Artykuł metodologiczny

Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby: wielokrotnego użytku narzędzie drukowane w 3D do mikroskopii śródżyciowej wątroby

DOI:

10.3791/68337

⸱

17 marca 2026

 ,  ,  , 
1Cavendish Laboratory, Department of Physics, University of Cambridge, 2Thoracic and GI Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, 3Facultad de Ciencias Físicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências de Materiais, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal de Pernambuco

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten wprowadza nowoczesne, wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby (RHIT) do mikroskopii śródżyciowej (IVM) żywych myszy, które zwiększa stabilność tkanek podczas szybkich i ostrych eksperymentów. Konstrukcja RHIT, drukowana w 3D, oferuje opłacalną produkcję, skalowalność i wszechstronność, umożliwiając długotrwałą obserwację procesów metabolicznych u myszy o różnych rozmiarach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcję i dysfunkcję wątroby można ocenić, bezpośrednio wizualizując dynamiczne procesy wątroby za pomocą mikroskopii śródżyciowej opartej na konfokalnej (IVM). W szczególności można osiągnąć doskonałą precyzję przestrzenną i czasową przy wydobyciu zarówno informacji jakościowych, jak i ilościowych. Na etapie mikroskopu utrzymanie warunków tkanek fizjologicznych przy jednoczesnym osiągnięciu stabilności i powtarzalności pozostaje wyzwaniem. Wzrost masy ciała i zawartość lipidów wątrobowych mają negatywny wpływ na ten proces w zwierzęcych modelach cukrzycy typu II (T2D) oraz niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (MAFLD). Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stworzyliśmy RHIT, rewolucyjny projekt instrumentu obrazowania, który poprawia dostęp i stabilność tkanek. RHIT to wielokrotnego użytku, skalowalne urządzenie do obrazowania wątroby produkowane przy użyciu druku 3D w efektywnej, jednostopniowej metodzie. Jego wymiary mogą być zmieniane, aby pasować do myszy o różnych rozmiarach. W skrócie, RHIT to urządzenie drukowane w 3D do pozycjonowania i stabilizacji zwierząt laboratoryjnych podczas mikroskopii wewnątrzżyciowej wątroby, stosowane po krótkim przygotowaniu chirurgicznym w celu minimalizacji manipulacji, stresu i zmienności. Jego wielorazowy, standaryzowany projekt jest łatwy do produkcji i personalizacji, wspierając różne rozmiary i potencjalne projekty eksperymentalne. Wstępne wyniki wykazują znaczącą poprawę stabilności i niezawodności obrazowania wewnątrzżyciowego wątroby, umożliwiając szczegółową wizualizację struktur podkomórkowych, takich jak krople lipidowe. Ta zwiększona precyzja ułatwia badania metaboliczne i fizjologiczne z lepszą przejrzystością, powtarzalnością i potencjałem do projektowania podłużnego. Protokół oferuje ustandaryzowane, dostępne podejście, które odpowiada na długoletnie wyzwania techniczne związane z terapią IVM wątroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia śródżytna to potężne narzędzie do dynamicznej wizualizacji procesów biologicznych in vivo 1,2,3, w przeciwieństwie do tradycyjnej histologii immunofluorescencji z uwarunkowaniem obrazowania tkanek lub żywych komórek oraz analizą cytometrii przepływowej izolowanych komórek. Do badań wątroby zastosowano IVM do badania wydzieliny żółcii przepływu 4,5, mobilizacji glukozy 6,7, komórek nieprzyprzyprzyzębnych 8,9,10 oraz chorób wątroby11,12. Co więcej, w zakresie badań nad akumulacją lipidów, IVM umożliwia w czasie rzeczywistym informacje o dynamice powstawania, wzrostu i degradacji kropelek lipidowych w żywych tkankach, takich jak wizualizacja i ilościowa ilościowa analiza kropelek lipidowych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, a także bezpośrednia korelacja akumulacji kropelek lipidowych z innymi procesami komórkowymi i fizjologicznymi13. Pomimo tych zalet, IVM wciąż stanowi wyzwanie techniczne: wymaga specjalistycznego sprzętui wiedzy, może powodować uszkodzenia tkanek, zmieniać zachowanie komórkowe i wymagać inwazyjnych zabiegów. Tradycyjne badania in vivo opierające się na obserwacji behawioralnej, monitorowaniu fizjologii i analizie genetycznej dostarczają cennych informacji, ale nie mają przestrzennej i czasowej rozdzielczości oferowanej przez mikroskopię śródżyciową.

Pierwszym poważnym wyzwaniem IVM jest kontrola niestabilności artefaktów spowodowanej biciem serca i oddychaniem badanych zwierząt, co może obniżyć jakość obrazu, skutkując zamazanymi lub zniekształconymi obrazami obserwowanych procesów biologicznych15. Próby korekty tego za pomocą przetwarzania obrazu często skutkują utratą ważnych informacji przestrzennych i czasowych lub wymaganiem zaawansowanego sprzętu chirurgicznego i konserwacji16,17. Po drugie, modele mysie do badań chorób wątroby, takie jak MAFLD i T2D, często są otyłe i dlatego trudniejsze do stabilizacji ze względu na zwiększony rozmiar i zawartość lipidów tkanek16,18. W otyłych modelach myszy NAFLD i T2D wzrost masy ciała stanowi mechaniczne wyzwania dla obrazowania wewnątrzżyciowego poprzez przekraczanie nośności standardowych etapów mikroskopu i utrudnianie stabilizacji zwierząt19. Ta dodatkowa masa zwiększa ryzyko artefaktów ruchu i kompresji tkanek, które oba upośledzają precyzję obrazowania20.

Jednocześnie podwyższona zawartość lipidów wątroby zwiększa nieprzezroczystość tkanek i rozpraszanie światła, co pogarsza rozdzielczość obrazu i kontrast. Efekty te często potęgują współistniejące choroby metaboliczne, takie jak zmienione przeciekanie i stan zapalny, co dodatkowo zmniejsza rozmieszczenie barwnika i klarowność sygnału21. Wreszcie, utrzymanie stałej temperatury ciała podczas obrazowania, aby utrzymać fizjologię tkanek i aktywność biologiczną, może być trudne i utrudniać powtarzalność. Ponadto stabilne ustawienie wątroby na etapie mikroskopu podczas IVM jest kluczowe, aby zapobiec naprężeniom mechanicznym lub uszkodzeniom tkanek7. Odsłonięcie tkanki wątroby to delikatny zabieg, który wymaga precyzji technicznej, aby zapobiec silnemu krwawieniu i uszkodzeniu miąższu wątroby7. Aby ograniczyć artefakty ruchu, klatka piersiowa myszy była wcześniej podnoszona ze sceny mikroskopu za pomocą kartonu, co pozwoliło grawitacji odciągnąć wątrobę od reszty ciała22. Chociaż to podejście okazało się skuteczne w generowaniu danych mierzalnych, materiał kartonowy jest nie do utrzymania, ponieważ traci kształt i jest trudny do czyszczenia. Dodatkowo trudno jest zmienić wymiary kartonowej wkładki, aby dostosować je do modeli myszy z otyłością.

W ostatnich latach pojawiło się kilka zaawansowanych technik mikroskopii wewnątrzżyciowej wątroby, w tym skaningowa mikroskopia pola świetlnego oraz komputerowo ulepszone systemy optyczne, które wykazały poprawę rozdzielczości przestrzenno-czasowej23, obniżonej fototoksyczności24, większej głębi obrazowania25,26 oraz tłumienia artefaktów ruchu27. Te zmiany, co potwierdzają najnowsze badania28, 29, 30, stanowią istotny postęp technologiczny w tej dziedzinie. Niniejszy artykuł przedstawia narzędzie do obrazowania wątroby wielokrotnego użytku (RHIT), innowacyjne narzędzie do IVM wątroby myszy. RHIT przyczynia się do ewoluującego krajobrazu, oferując skalowalne i wielokrotnego użytku narzędzie, które zwiększa stabilność mechaniczną oraz dostępność tkanek w różnych modelach zwierzęcych, w tym tych z chorobami metabolicznymi. Jego projekt odpowiada na uporczywe wyzwania związane z ruchem, zmiennością i złożonością ustawienia, integrując dopasowanie anatomiczne, powtarzalność aranżacji oraz łatwość obsługi. Kompatybilność RHIT-a zarówno z konwencjonalnymi, jak i zaawansowanymi metodami obrazowania, zwiększa użyteczność tych nowych technik, wspierając niezawodne i fizjologicznie stabilne obrazowanie wewnątrzżyciowe wątroby.

Chociaż zaproponowano różne metody stabilizacji tkanki podczas IVM, takie jak oknochirurgiczne 9,31,32,33,34,35,36 oraz specjalnie złożony etap akrylowy 6,37, te metody wprowadzają również liczne ograniczenia i złożoności dotyczące skalowalności, powtarzalności i umiejętności chirurgicznych. W porównaniu z tym RHIT jest funkcjonalnie odrębny pod względem przeznaczenia i konstrukcji. Nie opiera się na bezpośredniej kompresji ani osadzaniu na bazie żelu38. Zamiast tego RHIT pełni rolę skalowalnego, wielokrotnego użytku, anatomicznie konturowanego narzędzia, które wspiera izolację wątroby poprzez pozycjonowanie grawitacyjne, utrzymując orientację fizjologiczną bez ograniczania lub zniekształcania tkanki. Co istotne, RHIT poprawia powtarzalność danych, wierność obrazowaniu oraz spójność proceduralną w szerokim zakresie rozmiarów myszy. Eliminuje to potrzebę stosowania żeli, klejów czy skomplikowanych interfejsów chirurgicznych, jednocześnie upraszczając ustawienie tkanek i kontrolę temperatury. Ponadto RHIT to specjalistyczne narzędzie łączące zwierzęta z mikroskopem, zaprojektowane tak, aby wspierać zarówno wsparcie fizjologiczne, jak i precyzję obrazowania.

RHIT bezpośrednio odpowiada na mechaniczne i optyczne wyzwania modeli o metabolicznych uszkodzeniach dzięki skalowalnej geometrii, która pozwala na większe rozmiary zwierząt i równomiernie rozkłada masę, minimalizując niestabilność platformy. Osłona wątroby stabilizuje tkankę za pomocą grawitacji bez nacisku, umożliwiając stały dostęp i zmniejszając ruch podczas obrazowania. Jego wielokrotnego użytku, chemicznie obojętny projekt zapewnia kompatybilność z tkankami biologicznymi, jednocześnie wspierając higieniczne ponowne użycie. Dzięki konsekwentnemu pozycjonowaniu, minimalizacji artefaktów ruchu i utrzymaniu integralności tkanek, RHIT zapewnia fundamentalny postęp w procesach pracy mikroskopii śródkluczowej. Jego elastyczność i dostępność w otwartym kodzie dodatkowo promują szeroką użyteczność w laboratoriach i modelach zwierzęcych, ustanawiając nowy standard dla narzędzi obrazowania wspierających zarówno próbkę, jak i system obrazowania.

Ponadto komercyjnie dostępne podgrzewane sceny mikroskopu mogą wymagać zaawansowanych ustawień mikroskopu i obsługi39. Nie są skalowalne do samego okazu i zazwyczaj są droższe, przez co dla wielu badaczy są mniej dostępne. Dlatego ważna jest wielokrotnego użytku, skalowalna wkładka, aby ustandaryzować IVM dla różnych modeli zwierzęcych. Technologia druku 3D, nazywana także produkcją addytywną, zyskuje coraz większą popularność w laboratoriach naukowych, przekształcając protokoły laboratoryjne biochemiczne, fizyczne i biologiczne. W przypadku IVM technologia 3D została wykorzystana do produkcji lekkich obrazujących optycznych okien41,42, poprawy dostępności tkanek43 oraz ułatwienia naprawy i rekonstrukcji tkanek44. Dlatego spersonalizowane narzędzie stabilizacji tkanek, które, o ile nam wiadomo, nie zostało jeszcze opisane, stanowi doskonałą okazję do wykorzystania druku 3D w celu pokonania niektórych wyzwań związanych z wątrobową IVM.

RHIT powstaje przy użyciu jednoetapowej metody druku 3D i znacząco poprawia stabilizację tkanek przez dłuższy czas. RHIT jest bardzo dostępny i nadaje się do ostrych eksperymentów IVM, które wymagają minimalnej wiedzy chirurgicznej. Ponadto RHIT jest łatwo skalowalny do rozmiaru zwierzęcia i ma niskie koszty produkcji. Na koniec wykazujemy, że RHIT umożliwia stabilne obrazowanie fluorescencyjne poklatkowe i poprawia stabilność tkanek w porównaniu z wcześniej używaną wkładką kartonową. RHIT upraszcza IVM homeostazy lipidów wątrobowych bez bezpośredniego kontaktu lub mierzalnego wpływu na warunki fizjologiczne. W konsekwencji RHIT stanowi przewagę konkurencyjną jako przyspieszony, wielokrotnego użytku i elastyczny wkład w IVM 34,36,45.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Projekt RHIT. (A) Projekt i wymiary 3,0 mm RHIT w skali dla myszy otyłej. Widok enface (po lewej) pokazuje wymiary, pozycję i rozmiar otworu tkankowego, a także orientację myszy podczas obrazowania. Widok z boku (po prawej) zawiera wymiary i wskazuje położenie podkładki grzewczej oraz wkładki do pomiaru temperatury. Parametry skalowania dla różnych rozmiarów myszy przedstawiono w Tabeli 1. (B) 3D widok RHIT wygenerowany z otwartoźródłowego pliku STL, pokazujący, gdzie przewód sondy odbytniczej jest włożony przez niestandardowy port (wymiary wkładki sondy odbytniczej pokazane w prawym górnym rogu). (C) Montaż techniczny RHIT pokazujący integrację urządzenia grzewczego i niestandardowych wkładek konstrukcyjnych dla różnych rozmiarów RHIT, przewód jest montowany w wkładce do sondy odbytniczej dla dostępu do sondy temperatury. Skrót: RHIT = Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

RHIT został pierwotnie zaprojektowany jako jednoczęściowy zespół z wykorzystością ABS (akrylonitryl butadienowy styren), szeroko stosowanego polimeru termoplastycznego w modelowaniu osadzonym (3D) drukowanym45. ABS oferuje kilka zalet w tym zastosowaniu: jest lekki, odporny na wysoką temperaturę (temperatura topnienia ~200 °C) oraz dobrą odporność na uderzenia 46,47,48. Konstrukcja RHIT-a wykorzystuje regulowalną gęstość ABS, pozwalając mu pochłaniać ruchy fizjologiczne, takie jak tętno i oddychanie. Zwiększona gęstość wypełnienia poprawia tłumienie ruchu, co skutkuje większą stabilnością obrazu i poprawą jakości obrazu.

RHIT został zaprojektowany tak, aby pochłaniać ruch poprzez regulacje gęstości chemicznie obojętnego materiału, takiego jak ABS. W tym kontekście gęstość odnosi się konkretnie do wewnętrznego procentu wypełnienia używanego podczas druku 3D, co wpływa na sztywność i zdolność platformy do tłumienia drgań 49,50,51. Zaobserwowano, że zwiększenie gęstości ABS zmniejsza transmisję ruchu spowodowaną biciem serca i oddychaniem, co daje stabilną platformę do obrazowania i poprawia jakość obrazu. Testowaliśmy konstrukty RHIT o zmiennej gęstości wypełnienia wewnętrznego (20-100%) i zaobserwowaliśmy jakościowo, że konfiguracje o wyższej gęstości prowadziły do widocznego zmniejszenia artefaktów ruchu podczas obrazowania wewnątrzżyciowego wątroby u myszy. Formalna ilościfikacja nie została przeprowadzona, ponieważ konfiguracja o wysokiej gęstości okazała się wystarczająco solidna i skuteczna we wszystkich testowanych rozmiarach RHIT oraz konsekwentnie zapewniała niezawodne działanie w warunkach rutynowych obrazowania. Dla większości użytkowników ta domyślna gęstość będzie odpowiednia bez dalszych regulacji. Jednak w przypadku eksperymentów wymagających określonych cech mechanicznych można modyfikować gęstość wypełnienia i parametry projektowe, a pełne instrukcje druku 3D wspierają takie dostosowywanie.

Do druku można stosować alternatywne materiały; jednak ABS jest preferowanym materiałem do produkcji RHIT, ponieważ oferuje kilka kluczowych zalet. Jest chemicznie obojętny, minimalizując ryzyko interakcji z tkankami lub płynami ustrojowymi, oraz nierozpuszczalny w wodzie, co umożliwia efektywne czyszczenie, przechowywanie i ponowne użycie. Te właściwości czynią ABS niezawodnym i trwałym wyborem do zastosowań eksperymentalnych. Gdy dostęp do drukarki modelującej z osadzeniem jest ograniczony, można stosować inne techniki i materiały druku 3D. Stereolitografia, selektywne spiekanie laserowe oraz wielostrumieniowe fuzje to odpowiednie opcje z materiałami takimi jak nylon, żywice fotopolimerowe czy proszki kompozytowe. Nylon zapewnia trwałość i elastyczność, podczas gdy żywice stereolitograficzne oferują wysoką rozdzielczość do zastosowań wymagających drobnych szczegółów konstrukcyjnych. Projekt RHIT można łatwo dostosować do tolerancji i ograniczeń różnych materiałów, co sprawia, że jest kompatybilny z różnymi platformami drukarskimi. Użytkownicy powinni wybierać materiały na podstawie stabilności mechanicznej, biokompatybilności, kompatybilności z procesami obrazowania oraz dostępnych zasobów drukarskich.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach były przeprowadzane w obiektach zwierzęcych Narodowych Instytutów Zdrowia, zgodnie z wytycznymi i protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach (protokół nr LCMB-037). Wszyscy pracownicy muszą być odpowiednio przeszkoleni przed przystąpieniem do następujących protokołów. Obsługa zwierząt była wykonywana zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.

Protokół RHIT określa przygotowanie wielokrotnego użytku Narzędzi Obrazowania Wątroby (RHIT) do eksperymentów z mikroskopią śródżyciową (IVM). Procedury eksperymentalne przeprowadza się w sterylnym pomieszczeniu mikroskopowym lub okapu i obejmują szereg etapów: najpierw drukowanie RHIT, znieczulenie i znakowanie fluorescencyjne myszy, następnie ustawienie mikroskopu, następnie zabieg chirurgiczny, a na końcu zastosowanie IVM wspomaganego RHIT. Rysunek 1 i Rysunek 2 ilustrują niezbędne komponenty do obrazowania żywych okazów za pomocą mikroskopu konfokalnego, w tym metalową wkładkę 5,6,7 (adapter mikroskopu do obrazowania żywych próbek) do umieszczania RHIT, a także RHIT-y do stosowania w zaawansowanej lub kontrolowanej steatozie. Do testowania systemu pozyskano samców C57BL/6J Musculus w wieku 6-10 tygodni, którzy karmiono je dietą standardową lub zachodnią przez 8-10 tygodni przed eksperymentem.

1. Projektowanie RHIT z modyfikacjami

  1. Aby odtworzyć RHIT, użyj oprogramowania do projektowania produktów 3D (patrz Tabela materiałów). Otwórz oprogramowanie projektowe i stwórz nową standardową część. Zapisz plik z odpowiednim opisem.
  2. Stwórz szkic RHIT na płaszczyźnie frontowej za pomocą funkcji Create 2D Sketch .
    1. Kliknij ikonę prostokąta i umieść jej lewy dolny róg w miejscu początkowym płaszczyzny szkicu.
    2. Narysuj drugi prostokąt wewnątrz pierwszego, aby reprezentować okno obrazowania RHIT.
    3. Dodaj wymiary do obu prostokątów za pomocą funkcji Wymiar , zapewniając, że wszystkie długości i szerokości są odwoływane do początku i względem siebie.
    4. Dostosuj wymiary RHIT do rozmiaru myszy.
    5. Dodaj grubość do RHIT, wybierając tylko zewnętrzny prostokąt i klikając "ekstruduj". Gdy pojawi się wyskakujące okienko, wybierz szkic za pomocą narzędzia Extrude , aby zostawić otwór na środku.
    6. Wybierz dolną ścianę wytłoczonego RHIT i rozpocznij nowy szkic 2D za pomocą funkcji Start 2D Sketch .
  3. Narysuj prostokąt, aby określić kieszeń na termofor. Zastosuj pozyskane wymiary za pomocą funkcji Wymiar .
    1. Opuszczaj szkic 2D i wykonaj usunięcie materiału za pomocą narzędzia Cut Extrude , aby stworzyć głęboką wnękę dla podkładki grzewczej.
  4. Zacznij nowy szkic sondy temperaturowej na tej samej powierzchni co komora. Kliknij na rozpocznij szkic 2D i wybierz ikonę koła . Umieść koło na płaskiej powierzchni i odpowiednio je wymierz. Wyjście z trybu szkicu .
    1. Kliknij na wyciąganie i wybierz szkic koła. W trybiee xtrusion kliknij na tnij ekstrudację i poczekaj na wyskakujące okienko z opcją "through all" do usunięcia materiału. Kliknij OK. Wyjście z trybu wytłaczania .
    2. Dodaj zaokrąglenia na krawędziach okna, klikając ikonę zaokrągłowania i wybierając wszystkie osiem ostrych krawędzi. Dodaj rozmiar zaokrągłowania i wyjdź z trybu zaokrągania .
      UWAGA: Jeśli pożądane jest dodatkowe pochłanianie ruchu, użytkownicy mogą zwiększyć gęstość wypełnienia wewnętrznego podczas przygotowań do druku 3D.
  5. Przygotuj model do druku 3D, przechodząc do zakładki środowiska i wybierając zakładkę Druk 3D.
    1. Użyj funkcji Set Orientation , aby upewnić się, że model leży płasko na stole drukującym, a nie jest ustawiony pionowo.
    2. Kliknij Opcje Druku, aby skonfigurować ustawienia jednostki i w razie potrzeby dostosować skalę.
    3. Zapisz finalny model. Formatuj STL za pomocą funkcji eksportu STL .
    4. Usuń zakładkę środowiska i kliknij zapisz, aby zapisać RHIT jako solidną część.
  6. Zamknij program projektowy.
    UWAGA: Upewnij się, że drukarka jest kompatybilna z . Format pliku STL lub konwertowanie do odpowiedniego formatu zgodnie z wymaganiami oprogramowania drukarki 3D.

2. Przesyłanie i drukowanie RHIT z plików STL

  1. Zaimportuj plik .stl z Rysunku 1A lub Pliku Uzupełniającego 1 do oprogramowania 3D do komputerowego projektowania (CAD), klikając Import i wybierając plik .stl. Kliknij przycisk Przygotowaj, aby pokroić model na cienkie warstwy do druku 3D.
  2. Wybierz odpowiednią komercyjną drukarkę 3D i kliknij Drukuj. Następnie monitoruj postęp wydruku, a po zakończeniu wydruku usuwaj i czyścij obiekt wydrukowany w 3D w razie potrzeby.
Rozmiar myszyMasa ciała myszy (g)Grubość RHIT (mm)Okno obrazowania Rozmiar L X W (mm)
Małe (S)17-201.517 x 17
Medium (M)22-252.521 x 21
Duże (L)35-40326 x 26

Tabela 1: Skalowanie rozmiaru myszy do RHIT. Waga myszy jest skalowana do grubości RHIT, gdzie waga większa niż 30 g (grot strzały) odpowiada największemu RHIT (3,0 mm). Najlżejsza mysz odpowiada najcieńszemu RHIT, a otyłe myszy reprezentuje najgrubszy RHIT. Te wymiary można regulować w oprogramowaniu CAD. Długość RHIT i apertura obrazowania mogą się różnić w zależności od lokalizacji organu użytego preparatu; stała długość i apertura obrazowania dla wszystkich trzech RHIT były odpowiednie do tego badania. Skróty: RHIT = Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby; CAD = projektowanie wspomagane komputerowo.

3. Przygotowanie mikroskopów i wykorzystanie RHIT

figure-protocol-1
Rysunek 2: IVM wątroby z użyciem techniki RHIT. (A) Schemat odwróconego mikroskopu konfokalnego z unieczuloną myszą. (B) Do ustawienia myszy na stole mikroskopu do obrazowania na żywo użyto metalowego adaptera mikroskopowego (insert). (C) Wydrukowany 3D RHIT był używany z paskiem gazy do łatwej manipulacji przymiąściem wątroby. (D) Obraz przedzewnętrznej wątroby przed pozycjonowaniem RHIT. Stożek nosowy był stosowany do znieczulenia przed i podczas operacji. (E) Obraz zewnętrznej wątroby przed położeniem RHIT podczas ostrego zabiegu. Golenie nie było wymagane. (F) Obraz odwróconej myszy w ostatecznej pozycji zakrytej na RHIT do obrazowania. (G) RHIT bezpiecznie przymocowany do sceny mikroskopu. (H) Mysz ustawiona na RHIT i metalowym adapterze. (I) Szczupłe (niebieska strzałka) i otyłe (zielona strzałka) myszy pokazane z odpowiednimi łuskowatymi wkładkami RHIT w J-L przedstawiają grube obrazy anatomiczne otyłej i szczupłej wątroby (odpowiednio). Wysokorozdzielczy IVM obrazuje M,N wątroby u myszy otyłych i szczupłych oznaczonych odpowiednio BODIPY (zielony, oznaczony różową strzałką) do oznakowania kropelek lipidowych oraz Hoechst 33342 (biały, przedstawiony cyjanową strzałką) do oznaczania jąder, odpowiednio. Skróty: RHIT = Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby; IVM = mikroskopia śródwitalna. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

  1. Przygotuj konwencjonalny odwrócony mikroskop konfokalny do IVM wątroby, jak pokazano na Rysunku 2.
    1. Włóż adaptator sceniczny, aby pomieścić próbkę. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, użyj specjalnie wykonanej metalowej wkładki z okrągłym otworem 35 mm i szybą osłonową o średnicy 40 mm.
    2. Dokładnie umyj obie strony szkła pokrywy przed i po każdym zdjęciu, używając w razie potrzeby 70% etanolu.
  2. Zabezpiecz odpowiedni RHIT według rozmiaru myszy (Tabela 1) taśmą (opcjonalnie), ustawiając przysłonę RHIT z obiektywem obiektywu i równolegle nad okładką obrazowania (Rysunek 2G) na metalowej wkładce taśmą na szybie osłony.
  3. Wybierz obiektyw do obrazowania na podstawie rozmiaru obszaru, rozdzielczości przestrzennej i czasu obrazowania, na przykład obiektyw wodny 25x/0,95.
    UWAGA: Chociaż większe powiększenie poprawia rozdzielczość, zwiększa też prawdopodobieństwo powstawania artefaktów ruchowych.
    1. Wypoziomuj obiektyw blisko szyby pokrywy.
  4. Przypiąć taśmą taśmę gazy (około 1 x 8 cm, rysunek 2C,D) na oknie RHIT, aby pomóc umiejscowić tkankę i oddzielić ją od innych narządów brzusznych (rysunek 2C).
  5. Wstępnie rozgrzewany RHIT za pomocą podgrzewki włożonej do szczeliny i zabezpieczenia sondy ciepła obok RHIT (rysunek 2G,H), aby utrzymać temperaturę ciała myszy podczas obrazowania.

4. Znakowanie fluorescencyjne i znieczulenie myszy

  1. Zmniejsz stres myszy, dezynfekując komorę indukującą znieczulenie, aby pozbyć się ostatnich śladów zwierzęcego smrodu.
  2. Włącz skraplacz tlenowy, system ochrony środowiska (EPS) oraz parownik izofluranowy.
  3. Umieść mysz w komorze indukcyjnej i znieczulaj z użyciem 2-3% izofluranu przez około 3-5 minut, czyli do momentu, gdy zwierzę wykazuje stabilne oddychanie i utratę odruchu prostego oraz pedału.
    1. Po znieczuleniu przenieś mysz na poduszkę grzewczą i utrzymuj znieczulenie przy użyciu 1-2% izofluranu podanego przez stożek nosowy (Rysunek 2D), dostosowując w razie potrzeby, aby zapewnić stabilną płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego przez cały zabieg.
    2. Ocenić głębokość znieczulenia, wykonując test uszczypania palca, aby obserwować ewentualne dobrowolne ruchy.
  4. Aby oznaczać struktury bogate w lipidy, wstrzyknij 200 nmol BODIPY 665/676 rozcieńczonego w PBS (całkowita objętość 200 μL) przez żyłę ogonową za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 31 G.
    1. Aby uzyskać sygnał optymalny, podawaj BODIPY raz dziennie przez 2 kolejne dni przed badaniem obrazowym. Należy odczekać co najmniej 3-4 godziny po drugim zastrzyku, aby zapewnić systemowe usunięcie tła i stabilizację sygnału tkankowego.
  5. Aby uzyskać kontrast jądrowy, wstrzykni Hoechst 33342 (2 μg/g masy ciała) rozcieńczony w 1x roztworze heparyny (przygotowanej przez wymieszanie 120 μL heparyny z 180 μL soli fizjologicznej, aby uzyskać 400 U/mL) przez zatokę zaostzodołową za pomocą strzykawki insulinowej 31 G.
    UWAGA: Hoechst podaje się osobno, aby uniknąć opadów przy mieszaniu z innymi barwnikami.
  6. Aby zobrazować naczynia, wstrzyknij 18 μg/g fluorescencyjnego dekstranu (70 kDa) rozcieńczonego w tym samym 1x roztworze heparyny opisanym w kroku 4.5, przez zatokę przeciwną zatoku retrooczodołową za pomocą insulinowej strzykawki o masie 31 g (Tabela 2).
    UWAGA: Heparyna jest dodawana, aby zmniejszyć tworzenie zakrzepów i wspierać stały przepływ krwi podczas badań obrazowych.
  7. Poczekaj 10-15 minut po zastrzykach z Hoechst i dektranem, zanim rozpoczniesz operację i badania obrazowe.
Reporter fluorescencyjnyCelDawka na wagę (lub stężenie)
Hoechst 33342Jądra barwiowe2 μg/g: uzupełnienie objętości wtrysku do 50 μl roztworem heparyny
Bodiby 665/676Krople lipidowe barwiące0,8 μg/g: uzupełnienie objętości wtrysku do 200 μl w roztworze soli fizjologicznej
2M tetrametylorodamina-dekstran (Dextran)Naczynia barwione18 μg/g: uzupełnij objętość wtrysku do 50 μl roztworem heparyny

Tabela 2: Opcje reporterów fluorescencjonalnych. Ta tabela zawiera szczegółowy opis metod używanych do znakowania tkanek myszy podczas obrazowania in vivo. Najpierw przygotowuje się roztwór heparyny, a następnie wykorzystuje się do produkcji roztworów DAPI-heparyny i dektranowej heparyny7. Hoechst 33342 jest wstrzykiwane retroorbitalnie do jednego oka, natomiast BODIPY jest podawane bezpośrednio do żyły ogonowej 2-3 dni wcześniej, z wyższym stężeniem u otyłych myszy. Dekstran jest wstrzykany retroorbitalnie do drugiego oka. Ważne jest, aby wykonywać iniekcje retrooczodołowe osobno w każdym oku. Skrót: DAPI = 4', 6-diamidino-2-fenylindol.

5. Zabieg chirurgiczny na myszy

  1. Ogol sierść brzucha za pomocą maszynki do włosów i/lub kremu do usuwania włosów. Usuń osad włosów i użyj 70% etanolu do oczyszczenia odsłoniętej skóry.
    UWAGA: W zależności od wymagań instytucjonalnych IACUC może być stosowane naprzemiennie stosowanie betadyny i etanolu, aby zapewnić odpowiednie przygotowanie miejsca operacji.
  2. Ponownie oceń głębokość znieczulenia przed operacją.
  3. Odsłonić wątrobę, wykonując poziome, półksiężycowe nacięcie o średnicy 2-3 cm pod klatką piersiową nożyczkami chirurgicznymi od ksigłowego mięśnia brzusznego, kończące się po lewej bocznej stronie górnej części brzucha.
  4. Po początkowym nacięciu ostrożnie wykonaj mniejsze drugie nacięcie w warstwie mięśniowej, aby odsłonić lewy płat wątroby, kauteryzuj (opcjonalnie), jeśli to konieczne, aby uniknąć krwawienia (Rysunek 2E).
    1. Zapobiegaj uszkodzeniom cieplnym wątroby podczas stosowania kauteryzatora, umieszczając gazę nasączoną solą fizjologiczną między wątrobą a warstwą mięśniową, aby pochłaniać ciepło wydzielane z warstwy mięśniowej.
    2. Unikaj nadmiernego krwawienia, urazów chirurgicznych lub mechanicznych, albo zewnętrznego ucisku.
  5. Po odsłonięciu wątroby przenieś mysz na etap mikroskopowy.

6. Umieszczenie myszy na scenie mikroskopu

  1. Ustaw odbrzuch znieczulonej myszy skierowany do dołu na platformie RHIT mikroskopu.
    1. Reguluj stożek nosa tak, aby mysz pozostawała pod znieczuleniem.
    2. Użyj aplikatora z bawełnianym końcówką nawilżonym solą fizjologiczną, aby delikatnie manewrować lewym bocznym płatem wątroby przy warstwie pokrywowej, jednocześnie delikatnie naciskając zewnętrznie na jamę piersiową.
      UWAGA: Wykorzystaj grawitację, aby ostrożnie wyprowadzić wątrobę na szybę pokrywową.
    3. Użyj paska gazy, aby delikatnie oddzielić wątrobę od ciała myszy (Rysunek 2E-H).
  2. Sprawdź ponownie stożek nosa, aby upewnić się, że mysz pozostaje pod znieczuleniem podczas badania obrazowego.
  3. Zapobiegaj odwodnieniu tkanek, nakładając żel na bazie wody wokół krawędzi odsłoniętej jamy i unikając bezpośredniego kontaktu z termoforem.
    UWAGA: Utrzymanie temperatury i wilgotności może być również ułatwione przez mikroskop z zamkniętą komorą wilgotności 5,6,7.
  4. Nakładaj maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszaniu rogówki.
  5. Ustaw time-lapse IVM, aby rozpocząć obrazowanie 7,52.
    1. Otwórz migawki laserowe, oceniaj znakowanie fluorescencyjne i zidentyfikuj stabilny obszar zainteresowania z wyraźnym przepływem krwi. Wybierz odpowiednie parametry akwizycji, w tym format obrazu, szybkość przechwytu, interwały obrazowania, całkowity czas akwizycji oraz średnią linii/klatki (512 × 512 pikseli; 1-5 klatek s⁻¹ na region; interwały obrazowania 5-30 s; całkowity czas akwizycji 5-20 min; średnia linia/klatka 2-8, w zależności od wymagań eksperymentalnych). Optymalizuj ekspozycję błyskową fluorescencji, aby dostosować się do użytych fluoroforów.
    2. Zdefiniuj górne i dolne granice dla stosów Z, wybierając stos Z w panelu akwizycji , regulując górne i dolne płaszczyzny ogniskowej za pomocą przycisków pozycji Z i potwierdzając zakres za pomocą Set First/Set Last; następnie rozpocznij nagrywanie time-lapse, klikając Start Experiment (lub Start Acquisition Acquisition)). Po zakończeniu badania obrazowego należy uśpić zwierzę zgodnie z protokołami instytucjonalnej opieki nad zwierzętami i jej użyciem zatwierdzonymi przez komitet.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Pomiar poprawy stabilności wątrobowego IVM RHIT za pomocą SSIM. Wątrobowa dożylna dożylna część lewego dolnego płata wątroby pod trzema warunkami stabilizacyjnymi: (A) brak wkładki (BRAK), (B) wkładka kartonowa oraz (C) RHIT. Tkanki są oznaczane BODIPY (magenta, lipidy), Hoechst 33342 (zielone, jądra) oraz Dextran (cyjan, naczynia); panele A i B wykazują widoczne zniekształcenia i artefakty ruchu, podczas gdy C wykazuje większą klarowność dzięki RHIT. (D) Do ilościowego określenia stabilności obrazu obliczono wskaźnik podobieństwa strukturalnego (SSIM). Słupki pokazują średnią ± SEM, a każda kolorowa kropka reprezentuje indywidualny biologiczny replikat: RHIT (n = 14), Karton (n = 10), No Insert (n = 8). Te grupy to podgrupy wybrane z całkowitej eksperymentalnej kohorty liczącej około 50-70 myszy. Analizowano wyłącznie sesje spełniające określone kryteria obrazowania (np. spójne wyrównanie ramek i jakość obrazu) za pomocą SSIM. RHIT konsekwentnie generował wyższe wartości SSIM (średnia 0,511 ± SEM), co wskazuje na lepszą stabilność i rozdzielczość w różnych warunkach obrazowania. Skala = 15 μm. Pokazane są reprezentatywne obrazy; SSIM odzwierciedla sesje seryjnego IVM bez widocznych uszkodzeń lub zakłóceń tkanek. Skróty: RHIT = Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby; IVM = mikroskopia śródwitalna; SSIM = wskaźnik podobieństwa strukturalnego; CARD = wkładka kartonowa. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RHIT został zaprojektowany przy użyciu aplikacji CAD (Rysunek 1). Wymiary RHIT są skalowane, aby uwzględnić małe, średnie i duże myszy (Tabela 1). Projekt RHIT składa się z płaskiego materiału ABS o długości 107,50 mm z otworem dostosowanym do obrazowania wątroby. IVM wykonywano w warunkach optymalnych (RHIT) i suboptymalnych (bez wkładek lub kartonu) (patrz Rysunek 3A-C). To ilustruje zakres możliwych wyników oraz stopień stabi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia wewnątrzżyciowa wątroby była szeroko badana, jednak wcześniejsze metody często wymagały wysoce inwazyjnych i niestandaryzowanych zabiegów chirurgicznych w celu stabilizowanego obrazowania końcowego 5,6,7,9,31,32. Ruch jest prawdopodobnie najtrudniejszą barierą uniemożliwiającą powtarzalne obrazowanie w wątrobowym ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Intramural Research Program w US National Institutes of Health, National Cancer Institute oraz bibliotekę NIH. H. Sanchez Cornejo dziękuje peruwiańskiej agencji CONCYTEC za wsparcie finansowe w formie grantu nr PE501087367-2024-PROCIENCIA. Chcemy podziękować członkom laboratorium Porat-Shliom oraz współpracownikom grupy fizyki kwantowej na Uniwersytecie Cambridge za krytyczną lekturę, pracownikom biblioteki NIH oraz Geneti Gaga za pomoc techniczną. Obraz wyrenderowany 3D na Rysunku 2A został stworzony za pomocą Biorender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Taśma maskująca ½calowaTaśma maskująca 3M uniwersalna:b40069428
Pokrywki 40 mmBioptech40-1313-03191
70% (v/v) etanoluThermo Fisher ScientificBP2818-470% etanolu objętościowo i 30% wody objętościowej
Aparat do znieczulenia: AMD 3 PlusSomniAMD-17106
Żel transmisji ultradźwiękowej Aquasonic 100Laboratoria Parkera  01 08
BODIPY 665/67Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)B3932Zobacz Tabelę 2
Oprogramowanie CAD (Autodesk Inventor lub odpowiednik)  Autodesk (reprezentatywne oprogramowanie CAD)Nie maOprogramowanie
System kauteriiGeminiGEM 5917
Środek dezynfekuujący ClidoxPharmacal Research Laboratories Inc.VWR, MSPP-96118F
Mikroskop konfokalny (Leica SP8 lub odpowiednik)LeicaSP8
Aplikatory z bawełnianymi końcówkamiPuritańskie Produkty Medyczne25-806 1WC
Niestandardowa aluminiowa wkładka sceniczna (3 mm grubości, 35 mm wgłębienia)Nie maNie ma
FORANE (izofluran, USP) płyn do inhalacji, 250 mLBaxter10019-360-60
Maszynka do strzyżenia włosów (opcjonalnie)Onyx Fine InstrumentsASWRHC
Poduszka grzewcza z sondą odbytnicząInstrumenty naukowe ALAPODKŁADKA GRZEWCZA-1/2
Heparyna sodowa, 1000 USP U/mLHikma0641-0391-12
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)62249Zobacz Tabelę 2
Podkładka grzewcza do myszyInstrumenty naukowe ALAPODKŁADKA GRZEWCZA-1/2
Mus musculusLaboratorium JacksonaC57BL/6Mysz laboratoryjna
Sól fizjologiczna (0,9% chlorku sodu)Thermo Fisher Scientific7210-16
RHIT (Reuseable Hepatic Imaging Tool) – odpowiedni rozmiarDostarczoneNie maZobacz Tabelę 1
Szczypce chirurgiczne, zakrzywiony koniecNarzędzia Nauki Ścisłej11251-23
Gaza chirurgicznaMcKesson6939
Nożyczki chirurgiczneNarzędzia Nauki Ścisłej14001-14
Tetrametylorodamina DextranThermo Fisher Scientific (Invitrogen)D7139Zobacz Tabelę 2
Ultra Fine Strzykawki U-100 Insuliny, 31 gBetty MillsBD326730

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scheele, C. L. G. J., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 89(2022).
  2. Hor, J. L., Germain, R. N. Intravital and high-content multiplex imaging of the immune system. Trends Cell Biol. 32 (5), 406-420 (2022).
  3. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  4. Meyer, K., et al. A predictive 3D multi-scale model of biliary fluid dynamics in the liver lobule. Cell Syst. 4 (3), 277-290.e9 (2017).
  5. Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
  6. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  7. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  8. Zhang, X. Y., Sun, C. K., Wheatley, A. M. A novel approach to the quantification of hepatic stellate cells in intravital fluorescence microscopy of the liver using a computerized image analysis system. Microvasc Res. 60 (2), 232-240 (2000).
  9. Gola, A., et al. Commensal-driven immune zonation of the liver promotes host defence. Nature. 589 (7840), 131-136 (2021).
  10. Kamoun, W. S., Schmugge, S. J., Kraftchick, J. P., Clemens, M. G., Shin, M. C. Liver microcirculation analysis by red blood cell motion modeling in intravital microscopy images. IEEE Trans Biomed Eng. 55 (1), 162-170 (2008).
  11. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2020).
  12. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  13. Soulet, D., Lamontagne-Proulx, J., Aube, B., Davalos, D. Multiphoton intravital microscopy in small animals: motion artefact challenges and technical solutions. J Microsc. 278 (1), 3-17 (2020).
  14. Mempel, T. R., Bauer, C. A. Intravital imaging of CD8+ T cell function in cancer. Clin Exp Metastasis. 26 (4), 311-327 (2009).
  15. Lee, S., Courties, G., Nahrendorf, M., Weissleder, R., Vinegoni, C. Motion characterization scheme to minimize motion artifacts in intravital microscopy. J Biomed Opt. 22 (3), 036005(2017).
  16. Rhodes, G. J. Surgical preparation of rats and mice for intravital microscopic imaging of abdominal organs. Methods. 128 (1), 129-138 (2017).
  17. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  18. Davis, R. P., et al. Optimization of in vivo imaging provides a first look at mouse model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) using intravital microscopy. Front Immunol. 10 (1), 2988(2019).
  19. Dawson, C. A., et al. Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue. Nat Protoc. 16 (4), 1907-1935 (2021).
  20. Murphy, K. J., Reed, D. A., Trpceski, M., Herrmann, D., Timpson, P. Quantifying and visualising the nuances of cellular dynamics in vivo using intravital imaging. Curr Opin Cell Biol. 72 (1), 41-53 (2021).
  21. Pereira, E. N. G. dS., et al. Hepatic microvascular dysfunction and increased advanced glycation end products are components of non-alcoholic fatty liver disease. PLoS One. 12 (6), e0179654(2017).
  22. Stefkovich, M. L., Kang, S. W. S., Porat-Shliom, N. Intravital microscopy for the study of hepatic glucose uptake. Curr Protoc. 1 (1), e139(2021).
  23. Lu, Z., et al. Long-term intravital subcellular imaging with confocal scanning light-field microscopy. Nat Biotechnol. 43 (4), 569-580 (2025).
  24. Lu, Z., et al. A practical guide to scanning light-field microscopy with digital adaptive optics. Nat Protoc. 17 (8), 1953-1979 (2022).
  25. Zhang, Y., et al. Computational optical sectioning with an incoherent multiscale scattering model for light-field microscopy. Nat Commun. 12 (1), 6391(2021).
  26. Zhao, Z., et al. Two-photon synthetic aperture microscopy for minimally invasive fast 3D imaging of native subcellular behaviors in deep tissue. Cell. 186 (11), 2475-2491.e22 (2023).
  27. Lu, Z., et al. Virtual-scanning light-field microscopy for robust snapshot high-resolution volumetric imaging. Nat Methods. 20 (5), 735-746 (2023).
  28. Chen, S., et al. Hepatocyte-specific Mas activation enhances lipophagy and fatty acid oxidation to protect against acetaminophen-induced hepatotoxicity in mice. J Hepatol. 78 (3), 543-557 (2023).
  29. Chen, S., et al. Myeloid-Mas signaling modulates pathogenic crosstalk among MYC+CD63+ endothelial cells, MMP12+ macrophages, and monocytes in acetaminophen-induced liver injury. Adv Sci. 11 (1), 2306066(2024).
  30. Wu, J., et al. Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale. Cell. 184 (12), 3318-3332 (2021).
  31. Benechet, A. P., Ganzer, L., Iannacone, M. Intravital microscopy analysis of hepatic T cell dynamics. Methods Mol Biol. 1514 (1), 49-61 (2017).
  32. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital microscopy imaging of the liver following Leishmania infection: an assessment of hepatic hemodynamics. J Vis Exp. 98 (1), e52303(2015).
  33. Heymann, F., et al. Long-term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (98), e52607(2015).
  34. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128 (1), 12-19 (2017).
  35. Wang, J., Kubes, P. A reservoir of mature cavity macrophages that can rapidly invade visceral organs to affect tissue repair. Cell. 165 (3), 668-678 (2016).
  36. Wang, Y., Wang, J. Intravital imaging of inflammatory response in liver disease. Front Cell Dev Biol. 10 (1), 922041(2022).
  37. Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
  38. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  39. Liu, T. W., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, D. Multi-modal multi-spectral intravital microscopic imaging of signaling dynamics in real time during tumor-immune interactions. Cells. 10 (3), 499(2021).
  40. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  41. Kuss, M., Crawford, A. J., Alimi, O. A., Hollingsworth, M. A., Duan, B. Three-dimensional printed abdominal imaging windows for in vivo imaging of deep-lying tissues. Machines. 10 (8), 697(2022).
  42. Xie, W., et al. 3D-printed lightweight dorsal skin fold chambers from PEEK reduce chamber-related animal distress. Sci Rep. 12 (1), 11599(2022).
  43. Burkovskiy, I., Lehmann, C., Jiang, C., Zhou, J. Utilization of 3D printing for an intravital microscopy platform to study the intestinal microcirculation. J Microsc. 264 (3), 224-226 (2016).
  44. Urciuolo, A., et al. Intravital three-dimensional bioprinting. Nat Biomed Eng. 4 (8), 901-915 (2020).
  45. Dul, S., Gutierrez, B. J. A., Pegoretti, A., Alvarez-Quintana, J., Fambri, L. 3D printing of ABS nanocomposites: comparison of processing and effects of multi-wall and single-wall carbon nanotubes on thermal, mechanical and electrical properties. J Mater Sci Technol. 121 (1), 52-66 (2022).
  46. Stansbury, J. W., Idacavage, M. J. 3D printing with polymers: challenges among expanding options and opportunities. Dent Mater. 32 (1), 54-64 (2016).
  47. Ligon, S. C., Liska, R., Stampfl, J., Gurr, M., Mulhaupt, R. Polymers for 3D printing and customized additive manufacturing. Chem Rev. 117 (15), 10212-10290 (2017).
  48. Das, A., et al. Current understanding and challenges in high-temperature additive manufacturing of engineering thermoplastic polymers. Addit Manuf. 34 (1), 101218(2020).
  49. Turaka, S., Jagannati, V., Pappula, B., Makgato, S. Impact of infill density on morphology and mechanical properties of 3D-printed ABS/CF-ABS composites using design of experiments. Heliyon. 10 (9), e29920(2024).
  50. Ahmad, M. N., Yahya, A. Effects of 3D printing parameters on mechanical properties of ABS samples. Designs. 7 (6), 136(2023).
  51. Nguyen, T. T., Tran, V. T., Nguyen, V., Nguyen, V. T. T. Effect of infill ratios in SLA 3D printing on mechanical properties of castable wax patterns for molded shells in investment casting. PLoS One. 20 (2), e0311245(2025).
  52. Acevedo-Acevedo, S., et al. LKB1 acts as a critical brake for the glucagon-mediated fasting response. Hepatol Commun. 6 (7), 1949-1961 (2022).
  53. Wang, Z., Bovik, A. C., Sheikh, H. R., Simoncelli, E. P. Image quality assessment: from error visibility to structural similarity. IEEE Trans Image Process. 13 (4), 600-612 (2004).
  54. Madhav, B. T. P., Rao, M. V. G., Pisipati, V. G. K. M. Identification of liquid crystalline phases in 7O.O9 compound based on structural similarity index measure. Liq Cryst. 42 (2), 198-203 (2015).
  55. Zhou, W., Bovik, A. C. A universal image quality index. IEEE Signal Process Lett. 9 (1), 81-84 (2002).
  56. Winkler, S. Human Vision and Electronic Imaging IV. , 175-184 (1999).
  57. Alizadeh-Tabrizi, N., Hall, S., Lehmann, C. Intravital imaging of pulmonary immune response in inflammation and infection. Front Cell Dev Biol. 8 (1), 620471(2020).
  58. Matsumoto, S., Kikuta, J., Ishii, M. Intravital Imaging of Dynamic Bone and Immune Systems: Methods and Protocols. Ishii, M. , 137-143 (2018).
  59. Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145(2012).
  60. Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (5), 551-558 (2013).
  61. Courson, J. A., Langlois, K. W., Lam, F. W. Intravital microscopy to study platelet-leukocyte-endothelial interactions in the mouse liver. J Vis Exp. 188 (1), e64239(2022).
  62. de Paz, J. L., et al. Profiling heparin-chemokine interactions using synthetic tools. ACS Chem Biol. 2 (11), 735-744 (2007).
  63. Taqueti, V. R., Jaffer, F. A. High-resolution molecular imaging via intravital microscopy: illuminating vascular biology in vivo. Integr Biol (Camb). 5 (3), 278-290 (2013).
  64. Freund, J. B., Goetz, J. G., Hill, K. L., Vermot, J. Fluid flows and forces in development: functions, features and biophysical principles. Development. 139 (7), 1229-1245 (2012).
  65. Tabira, K., et al. An in vitro study of digital impressions and three-dimensional printed models of orbital defects using mobile devices and monoscopic photogrammetry. J Oral Sci. 65 (2), 127-130 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Narz dzie wydrukowane w technologii 3Dobrazowanie w trobywielorazowe urz dzenie do obrazowaniastabilizacja tkankimikroskopia konfokalnaobrazowanie kropel lipidowychchirurgia myszypowtarzalno obrazuwska nik podobie stwa strukturalnego

Powiązane artykuły