Ten protokół przedstawia zoptymalizowane techniki analizy degeneracji i zachowania fotoreceptorów w mysim modelu barwnikowego zwyrodnienia siatkówki, w tym podawanie leków doszklistkowych, kriostat i immunofluorescencję. Metoda zapewnia integralność siatkówki i dostarcza danych ilościowych na temat skuteczności interwencji terapeutycznych.
Artykuł metodologiczny
Analiza zwyrodnienia i zachowania fotoreceptorów w mysim zwyrodnieniu barwnikowym siatkówki
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Retinopatie dotykają setki milionów ludzi na całym świecie i są istotnymi przyczynami upośledzenia wzroku i ślepoty. Wśród tych chorób barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) jest dziedziczną chorobą oczu charakteryzującą się postępującym zwyrodnieniem siatkówki, dotykającą około 1,5 do 2 milionów ludzi na całym świecie. Badania typu proofofor słuszności koncepcji na zwierzęcych modelach dziedzicznych dystrofii siatkówki stanowią ważną podstawę dowodową dla badań nad patofizjologicznymi mechanizmami choroby, skutecznością i bezpieczeństwem leczenia. Iniekcje doszklistkowe u myszy i sekcje kriostatu są szeroko stosowanymi technikami do badania efektów działania leków w modelach RP, ponieważ umożliwiają precyzyjne dostarczanie substancji do ciała szklistego i przygotowanie wysokiej jakości próbek histologicznych do szczegółowej analizy zmian w siatkówce. Ponadto zliczanie komórek poprzez immunofluorescencję przy użyciu przeciwciał przeciwko rekupynie, zależnemu od wapnia białku ulegającemu ekspresji w fotoreceptorach siatkówki, zostało ostatnio wykorzystane do badania zmian komórkowych związanych ze zwyrodnieniem siatkówki w modelach RP, ponieważ podejście to ułatwia ocenę utraty fotoreceptorów i potencjalnego zachowania komórek po interwencjach terapeutycznych. Wstrzyknięcie do ciała szklistego zostało zoptymalizowane w celu zapewnienia integralności oka i wiarygodnych wyników, przy użyciu cienkiej igły do podawania roztworu do komory ciała szklistego. Po upływie określonego czasu na ocenę działania leku przeprowadza się przetwarzanie histologiczne, w którym próbki są cięte na kawałki o grubości 10 μm za pomocą kriostatu, a następnie znakowane immunofluorescencyjnie przeciwciałami odzysku. Na koniec przeprowadza się zliczanie komórek w celu oceny, czy leczenie lekami wywarło efekt ochronny, o czym świadczy zachowanie fotoreceptorów. Chociaż techniki te są szeroko stosowane w celu generowania spójnych danych w badaniach nad retinopatią, nadal istnieją wyzwania związane z osiągnięciem precyzyjnej obsługi tkanek i jakości przetwarzania. Protokół ten zapewnia ustandaryzowane podejście do optymalizacji każdego etapu, od iniekcji do ciała szklistego po przygotowanie skrawków histologicznych, zapewniając powtarzalne i wysokiej jakości wyniki.
Wprowadzenie
Widzenie jest jednym z najbardziej złożonych zmysłów systemu sensorycznego, niezbędnym do wychwytywania bodźców wizualnych otoczenia i przekształcania ich w sygnały elektrochemiczne, które są przetwarzane w mózgu w celu utworzenia obrazów. Różne czynniki biologiczne, takie jak starzenie się, wady genetyczne i choroby, mogą upośledzać wzrok, znacząco wpływając na jakość życia i codziennych czynności.
Ludzkie oko składa się z trzech głównych komór. Warstwa zewnętrzna, utworzona przez rogówkę i twardówkę, zapewnia strukturalne wsparcie gałki ocznej. Warstwa pośrednia obejmuje tęczówkę, ciało rzęskowe i naczyniówkę, przy czym ta ostatnia odpowiada za dostarczanie krwi do fotoreceptorów. Wreszcie, warstwa wewnętrzna obejmuje siatkówkę, strukturę odpowiedzialną za przetwarzanie bodźców świetlnych i przekształcanie światła w sygnały elektryczne wysyłane do mózgu w celu tworzenia obrazu1,2.
Siatkówka nerwowa składa się z kilku warstw komórkowych, w tym wyspecjalizowanych komórek, takich jak fotoreceptory, komórki dwubiegunowe, komórki poziome, komórki amakrynowe i komórki zwojowe. Dodatkowo siatkówka zawiera komórki glejowe, takie jak mikroglej, astrocyty i komórki Müllera, a także barwnikowe komórki nabłonkowe. Ten ostatni, zlokalizowany w nieneuronalnej części siatkówki, odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu integralności strukturalnej, ochronie i wsparciu dla fotoreceptorów3,4. W części neuronalnej znajdują się komórki czuciowe i neuronalne bezpośrednio zaangażowane w wychwytywanie i przetwarzanie światła5,6,7.
Będąc niezbędną dla widzenia, siatkówka jest często dotknięta patologiami, które mogą prowadzić do ślepoty. Wśród tych schorzeń barwnikowe zwyrodnienie siatkówki (RP) wyróżnia się jako jedna z głównych retinopatii dziedzicznych, z ponad 80 genami związanymi z jej etiologią8,9. RP jest chorobą heterogenną, dziedziczoną głównie w sposób autosomalny dominujący lub recesywny, ale może również wystąpić jako sprzężona z chromosomem X lub z powodu spontanicznych mutacji10.
Z globalnym rozpowszechnieniem szacowanym między 1 na 3 000 a 1 na 7 000 osób, w zależności od populacji i regionu geograficznego11,12, RP zwykle objawia się w okresie dojrzewania lub wczesnej dorosłości, z początkowymi objawami, takimi jak pogorszenie widzenia w nocy i utrata obwodowego pola widzenia. W miarę postępu choroby widzenie centralne ulega pogorszeniu, co może prowadzić do całkowitej ślepoty9,13.
Chociaż nie ma jeszcze lekarstwa na RP, różne terapie w fazie rozwoju wykazały potencjał spowolnienia lub odwrócenia postępu choroby. Wśród tych podejść znajdują się terapie genetyczne, komórkowe i farmakologiczne, a także urządzenia elektroniczne. Aby pogłębić wiedzę na temat RP i ocenić nowe interwencje, szeroko stosowano mysie modele zwyrodnienia siatkówki. Modele te, często określane jako rd (degeneracja siatkówki), są cennymi narzędziami do badania podstaw molekularnych i terapii RP. Wśród różnych modeli stosowanych w badaniu barwnikowego zwyrodnienia siatkówki, szczep myszy Pde6βrd10/rd10 (rd10) wykazuje mutację missense w genie kodującym specyficzną dla pręcików podjednostkę β fosfodiesterazy < sup="xref">14, wykazując powolną degenerację fotoreceptorów podobną do tej, która występuje u ludzi15.
Podawanie leków doszklistkowych było szeroko stosowane w różnych badaniach16,17,18. Protokół ten jest odpowiedni dla naukowców badających wpływ leków na siatkówkę, szczególnie w odniesieniu do przeżycia komórek fotoreceptorowych. W ten sposób głównym celem tego protokołu jest optymalizacja dostarczania leku poprzez wstrzyknięcie do ciała szklistego w mysim modelu barwnikowego zwyrodnienia siatkówki (RP) i ocena przeżycia fotoreceptorów za pomocą immunofluorescencji do odzyskiwania, markera komórkowego fotoreceptora. Iniekcja doszklistkowa umożliwia miejscowe podawanie leku, minimalizując ogólnoustrojowe skutki uboczne, zwiększając biodostępność siatkówki i zmniejszając działania niepożądane w innych narządach. Z drugiej strony, immunofluorescencja rekonwalescencji pozwala na specyficzną analizę przeżycia fotoreceptorów, zapewniając skuteczne narzędzie do oceny skuteczności tej strategii terapeutycznej. Jednak ich zastosowanie zależy od takich czynników, jak wybór modelu zwierzęcego, precyzja iniekcji i czas trwania leczenia, które należy wziąć pod uwagę przy dostosowywaniu tej metody do innych warunków eksperymentalnych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Projekt i wszystkie protokoły przeprowadzone w jego ramach są zgodne z wytycznymi Krajowej Rady Kontroli Doświadczeń na Zwierzętach i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Użytkowania Zwierząt (CEUA - UFF) pod numerem 1464280219.
1. Zwierzęta
- Użyj mysiego szczepu rd10, który ulega degeneracji fotoreceptorów, oraz szczepu C57 Black/6 (tło rd10). Utrzymuj te szczepy w cyklu 12 godzin/12 godzin światła i ciemności, z dostępem ad libitum do wody i pożywienia.
2. Znieczulenie
- Wykonać iniekcję dootrzewnową ze środkiem znieczulającym przygotowanym w dawce 80 mg/kg ketaminy i 8 mg/kg ksylazyny, rozcieńczonych w wodzie destylowanej. Ketamina działa jako inhibitor receptora receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA), zapewniając działanie przeciwbólowe, podczas gdy ksylazyna działa jako środek uspokajający.
- W przypadku wstrzyknięcia dootrzewnowego należy obliczyć objętość do wstrzyknięcia jako 10 μl x waga (g).
- Unieruchom, aby zapewnić swobodny dostęp do brzucha. Oczyść dolny prawy kwadrant jamy brzusznej 70% alkoholem, w miejscu, w którym należy wprowadzić igłę skosem skierowanym do góry.
- Aby potwierdzić brak odruchu bólowego, delikatnie uszczypnij ogon lub łapę zwierzęcia. Jeśli nie ma reakcji, oznacza to, że zwierzę jest odpowiednio znieczulone.
3. Wstrzyknięcie do ciała szklistego
- Po znieczuleniu zwierząt należy odsłonić oczy i za pomocą dwuokularowego mikroskopu stereoskopowego o powiększeniu 10x zidentyfikować obszar rąbka, szary pas między rogówką a twardówką, w którym zostanie wykonane wstrzyknięcie.
- Do wykonania iniekcji potrzebna jest pomoc innej osoby. Pod lornetkowym mikroskopem stereoskopowym jedna osoba musi przytrzymać zwierzę i wprowadzić igłę, podczas gdy asystent naciska tłok strzykawki, aby wprowadzić substancję do oka.
- Najpierw użyj ultracienkiej strzykawki ze stałą igłą (31 G x 6 mm), aby wykonać nakłucie w okolicy rąbka, uważając, aby nie wbić igły zbyt głęboko; wystarczy włożyć tylko połowę skosu .
- Następnie włożyć ręczną, wstępnie wysterylizowaną mikrostrzykawkę (skala 26 S bez skosu), zawierającą 1 μl płynu/leku będącego przedmiotem zainteresowania, do nakłucia wykonanego przez strzykawkę insulinową.
- Poprosić asystenta o powolne naciskanie tłoka strzykawki, upewniając się, że cała objętość jest podawana przez około 30 sekund.
- Powtórz ten proces dla drugiego oka tego samego zwierzęcia i zapisz czas.
- Jeżeli istnieje więcej niż jedna grupa doświadczalna, należy oznaczyć ucho zwierzęcia, aby zapewnić właściwą identyfikację każdej grupy.
- Użyć 1 kropli 0,01 M roztworu PBS do każdego oka zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu.
- Po tych zabiegach umieść zwierzęta na poduszce grzewczej o temperaturze ustawionej na 37 °C, aż się obudzą. Może to zająć 1-2 godziny. Monitoruj zwierzęta w sposób ciągły podczas znieczulenia, a po przebudzeniu wróć je do klatek do czasu analizy.
- Przeprowadź wstępną sesję szkoleniową z użyciem widocznego barwnika, takiego jak błękit trypanowy, aby pomóc operatorom udoskonalić technikę wstrzykiwania do ciała szklistego myszom.
UWAGA: Barwnik ułatwia wizualizację drogi igły, umożliwiając precyzyjną regulację głębokości i kąta iniekcji, zmniejszając ryzyko uszkodzenia struktury oka i zwiększając bezpieczeństwo zabiegu.
4. Eutanazja i przygotowanie oczu
- Po określonym czasie leczenia po wstrzyknięciu, należy poddać zwierzęta eutanazji poprzez wdychanie 5% przedawkowania izofluranu. Ekspozycję należy kontynuować przez co najmniej 1 minutę po ustaniu oddychania. Aby zapewnić śmierć, trzymaj zwierzę za kark i mocno naciskaj na ogon, aż do osiągnięcia zwichnięcia szyjki macicy.
- Przed usunięciem oczu zaznacz biegun skroniowy. Ostrożnie przyłóż marker lub gorącą igłę/szpilkę do skroniowego obszaru twardówki, upewniając się, że oznaczenie jest widoczne i precyzyjne. Ten krok będzie służył jako punkt odniesienia do orientacji podczas procesu cięcia.
- Następnie odsłoń oczy i za pomocą sterylnego skalpela i nożyczek do irydektomii przetnij otaczającą tkankę, aby oddzielić tkankę łączną i mięśniową oraz odsłonić gałkę oczną. U myszy należy dokładnie przeciąć mięśnie oka, ponieważ może to być trudne. Aby ułatwić zabieg, należy wykonać boczne nacięcie sterylnym skalpelem w obu rogach skóry oka.
- Za pomocą zakrzywionych kleszczyków ze średnią końcówką delikatnie wyjmij oczy z oczodołu, trzymając je za nerw wzrokowy i natychmiast utrwal tkankę na 5 minut w 4% roztworze paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej (RT).
- Po utrwaleniu w roztworze PFA przenieś oczy na szklaną płytkę za pomocą zakrzywionych kleszczyków ze średnią końcówką. Płytka ta działa jako platforma rozwarstwiająca i upewnij się, że zawiera bufor fosforanowy o stężeniu 0,1 M pH 7,4.
- Następnie umieść płytkę pod dwuokularowym mikroskopem stereoskopowym o powiększeniu 10x i wykonaj małe nacięcie tuż nad rąbkiem (granicą rogówki) za pomocą skalpela. Następnie wykonaj cięcie obwodowe wzdłuż rąbka za pomocą nożyczek do mikroirydektomii, aby oddzielić rogówkę.
- Usuń rogówkę wraz z tęczówką i soczewką za pomocą kleszczyków Dumont #5. Na koniec ponownie utrwal oczy w roztworze 4% PFA na 55 minut. Następnie trzykrotnie przemyć oczy buforem fosforanowym 0,1 M, pH 7,4.
5. Kriokonserwacja i zamrażanie
UWAGA: Sekcja kriostatu tkanki siatkówki została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem z pewnymi poprawkami19.
- Kriokonserwuj oczy za pomocą gradientu sacharozy 10%, 20% i 30%, rozcieńczonego w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4. Zanurzaj oczy kolejno w roztworach sacharozy, zaczynając od najniższego stężenia (10%) i stopniowo zwiększając do najwyższego (30%). Każdy krok trwa przez niezbędny czas, aż oczy osiądą na dnie pojemnika, wskazując, że można użyć następnego stężenia. W końcowym stężeniu przechowywać oczy w temperaturze 4 °C przez około 12 godzin.
- Następnego dnia usuń nadmiar 30% sacharozy i umieść oczy w okrągłym aluminiowym pojemniku o średnicy 2 cm, ułożonym zgodnie z grupami eksperymentalnymi.
UWAGA: Wykonaj pojemnik z folii aluminiowej w odpowiednim rozmiarze w zależności od liczby grup eksperymentalnych. - Pod lornetkowym mikroskopem stereoskopowym o powiększeniu 10x usuń nadmiar sacharozy z wnętrza i wokół gałki ocznej za pomocą pipety lub bibuły filtracyjnej, zwracając uwagę na to, aby nie uszkodzić struktury tkanki.
- Zanurz oczy w podłożu zamrażającym o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), uważając, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków wewnątrz lub wokół oczu, i pozostaw je na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Po 1 godzinie w KOCT, ustaw oczy tak, aby wcześniej zaznaczony punkt odniesienia był skierowany do góry. Umieść pojemnik z folii aluminiowej na odpowiedniej aluminiowej płycie w małym styropianowym pudełku do zamrożenia.
- Ostrożnie wlej ciekły azot na aluminiową płytę, wokół pojemnika foliowego. Upewnij się, że azot rozprowadza się równomiernie po powierzchni. Sprzyja to równomiernemu zamrażaniu tkanek. Upewnij się, że ciekły azot nie ma bezpośredniego kontaktu z oczami wewnątrz pojemnika foliowego. Następnie przystąp do cięcia oczu za pomocą kriostatu.
6. Przygotowanie slajdów
- Rozprowadź poli-L-lizynę (200 μg/ml) na szkiełkach z matowymi krawędziami.
- Odczekaj 12 godzin, aż szkiełka wyschną i będą gotowe do użycia.
7. Sekcja kriostatu
- Na kriostacie umieść zamrożony blok na platformie.
- Obróć pokrętło, aby wykonać sekcje o grubości 10 μm.
- Dostosuj położenie bloku, aby upewnić się, że wszystkie oczy są jednakowo obecne w cięciu.
- Kontynuuj cięcie, aż nerw wzrokowy zostanie zidentyfikowany, używając mikroskopu jasnego pola.
- Zebrać skrawki na szkiełkach wstępnie poddanych obróbce poli-L-lizyny.
- Przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
8. Immunofluorescencja
UWAGA: Immunofluorescencję przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem z pewnymi poprawkami19,20.
- Preparaty otrzymane z przekroju kriostatu inkubować ze 100 μl 0,5% Triton X-100 w 0,01 M PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej w celu przeniknięcia przez błonę plazmatyczną komórki.
- Umyj szkiełka dwukrotnie 0,01 M PBS przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar Triton X-100.
- Inkubować ze 100 μl 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 0,01 M PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania przeciwciał.
- Po zablokowaniu inkubować skrawki ze 100 μl anty-rekupyny o stężeniu 1:1500 rozcieńczonej w BSA 1% w celu znakowania komórek fotoreceptorowych, przez noc w temperaturze 4 °C (lodówka).
- Następnego dnia inkubować skrawki ze 100 μl antykróliczego poliklonalnego przeciwciała drugorzędowego 488 lub anty-króliczego poliklonalnego przeciwciała drugorzędowego 568 1:500 rozcieńczonego w BSA 1% przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Umyć szkiełka dwukrotnie 0,01 M PBS przez 5 minut każdy w temperaturze pokojowej.
- Inkubować skrawki ze 100 μl DAPI 1 mg/ml (4',6-diamidino-2-fenyloindolu) przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej.
- Umyć szkiełko raz 0,01 M PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Na koniec potraktować skrawki podłożem montażowym zawierającym 2,5 g galusanu n-propylu w 40 ml glicerolu w 0,1 M buforze fosforanowym o pH 7,4. Będą one działać jako odczynnik zapobiegający blaknięciu i medium mocujące, konserwując próbki. Umieść szkiełko nakrywkowe (24 mm, 50 mm) na szkiełkach, a następnie uszczelnij sekcje lakierem do paznokci. Następnie przystąp do oglądania próbek pod mikroskopem.
9. Mikroskop fluorescencyjny fotomikrografia
- Aby uzyskać obrazy komórek znakowanych techniką immunohistochemiczną, należy użyć fluorescencyjnego mikroskopu optycznego wyposażonego w filtry niebieski, zielony i czerwony. Dodatkowo dołącz aparat fotograficzny do mikrofotografii slajdów. Aby uzyskać mikrofotografie, należy użyć komputera z oprogramowaniem LAS V3.7 (Leica) (oprogramowanie do obrazowania), który musi być otwarty w celu jednoczesnej wizualizacji za pomocą mikroskopu.
- Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. Początkowo używaj obiektywu o najmniejszym powiększeniu i niebieskiego filtra.
- Dostosuj ostrość za pomocą pokręteł zgrubnego i precyzyjnego ustawiania ostrości, aż siatkówka z komórkami oznaczonymi na niebiesko (jądra komórkowe) będzie wyraźnie widoczna.
- Wybierz żądany obszar siatkówki do obrazowania. Stopniowo zwiększaj powiększenie do 40x, dostosowując ostrość w razie potrzeby.
- Po ustawieniu ostrości pociągnij kołek boczny, aby przenieść obraz mikroskopu do oprogramowania do obrazowania. Wybierz żądane filtry (A4 (niebieski), L5 (zielony) i TX2 (czerwony)). Dostosuj następujące parametry: Ekspozycja, Wzmocnienie i Gamma, aby upewnić się, że obraz jest wyraźny i jak najbardziej zbliżony do tego, co jest obserwowane pod mikroskopem.
- Przy powiększeniu 400× uchwyć cztery pola o powierzchni od 113 × 113 μm, zgodnie z orientacją od obrzeża do środka siatkówki. Upewnij się, że dwa z tych pól reprezentują obszar peryferyjny, a dwa reprezentują centralny obszar siatkówki.
- Aby uzyskać mikrofotografie pola peryferyjnego, należy wykonać obrazy w odległości około 50 μm od krawędzi oka. W przypadku mikrofotografii pola centralnego wybierz sąsiednie obszary znajdujące się w odległości 50 μm od nerwu wzrokowego i uzyskaj obrazy. Do oznaczania ilościowego używaj zarówno prawego, jak i lewego oka, co daje w sumie osiem analizowanych pól na zabieg.
- Po wykonaniu wszystkich mikrofotografii przystąp do ręcznej kwantyfikacji komórek znakowanych immunologicznie.
10. Kwantyfikacja komórek
- Otwórz program ImageJ v.1.54g. W programie kliknij Plik, a następnie Otwórz i wybierz obraz zapisany na komputerze.
- Gdy obraz jest już otwarty, kliknij opcję Wielopunktowy. Użyj tego narzędzia, aby określić ilościowo komórki, klikając lewym przyciskiem myszy każdą komórkę, która ma zostać policzona.
- Określ ilościowo kolokalizowane komórki, tj. dodatnie dla odzysku i DAPI, w zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL).
- Po zakończeniu liczenia kliknij dwukrotnie lewym przyciskiem myszy, aby zobaczyć łączną liczbę zaznaczonych komórek.
- Po określeniu liczby komórek z dodatnim wynikiem rekonwalescencji wprowadź liczbę komórek w tabeli kwantyfikacji programu Excel i przejdź do następnego mikrofotografii.
- Powtórz wszystkie kroki dla 8 pól odpowiadających każdemu zwierzęciu.
- Obliczyć średnią z tych ośmiu pól, odpowiadającą pojedynczemu punktowi doświadczalnemu dla całej siatkówki (n = 1). Dla wykresu siatkówki obwodowej użyj średniej pól obwodowych, w sumie czterech pól: dwóch z lewego oka i dwóch z prawego oka. Średnia ta odpowiada jednemu punktowi doświadczalnemu dla siatkówki obwodowej (n = 1). Utwórz środek wykresu siatkówki w taki sam sposób, jak wykres peryferyjny, zmieniając tylko obszar.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Technika immunofluoroscencji służąca do znakowania fotoreceptorów, czyli komórek wykazujących pozytywną reakcję na recoverinę, pozwoliła nam zaobserwować wzorzec degeneracji fotoreceptorów u zwierząt rd10 oraz C57Bl6, z których te ostatnie uznano za zdrowe (Rycina 1). Jak widać, znakowanie komórek pozytywnych pod kątem recoveriny ogranicza się do zewnętrznej warstwy jądrowej (ONL), w której znajdują się fotoreceptory, obejmując również znakowanie segmentów we...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Siatkówka to delikatna tkanka, do której trudno dostęp; W związku z tym należy rozważyć technikę, która ma być stosowana do przeprowadzania leczenia farmakologicznego ukierunkowanego na tę tkankę. Iniekcja doszklistkowa jest dobrze ugruntowaną i szeroko stosowaną techniką dostarczania leków bezpośrednio do siatkówki, szczególnie w leczeniu chorób oczu, takich jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem21, retinopatia cukrzycowa22 i barwnikowe zwyrodnienie s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca została przeprowadzona podczas stypendium badawczego wspieranego przez Narodową Radę Rozwoju Naukowego i Technologicznego (CNPq), Fundację Carlosa Chagasa Filho na rzecz Wspierania Badań Stanu Rio de Janeiro (FAPERJ), a także została częściowo sfinansowana przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brazylia (CAPES) - Kod Finansowy 001.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,3% Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Roztwór do blokowania bufora |
| 1% BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | Roztwór do blokowania buforu |
| 1% Ludzki blok BD Fc BD | Biosciences | 564220 | Fc Blok wymagany do blokowania bufora |
| Lampa LED 150 W | Amazon | B07VH3CVSF | Źródło światła LED do fotonaświetlania tkanek |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | Roztwór do blokowania etapów bufora i mycia |
| Pojemnik do przechowywania o pojemności 20 galonów | Amazon | B001B1C4G0 | Pojemnik do procesu naświetlania fotologicznego |
| Lampa LED o mocy 40 W RGBW | Amazon | B08QFPJSMD | Źródło światła RGB do napromieniania tkanek |
| Ag85B | Abcam | ab43019 / NA | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Alfa-aktyna mięśni gładkich DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Zestaw blokujący awidynę/biotynę | Abcam | ab64212 | Roztwór blokujący awidynę i biotynę |
| BD Cytofix/Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Roztwór do utrwalania |
| BOND Dewax Roztwór do deparafinizacji | Leica Biosystems | NC0221076 | Roztwór |
| odzyskiwania epitopów BOND 1 | Leica Biosystems | NC0235529 | Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 6 na bazie cytrynianu ( ER1) |
| BOND Roztwór do odzyskiwania epitopów 2 | Leica Biosystems | NC0235530 | Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 9 na bazie EDTA (ER2) |
| System detekcji badań NC0396648BOND Automatyczny | odczynnik do barwienia | ||
| badawczego BOND RX Barwnik badawczy Leica | Biosystems | NA | Zautomatyzowana platforma badawcza do barwienia |
| BOND Wash Solution | Leica Biosystems | Bufor NC0221077 | Wash |
| CD15 | BD Biosciences | 347420/AB_400298 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82/AB_11150959 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R& D Systems | FAB8165G/AB_2728839 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| CD45 Fikoerytryna (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE/NA | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135/AB_2892745 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Przeciwciało przeciw kozom IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814/AB_2762838 | do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Osioł anty-mysie IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/ AB_2762830 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Przeciwciało przeciw myszom IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Przeciwciało przeciw królikom IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| System barwienia EasyDip | Newcomer Supply | 5300KIT | System barwienia szkiełkowego |
| Fluoromount-G | Thermo Fisher Scientific | 00-4958-02 | Media montażowe |
| Hoechst | Biotium | 40046 | Barwnik jądrowy do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Imaris File Converter x64 10.2.0 | Imaris Oxford Instruments | Darmowy konwerter plików | |
| Oprogramowanie ImarisViewer x64 10.2.0 | Imaris Oxford Instruments | Darmowe oprogramowanie do przetwarzania obrazu | |
| ImmEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrofobowy długopis barierowy |
| Borowodorek litu (1 gram) | STREM Chemicals | 93-0397 | Substancja chemiczna do inaktywacji barwnika, kup małe porcje tej substancji chemicznej (1 gram) |
| Lumican Biotyna | R& Systemy D | BAF2846 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Okulary Micro Cover | VWR | 48393-241 | Szklane osłony ślizgowe |
| Pan-cytokeratyna Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750/AB_2868569 | Przeciwciało do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| System mikrofalowy PELCO BioWave Pro | Ted Pella Inc | 36500-230 | Nienagrzewająca się naukowa kuchenka mikrofalowa |
| PELCO SteadyTemp Pro | Ted Pella Inc | 50062 | W pełni zautomatyzowana kontrola temperatury dla naukowej kuchenki mikrofalowej |
| SimpleITK | Oprogramowanie | Oprogramowanie do rejestracji i przetwarzania kanałów | |
| Streptawidin Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | Odczynnik do znakowania do obrazowania IBEX. Patrz tabela 1. |
| Mikroskop szerokokątny | Leica Microsystems | NA | Imager Leica Microsystems THUNDER ze źródłem światła LED8 i oprogramowaniem LAS X (3.7.1.21655). Do obrazowania fluorescencyjnego użyto niestandardowego filtra czteropasmowego z zewnętrznym kołem filtrów (PN: 11536075) z dwoma dodatkowymi filtrami jednopasmowymi (PN: 8118215) do obrazowania siedmiu kanałów barwnika na przejście. Linie wzbudzenia, dichroicznego i emisyjnego filtra to (1) sześcian czteropasmowy: dichroiczny w 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, bez filtrów wzbudzenia lub emisji; (2) Zewnętrzne koło filtrowe pozycja 1: 434/32, pozycja 2: 520/40, pozycja 3: 585/20, pozycja 4: 720/60, pozycja 5: przepustowe; (3) jednopasmowy 1— 585/22 wzbudzenie, 594 dichroiczne, 625/30 emisja; (4) jednopasmowy 2— 635/20 wzbudzenie, 647 dichroiczne, 667/30 emisja. |
| Zeiss Optical Lens Cleaner | Amazon | B00GPVQVCO | Mikroskop do czyszczenia soczewek obiektywowych |
| Przeciwciała | |||
| Ag85B | Abcam | ab43019 | Poliklonalny królik IgG, cykl 1 |
| Alfa-aktyna mięśni gładkich DyLight 755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R | 1A4/asm-1, cykl 1 |
| CD4 Alexa Fluor 488 | R&;D Systemy | FAB8165G | Poliklonalne kozie IgG, cykl 1 |
| CD8 Alexa Fluor 647 | BioLegend | 372906 | C8/144B, cykl 1 |
| CD68 iFluor 594 | Caprico Biotechnologies | 1064135 | KP1, cykl 1 |
| Osioł anty-kozi IgG Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814 | Osioł poliklonalny, cykl 1 |
| Osioł anty-mysz IgG Alexa Fluor Plus AF647 | Thermo Fisher Scientific | A32787 | Osioł poliklonalny, cykl 1 |
| Osioł anty-królik IgG Alexa Fluor Plus AF555 | Thermo Fisher Scientific | A32794 | Osioł poliklonalny, cykl 1 |
| Hoechst | Biotium | 40046 | Etykieta jądrowa, cykl 1 |
| CD15 | BD Biosciences | 347420 | MMA, cykl 2 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82 | L26, cykl 2 |
| CD45 Fikoerytryna (PE) | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 2B11 + PD7/26, cykl 2 |
| Osioł anty-mysi IgM Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020 | Osioł poliklonalny, cykl 2 |
| Lumican Biotyna | R& Systemy D | BAF2846 | Poliklonalna koza IgG, cykl 2 |
| Pan-cytokeratyna Alexa Fluor 750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | AE-1/AE-3, cykl 2 |
| Streptawidyna Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | S11227 | N/A, cykl 2 |
| Hoechst | Biotium | 40046 | cykl 2 |
| Solutions | |||
| Bufor blokujący Blocking (cykl 1) | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 0,3% objętościowo |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 1% objętościowo |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | 1% objętościowo |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | 97,7% objętościowo |
| Primary Antibody Staining Solution #1 (Cykl 1) | |||
| Blocking Buffer (Cykl 1) | Patrz wyżej | Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał | |
| Hoechst | Biotium | 40046 | 1:5000 |
| CD8 AF647 | BioLegend | 372906 | 1:10 |
| Primary Antibody Staining Solution #2 (Cykl 1) | |||
| Blocking Buffer (Cykl 1) | Patrz wyżej | Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał | |
| CD4 AF488 | R& D Systems | FAB8165G | 1:10 |
| Ag85B | Abcam | ab43019/NA | 1:100 |
| Wtórny roztwór do barwienia przeciwciał #1 (cykl 1) | |||
| Blocking Buffer (cykl 1) | Patrz wyżej | Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał | |
| Donkey Anti-Goat AF Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32814/AB_2762838 | 1:100 |
| Donkey anti-Rabbit AF Plus 555 | Thermo Fisher Scientific | A32794/AB_2762834 | 1:100 |
| Donkey anti-Mouse AF Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32787/AB_2762830 | 1:50 |
| Primary Antibody Staining Solution #3 (Cykl 1) | |||
| Blocking Buffer (Cykl 1) | Patrz wyżej | Uzupełnij do objętości po dodaniu | |
| przeciwciała CD68 iF594 | Caprico Biotechnologies | 1064135 | 1:10 |
| a-SMA DL755 | Novus Biologicals | NBP2-345221R/NA | 1:30 |
| Bufor blokujący wolny od BSA (cykl 2) | |||
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 0,3% objętości |
| Human BD Fc Block | BD Biosciences | 564220 | 1% objętościowo |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | 98,7% objętościowo |
| Roztwór do barwienia przeciwciał pierwotnych #4 (cykl 2) | |||
| bufor blokujący wolny od BSA (cykl 2) | Patrz wyżej | Uzupełnij do objętości po dodaniu przeciwciał | |
| CD15 | BD Biosciences | 347420 | 1:30 |
| Lumican Biotyna | R& D Systems | BAF2846 | 1:100 |
| CD45 PE | Novus Biologicals | NBP2-34528PE | 1:20 |
| CD20 eFluor 660 | Thermo Fisher Scientific | 50-0202-82 | 1:10 |
| Pan-cytokeratyna AF750 | Novus Biologicals | NBP2-33200AF750 | 1:10 |
| wtórny roztwór do barwienia przeciwciał #2 (cykl 2) | |||
| Bufor blokujący wolny od BSA (cykl 2) | Patrz wyżej | Uzupełnij objętość po dodaniu przeciwciał | |
| Osioł anty-mysi IgM AF488 | Jackson ImmunoResearch | 715-545-020/AB_2340844 | 1:100 |
| Strepawidyna AF594 | Thermo Fisher | Scientific S11227 | 1:200 |
Bibliografia
- Kels, J., et al. Anatomy and physiology of the retina: a comprehensive review. Retinal J. 21, 75-92 (2015).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
- Tsang, S. H., Sharma, T. Retinal degeneration and gene therapy: present and future approaches. Prog Retin Eye Res. 67, 93-120 (2018).
- Gasparini, S. J., Favretto, F., La Greca, C. Biology of the retina: structure, function, and dysfunction. J Biomed Sci. 19 (3), 289-300 (2019).
- Masland, R. Neuronal diversity in the retina. Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
- Hoon, M., et al. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Liu, W., et al. Retinitis pigmentosa: progress in molecular pathology and biotherapeutical strategies. Int J Mol Sci. 23 (9), 4883(2022).
- Hamel, C. Retinitis pigmentosa. Orphanet J Rare Dis. 1, 40(2006).
- Verbakel, S. K., et al. Non-syndromic retinitis pigmentosa. Prog Retin Eye Res. 66, 157-186 (2018).
- O'Neal, T. B., Tripathy, K., Luther, E. E. Retinitis Pigmentosa. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2025).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), e112142(2014).
- Chang, B., et al. Two mouse retinal degenerations caused by missense mutations in the beta-subunit of rod cGMP phosphodiesterase gene. Vision Res. 47 (5), 624-633 (2007).
- Jae, S. A., et al. Electrophysiological and histologic evaluation of the time course of retinal degeneration in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Korean J Physiol Pharmacol. 17 (3), (2013).
- Strettoi, E., et al. Inhibition of ceramide biosynthesis preserves photoreceptor structure and function in a mouse model of retinitis pigmentosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18706-18711 (2010).
- Rösch, S., Johnen, S., Mataruga, A., Müller, F., Pfarrer, C., Walter, P. Selective photoreceptor degeneration by intravitreal injection of N-methyl-N-nitrosourea. Investig Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1711-1723 (2014).
- Kellish, P. C., et al. Intravitreal injection of a rationally designed AAV capsid library in non-human primate identifies variants with enhanced retinal transduction and neutralizing antibody evasion. Mol Ther. 31 (12), 3441-3456 (2023).
- Molday, L. L., Cheng, C. L., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells and Subcellular Organelles by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. New York. (2019).
- Cheng, C. L., Djajadi, H., Molday, R. S. Cell-Specific Markers for the Identification of Retinal Cells by Immunofluorescence Microscopy. Retinal Degeneration. , Humana Press. Totowa, NJ. (2012).
- Girgis, S., Lee, L. R. Treatment of dry age-related macular degeneration: a review. Clin Exp Ophthalmol. 51 (8), 835-852 (2023).
- Lee, J. Y., et al. Superoxide dismutase 3 prevents early stage diabetic retinopathy in streptozotocin-induced diabetic rat model. PLoS One. 17 (1), e0262396(2022).
- Isiegas, C., et al. Intravitreal injection of proinsulin-loaded microspheres delays photoreceptor cell death and vision loss in the rd10 mouse model of retinitis pigmentosa. Investig Ophthalmol Vis Sci. 57 (8), 3610-3618 (2016).
- Doshi, R. R., Bakri, S. J., Fung, A. E. Intravitreal injection technique. Semin Ophthalmol. 26 (3), 104-113 (2011).
- Kim, H. M., Woo, S. J. Ocular drug delivery to the retina: current innovations and future perspectives. Pharmaceutics. 13 (1), 108(2021).
- Jones, B. W., Marc, R. E., Pfeiffer, R. L. Retinal Degeneration, Remodeling and Plasticity. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , University of Utah Health Sciences Center, Salt Lake City. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK482309/"K482309 (2016).
- Roche, S. L., Wyse-Jackson, A. C., Byrne, A. M., Ruiz-Lopez, A. M., Cotter, T. G. Alterations to retinal architecture prior to photoreceptor loss in a mouse model of retinitis pigmentosa. Int J Dev Biol. 60, 127-139 (2016).
- Ladha, R., Caspers, L. E., Willermain, F., de Smet, M. D. Subretinal therapy: technological solutions to surgical and immunological challenges. Front Med. 9, 846782(2022).
- Varela-Fernández, R., et al. Drug delivery to the posterior segment of the eye: biopharmaceutic and pharmacokinetic considerations. Pharmaceutics. 12 (3), 269(2020).
- Bussing, D., et al. Pharmacokinetics of monoclonal antibody and antibody fragments in the mouse eye following intravitreal administration. J Pharm Sci. 112 (8), 2276-2284 (2023).
- Roberge, F. G., de Kozak, Y., Utsumi, T., Faure, J. P., Nussenblatt, R. B. Immune response to intraocular injection of retinal S-antigen in adjuvant. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 227 (1), 67-71 (1989).
- Ishikawa, T., Hokama, H., Katagiri, Y., Goto, H., Usui, M. Effects of intravitreal injection of tacrolimus (FK506) in experimental uveitis. Curr Eye Res. 30 (2), 93-101 (2005).
- Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry: the red, brown, and blue technique. Vet Pathol. 51 (1), 42-87 (2014).
- Gargini, C., Terzibasi, E., Mazzoni, F., Strettoi, E. Retinal organization in the retinal degeneration 10 (rd10) mutant mouse: a morphological and ERG study. J Comp Neurol. 500 (2), 222-238 (2007).
- Haverkamp, S., Wässle, H. Immunocytochemical analysis of the mouse retina. J Comp Neurol. 424, 1-23 (2000).
- Haverkamp, S., Ghosh, K. K., Hirano, A. A., Wässle, H. Immunocytochemical description of five bipolar cell types of the mouse retina. J Comp Neurol. 455, 463-476 (2003).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie