Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie RNA ujawnia szlak różnicowania komórek Th17 jako mechanizm uszkodzenia mózgu wywołanego promieniowaniem

561 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68322

⸱

20 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Institute of Radiation Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie ma na celu zbadanie aktywacji szlaku różnicowania komórek Th17 u myszy z uszkodzeniem mózgu wywołanym promieniowaniem.

Streszczenie

Radioterapia jest powszechną metodą leczenia nowotworów głowy i szyi; jednak niezmiennie prowadzi do wywołanego promieniowaniem uszkodzenia normalnej tkanki mózgowej, czego kulminacją jest uszkodzenie mózgu wywołane promieniowaniem (RBI). Pomimo szeroko zakrojonych badań nad zapaleniem nerwów wywołanym promieniowaniem, związek między RBI a szlakiem różnicowania komórek Th17 pozostaje niewystarczająco poznany. Myszy C57BL/6 poddano pojedynczemu podaniu napromieniania czaszki 30 Gy w celu opracowania modelu RBI. Funkcje poznawcze oceniano za pomocą labiryntu wodnego Morrisa (MWM), testu otwartego pola, testu rozpoznawania nowych obiektów i testu rotarod. Zmiany histopatologiczne w tkance mózgowej analizowano za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E). Barwienie immunofluorescencyjne zastosowano do oceny aktywacji mikrogleju (IBA-1) i astrocytów (GFAP). Sekwencjonowanie RNA przeprowadzono w celu identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji, podczas gdy Simple Western i qPCR wykorzystano do zbadania kluczowych cząsteczek sygnałowych zaangażowanych w różnicowanie komórek Th17. Myszy RBI wykazywały wyraźne deficyty poznawcze, szczególnie w uczeniu się przestrzennym i zapamiętywaniu. Badanie histologiczne wykazało aktywację mikrogleju i astrocytów w korze i hipokampie napromieniowanych myszy. Analiza sekwencjonowania RNA wykazała znaczne wzbogacenie szlaku różnicowania komórek Th17 w korze grupy RBI. Dalsza walidacja za pomocą analiz Simple Western i qPCR potwierdziła regulację w górę TGF-β, IL-6, RORγt, IL-17 i P-STAT3 w korze myszy RBI. Odkrycia te sugerowały, że szlak różnicowania komórek Th17 odgrywa kluczową rolę w patogenezie uszkodzenia mózgu wywołanego promieniowaniem. Zapalenie nerwów, w którym pośredniczą komórki Th17, może być krytycznym mechanizmem leżącym u podstaw dysfunkcji poznawczych wywołanych promieniowaniem.

Wprowadzenie

Radioterapia jest kluczowym sposobem leczenia zarówno pierwotnych, jak i przerzutowych nowotworów głowy i szyi, ale uszkodzenie mózgu wywołane promieniowaniem (RBI) może wystąpić jako poważne powikłanie, charakteryzujące się uszkodzeniem ośrodkowego układu nerwowego. Częstość występowania RBI różni się w zależności od typu guza i metody leczenia, przy czym zgłaszane wskaźniki wahają się od 28%-50% po radioterapii stereotaktycznej w przypadku oponiaków1, 1,9%-5% w przypadku raka nosogardzieli < klasa SUP = 'xref'>2,3, 1%-24% dla glejaków o niskim stopniu złośliwości4,5 i 8%-20% dla przerzutów do mózgu6,7. RBI dzieli się na typ ostry, wcześnie opóźniony i późno opóźniony, przy czym dysfunkcje poznawcze, w szczególności upośledzenie pamięci i deficyty uczenia się są widoczne w formie późno opóźnionej. Dysfunkcja poznawcza wywołana promieniowaniem (RICD), która dotyka 50%-90% osób, które przeżyły raka głowy i szyi, znacząco wpływa na jakość życia8, jednak jego patogeneza pozostaje słabo poznana, a skuteczne strategie zapobiegawcze i terapeutyczne są niewystarczające.

Zapalenie nerwów jest kluczową patologiczną cechą RBI, pogarszającą zakłócenie bariery krew-mózg i utrudniającą neurogenezę w hipokampie. Limfocyty Th17, podzbiór limfocytów T CD4 + znanych z wytwarzania cytokiny prozapalnej IL-179, zostały powiązane z różnymi chorobami neurodegeneracyjnymi, w tym stwardnieniem rozsianym i chorobą Parkinsona10,11. Komórki te, w pewnych stanach zapalnych, mogą przekraczać barierę krew-mózg i przyczyniać się do zapalenia nerwów12. Od czasu ich odkrycia w 2005 roku, limfocyty Th17 przyciągnęły uwagę zarówno ze względu na ich rolę zarówno w odpowiedziach immunologicznych przeciwko patogenom, jak i ich udziale w chorobach zapalnych, co czyni je potencjalnym celem do badania mechanizmów RBI i związanych z nim dysfunkcji poznawczych13.

W tym badaniu wykorzystano tylko samce myszy. Wykluczenie samic miało na celu uniknięcie potencjalnych zakłóceń wynikających z fluktuacji neurozapalnych związanych z cyklem rujowym, ponieważ poziomy progesteronu mogą różnić się nawet dziesięciokrotnie w różnych fazach cyklu14. Co więcej, nasz model eksperymentalny został zaprojektowany tak, aby odzwierciedlić kontekst kliniczny radioterapii nowotworów głowy i szyi, w której około 72% pacjentów to mężczyźni15. W związku z tym, większość opublikowanych badań badających mechanizmy uszkodzenia mózgu wywołanego promieniowaniem (RBI) wykorzystywała samce gryzoni do ustalenia wyjściowych cech patologicznych16.

Chociaż do badania RBI zastosowano różne modele, tradycyjne metodologie, takie jak barwienie histopatologiczne i proste Western blotting, napotykają ograniczenia pod względem czułości, przepustowości i dokładności17. Ostatnie osiągnięcia, takie jak sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) i proteomika o wysokiej przepustowości, dostarczyły bardziej szczegółowych informacji na temat mechanizmów molekularnych leżących u podstaw RBI18. Technologie te pozwalają na kompleksowe zrozumienie zmian ekspresji genów i zmian białek, dostarczając bardziej precyzyjnych danych niż wcześniejsze metody19. W szczególności Simple Western jest nowatorską i zautomatyzowaną techniką, która łączy zalety elektroforezy kapilarnej z wykrywaniem białek za pomocą chemiluminescencji, ułatwiając analizę o wysokiej przepustowości przy minimalnej objętości próbki i zwiększonej odtwarzalności20. W porównaniu z tradycyjnym Western blotting, Simple Western eliminuje potrzebę transferu błony i dostarcza ilościowych danych dotyczących ekspresji białek, oferując kilka korzyści pod względem czułości i odtwarzalności, szczególnie w wykrywaniu białek o niskiej liczebności21,22.

Praktyczne wytyczne dotyczące ekstrakcji i przygotowania RNA są kluczowe dla sukcesu wysokiej jakości sekwencjonowania i kwantyfikacji. W celu optymalnej ekstrakcji RNA zalecamy stosowanie wysokiej jakości zestawów do izolacji RNA i upewnienie się, że stężenie mieści się w zakresie 100-1000 ng/μL, przy liczbie integralności RNA (RIN) powyżej 7,0, aby uniknąć degradacji. Podczas wykonywania analizy białek za pomocą Simple Western ważne jest, aby upewnić się, że próbki białek są odpowiednio zdenaturowane i załadowane w stężeniu około 1-5 μg na kapilarę. Do walidacji qPCR należy użyć wysokiej jakości cDNA zsyntetyzowanego z co najmniej 1 μg RNA, zapewniając spójne warunki odwrotnej transkrypcji. Należy unikać typowych pułapek w przygotowaniu RNA, takich jak zanieczyszczenie genomowym DNA lub degradacja RNA, poprzez stosowanie sprzętu wolnego od RNAzy i szybkie przeprowadzanie separacji faz, aby zapobiec degradacji RNA.

Poprzez włączenie tych metod, to badanie ma na celu zbadanie, czy szlak różnicowania komórek Th17 jest aktywowany w mysich modelach RBI i jak przyczynia się do patogenezy dysfunkcji poznawczych wywołanych promieniowaniem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury eksperymentalne prowadzone tutaj są ściśle zgodne z wytycznymi ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). Zgodę uzyskano od Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Pekińskiego Instytutu Medycyny Radiacyjnej (Zatwierdzenie nr. AF/SC-08/02; Data: 25 lutego 2024 r.).

1. Napromienianie czaszki myszy

  1. W badaniu wykorzystano łącznie 10 samców myszy C57BL/6 w wieku 6-8 tygodni, przydzielając pięć zwierząt do grupy RBI i pięć do grupy kontrolnej, gdzie grupa kontrolna składa się z ślepych myszy kontrolnych, które nie otrzymały RBI. Utrzymuj myszy w kontrolowanych warunkach środowiskowych, w tym w regulowanej temperaturze, wilgotności i 12-godzinnym cyklu światła/ciemności. Zaaklimatyzuj myszy przez 1 tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu.
  2. Znieczulanie zwierząt za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia 1% pentobarbitalu sodu w dawce 50 mg/kg masy ciała. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, sprawdzając brak odruchowej reakcji na mocne uszczypnięcie łapy. Nałożyć weterynaryjną maść okulistyczną na oba oczy natychmiast po rozpoczęciu znieczulenia, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.
  3. Ułóż zwierzęta w pozycji leżącej za pomocą specjalnego drewnianego urządzenia przytrzymującego i przykryj niedocelowe obszary ciała płytką ekranującą z ołowiu (Pb) o grubości 3 mm (czystość 99,9%), aby zapewnić miejscowe napromieniowanie.
  4. Kolimacja pola napromieniowania 2 x 2 cm2 z filtracją naturalną (1,5 mm Al + 0,25 mm Cu). Dopasuj pole do linii środkowej czaszki za pomocą zintegrowanego krzyża laserowego (λ = 635 nm ± dokładności 0,5 mm) i weryfikuj pozycjonowanie w czasie rzeczywistym za pomocą zintegrowanego systemu kamer CMOS i podświetlenia w podczerwieni. Naświetlić okolicę czaszki pojedynczą dawką promieniowania rentgenowskiego 30 Gy z prędkością 1,325 Gy/min za pomocą systemu X-RAD 320 przy następujących parametrach: 320 kVp/12,5 mA, SSD = 50 cm.
  5. Wykonaj tygodniową kalibrację dawki za pomocą identyfikowalnej komory jonizacyjnej umieszczonej w izocentrum. Utrzymuj parametry wiązki na poziomie 320 kVp/12,5 mA z filtracją 3,2 mm Cu HVL, aby osiągnąć szybkość dawki 1,325 Gy/min (± 3% odchylenia). Codziennie sprawdzaj jednorodność wiązki (> 95% w terenie) za pomocą folii Gafchromic EBT3.
  6. Meloksykam (1-2 mg/kg mc., podskórnie) należy podawać raz na dobę przez 3 dni w celu opanowania bólu pooperacyjnego. Umieść zwierzęta we wstępnie ogrzanej komorze rekonwalescencji i stale monitoruj, aż odzyskają pełną świadomość i będą w stanie utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie pozostawiaj zwierząt bez opieki w okresie rekonwalescencji.
  7. Rejestruj masę ciała wszystkich myszy co tydzień przez cały czas trwania badania. Obserwuj myszy w sumie przez 4 tygodnie, w tym 1 tydzień aklimatyzacji i 3 tygodnie po napromienianiu.

2. Analiza zachowania zwierząt

  1. Wykonuj eksperymenty behawioralne 3 tygodnie po RBI.
  2. Labirynt wodny Morris
    1. Napełnij okrągły basen (średnica: 120 cm, wysokość: 50 cm) nieprzezroczystą wodą (20-22 °C) za pomocą mleka w proszku, aby zasłonić zanurzoną platformę. Umieść ukrytą platformę (średnica: 10 cm) 1 cm pod powierzchnią wody w stałym kwadrancie.
    2. Zaaklimatyzować myszy w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut przed próbami. Rozpocznij fazę treningu od umieszczenia każdej myszy w wodzie z jednego z czterech pseudolosowo wybranych punktów startowych (N, S, E, W).
    3. Pozwól myszy pływać przez maksymalnie 60 sekund, aby zlokalizować ukrytą platformę. Jeśli mysz nie znajdzie platformy w ciągu 60 sekund, poprowadź ją do platformy i pozwól jej pozostać tam przez 15 sekund.
    4. Przeprowadzaj cztery próby dziennie na mysz z 15-minutowymi przerwami między próbami. Dokładnie osusz każdą mysz ciepłym ręcznikiem między próbami, aby zapobiec hipotermii. Kontynuuj szkolenie przez 5 kolejnych dni, aby ocenić przyswajanie wiedzy.
    5. W dniu próby sondy zdejmij platformę i pozwól myszy swobodnie pływać przez 60 sekund. Rejestruj parametry, takie jak czas spędzony w kwadrancie docelowym, skrzyżowania platformy i ścieżki pływania.
    6. Śledź i analizuj wszystkie badania za pomocą zautomatyzowanego systemu śledzenia wideo, w którym eksperymentatorzy są ślepi na alokację grupową.
  3. Test w terenie otwartym
    1. Zaaklimatyzować myszy w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut przed eksperymentem. Używaj aparatu do otwartego pola (50 cm x 50 cm x 40 cm) wykonanego z nieprzezroczystego tworzywa sztucznego. Oświetl arenę równomiernie (zwykle 25-30 luksów), aby uniknąć silnych cieni i zminimalizować stres.
    2. Oczyść arenę 70% etanolem przed przetestowaniem każdego zwierzęcia, aby wyeliminować sygnały zapachowe. Delikatnie umieść mysz na środku otwartego pola, aby rozpocząć test. Pozwól myszy swobodnie eksplorować arenę przez 10 minut.
    3. Rejestruj aktywność lokomotoryczną i pozycję za pomocą automatycznego systemu śledzenia. Zdefiniuj strefę środkową jako wewnętrzne 20%-25% całkowitej powierzchni. Zmierz czas spędzony w strefie centralnej i całkowity przebyty dystans.
    4. Po sesji wróć mysz do jej domowej klatki i dokładnie wyczyść urządzenie.
  4. Test rozpoznawania nowych obiektów
    1. Zaaklimatyzować myszy w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut przed eksperymentem. Użyj areny na otwartym polu (50 cm x 50 cm x 40 cm) z równomiernym oświetleniem (20-30 luksów). Dokładnie oczyść arenę 70% etanolem między zwierzętami, aby wyeliminować sygnały węchowe.
    2. Umieść każdą mysz na pustej arenie i pozwól jej swobodnie eksplorować przez 10 minut. W tej fazie nie umieszczaj żadnych przedmiotów.
    3. Po 24 godzinach umieść dwa identyczne obiekty (A i A′) w przeciwległych rogach areny (co najmniej 8 cm od ścian). Delikatnie umieść mysz na środku areny i pozwól jej eksplorować przez 10 minut.
    4. Rejestruj interakcję z obiektem za pomocą zautomatyzowanego systemu wideo. Zdefiniuj eksplorację obiektu jako pysk myszy znajdujący się w odległości nie większej niż 2 cm od obiektu, gdy jest zorientowany w jego kierunku.
    5. Po próbie przywróć mysz do jej domowej klatki i posprzątaj arenę oraz obiekty.
    6. Po upływie 1 godziny przerwy między przechowywaniem umieść jeden znany obiekt (A) i jeden nowy obiekt (B) w tych samych pozycjach. Przywróć mysz na arenę i pozwól jej eksplorować przez 5 minut.
    7. Rejestruj czas spędzony na eksploracji każdego obiektu przy użyciu tych samych kryteriów, co wcześniej. Oblicz indeks rozpoznawania jako:
      Wskaźnik rozpoznawania (%) = [Czas na nowym obiekcie / (Czas na powieści + znajomy obiekt)] x 100
  5. Próba Rotarod
    1. Zaaklimatyzować myszy w pomieszczeniu testowym przez co najmniej 30 minut przed badaniem. Użyj zmotoryzowanego aparatu rotarodowego o średnicy pręta ~3 cm i wysokości ~30 cm nad podstawą.
    2. Ustaw tryb obrotów na prędkość przyspieszania (od 4 obr./min do 40 obr./min w ciągu 5 min). Oczyść powierzchnię pręta 70% etanolem przed umieszczeniem każdej myszy.
    3. Delikatnie umieść mysz na środku obracającego się pręta, skierowaną do przodu. Rozpocznij rotację i natychmiast rozpocznij odmierzanie czasu.
    4. Zapisz opóźnienie, które ma zostać automatycznie zmniejszone przez system. Chwyć mysz bezpiecznie po upadku, aby uniknąć obrażeń. Odczekaj okres odpoczynku co najmniej 15 minut między próbami, aby zapobiec zmęczeniu.
    5. Przeprowadź 3 kolejne próby na mysz dziennie i uśrednij opóźnienie jako wynik końcowy. Upewnij się, że wszystkie testy są wykonywane przez zaślepionych eksperymentatorów w spójnych warunkach. Po przetestowaniu umieść mysz w klatce domowej i dokładnie zdezynfekuj urządzenie.

3. Eutanazja zwierząt i przygotowanie próbki

  1. Pobrać próbki tkanek 5 tygodni po RBI.
  2. Przygotować pentobarbital sodu (100 mg/kg) i sterylną strzykawkę. Pentobarbital sodu należy wstrzykiwać dootrzewnowo. Poczekaj, aż mysz przestanie oddychać, a bicie serca ustanie, potwierdzając śmierć.
  3. Szybko odetnij głowę na skrzyżowaniu potylicznym i strzałkowo nacinaj szwy czaszkowe za pomocą cienkich nożyczek, a następnie ostrożnie podnieś obustronne płaty czaszki za pomocą zakrzywionych kleszczy, zachowując integralność opony mózgowej przed zerwaniem połączeń nerwowych.
  4. Przenieś nienaruszony mózg do wstępnie schłodzonej matrycy w ciągu 60 sekund w celu bisekcji środkowej strzałki za pomocą sterylnych żyletek. Natychmiast rejestruj wymiary przednio-tylne (8,2 ± 0,3 mm), szerokość przyśrodkowo-boczną (4,5 ± 0,2 mm) i masę tkanki (112 ± 8 mg) za pomocą precyzyjnego oprzyrządowania.
  5. Wypreparuj tkanki korowe i hipokampa na lodzie. Błyskawiczne zamrożenie lewej półkuli w ciekłym azocie do sekwencjonowania RNA, qPCR i Simple Western.
  6. Ustaw prawą półkulę w 4% paraformaldehydzie (PFA) do histologii. Odwodnić utrwalone mózgi w stopniowanym etanolu od 70% do 100%, przy czym każdy krok trwa 30 minut.
  7. Oczyść mózgi w ksylenie przez 2 godziny. Naciekaj tkanki stopioną parafiną w temperaturze 60°C przez 4 godziny. Osadź oczyszczone mózgi w blokach parafinowych i pozwól im zestalić się w temperaturze pokojowej. Wyciąć przekroje koronalne o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu.

4. Barwienie hematoksyliną i eozyną

  1. Odparafinować skrawki tkanek, zanurzając szkiełka w ksylenie na 5 minut, 3 razy. Ponownie uwodnić skrawki za pomocą serii stopniowanego etanolu: 100%, 95%, 70% i wody destylowanej, przez 5 minut każda.
  2. Skrawki barwić Hematoksyliną przez 5 minut, w zależności od pożądanej intensywności barwienia. Opłucz skrawki pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut, aby usunąć nadmiar Hematoxyliny.
  3. Różnicuj skrawki w 1% kwasie solnym w etanolu przez kilka sekund, aby uzyskać pożądany kontrast. Ponownie spłucz pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Barwieć skrawki preparatem Eosin przez 1 min.
  4. Krótko opłucz sekcje w wodzie destylowanej. Odwodnić sekcje za pomocą serii stopniowanego etanolu: 70%, 95% i 100% przez 5 minut każda.
  5. Oczyść sekcje z ksylenu przez 5 minut, 3x. Zamontuj sekcje za pomocą szkiełka nakrywkowego za pomocą medium montażowego. Rób zdjęcia za pomocą mikroskopu Nikon Eclipse Ni-U z obiektywem 20x.

5. Immunofluorescencja

  1. Utrwal chusteczkę, zanurzając szkiełka w 4% PFA na 15 minut w temperaturze pokojowej. Myć szkiełka w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) przez 5 minut, 3 razy, w celu usunięcia nadmiaru PFA.
  2. Przepuszczalność tkanki poprzez inkubację szkiełek z 0,3% Triton X-100 w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zablokuj niespecyficzne wiązanie, inkubując szkiełka z 5% normalną surowicą przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami IBA-1 i GFAP, rozcieńczonymi w buforze blokującym w rozcieńczeniu 1:2000, przez noc w temperaturze 4 °C, w zależności od specyfikacji przeciwciał. Myć szkiełka w PBS przez 5 minut, 3 razy, w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego.
  4. Inkubować z kozim przeciwciałem drugorzędowym anty-króliczym IgG sprzężonym z Alexa Fluor 488, rozcieńczonym w stosunku 1:1000 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Myć szkiełka w PBS przez 5 minut, 3x, aby usunąć nadmiar przeciwciał drugorzędowych.
  5. Zamontuj slajdy za pomocą medium montażowego zapobiegającego blaknięciu zawierającego DAPI. Uszczelnij szkiełko nakrywkowe przezroczystym lakierem do paznokci.
  6. Rejestruj obrazy fluorescencyjne za pomocą systemu mikroskopu konfokalnego z obiektywem 20x.
  7. Określ ilościowo intensywność fluorescencji za pomocą ImageJ. Wykonaj analizę ilościową za pomocą narzędzia Analizuj cząstki firmy ImageJ z progami wielkości 50-200μm2 (mikroglej) i 100-500μm2 (astrocyty). Odejmij tło za pomocą algorytmu Rolling Ball (promień = 50 pikseli).

6. analiza qPCR

  1. Wyodrębnij całkowite RNA z tkanki za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA. Postępuj zgodnie z protokołem producenta dotyczącym homogenizacji, lizy i oczyszczania RNA.
  2. Określić ilościowo wyekstrahowany RNA za pomocą spektrofotometru w celu zmierzenia stężenia i oceny czystości (stosunek A260/A280). Upewnij się, że stężenie RNA jest odpowiednie do syntezy cDNA (100-500 ng/μL).
  3. Oceń jakość RNA za pomocą bioanalizatora. Upewnij się, że RNA nie wykazuje degradacji (ostre prążki dla 18S i 28S rRNA) i ma numer integralności RNA (RIN) powyżej 7.
  4. Przygotować mieszaninę reakcyjną o objętości 20 μl z 1 μg RNA, buforem do odwrotnej transkrypcji, oligo-dT, dNTP, inhibitorem RNazy i odwrotną transkryptazą.
  5. Inkubować w temperaturze 42 °C przez 60 minut w celu syntezy cDNA. Podgrzewać w temperaturze 85 °C przez 5 minut, aby dezaktywować odwrotną transkryptazę.
  6. Połącz cDNA, mieszaninę główną, starter do przodu, starter odwrotny (tabela 1) i wodę wolną od nukleaz na 96-dołkowej płytce PCR. Użyć 2 μl cDNA na 20 μl reakcji i zapewnić końcowe stężenie startera 200 nM. Uszczelnij płytkę optyczną folią samoprzylepną, aby zapobiec parowaniu.
powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:
gensekwencja starterów (5'-3', przód/tył)
TGF-β1CCACCTGCAAGACCATCGAC powiedział:
CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC
TGF-β3GGACTTCGGCCACATCAAGAA powiedział:
TAGGGGACGTGGGTCATCAC powiedział:
IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG
AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG
RORγtTCCACTACGGGGTTATCACCT
AGTAGGCCACATTACACTGCT
IL-17ATCAGCGTGTCCAAACACTGAG
CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT
IL-17FTGCTACTGTTGATGTTGGGAC powiedział:
CAGAAATGCCCTGGTTTTTTT powiedział: CAGAAATGCCCTGGTTTTTTT powiedział:
GAPDHAGGTCGTGTGAACGGATTTG powiedział:
GGGGTCGTTGATGGCAACA powiedział:

Tabela 1: startery sekwencji qPCR.

  1. Umieść płytkę reakcyjną w przyrządzie do PCR w czasie rzeczywistym i zaprogramuj termocykler. Stosować następujące warunki cyklu: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 30 s.
  2. Normalizuj ekspresję docelowych genów do GAPDH. Oblicz względne poziomy wyrażenia za pomocą metody ΔΔCt i przedstaw dane jako zmiany krotności w porównaniu z grupą kontrolną.

7. Analiza sekwencjonowania RNA

  1. Znieczulij i poddaj eutanazji mysz zgodnie z instytucjonalnymi protokołami opieki nad zwierzętami. Natychmiast wykonaj perfuzję zimnym PBS, aby usunąć krążącą krew.
  2. Przeanalizuj mózg na lodzie. Odizoluj korę mózgową za pomocą sterylnych narzędzi preparacyjnych. Zminimalizuj czas preparacji, aby zachować integralność RNA.
  3. Błyskawiczne zamrożenie tkanki korowej w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C, jeśli ekstrakcja RNA nie zostanie przeprowadzona natychmiast.
  4. Homogenizować zamrożoną korę (30-50 mg) w 1 ml odczynnika do ekstrakcji RNA za pomocą homogenizatora z napędem, aż nie pozostaną żadne widoczne fragmenty.
  5. Przeprowadzić separację faz chloroformu. Dodać 200 μl chloroformu, wstrząsać energicznie przez 15 s, inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej, następnie odwirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Przenieś górną warstwę do nowej probówki, dodaj równą objętość 70% etanolu i kontynuuj oczyszczanie RNA za pomocą zestawu opartego na kolumnie krzemionkowej.
  7. Użyj trawienia DNazy w kolumnie, aby usunąć genomowe DNA podczas oczyszczania RNA. Zbierz całkowite RNA w 30-50 μl i trzymaj na lodzie do natychmiastowego użycia.
  8. Użyj spektrofotometru, aby określić ilościowo stężenie i czystość RNA. Potwierdź stosunek A260/A280 ~2,0. Przeanalizuj 1 μl RNA na bioanalizatorze. Upewnij się, że RIN jest większy niż 8.0 dla sekwencjonowania.
  9. Użyj protokołu wyboru poly(A) i zestawu do przygotowania biblioteki stranded. Postępuj zgodnie z protokołem producenta, aby wygenerować biblioteki 300-400 bp. Oczyść biblioteki za pomocą zestawu komercyjnego.
  10. Użyj Bioanalyzera, aby potwierdzić rozmiar fragmentu i określić ilościowo za pomocą bibliotek puli równomolarnie. Wykonaj sekwencjonowanie sparowanych końców (2x, 150 pz) przy użyciu platformy Illumina.
  11. Przycinaj adaptery za pomocą Trim Galore, oceniaj jakość za pomocą FastQC, dopasowuj odczyty do genomu myszy (GRCm39) za pomocą STAR i określaj ilościowo ekspresję genów za pomocą featureCounts. Zidentyfikuj geny o zróżnicowanej ekspresji za pomocą DESeq2.
  12. Wykorzystaj dane wyjściowe z DESeq2 i przefiltruj geny o znacząco zróżnicowanej ekspresji DEG (skorygowana wartość p < 0,05 i |log2FC| > 1). Wykonaj analizę wzbogacania szlaków GO i KEGG za pomocą Phyper w oparciu o test hipergeometryczny. Zidentyfikuj ścieżki o skorygowanej wartości P ≤ 0,05 jako statystycznie istotne.

8. Prosta analiza Zachodu

  1. Homogenizować korę mózgową myszy w buforze RIPA z inhibitorami proteazy i fosfatazy, a następnie odwirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia zanieczyszczeń. Określ stężenie białka za pomocą testu BCA.
  2. Denaturacja próbek białkowych poprzez zmieszanie ich z buforem próbki i inkubację w temperaturze 95°C przez 5 minut w celu zapewnienia całkowitej denaturacji.
  3. Załaduj 3 μl zdenaturowanych próbek białek do kapilar Simple Western. Upewnij się, że próbki są prawidłowo załadowane, aby zapobiec przepełnieniu. Umieść naczynia włosowate w prostym instrumencie zachodnim.
  4. Inkubować oddzielone białka z rozcieńczonymi w stosunku 1:50 przeciwciałami pierwszorzędowymi, w tym p-STAT3, STAT3, RORγt, TGF-β, IL-6 i IL-17, przez 30 minut.
  5. Przemyć układ kapilarny buforem do przemywania przez trzy płukania po 5 minut każde w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał pierwszorzędowych. Dodać przeciwciało drugorzędowe sprzężone z HRP rozcieńczone w buforze blokującym i inkubować przez 30 minut.
  6. Wykonaj 3 płukania po 5 minut każde z buforem do przemywania w celu usunięcia nadmiaru przeciwciał wtórnych. Uruchom program detekcyjny w systemie Simple Western, aby automatycznie wykryć białka za pomocą chemiluminescencji.
  7. Analizuj dane za pomocą oprogramowania Compass for Simple Western. Określ ilościowo ekspresję białka, porównując względne obszary pików w elektroferogramie. Znormalizuj dane do białka GAPDH.

9. Analiza statystyczna

  1. Otwórz oprogramowanie GraphPad Prism 9.0.0. Kliknij Plik> Importuj dane w celu załadowania danych. Przedstaw dane jako średnie ± SD. Użyj niesparowanego testu t do porównań między dwiema grupami.
  2. Oceń normalność za pomocą testu Shapiro-Wilka. Jeśli normalność jest naruszona (p < 0,05), zastosuj test U Manna-Whitneya do porównań między grupami. Jeśli spełniona jest norma (p ≥ 0,05), wykonaj test t dla prób niezależnych, aby ocenić różnice w grupach.
  3. Raportuj wyniki z wartościami p. Uznajmy, że p < 0,05 jest statystycznie istotne. Użyj następującej notacji: n.s. dla nieistotnego, * dla p < 0,05, ** dla p < 0,005, *** dla p < 0,0005 i **** dla p < 0,0001.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Upośledzenie poznawcze u myszy z RBI
Po napromieniowaniu całego mózgu dawką 30 Gy monitorowano masę ciała myszy w odstępach tygodniowych. Funkcje poznawcze oceniano w 4.th tydzień (Rycina 1A). Pomiary wstępne wykazały, że masa ciała grup kontrolnej i RBI była zbliżona. Jednakże między 1. a 3. tygodniem po napromieniowaniu w grupie RBI odnotowano istotny spadek masy ciała (Rycina 1B), co wskazuje, ż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Krytyczne kroki w ramach protokołu
Protokół ten obejmuje indukcję RBI u myszy, a następnie kompleksową ocenę zapalenia nerwów i szlaku różnicowania komórek Th17 (ryc. 6). Krytycznym etapem jest napromienianie czaszki myszy C57BL/6 dawką 30 Gy, dobrze ugruntowanym modelem dla RBI1. Dokładna kalibracja dawki za pomocą komór jonizacyjnych zapewnia powtarzalność28. Testy behawioralne, w tym MWM, oceniają upośledzenie funkcji p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Wsparcie dla tej pracy zostało zapewnione przez Pekiński Instytut Medycyny Radiacyjnej

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Moduł separacji 12-230 kDa, 8 x 25 wkładów kapilarnychProteinSimpleSM-W004dla
przeciwciała anty-GAPDHSimpleWestern ProteintechHRP-600041:500 rozcieńczenie/przeciwciało dla
przeciwciała anty-GFAPSimpleWestern Abcamab72601:2000 rozcieńczenie/przeciwciało dla przeciwciała immunofluorescencyjnego
anty-IBA-1Abcamab1788461:2000 rozcieńczenie/przeciwciało dla immunofluorescencji
przeciwciało anty-IL-17 A/FThermoMA5-237481:10 rozcieńczenie/przeciwciało dla przeciwciała
anty-IL-1 i betaSimpleWestern CST122421:50 rozcieńczenie/przeciwciało dla
przeciwciała anty-IL-6SimpleWesternMA5-23800rozcieńczenie/przeciwciało 1:5 dla
modułuwykrywania SimpleWestern Anti-MouseBiałkoSimpleDM-002przeciwciało drugorzędowe dla
przeciwciała anty-P-STAT3(Try705)ThermoMA5-15193rozcieńczenie/przeciwciało 1:2 dla
modułu wykrywania SimpleWestern Anti-Rabbit Białkowtórne DM-001dla
anty-ROR&gamma SimpleWestern; t przeciwciałoThermo14-6988-821:5 rozcieńczenie/przeciwciało dla
przeciwciała anty-STAT3SimpleWestern Thermo7100771:20 rozcieńczenie/przeciwciało dla
przeciwciała SimpleWestern anty-TGF β-1,2,3ThermoMA5-237951:10 rozcieńczenie/przeciwciało do
testu SimpleWestern BACThermoA55860białek
EZ Standard Pack 1 12-230 kDaProteinSimplePS-ST01EZ-8dla SimpleWestern
Goat Anti-Rabbit IgG H& LAbcamab1500771:1000 rozcieńczenie/przeciwciało do immunofluorescencji
RNeasy KitQiagen74134Ekstrakcja RNA
SuperScript IV System syntezy pierwszej niciThermo Fisher Scientific18091050Odwrotna transkrypcja
SYBR Green Master MixTakara Bio RR820AQ-PCR
Odczynnik trizolowyInvitrogen15596026ekstrakcji RNA
testy

Bibliografia

  1. Milano, M. T., et al. Radiation-induced edema after single-fraction or multifraction stereotactic radiosurgery formeningioma: a critical review. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 101 (2), 344-357 (2018).
  2. Tian, Y., et al. Radiation encephalopathy in nasopharyngeal carcinoma patients in mainland China: a systematic evaluation. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 24 (5), 471-473 (2002).
  3. Na, A., et al. Cerebral radiation necrosis. Asia Pac J Clin Oncol. 10 (1), 11-21 (2014).
  4. Deangelis, L. M. Brain tumors. N Engl J Med. 344 (2), 114-123 (2001).
  5. Kumar, A. J., et al. Malignant gliomas: MR imaging spectrum of radiation therapy-and chemotherapy-induced necrosis of the brain after treatment. Radiology. 217 (2), 377-384 (2000).
  6. Minniti, G., et al. Single-fraction versus multifraction (3 x 9 Gy) stereotactic radiosurgery for large (>2 cm) brain metastases: acomparative analysis of local control and risk of radiation-induced brain necrosis. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 95 (4), 1142-1148 (2016).
  7. Minniti, G., et al. Repeated stereotactic radiosurgery for patients with progressive brain metastases. J Neurooncol. 126 (1), 91-97 (2016).
  8. Turnquist, C., Harris, B. T., Harris, C. C. Radiation-induced brain injury: current concepts and therapeutic strategies targeting neuroinflammation. Neurooncol Adv. 2 (1), vdaa057(2020).
  9. Raphael, I., et al. T cell subsets and their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases. Cytokine. 74 (1), 5-17 (2015).
  10. Moser, T., et al. The role of TH17 cells in multiple sclerosis: Therapeutic implications. Autoimmun Rev. 19 (10), 102647(2020).
  11. MacMahon, C. A., et al. The Pathogenesis of Parkinson's Disease: A Complex Interplay Between Astrocytes, Microglia, and T Lymphocytes. Front Neurol. 12, 666737(2021).
  12. Kebir, H., et al. Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous system inflammation. Nat Med. 13 (10), 1173-1175 (2007).
  13. Omenetti, S., et al. The Intestine Harbors Functionally Distinct Homeostatic Tissue-Resident and Inflammatory Th17 Cells. Immunity. 51 (1), 77-89.e6 (2019).
  14. Mangold, C. A., et al. Sexually divergent induction of microglial-associated neuroinflammation with hippocampal aging. J Neuroinflammation. 14 (1), 141(2017).
  15. SEER Cancer Stat Facts: Head and Neck Cancer. , National Cancer Institute. https://seer.cancer.gov/statfacts/html/headneck.html (2025).
  16. Holmes-Hampton, G. P., et al. Time- and sex-dependent delayed effects of acute radiation exposure manifest via miRNA dysregulation. iScience. 27 (2), 108867(2024).
  17. Kempf, S. J., et al. The cognitive defects of neonatally irradiated mice are accompanied by changed synaptic plasticity, adult neurogenesis and neuroinflammation. Mol Neurodegener. 9, 57(2014).
  18. Zhao, J., et al. RNA-seq reveals Nup62 as a potential regulator for cell division after traumatic brain injury in mice hippocampus. PeerJ. 11, e14913(2023).
  19. Zhang, P., et al. Quantitative proteomics analysis to identify diffuse axonal injury biomarkers in rats using iTRAQ coupled LC-MS/MS. J Proteomics. 133, 93-99 (2016).
  20. Sormunen, A., et al. Comparison of Automated and Traditional Western Blotting Methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
  21. Mishra, M., et al. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Rev Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  22. Edouard, S., et al. Automated Western immunoblotting detection of anti-SARS-CoV-2 serum antibodies. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 40 (6), 1309-1317 (2021).
  23. Galland, F., et al. Astrocyte culture models: Molecular and function characterization of primary culture, immortalized astrocytes and C6 glioma cells. Neurochem Int. 131, 104538(2019).
  24. Wu, B., et al. The TGF-β superfamily cytokine Activin-A is induced during autoimmune neuroinflammation and drives pathogenic Th17 cell differentiation. Immunity. 54 (2), 308-323.e6 (2021).
  25. Korn, T., et al. IL-17 and Th17 Cells. Annu Rev Immunol. 27, 485-517 (2009).
  26. Kumar, R., et al. RORγt protein modifications and IL-17-mediated inflammation. Trends Immunol. 42 (11), 1037-1050 (2021).
  27. Qin, Z., et al. TCR signaling induces STAT3 phosphorylation to promote TH17 cell differentiation. J Exp Med. 221 (3), e20230683(2024).
  28. Lampert, P. W., et al. Delayed effect of radiation on the human central nervous system, 'early' and 'late' delayed reactions. Neurology. 14, 912-917 (1964).
  29. Martin, A., et al. Neurological imaging of brain damages after radiotherapy and/or chemotherapy. J Neuroradiol. 41 (1), 52-70 (2014).
  30. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17, 13(2016).
  31. Allen, B. D., et al. Mitigation of helium irradiation-induced brain injury by microglia depletion. J Neuroinflammation. 17 (1), 159(2020).
  32. Singh, R. P., et al. Th17 cells in inflammation and autoimmunity. Autoimmun Rev. 13 (12), 1174-1181 (2014).
  33. Monje, M. L., Toda, H., Palmer, T. D. Inflammatory blockade restores adult hippocampal neurogenesis. Science. 302 (5651), 1760-1765 (2003).
  34. Pazzaglia, S., et al. Neurocognitive Decline Following Radiotherapy: Mechanisms and Therapeutic Implications. Cancers. 12 (1), 146(2020).
  35. Zhang, X., et al. DNA methylation changes and their role in radiation-induced brain injury,". Neurobiol Dis. 129, 96-104 (2019).
  36. Lee, H. J., et al. Profiling of gene expression in the brain associated with anxiety-related behaviors in the chronic phase following cranial irradiation. Sci Rep. 12 (1), 13162(2022).
  37. Cañada-García, D., Arévalo, J. C. A Simple, Reproducible Procedure for Chemiluminescent Western Blot Quantification. Bio Protoc. 13 (9), e4667(2023).
  38. Raber, J., et al. Radiation-induced cognitive impairments are associated with changes in indicators of hippocampal neurogenesis. Radiat Res. 162 (1), 39-47 (2004).
  39. Zhang, J., et al. Th17 cell-mediated neuroinflammation is involved in neurodegeneration of aβ1-42-induced Alzheimer's disease model rats. PLoS One. 8 (10), e75786(2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekwencjonowanie RNAneuroinflamacjadysfunkcja poznawczaaktywacja mikroglejuaktywacja astrocyt wwodny labirynt MorrisaSimple Westernanaliza qPCR
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły