystalnej gałęzi prawej tętnicy mózgowej za pomocą niewchłanialnego szwu polipropylenowego 10-0, zabezpieczając go podwójnym węzłem, po którym następuje węzeł odwrotny. Następnie usuń nadmiar końców szwu.
  6. Ustaw tkankę do pierwotnego stanu i zamknij nacięcie skóry twarzy nylonowym szwem 4-0.
  7. Ustaw mysz w pozycji leżącej na plecach i przytnij futro w okolicy szyi za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Upewnij się, że skóra jest sterylna, nakładając naprzemiennie chlorheksydynę i alkohol okrężnymi ruchami przez co najmniej trzy aplikacje.
  8. Wykonaj poziome nacięcie w okolicy szyi i delikatnie rozsuń gruczoły podżuchwowe. Krótko mówiąc, umiejętnie wykonuje się poprzeczne nacięcie przez skórę za pomocą skalpela, ułatwiając wizualizację gruczołów podżuchwowych po obu stronach linii środkowej. Gruczoł podżuchwowy jest następnie ostrożnie poddawany sekcji za pomocą kleszczy i tępo zakończonych nożyczek, odsłaniając leżącą poniżej tętnicę szyjną.
  9. Ostrożnie wypreparuj pochewkę tętnicy szyjnej za pomocą mikrokleszczyków, identyfikując wspólną tętnicę szyjną i oddzielając ją od nerwu błędnego.
  10. Przewlecz nylonowy szew 4-0 przez wspólną tętnicę szyjną i zabezpiecz go węzłem ślizgowym.
  11. Powtórz krok 10 na przeciwległej tętnicy szyjnej wspólnej. Tymczasowo zamknij obustronne tętnice szyjne wspólne (CCA) na 7 minut.
  12. Wymień tkankę gruczołu podżuchwowego do jej pierwotnej pozycji i zamknij nacięcie szyi klejem tkankowym.
    UWAGA: Pozorowana grupa operacyjna została poddana procedurom, które były identyczne z tymi w grupie udarowej, z jednym wyjątkiem, że dystalne MCA i CCA pozostały niepodwiązane.
  13. Monitoruj mysz przez cały zabieg chirurgiczny i po nim, w tym jej oddech i temperaturę ciała. Umieść mysz w klatce pozbawionej ściółki, umieszczonej do połowy na poduszce grzewczej i utrzymuj tę konfigurację, aż będzie w pełni wybudzona. Aby złagodzić dyskomfort, należy podać 0,05 mg/kg buprenorfiny w ciągu pierwszych 48 godzin po zabiegu.

3. Perfuzja i rozwarstwienie mózgu

  1. Przygotować strzykawkę o pojemności 50 ml i przymocować do jej końca igłę o pojemności 26 g. Napełnić strzykawkę roztworem soli fizjologicznej.
  2. Głęboko znieczulij mysz za pomocą 3% izofluranu, a następnie poddaj się eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla.
    UWAGA: Badanie to podkreśla krytyczną konieczność upewnienia się, że znieczulone zwierzęta osiągnęły chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia przed wykonaniem jakichkolwiek nacięć. Weryfikację tę uzyskuje się poprzez ocenę odruchu wycofania łapy poprzez mocne uszczypnięcie palców na tylnej kończynie, potwierdzając w ten sposób brak jakiejkolwiek odpowiedzi. Jeśli nie zaobserwuje się żadnej reakcji, można stwierdzić, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone.
  3. Ustaw mysz w pozycji leżącej na piankowej desce, rozciągając kończyny przednie i tylne, zabezpieczając je igłami 26 G.
  4. Gdy mysz zostanie dokładnie znieczulona, chwyć skórę brzucha ząbkowanymi kleszczami kciuka i wykonaj boczne nacięcie, aby odsłonić wątrobę. Przystąp do cięcia wzdłuż obu stron żeber, aby odsłonić serce.
  5. Wprowadzić igłę 26 G do lewej komory i odciąć prawą małżowinę uszną, a następnie wcisnąć strzykawkę, aby umożliwić wypływ krwi.
  6. Kontynuuj proces perfuzji, aż krew spływająca z małżowiny usznej stanie się czysta.
  7. Odetnij głowę myszy, przecinając kręgosłup szyjny za pomocą prostych nożyczek chirurgicznych.
  8. Wykonaj tylno-przednie nacięcie w skórze głowy, aby odsłonić czaszkę. Wykonaj dwa boczne nacięcia na styku ścian bocznych i podstawy czaszki.
  9. Przeciąć czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego i wykonać nacięcie między oczodołami.
  10. Użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę pokrywającą każdą półkulę, odsłaniając w ten sposób mózg i przenieś go do stalowej matrycy mózgu myszy. Następnie podziel mózg na kolejne plasterki koronalne o grubości 2 mm.

4. Trawienie tkanki korowej do zawiesiny jednokomórkowej i barwienie przeciwciał do cytometrii przepływowej

  1. Wprowadzić 500 μl mieszanki enzymów trawiących do każdego dołka 12-dołkowej płytki.
  2. Delikatnie oddziel tkankę zawału i przenieś ją do mieszanki enzymów trawiennych za pomocą mikrokleszczy (ryc. 1).
  3. Tkankę należy rozdrobnić na jak najmniejsze kawałki za pomocą nożyczek okulistycznych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  4. Za pomocą pipety P1000 delikatnie odessać i dozować roztwór 10 razy, aby zdysocjować tkankę na poszczególne komórki, a następnie przepuścić roztwór przez sitko do komórek o wielkości 70 μm. Stale płukać zarówno płytkę 12-dołkową, jak i sitko komórkowe lodowatym HBSS zawierającym wapń i magnez.
  5. Odwirować w temperaturze 500 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, a następnie ostrożnie wyrzucić supernatant.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę, że wytworzone granulki są dość luźne i łatwo się przemieszczają, należy powstrzymać się od ich naruszania, aby zapobiec utracie komórek.
  6. Zawiesić osad w 1 ml 1x PBS i powtórzyć krok 5. Następnie ponownie zawiesić osad w 150 μl 1x PBS i przenieść zawiesinę na 96-dołkową płytkę z okrągłym dnem. Następnie ponownie odwirować w temperaturze 500 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  7. Mocno chwycić 96-dołkową płytkę i szybko ją odwrócić, aby odrzucić supernatant.
  8. Rozcieńczyć barwnik fluorescencyjny o żywotności komórek w stosunku 1:100 w 1x PBS, a następnie ponownie zawiesić osad w podwielokrotności 150 μl. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT), osłonięty przed światłem.
  9. Odwirować w temperaturze 500 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant. Rozcieńczyć koktajl przeciwciał na powierzchni komórki w buforze MACS. Nie myjąc komórek, dodać koktajl przeciwciał na powierzchni komórki i inkubować przez dodatkowe 15-20 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Odwirować przy 500 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 150 μl buforu MACS.
  11. Powtórzyć krok 4.10 i przenieść zawiesinę do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml lub probówek z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml.

5. Analiza i sortowanie cytometrii przepływowej

  1. Zaprojektuj wielokolorowy panel cytometrii przepływowej zgodnie z konfiguracją urządzenia, wykorzystując techniki ręczne lub narzędzie do projektowania online, aby zoptymalizować wybór fluoroforów sprzężonych z przeciwciałami i zminimalizować nakładanie się widma.
    UWAGA: Podczas projektowania wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej należy wziąć pod uwagę kilka kluczowych kwestii. Po pierwsze, przed rozpoczęciem należy zapoznać się z konfiguracją używanego instrumentu, w tym z laserami i filtrami. Po drugie, należy stosować jasne znaczniki fluoroforowe na przeciwciałach dla antygenów o niskiej liczebności, decydując się jednocześnie na słabe etykiety fluoroforowe na przeciwciałach ukierunkowanych na antygeny o wysokiej ekspresji. Wreszcie, konieczne jest uwzględnienie w panelu barwnika żywotności komórek, aby skutecznie wykluczyć z danych niezdolne do życia komórki i zanieczyszczenia. W szczególności, aby zapewnić odpowiednie bramkowanie antygenów o niskiej liczebności lub słabo scharakteryzowanych, należy stosować kontrole fluorescencji minus jeden (FMO)15. Kontrole FMO obejmują wszystkie markery linii z wyjątkiem interesującego nas, ułatwiając precyzyjne rozgraniczenie między komórkami zabarwionymi dodatnio i ujemnie16.
  2. Dostosuj ustawienia detektorów rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC), aby zapewnić, że interesujące komórki są odpowiednio wyświetlane na skali i mogą być bramkowane zgodnie z wymaganiami.
  3. Skrupulatnie dostosuj FSC i SSC, aby wyeliminować zanieczyszczenia i zewnętrzny hałas. Odróżniaj dublety od pojedynczych komórek na wykresie punktowym, który ilustruje zarówno obszar, jak i wysokość FSC. Wyizoluj żywotne komórki na podstawie żywotności komórek fluorescencji barwnika-ujemnego sygnału.
    UWAGA: Ustawienia dla różnych instrumentów mogą wykazywać niewielkie różnice. Na przykład niektóre sortowniki komórek wykorzystują szerokość i wysokość FSC do odróżnienia dubletów od pojedynczych komórek, podczas gdy inne wykorzystują obszar i wysokość FSC do tego samego celu.
  4. Dostosuj kompensację dla każdego kanału.
    UWAGA: Zarówno próbki komórkowe, jak i dostępne na rynku kulki kompensacyjne mogą być stosowane w celu kompensacji rozlewania się fluorescencji.
    1. Porównaj kontrolę autofluorescencji (niebarwione komórki) z kontrolami pozytywnymi barwionych komórek, aby upewnić się, że barwione komórki są odpowiednio skalowane dla każdego parametru. Ponadto można dostroić kompensację, analizując wielokolorowe próbki komórek, monitorując 2-kolorowe wykresy punktowe i dostosowując ustawienia kompensacji w górę lub w dół, aby upewnić się, że populacje komórek są wyrównane względem siebie w pionie lub poziomie.
    2. Wykorzystaj sygnały CD45 i CD11b do rozróżnienia limfocytów (wysoki CD11b-CD45), mikrogleju (CD11b + CD45int), komórek szpikowych (wysoki CD11b + CD45) i astrocytów (CD11b-CD45- GLAST+)17,18.
    3. Wykorzystaj pozorowaną tkankę mózgową jako kontrolę autofluorescencji i odniesienie do rozróżniania limfocytów. Jeśli badany jest określony cel, należy zastosować kontrolę FMO z tkanką mózgową po udarze.
  5. Rozpocznij zbieranie danych kontrolnych i przykładowych i upewnij się, że zostały one zapisane.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę, że opisany tutaj model mini-udaru powoduje mały zawał, zazwyczaj pobiera się mniej komórek niż w modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO). Ogólnie rzecz biorąc, zebranie 5 × 105 komórek daje odpowiednio około 5 × 103 mikrogleju i 1 × 105 astrocytów.
  6. Wybierz i posortuj żądane populacje komórek do okrągłodennych probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml lub stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Dodaj 500 μl PBS i skrupulatnie przepłucz probówkę, aby zapewnić żywotność komórek i pomóc w tworzeniu osadu komórkowego.

6. Analiza ekspresji genów w wybranych populacjach komórek

UWAGA: Ekstrakcję całkowitego RNA można alternatywnie przeprowadzić przy użyciu komercyjnych zestawów zgodnie z wytycznymi producenta.

  1. Odwirować komórki z etapu 5.6 w temperaturze 500 × g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty, a następnie odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml odczynnika TRIzol.
    UWAGA: Liczba posortowanych komórek jest znacznie mniejsza w porównaniu z hodowanymi komórkami lub tkankami. W związku z tym wyższa prędkość wirowania może pomóc w tworzeniu bardziej zwartych osadów komórkowych. Komórki uzyskane na tym etapie mogą być wykorzystane do kolejnych zastosowań, takich jak hodowle komórkowe lub sekwencjonowanie jednokomórkowego RNA.
  2. Pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby ułatwić dysocjację kompleksów nukleoproteinowych.
  3. Dodać 0,2 ml chloroformu do próbki i zabezpieczyć probówkę. Potrząsaj energicznie probówkami przez 15 s, a następnie inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  4. Odwirować próbki o masie 10 000 g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. RNA pozostanie wyłącznie w górnej fazie wodnej.
  5. Ostrożnie przenieś górną fazę wodną do czystej probówki, uważając, aby nie naruszyć interfejsu.
    UWAGA: Objętość fazy wodnej powinna wynosić około 500 μL.
  6. Wytrącić RNA z fazy wodnej, wprowadzając 0,5 ml izopropanolu i delikatnie mieszając, kilkakrotnie odwracając probówkę. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  7. Odwirować próbki o masie 10 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu zebrania RNA.
  8. Zdekantować supernatant i dokładnie usunąć wszelkie pozostałości cieczy przez aspirację.
  9. Umyj granulkę RNA raz 75% etanolem, dodając co najmniej 1 ml 75% etanolu. Dokładnie wymieszać próbkę, a następnie odwirować w temperaturze 7500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Wyeliminuj wszelkie ślady etanolu. Suszyć granulkę RNA na powietrzu przez 5 minut.
  11. Rozpuść RNA w 10 μl wody wolnej od RNaz, pipetując w górę i w dół.
  12. Kontynuuj przeprowadzanie PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z instrukcjami producenta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu przedstawiamy udoskonalony protokół oceny funkcjonalności komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym, wykorzystujący analizę cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Miniudar został wywołany przez trwałe podwiązanie dystalnej gałęzi prawej tętnicy środkowej mózgu (MCA), po którym nastąpiło 7-minutowe zamknięcie obustronnych tętnic szyjnych wspólnych (CCA). Metodologia ta prowadzi do łagodnego udaru charakteryzującego się niewielką, stałą objętością zmian i wyjątkowo niską śmiertelnością. Co więcej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy przedstawiono szczegółowy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym, wykorzystujący analizę cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Krytyczne etapy tego protokołu obejmują ustanowienie ogniskowego udaru niedokrwiennego poprzez trwałe podwiązanie dystalnej gałęzi prawej środkowej tętnicy mózgowej (MCA) wraz z siedmiominutową niedrożnością obustronnych tętnic szyjnych wspólnych (CCA). To podejście chirurgiczne prowadzi do łagodnego udaru, który charakteryzuje się stałą ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 82201622) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych Mongolii Wewnętrznej (nr 2020MS03017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówka do mikrowirówekGNIAZDO 615601Materiał laboratoryjny
1 i razy; PBSCorning21-040-CMOdczynnik
96-dołkowa, przezroczysta, okrągłodenna mikropłytka poddana działaniu TCCorning3799Materiał laboratoryjny
Układ anty-myszowy APC CD19Legenda biologiczna152410Przeciwciało
APC/Cyjanina7 anty-mysz CD45Legenda biologiczna103116Przeciwciało
Avertin (1,25 proc.)Biotechnologia Nanjing Aibei Zobacz materiał M2920Odczynnik
BD FACSAria IIBD642510Sprzęt
Brilliant Violet 421 anty-mysz CD4Legenda biologiczna100437Przeciwciało
Brilliant Violet 605 anty-mysz / człowiek CD11bLegenda biologiczna101237Przeciwciało
BSASigma-AldrichA1933-1GChemiczny
Kolagenaza IVSigma-AldrichC4-28-100MGEnzym
DNaza ILaboratoria biologiczne w Nowej AngliiZobacz materiał M0303LEnzym
EDTASigma-AldrichEDS-100GChemiczny
Falcon 5 ml probówki z polistyrenu z okrągłym dnemCorning352052Materiał laboratoryjny
Sokół  Stożkowe probówki wirówkowe 15 mlCorning352095Materiał laboratoryjny
FlowJo V10BDOprogramowanie
Przeciwciało GLAST (ACSA-1), PEMiltenyi Biotec130-118-344Przeciwciało
IzofluranRWD Nauki przyrodniczePrzekaźnik Przemysłowy R510-22-10Odczynnik
PE/Cyjanina7 anty-mysz CD3Legenda biologiczna100220Przeciwciało
PE/Dazzle 594 przeciw myszom NK-1.1Legenda biologiczna156518Przeciwciało
TRIzol ODCZYNNIKThermo Fisher Scientific Inc.15596026Odczynnik
Ultraczysta woda destylowana wolna od DNaz/RNazThermo Fisher Scientific Inc.10977015Odczynnik
Kleje do tkanek Vetbond3 mln1469SB powiedział:Materiał laboratoryjny
Zestaw do naprawy Zombie AquaLegenda biologiczna423102Aminowo-reaktywny barwnik fluorescencyjny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kleindorfer, D. O., et al. 2021 Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American heart association/American Stroke Association. Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).
  2. Pu, L., et al. Projected global trends in ischemic stroke incidence, deaths and disability-adjusted life years from 2020 to 2030. Stroke. 54 (5), 1330-1339 (2023).
  3. Cheng, Y., et al. Projections of the stroke burden at the global, regional, and national levels up to 2050 based on the global burden of disease study 2021. J Am Heart Assoc. 13 (23), e036142(2024).
  4. Ma, Y., Yang, S., He, Q., Zhang, D., Chang, J. The role of immune cells in post-stroke angiogenesis and neuronal remodeling: The known and the unknown. Front Immunol. 12, 784098(2021).
  5. Duan, M., Xu, Y., Li, Y., Feng, H., Chen, Y. Targeting brain-peripheral immune responses for secondary brain injury after ischemic and hemorrhagic stroke. J Neuroinflammation. 21 (1), 102(2024).
  6. Chen, B. R., Wu, T., Chen, T. H., Wang, Y. Neuroimmune interactions and their roles in neurodegenerative diseases. Fundam Res. 4 (2), 251-261 (2024).
  7. Zhang, Z., Lv, M., Zhou, X., Cui, Y. Roles of peripheral immune cells in the recovery of neurological function after ischemic stroke. Front Cell Neurosci. 16, 1013905(2022).
  8. Garcia-Bonilla, L., et al. Analysis of brain and blood single-cell transcriptomics in acute and subacute phases after experimental stroke. Nat Immunol. 25 (2), 357-370 (2024).
  9. Stevens, S. L., et al. The use of flow cytometry to evaluate temporal changes in inflammatory cells following focal cerebral ischemia in mice. Brain Res. 932 (1-2), 110-119 (2002).
  10. Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells. Glia. 22 (1), 72-85 (1998).
  11. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  12. De Haas, A. H., Boddeke, H. W., Biber, K. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
  13. Mcdonough, A., Weinstein, J. R. Neuroimmune response in ischemic preconditioning. Neurotherapeutics. 13 (4), 748-761 (2016).
  14. Wang, S., et al. Transcriptome analysis reveals dynamic microglial-induced a1 astrocyte reactivity via c3/c3ar/NF-kappab signaling after ischemic stroke. Mol Neurobiol. 61 (12), 10246-10270 (2024).
  15. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry. 69A, 1037-1042 (2006).
  16. Siddiqui, S., Livak, F. Principles of advanced flow cytometry: A practical guide. Methods Mol Biol. 2580, 89-114 (2023).
  17. Sousa, C., et al. Single-cell transcriptomics reveals distinct inflammation-induced microglia signatures. EMBO Rep. 19 (11), e46171(2018).
  18. Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry. J Vis Exp. 124, e55781(2017).
  19. Zhang, W., et al. Microglia-associated neuroinflammation is a potential therapeutic target for ischemic stroke. Neural Regen Res. 16 (1), 6-11 (2021).
  20. Mao, J. H., et al. Microglia polarization in ischemic stroke: Complex mechanisms and therapeutic interventions. Chin Med J (Engl). 134 (20), 2415-2417 (2021).
  21. Shui, X., et al. Microglia in ischemic stroke: Pathogenesis insights and therapeutic challenges. J Inflamm Res. 17, 3335-3352 (2024).
  22. Feng, Y., et al. Infiltration and persistence of lymphocytes during late-stage cerebral ischemia in middle cerebral artery occlusion and photothrombotic stroke models. J Neuroinflammation. 14 (1), 248(2017).
  23. Schulze, J., Gellrich, J., Kirsch, M., Dressel, A., Vogelgesang, A. Central nervous system-infiltrating t lymphocytes in stroke are activated via their TCR (T-cell receptor) but lack CD25 expression. Stroke. 52 (9), 2939-2947 (2021).
  24. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  25. Leelatian, N., et al. Single-cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry B Clin Cytom. 92 (1), 68-78 (2017).
  26. Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. Flow cytometry: Surface markers and beyond. J Allergy Clin Immunol. 143 (2), 528-537 (2019).
  27. Schmit, T., Klomp, M., Khan, M. N. The application of flow cytometry for simultaneous and multi-parametric analysis of heterogenous cell populations in basic and clinical research. Methods Mol Biol. 2223, 183-200 (2021).
  28. Dukhinova, M., Kopeikina, E., Ponomarev, E. D. Usage of multiparameter flow cytometry to study microglia and macrophage heterogeneity in the central nervous system during neuroinflammation and neurodegeneration. Methods Mol Biol. 1745, 167-177 (2018).
  29. Rui, W., et al. Myeloid gasdermin d drives early-stage T-cell immunity and peripheral inflammation in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neuroinflammation. 21 (1), 266(2024).
  30. Rauber, S., et al. Flow cytometry identifies changes in peripheral and intrathecal lymphocyte patterns in CNS autoimmune disorders and primary CNS malignancies. J Neuroinflammation. 21 (1), 286(2024).
  31. Rayaprolu, S., et al. Flow-cytometric microglial sorting coupled with quantitative proteomics identifies moesin as a highly-abundant microglial protein with relevance to Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 15 (1), 28(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Udar niedokrwiennycytometria przep ywowamodel mini udaruaktywacja kom rek odporno ciowychdysocjacja tkanki m zgowejzawiesina jednokom rkowailo ciowe oznaczanie kom rek odporno ciowychneuroinflamacjamysi model udaru

Powiązane artykuły