Wizualizacja rentgenowska wewnątrzprzewodowego wlewu ablacyjnego na bazie etanolu w profilaktyce raka piersi w modelach króliczych

Podsumowanie

W protokole tym przedstawiono procedurę infuzji pod kontrolą obrazu do systemu drzew przewodowych gruczołu sutkowego królika. Demonstrujemy kontrolowaną infuzję rentgenowskiego środka kontrastowego zawierającego roztwór ablacyjny na bazie etanolu do wszystkich otworów strzyków za pomocą obrazowania fluoroskopowego w czasie rzeczywistym.

Streszczenie

Rak piersi jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów kobiet związanych z rakiem. Chociaż istnieje niewiele proaktywnych interwencji dla kobiet średniego ryzyka, profilaktyczna mastektomia jest najskuteczniejszą, zmniejszającą ryzyko interwencją dla kobiet wysokiego ryzyka. Jednak profilaktyczna mastektomia jest zabiegiem inwazyjnym, który usuwa wszystkie komórki nabłonka sutka wraz z otaczającym zrębem, tkanką tłuszczową i/lub mięśniami. Naszym ogólnym celem badawczym jest opracowanie nieinwazyjnej procedury podawania wewnątrzprzewodowego (ID), która miejscowo zabija komórki nabłonka sutka poprzez wypełnienie całego drzewa przewodowego roztworem ablacyjnym. Wcześniej wykazaliśmy, że dostarczanie etanolu w postaci roztworu ablacyjnego jest skuteczne w modelach gryzoni (myszy i szczury). Protokół ten przedstawia dostarczenie ID 10-70% roztworu etanolu zawierającego joheksol (90-300 mg/ml) jako rentgenowskiego środka kontrastowego do wieloprzewodowego systemu drzew gruczołu sutkowego królika. Gruczoł mleczny królika (Oryctolagus cuniculus) z systemem wieloprzewodowym jest bardziej podobny do ludzkiej piersi niż u innych dużych zwierząt (np. krów, owiec). Ten protokół dla królików rozwiązuje techniczne wyzwania związane ze skalowalnością, obrazowaniem w czasie rzeczywistym i dostarczaniem identyfikatorów do wielokanałowego systemu drzew w modelu pośrednim dużych zwierząt. Protokół ten ustanawia wielokanałowe dostarczanie identyfikatora pod kontrolą fluoroskopii z instrumentami, materiałami i odczynnikami, które można bezpośrednio zastosować w klinice. Analiza tkanek umożliwia optymalizację stężenia etanolu w celu maksymalnej ablacji nabłonka i minimalnego uszkodzenia tkanek ubocznych jako punkt wyjścia dla przyszłej pierwszej u ludzi oceny tej procedury ablacyjnej w pierwotnej prewencji raka piersi.

Wprowadzenie

Rak piersi (BC) jest najczęstszym i drugim co do wielkości zgonem związanym z rakiem wśród kobiet w Stanach Zjednoczonych. Prognozy na rok 2025 szacują, że pojawi się 316 950 nowych przypadków raka piersi, a 42 170 kobiet umrze z powodu BC¹. Obecnie obustronna profilaktyczna mastektomia jest najskuteczniejszym zabiegiem zapobiegającym BC. Jest to jednak zabieg wysoce inwazyjny, który polega na całkowitym usunięciu komórek nabłonka, z których powstaje rak piersi, oraz otaczających tkanek. Ze względu na inwazyjność tej procedury oraz psychologiczny i społeczny wpływ tej procedury, mniej niż 50% kobiet wysokiego ryzyka poddaje się mastektomii zmniejszającej ryzyko². Wraz z innymi opracowaliśmy procedury podawania wewnątrzprzewodowego (ID) w prewencji pierwotnej i/lub leczeniu miejscowym raka piersi u gryzoni w modelach ^2,3 jako alternatywę dla obecnych profilaktyki i leczenia. Etanol (EtOH) ma niski profil toksyczności i bezpieczeństwa, który jest dobrze znany i jest stosowany w wielu zastosowaniach klinicznych, takich jak środki stwardniające w leczeniu wad rozwojowych żył oraz jako środek ablacyjny w miejscowym leczeniu niektórych nowotworów³. Zazwyczaj w tych procedurach klinicznych podaje się lub podaje kilka mililitrów EtOH w stężeniu 90-100%. W naszej poprzedniej pracy dostarczanie 70% EtOH bezpośrednio do systemu drzew przewodowych modeli myszy i szczurów było skuteczne w chemicznej ablacji komórek nabłonka sutka z ograniczonym uszkodzeniem sąsiednich normalnych tkanek oraz w zapobieganiu tworzeniu się guza piersi 4,5,6,7. Ponieważ procedura ta jest skalowana do większego systemu drzew przewodowych królika o większym stosunku objętości światła do powierzchni komórek nabłonka światła, badamy właściwości ablacyjne roztworu o niższym procencie EtOH (10% do 70%). Mając na uwadze translację kliniczną, dochodzimy do wniosku, że najniższy procent etanolu, który jest skuteczny w ablacji komórek nabłonka, będzie najlepiej tolerowany i będzie miał najlepszy profil bezpieczeństwa.

Potwierdzenie całkowitego wypełnienia drzewa przewodowego jest konieczne, aby zagwarantować, że roztwór ablacyjny miał bezpośredni kontakt z komórkami nabłonka sutka. W naszych poprzednich badaniach na modelach gryzoni po zabiegu zastosowano wizualizację rentgenowską drzewa (drzew przewodowych) za pomocą obrazowania mikrotomografii komputerowej. Ze względu na wymagany upływ czasu na znieczulenie, przeniesienie, ustawienie i ułożenie zwierzęcia do obrazowania, zatwierdzony przez FDA Omnipaque (iohexol) lub podobne szybko dyfuzyjne środki kontrastowe zawierające jod nie były odpowiednie do wizualizacji drzew przewodowych u gryzoni ^6,8. Stwierdziliśmy, że środki kontrastowe na bazie nanocząstek, zwłaszcza te zawierające nanokryształ tlenku tantalu, wolniej dyfundowały i były bardziej odpowiednie do wizualizacji drzew przewodowych u gryzoni 6,7,8,9. Jednak to potwierdzenie a posteriori za pomocą obrazowania mikrotomografii komputerowej nie pozwala nam monitorować ani kontrolować ilości podawanej objętości infuzji i odbiega od klinicznie ustalonych procedur diagnostycznych, takich jak ductografia^10,11, w celu wizualizacji drzewa przewodowego. W związku z tym kluczowym krokiem do ustalenia technicznej wykonalności przetłumaczenia tej procedury identyfikacji na ludzi jest zademonstrowanie w czasie rzeczywistym wizualizacji fluoroskopowej drzewa przewodowego w modelu zwierzęcym o rosnącym rozmiarze i złożoności jego gruczołów sutkowych. Protokół ten zwiększa skalę tej procedury ablacyjnej z gryzoni ^4,5 do modeli królików. Ewolucyjnie, anatomicznie i fizjologicznie gruczoły sutkowe królika są bardziej podobne do piersi człowieka niż do piersi gryzoni lub innych dużych modeli zwierzęcych, takich jak krowy i owce 12,13,14. Samice królików mają cztery pary gruczołów mlecznych, z których każda zawiera cztery drzewa przewodowe, podczas gdy gryzonie mają tylko jedno drzewo przewodowe na gruczoł sutkowy. Strzyki królika mogą być kaniulowane^15,16 przy użyciu procedury podobnej do podawania środka kontrastowego ID w duktografii klinicznej w pierwszym badaniu klinicznym z udziałem ludzi. W związku z tym króliki stanowią praktyczny i istotny pośredni model dużych zwierząt do translacyjnego zastosowania tej procedury ablacyjnej ID do ludzi. Protokół ten rozwiązuje problemy techniczne związane z dostarczaniem identyfikatorów i obrazowaniem in vivo wieloprzewodowego systemu drzew, których nie można było rozwiązać w modelach gryzoni. Protokół ten wykorzystuje instrumenty, odczynniki i materiały, które są zgodne z obecną praktyką kliniczną do wizualizacji drzew kanałowych. W związku z tym opisana procedura infuzji pod kontrolą fluoroskopii roztworu ablacyjnego na bazie etanolu zawierającego joheksol może być łatwo wdrożona i oceniona w pierwszych badaniach klinicznych z udziałem ludzi.

Metoda ta została wdrożona w naszym laboratorium w celu pomyślnej kanniulacji i sekwencyjnego infuzji wszystkich czterech drzew przewodowych jednego lub więcej gruczołów sutkowych u królika, podczas jednej sesji, roztworem ablacyjnym na bazie etanolu zawierającym środek kontrastowy (Figura 1, Ryc. 2, Ryc. 3). Metoda ta polega na wlewaniu roztworu ablacyjnego bezpośrednio do kaniulowanego otworu strzyka za pomocą igły o końcówce 27 G królika (4-miesięcznego dziewictwa) na stole fluoroskopowym. Zabieg ten wykonywany jest na zwierzęciu w znieczuleniu ogólnym (izofluran) z około- i pozabiegowym leczeniem przeciwzapalnym (ketoprofen, niesteroidowy lek przeciwzapalny). Obrazowanie fluoroskopowe pozwala nam monitorować wypełnienie drzewa kanałowego w czasie rzeczywistym, kontrolować szybkość i ilość dozowanej objętości i/lub określić, jak skuteczne jest dostarczanie ID w każdym pojedynczym systemie drzew (Ryc. 1, Ryc. 2, Ryc. 3). Ta technika fluoroskopii jest bardziej zbliżona do zamierzonego zastosowania klinicznego w zakresie obrazowania leczenia ablacyjnego i może pomóc w ograniczeniu całkowitej dawki promieniowania nałożonej na pacjenta. Protokół ten pokazuje, że zatwierdzony przez FDA Omnipaque (iohexol) jest odpowiednim środkiem kontrastowym do wizualizacji początkowego wypełnienia królika drzewa przewodowego (ryc. 3). Obserwacje przeprowadzone przez badanie ogólne i analizę histologiczną pokazują, że stężenie etanolu wynoszące 70% powoduje szybkie uszkodzenie tkanek wewnątrz i na zewnątrz drzewa przewodowego oraz wykraczające poza strukturę gruczołu sutkowego (ryc. 3). Stężenie etanolu w zakresie 10-40% zapewnia odpowiednią ablację komórek nabłonka przy mniejszym uszkodzeniu tkanek ubocznych niż 70% etanolu (ryc. 4). Badania podłużne z zastosowaniem tej procedury z odpowiednio dobraną wielkością grupy na roztwór ablacyjny i czasowymi pobraniami tkanek będą wymagane w celu ustalenia optymalnych parametrów roztworu ablacyjnego do jego oceny klinicznej u ludzi.

Protokół

Wszystkie opisane eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania na Uniwersytecie Stanowym Michigan. Króliki (Oryctolagus cuniculus) były opiekowane zgodnie z Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz ustawą o dobrostanie zwierząt USDA w placówce akredytowanej przez AAALAC.

UWAGA: Metodę tę przeprowadzono na dziewiczych (nieródek) i emerytowanych hodowcach (wieloródek) nowozelandzkich białych zwierzętach w różnym wieku (od 4 miesięcy do > 1 roku) i wadze (2,6 do 4,2 kg) pozyskanych ze źródeł komercyjnych. Z naszego doświadczenia wynika, że wielkość zwierzęcia określona na podstawie wagi jest bardziej wiarygodna niż wiek zwierzęcia w przewidywaniu wielkości strzyków. Ogólnie rzecz biorąc, zwierzęta o wadze powyżej 3,3 kg mają odpowiednie strzyki do kaniulacji. Opisany poniżej protokół koncentruje się na zwierzętach dziewiczych w wieku 4-5 miesięcy i wadze powyżej 3,3 kg, ponieważ są one bardziej odpowiednie do długotrwałej skuteczności, gojenia się ran, toksyczności i badań bezpieczeństwa.

1. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Zwierzęta w nowym obiekcie należy zaaklimatyzować przez co najmniej 1 tydzień po przyjeździe, szczególnie w przypadku zwierząt przeznaczonych do zabiegów rekonwalescencji i badań długoterminowych. W pierwszym tygodniu codziennie monitoruj/sprawdzaj króliki i dostarczaj im smakołyki, wzbogacanie składników odżywczych zgodnie z zaleceniami wytycznymi instytucjonalnymi, aby pomóc w procesie aklimatyzacji.
2. Zdobądź królika (~ 4 miesiące New Zealand White) z zatwierdzonego obiektu trzymania. Przed zabiegiem należy zanotować masę ciała.
   UWAGA: Masę ciała można zarejestrować dzień przed zabiegiem w celu przygotowania wymaganych obliczeń do znieczulenia. Mogą być również stosowane hodowcy na emeryturze (> 1 roku życia, > 3,5 kg), ponieważ mają większe strzyki i pozwalają na łatwiejsze kaniulowanie poszczególnych kanalików (ryc. 3). Z tych powodów emerytowani hodowcy mogą być wykorzystywani we wstępnych eksperymentach w celu zapoznania się i optymalizacji procedury wewnątrzprzewodowej.
3. Wstrzyknąć domięśniowo 35 mg/kg ketaminy i 5 mg/kg ksylazyny 20 minut przed podaniem izofluranu w celu uspokojenia zwierzęcia.
   UWAGA: Znieczulenie podaje się w zależności od masy ciała królika, a zakresy dla każdego leku są następujące: 15-35 mg/kg dla ketaminy i 2-5 mg/kg dla ksylazyny. Upewnij się, że zwierzę jest uspokojone przed przejściem do usuwania sierści i intubacji. Ma to na celu dobro i bezpieczeństwo zwierząt i personelu. Po potwierdzeniu sedacji, królika można następnie ułożyć grzbietowo na stole obrazowym/operacyjnym.
4. Wstrzyknąć 5 mg/kg ketoprofenu podskórnie w celu znieczulenia po wystąpieniu klinicznych objawów uspokojenia (tj. spokojnego zachowania i częściowo zamkniętych i różowych oczu).
   UWAGA: Analgezja jest podawana w zależności od masy ciała królika, a zakres ketoprofenu wynosi 2-5 mg/kg.
5. Zaintubuj królika odpowiednim sprzętem (np. rurką dotchawiczą lub urządzeniem do udrażniania dróg oddechowych) i podłącz do urządzenia do izofluranu (1-2% izofluranu, 1,0 l/min tlenu), który został odpowiednio przetestowany i certyfikowany do znieczulenia królika. Uważnie monitoruj oddech zwierzęcia, aby upewnić się, że znieczulenie jest utrzymywane na poziomie 1-2% izofluranu. Monitoruj królika pod kątem saturacji tlenem za pomocą SpO₂, tętna, częstości oddechów i temperatury przez cały czas trwania zabiegu.
   UWAGA: Rozmiar rurki intubacyjnej zależy od wagi i wielkości królika. Jednak zakres rozmiarów nie zawsze jest dokładny, dlatego pomocne jest posiadanie różnych rozmiarów, aby zobaczyć, który z nich najlepiej pasuje do tego konkretnego królika. Maska nosowa może być również używana zamiast rurki dotchawiczej do celów anestezjologicznych¹⁷, mając na uwadze, że maska ta nie zapewnia ochrony dróg oddechowych zwierzęcia zapewnianej przez intubację. Koce cyrkulacyjne z ciepłą wodą (koce ocieplające) ustawione na 37°C umieszcza się pod ręcznikami, aby utrzymać temperaturę ciała królika.
6. Umieścić i zabezpieczyć cewnik żylny 25 G w żyle ucha brzeżnego, aby umożliwić awaryjne podanie leku.
   UWAGA: W zależności od wielkości żyły królika można użyć zakresu miernika od 24 do 26.
7. Nałóż lubrykant do oczu na oba oczy, aby zapobiec podrażnieniu oczu i wysuszeniu rogówki.
8. Ogol futro wokół drugiej i trzeciej pary strzyków za pomocą elektrycznej maszynki do golenia. Użyj aplikatora z bawełnianą końcówką, aby rozprowadzić krem do depilacji na obszarze strzyka. Pozostaw krem do kontaktu z obszarem przez 15 sekund.
   UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić smoczków maszynki do golenia. Bezprzewodowy odkurzacz może być również używany do pomocy w utrzymaniu czystości w obszarze zabiegu.
9. Zwilż gazik sterylną solą fizjologiczną i użyj go do spłukania kremu i poluzowania sierści zwierzęcia po 15 sekundach od nałożenia kremu do depilacji. Upewnij się, że masz dobrą widoczność i dostęp do obszaru smoczka, z którego usunięto sierść. W razie potrzeby czynność powtórzyć.
   UWAGA: Krem powinien pozostać na króliku przez jak najkrótszy czas, od 10 do 30 s i zostać całkowicie usunięty, aby uniknąć oparzeń chemicznych skóry.

2. Wlew wewnątrzprzewodowy

1. Przygotować roztwór ablacyjny, mieszając odpowiednie objętości z roztworów podstawowych w sterylnych warunkach w kapturze do hodowli tkankowych BSL2.
   UWAGA: Joheksol (350 mg jodu/ml) należy przechowywać w ciemnym miejscu ze względu na wrażliwość na światło. Podczas tego eksperymentu zastosowano szereg stężeń EtOH. W celu zbadania innych wartości procentowych EtOH należy rozcieńczyć roztwory podstawowe do niezbędnego stężenia roztworu ablalacyjnego. Aby utrzymać to samo stężenie jodu w roztworze ablacyjnym z różnymi procentami EtOH, PBS lub sterylną wodą można użyć do uzupełnienia różnicy objętości.
2. W tym przykładzie przygotuj świeży roztwór ablacyjny 10% EtOH, 280 mg jodu/ml joheksolu, 1% barwnika spożywczego w probówce o pojemności 5 ml. Aby uzyskać końcową objętość 5 ml, dodaj 4 ml bulionu joheksolowego (350 mg jodu/ml), 500 μl 100% EtOH (200 proof), 450 μl PBS, 50 μl bulionu niebieskiego barwnika spożywczego.
   UWAGA: Każde drzewo kanałowe może być wypełnione do 400 μl, ale zazwyczaj 250-350 μl dla zwierząt poniżej 3,5 kg. Evans Blue do 0,2% może być stosowany zamiast barwnika spożywczego. Błękit Evansa może być preferowaną opcją, jeśli planowane jest przeprowadzenie analizy całego mocowania lub innych tkanek bezpośrednio po infuzji (infuzjach).
3. Usuń martwy naskórek, który zakrywa otwory kanałowe, za pomocą cienkich spiczastych kleszczy.
   UWAGA: Króliki mogą mieć zrogowaciały czop wystający ze smoczka, który może uniemożliwić pomyślną kaniulację, jeśli nie zostanie usunięty. Miejscowo lidokainę można również stosować wokół smoczka, aby zminimalizować podrażnienie wokół miejsca wstrzyknięcia (Tabela 1).
4. Przetrzeć miejsce infuzji gazikami z chlorheksydyną.
   UWAGA: Chlorheksydyna jest stosowana jako środek czyszczący do dezynfekcji miejsca wstrzyknięcia przed kaniulacją (Tabela 1).
5. Włożyć skos igły 28 G (długość: 12,7 mm) z boku smoczka i powoli wstrzyknąć 200 μl 0,9% soli fizjologicznej z szybkością 200 μl/min. Pozwala to na lepszą wizualizację otworów kanałowych.
   UWAGA: Nie wszystkie 200 μl soli fizjologicznej może wymagać wstrzyknięcia do smoczka; Należy przerwać wstrzykiwanie, gdy zobaczy się, że sól fizjologiczna wydostaje się z jednego lub więcej otworów przewodowych.
6. Odessać 1 ml przygotowanego roztworu ablacyjnego za pomocą strzykawki Luer lock o pojemności 1 ml. Przymocuj strzykawkę do żeńskiego, "skrzydlatego" końca 12-calowej linii przedłużającej męsko-żeńskiej. Ostrożnie przymocuj igłę z końcówką 27 G (długość: 12.7 mm) do męskiego końca przedłużacza. Zagruntować linię roztworem. Wytrzeć igłę gazikiem nasączonym alkoholem. Należy również pamiętać, aby nie przechylać strzykawki z roztworem ablacyjnym, ponieważ może to spowodować tworzenie się pęcherzyków powietrza.
   UWAGA: Są to zalecane objętości mające na celu pełne wypełnienie drzewa (drzew) przewodowych: do 300 μl w każdym drzewie i do 1,2 ml na gruczoły sutkowe szyjki macicy i/lub pachwinowe (1^{. i 4. para),} do 400 μl w każdym drzewie i do 1,6 ml na gruczoły piersiowe i/lub brzuszne (2^{. i 3. pary).} W przypadku innych zastosowań właściwe może być użycie mniejszych lub większych objętości w oparciu o wymagania eksperymentalne i/lub wskazówki dotyczące fluoroskopii, aby uniknąć przepełnienia drzewa kanałowego. Przedłużacz pozwala na większą kontrolę natężenia przepływu oraz na jednoczesną infuzję i obrazowanie fluoroskopowe na żywo. Dla porównania, zalecane objętości wlewu doprzewodowego w modelach mysich w wieku 9-12 tygodni⁴ wynoszą: do 30 μl w gruczołach sutkowych szyjnych i pachwinowych oraz do 50 μl w gruczołach piersiowych i brzusznych oraz modele szczurze⁵: do 100 μl w odcinku szyjnym i pachwinowym oraz do 300 μl w gruczołach sutkowych klatki piersiowej i brzusznej.
7. Użyj lampy powiększającej 10x, aby pomóc w zlokalizowaniu otworów kanałowych. Delikatnie przytrzymaj smoczek palcami i wprowadź igłę do otworu kanałowego. Delikatnie kontynuuj wkładanie igły z końcówką 27 G, aż końcówka całkowicie znajdzie się w smoczku. Aby umieścić igłę w smoczku, należy podnieść smoczek w kierunku igły, zamiast wciskać igłę w smoczek. Uważaj, aby podążać ścieżką otworu kanałowego.
   UWAGA: U niektórych królików możesz odczuwać opór podczas próby włożenia igły do otworu smoczka. Ostrożnie lekko dociśnij, aby przebić się przez górną warstwę komórek nabłonka. Z naszego doświadczenia wynika, że urządzenie powiększające jest wymagane, aby wyraźnie zidentyfikować otwór kanałowy do kaniulacji. Może to być lampa powiększająca, soczewka, lupa lub podobne urządzenie.
8. Powoli wlewać 300 μl roztworu ze stałą szybkością około 200 μl/min po całkowitym wprowadzeniu igły. Odczekaj 30 s po infuzji, aby usunąć igłę z kaniulowanego drzewa; Dzięki temu wstrzykiwana objętość pozostaje w drzewie kanałowym i zmniejsza prawdopodobieństwo wycieku.
   UWAGA: Zazwyczaj jeden badacz kaniuluje i trzyma igłę, podczas gdy drugi badacz trzyma strzykawkę i popycha tłok z pożądaną szybkością. Pompa strzykawkowa może być używana w celu uzyskania bardziej kontrolowanego natężenia przepływu, ponieważ nagłe zmiany szybkości infuzji mogą spowodować pęknięcie lub uszkodzenie drzew przewodowych.
9. Oczyść rozlany roztwór zwilżoną gazą lub chusteczką EtOH, aby uniknąć obcego roztworu kontrastowego na obrazach.

3. Obrazowanie fluoroskopowe

1. Wykonaj obrazy fluoroskopowe po wstrzyknięciu każdego drzewa przewodowego. Parametry fluoroskopii to: 30 kl./s, 67 kV i 17,3 mA na urządzeniu rentgenowskim do fluoroskopii. Należy je jednak dostosować w zależności od potrzeb eksperymentu i obrazowania.
2. Skorzystaj z obrazów fluoroskopowych, aby określić, czy do pełnego wypełnienia drzewa kanałowego wymagana jest dodatkowa objętość.
   UWAGA: Obrazowanie fluoroskopowe może odbywać się na żywo w tym samym czasie, co infuzja roztworu ablacyjnego. Metalowe lub plastikowe kleszcze mogą być używane do przytrzymywania smoczka podczas obrazowania, aby chronić personel przed szkodliwym promieniowaniem rentgenowskim. Pozwala to na monitorowanie wypełnienia drzew kanałowych. Fluoroskopia na żywo może wskazać, kiedy należy przerwać infuzję na podstawie zwiększonej objętości na końcach pęcherzyków płucnych. Fluoroskopia po infuzji może potwierdzić, czy drzewo przewodowe było całkowicie wypełnione lub czy wystąpił jakiś wyciek. Fluoroskopia potwierdzająca jest zwykle wykonywana po infuzji każdego przewodu w tym samym gruczole sutkowym.

4. Opieka pooperacyjna i rekonwalescencja

1. Przerwać przepływ izofluranu po ostatniej infuzji doprzewodowej.
2. Wstrzyknąć domięśniowo 0,5 mg/kg atipamezolu.
   UWAGA: Czas rekonwalescencji różni się u poszczególnych zwierząt, ale królik powinien zacząć wykazywać oznaki powrotu do zdrowia po 5-20 minutach od wstrzyknięcia.
3. Zapewnij zwierzęciu ciągłe wsparcie cieplne na kocu rozgrzewającym, aż do całkowitego wyzdrowienia ze znieczulenia. Utrzymuj przepływ tlenu do 5 minut przed wyjęciem ze znieczulenia.
   UWAGA: Oznaki powrotu do zdrowia obejmują ruchy ust, takie jak żucie, kaszel, drganie nosa i/lub ruchy gałek ocznych. Króliki powinny mieć odruch prostowania i być w stanie utrzymać się w pozycji mostkowej przed ponownym umieszczeniem w nosidełku ratunkowym. Środek regeneracyjny podaje się w zależności od masy ciała królika w zakresie 0,1-1 mg/kg atipamezolu.
4. Wstrzyknąć podskórnie 5 mg/kg ketoprofenu.
5. Usuń cewnik dożylny, gdy królik będzie w stanie utrzymać się w pozycji mostka. Przyłóż gazik do miejsca, w którym usunięto cewnik, aby zatamować nadmierne krwawienie.
   UWAGA: Usunięcie cewnika może nastąpić, gdy królik znajduje się w transporterze.
6. Przetransportować królika z powrotem do odpowiedniego obiektu w pomieszczeniu.
7. Kontynuować wstrzyknięcia 5 mg/kg ketoprofenu podskórnie przez co najmniej 3 dni po zabiegu.
8. Monitoruj królika pod kątem oznak dyskomfortu, niepokoju, bólu i samookaleczenia raz dziennie przez co najmniej 3 dni po zabiegu. Jeśli królik wykazuje którykolwiek z tych objawów klinicznych, leczenie ketoprofenem można przedłużyć. Rejestruj i monitoruj masę ciała, aby ocenić objawy anoreksji.
   UWAGA: Ketoprofen podaje się w zależności od masy ciała królika w zakresie 2-5 mg/kg. Może być podawany co 24 godziny przez okres do 5 dni po infuzji doprzewodowej w celu zmniejszenia stanu zapalnego i zminimalizowania blizn. Aby zminimalizować działania niepożądane związane z owrzodzeniami skóry lub innymi problemami związanymi z gojeniem się ran, lidokainę należy stosować miejscowo w miejscu wstrzyknięcia. Każde zwierzę wykazujące uporczywe oznaki dyskomfortu, niepokoju, bólu lub urazu po leczeniu ketoprofenem powinno zostać poddane eutanazji.

5. Analiza tkanek

1. Podawać roztwór do eutanazji (pentobarbital sodu i fenytoiny sodu) dożylnie w dawce 100 mg/kg. Po 60 s sprawdź, czy nie ma oznak życia poprzez szczypanie palców u stóp/uszu, oznaki oddychania lub bicia serca, odruch rogówkowy i/lub stymulację źrenic.
2. Przeprowadzić sekcję zwłok w celu uzyskania tkanki gruczołu sutkowego i poddać ją rutynowej procedurze zatapiania parafiny po 24-36 godzinach w 10% neutralnej buforowanej formalinie¹⁸. Następnie wykonaj standardowe barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) i/lub barwienie immunohistochemiczne markerem specyficznym dla typu komórki, aby pomóc w pożądanych odczytach analizy¹⁸. Zwłoki należy usunąć zgodnie z odpowiednim protokołem unieszkodliwiania (np. spalanie).
3. Przeanalizuj tkanki gruczołu sutkowego w porozumieniu z patologiem. Użyj programu komputerowego, aby pomóc w ilościowym określeniu szybkości ablacji i pobocznego uszkodzenia tkanki.
   UWAGA: Analizę tkanek przeprowadzono na 4-miesięcznych królikach rasy białej nowozelandzkiej w ciągu jednej godziny po infuzji (ryc. 4) za pomocą oprogramowania QuPath Open Software for Bioimage Analysis (https://qupath.github.io/). Analiza ta opiera się wyłącznie na tkankach barwionych H&E. QuPath lub podobne oprogramowanie komputerowe wymaga wprowadzenia i kalibracji przez patologa. Niektóre komórki mogą być błędnie sklasyfikowane na podstawie samych cech morfologicznych (ryc. 4). Zastosowanie markerów specyficznych dla typu komórki, takich jak cytokeratyny i aktyna α mięśni gładkich, może być wykorzystane do poprawy klasyfikacji wspomaganej komputerowo⁶. Ostatecznie analiza klasyfikacji komórek musi być nadzorowana i zatwierdzana przez patologa.

Wyniki

Każdy z 8 gruczołów sutkowych samicy królika zawiera 4 drzewa przewodowe, które otwierają się w niezależnych ujściach strzyków (ryc. 2). Ze względu na różnicę w wielkości i liczbie drzew przewodowych na gruczoł sutkowy między gryzoniami (tylko 1 przewód na gruczoł mleczny), króliki są dobrym modelem pośrednim dla translacji człowieka. Możemy podać do 400 μl 10-70% roztworu EtOH, aby wypełnić całe drzewo przewodowe dowolnego gruczołu mlecznego 4-miesięcznych królików rasy nowozelandzkiej białej (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4 ^4,8,9). Roztworem ablacyjnym możemy zainparować do 4 drzew przewodowych w maksymalnie 8 gruczołach sutkowych podczas jednej sesji. Typowy projekt eksperymentalny polega na infuzji 2-3 drzew przewodowych w jednym gruczole sutkowym w maksymalnie 4 gruczołach sutkowych określonym roztworem ablacyjnym zawierającym rentgenowski środek kontrastowy na bazie jodu (ryc. 2, ryc. 3). W przypadku roztworu ablacyjnego zawierającego joheksol (90-300 mg jodu/ml) fluoroskopię wykonuje się w trakcie i/lub po każdej infuzji w celu określenia indywidualnego sukcesu infuzji każdego drzewa przewodowego częściową lub pełną ilością roztworu w infuzji (ryc. 2, ryc. 3). Pobranie tkanki gruczołu sutkowego umożliwia ocenę, w jaki sposób zmiany w postaci wpływają na niszczenie komórek nabłonka sutka (ryc. 4). Te analizy obrazowe dostarczają informacji pozwalających zrozumieć najbardziej odpowiednie rozwiązanie w celu osiągnięcia maksymalnej ablacji przy jednoczesnej minimalizacji uszkodzeń otaczających tkanek. Ustaliliśmy, że 10% roztwór EtOH zapewnia porównywalną szybkość ablacji do roztworów ablacyjnych zawierających wyższy procent EtOH (ryc. 4).

Rysunek 1: Przebieg procedury wewnątrzprzewodowej. Podkreślono kluczowe etapy procedury identyfikacji. Zobacz film, aby uzyskać więcej informacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Kluczowe etapy kaniulacji i infuzji wewnątrzprzewodowej. (A) Wstrzyknięcie soli fizjologicznej prostopadle do strzyka w celu rozszerzenia otworów przewodowych do kaniulacji (widok w płaszczyźnie środkowej). (B) Kaniulację i wypełnienie drzewa przewodowego (D1) można śledzić za pomocą niebieskiego barwnika w roztworze ablacyjnym (widok w płaszczyźnie środkowej). (C) Obrazowanie fluoroskopowe w czasie rzeczywistym zapewnia precyzyjne monitorowanie wypełnienia drzew przewodowych (D1) joheksolem w roztworze ablacyjnym (widok na płaszczyźnie grzbietowej). Otwory w drzewach kanałowych są ponumerowane od lewej do prawej, zaczynając od górnej ćwiartki (D1, lewy górny ćwiartka) i kończąc na dolnej ćwiartce (D4, prawy dolny kwadrant). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Rozmiar smoczka i skuteczne podanie roztworu ablacyjnego do wielu przewodów. Typowa prezentacja rozmiarów strzyków u nowozelandzkich królików białych. Rozmiar smoczka różni się w zależności od wagi i wieku królika. Gruczoły sutkowe są ponumerowane od lewego górnego rogu (L1, lewy szyjka macicy) do prawego dolnego rogu (R8, prawy pachwinowy). Wszystkie obrazy są wyświetlane w płaszczyźnie grzbietowej. (A) 2,8 kg królika dziewiczego (na górze) z mniejszymi strzykami, trudnymi do kaniulacji, 3,5 kg królika dziewiczego (w środku) z odpowiednimi strzykami do kaniulacji i 4,1 kg królika wieloródka (na dole) z większymi strzykami, znacznie łatwiejszymi do kaniulacji. (B) Niebieski barwnik spożywczy w roztworze do infuzji może być stosowany jako dowód in vivo dostarczania wewnątrzprzewodowego i napełniania drzew przewodowych. Nieudana infuzja jest oznaczona czerwonym konturem (dostarczenie poduszeczki tłuszczowej, góra), a udane wlewy niebieskim konturem (podanie wewnątrzprzewodowe, środek i dół). 70% roztwór EtOH powoduje więcej uszkodzeń skóry (rumień) kilka minut po infuzji (ciemnoniebieski, środkowy panel) w porównaniu z 10% roztworem (jasnoniebieski, dolny panel). (C) Fluoroskopia dostarcza dowodów in vivo na dostarczanie wewnątrzprzewodowe. Nieudany napar (podanie poduszeczki tłuszczowej, górny panel). Udana sekwencyjna infuzja najpierw przewodowego D1 i drugiego przewodowego D2 (lewy dolny panel). Fluoroskopia na żywo zapewnia wskazówki obrazowe dotyczące wypełnienia (białe strzałki) drzewa kanałowego D3 (prawy dolny panel); Widoczna jest również linia przedłużająca wypełniona roztworem ablacyjnym zawierającym joheksol oraz kleszcze do przytrzymywania smoczka. Paski skali odpowiadają 1 cm na obrazach przy różnym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Analiza tkanek gruczołów sutkowych u królików białych w Nowej Zelandii po zabiegu wewnątrzprzewodowym roztworem ablacyjnym na bazie etanolu. (A-B) Reprezentatywne barwienie H&E prawego pachwinowego gruczołu sutkowego 4-miesięcznego zwierzęcia bez leczenia ablacyjnego w porównaniu z prawym gruczołem sutkowym pachwinowego innego zwierzęcia z 10% leczeniem ablacyjnym EtOH. Plasterki tkanki są cięte wzdłuż płaszczyzny środkowej, więc D1 i D3 (lewe drzewa kanałowe) są reprezentowane na tych samych odcinkach tkanki. Widok całej tkanki (A) i widok w dużym powiększeniu (B) pokazują morfologiczne i chromatyczne efekty ablacji EtOH na barwienie H&E (górne panele) oraz wydedukowane klasy komórek nabłonka i zrębu w oparciu o wspomagany komputerowo wyszkolony klasyfikator (dolne panele). podziałka odpowiada 1 mm w A , a biała podziałka 100 μm w B. (C) Wykres przedstawia rozkład klas komórek w drzewach przewodowych (n > 4 na grupę) poddanych działaniu EtOH o różnych stężeniach lub pozostawionych bez zabiegu. Gwiazdki wskazują wartość p niesparowanego testu t Welcha dla każdej klasy komórek na grupę w porównaniu z odpowiadającą mu klasą komórek w grupie 10% traktowanej EtOH (* <0,05, ** < 0,01, **** <0,0001). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W naszych poprzednich badaniach wykazaliśmy, że dostarczenie ID 70% EtOH powoduje ablację komórek nabłonka sutka, powodując minimalne uszkodzenia otaczającej tkanki u gryzoni ^6,7. W tej procedurze wykazaliśmy, że infuzja ID roztworu ablatywnego może być skalowana do modelu królika. W szczególności pokazujemy w tym większym modelu z wieloprzewodowym systemem drzew, że sekwencyjna infuzja wszystkich przewodów w gruczole sutkowym może być z powodzeniem podawana. Jest to kolejny etap w przekształcaniu tej procedury ablacyjnej w realną alternatywę dla profilaktycznej mastektomii w prewencji pierwotnej u osób z grupy wysokiego ryzyka.

Zatwierdzony przez FDA rentgenowski środek kontrastowy na bazie jodu Omnipaque (iohexol) pozwala nam ocenić sukces infuzji poprzez wizualizację na żywo procesu dostarczania roztworu przez drzewo przewodowe. Użycie fluoroskopii do wizualizacji wlewu gruczołu sutkowego ściśle koresponduje z tym, co prawdopodobnie jest sprzętem i instrumentami zastosowanymi w celu przeprowadzenia tej procedury pod kontrolą obrazu do kliniki^10,11. Ta metoda obrazowania pozwoli nam wiedzieć, kiedy należy przerwać infuzję, dzięki czemu fluoroskopia na żywo stanie się kluczowym elementem klinicznego wdrożenia tej procedury ablacyjnej. Ustaliliśmy skalowalność tej procedury od gryzoni do królików drzew przewodowych, ale potrzebne są dalsze badania, aby określić procent EtOH, który najlepiej abluje komórki nabłonka sutka, jednocześnie minimalizując uszkodzenia otaczających tkanek w tym większym modelu zwierzęcym. Protokół ten koncentrował się na wykonalności infuzji doprzewodowej i analizie tkanek bezpośrednio po zabiegu. Strategie rozwiązywania problemów i przydatne wskazówki przedstawiono w tabeli 1. Chociaż głównym celem tego protokołu jest dostarczanie roztworów ablacyjnych na bazie etanolu, protokół ten może być stosowany w innych zastosowaniach do lokalnego dostarczania innych odczynników do obrazowania, systemów modyfikujących geny, takich jak CRISPR/Cas9, wektory lentiwirusowe, siRNA, czynniki wzrostu i/lub czynniki rakotwórcze ^2,3 w celu zbadania innych aspektów rozwoju gruczołu sutkowego i onkogenezy u królików.

Podsumowując, protokół ten zapewnia narzędzia badawcze potrzebne do przeprowadzenia systematycznego i podłużnego badania lokalnych i ogólnoustrojowych skutków różnych roztworów ablacyjnych. Informacje te określą bezpieczeństwo tej procedury i wskażą wszelkie obawy związane z dalszym rozwojem i oceną kliniczną w pierwszych badaniach klinicznych z udziałem ludzi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkło powiększające 10X ze światłem i zaciskiem, duża gęsia szyja	Amazonka	B0D982JCZ2	Do wizualizacji strzyków
Exel Międzynarodowe Strzykawki Insulinowe	Fisher Naukowy	14-841-31	Do periductalnego wstrzykiwania soli fizjologicznej
Luzem igły o długości 27 0,5	Technologie infuzyjne SAI	B27-50 100 luzem	Do kaniulacji wewnątrzprzewodowej
Evans niebieski	Sigma	E2129-50G	Do wizualizacji gruczołu sutkowego
Fluoroskopowy system obrazowania rentgenowskiego	GE Opieka zdrowotna	DT-C31-01	Do akwizycji obrazów fluroskopowych
Koc ocieplający weterynaryjny HotDog	Hotdog	WC71V	Do zabiegu wewnątrzprzewodowego/przygotowania przedoperacyjnego
Przedłużki męsko-żeńskie, długość 12 cali	Technologie infuzyjne SAI	EXT-12	Do zabiegu wewnątrzprzewodowego
Omnipaque 500 ml (350 mg jodu/ml)	GE Opieka zdrowotna	0407-1414-72	Środek kontrastowy do wizualizacji rentgenowskiej (fluoroskopia)
Sterylny niebieski barwnik spożywczy	Mccormick	930641	Do wizualizacji gruczołu sutkowego
Sterylny sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Rybak termiczny	14190250	Do przygotowania roztworu
Strzykawki	BD	309659	Do infuzji doprzewodowej
V-żel	Docsinnovent	D30001 - 30006	Do intubacji (numer katalogowy zależy od rozmiaru V-żelu)
Ketoprofen	Chciwość	#005488	Na przeciwbóle
ketamina	Chciwość	71069	Na przeciwbóle
Miejscowa lidokaina	Okładka	70859	Na przeciwbóle
Ksylazyna	Chciwość	80907	Do znieczulenia
Euthasol powiedział:	Chciwość	#009444	Do eutanazji
Smar do oczu	Chciwość	75848	Do znieczulenia
Atipamezol	Chciwość	82124	Do znieczulenia
Chipsy bananowe	Bio-Serv	#F7161	Do aklimatyzacji
Klejnoty furii	Bio-Serv	#F5136-1	Do aklimatyzacji
Krople jogurtu	Bio-Serv	#F7200-1	Do aklimatyzacji