Artykuł metodologiczny

Genetycznie kodowane biosensory na bazie fluoroforu do ratiometrycznego obrazowania fluorescencyjnego u drobnoustrojów

DOI:

10.3791/68339

⸱

1 sierpnia 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 2Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de Málaga, 3Institute of Cell and Interaction Biology, Heinrich-Heine Universität Düsseldorf, 4Université de Lyon, INSA Lyon, CNRS, Université Claude Bernard Lyon 1

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje zastosowanie genetycznie kodowanych biosensorów opartych na fluoroforze w mikrobach do ilościowego ratiometrycznego obrazowania fluorescencyjnego w kontrolowanych warunkach. Dzięki zintegrowaniu tych strategii biodetekcji z zaawansowanymi technikami obrazowania, metoda ta umożliwia analizę w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki, zapewniając głębszy wgląd w dynamikę małych cząsteczek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie dynamiki małych cząsteczek w mikroorganizmach jest niezbędne do kompleksowych badań funkcji mikroorganizmów. Zarówno wewnątrzorganizmowa, jak i międzyorganizmowa dynamika małych cząsteczek odgrywa kluczową rolę w fizjologii drobnoustrojów, symbiozie i chorobach. Jednak monitorowanie tej dynamiki pozostaje dużym wyzwaniem przy użyciu większości istniejących technik. Genetycznie kodowane bioczujniki oparte na fluoroforze są potężnymi narzędziami do śledzenia dynamiki małych cząsteczek in vivo i mają duży potencjał w zakresie nowych odkryć. Te biosensory są najczęściej stosowane w obrazowaniu fluorescencyjnym, często w połączeniu z urządzeniami perfuzyjnymi, które umożliwiają precyzyjną kontrolę warunków środowiskowych. Po zintegrowaniu z zaawansowanymi technikami obrazowania, podejście to zapewnia dane o wysokiej rozdzielczości, rozdzielczości przestrzennej i czasowej, umożliwiając wgląd w reakcje mikrobiologiczne pojedynczych komórek. Pomimo obiecujących założeń, wdrożenie takich bioczujników pozostaje wyzwaniem technicznym. Zrozumienie kluczowych kroków ma kluczowe znaczenie dla szerszego przyjęcia. W tym miejscu przedstawiamy protokół opracowany w celu wsparcia skutecznego wdrażania nowo zaprojektowanych bioczujników w mikroorganizmach do ilościowego ratiometrycznego obrazowania fluorescencyjnego w kontrolowanych warunkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biosensory oparte na intensywności pojedynczego fluoroforu i podwójnego fluoroforu są szeroko stosowane przez badaczy do różnych zastosowań1. W niektórych badaniach wykorzystano analizy biosensorów multipleksowych do jednoczesnego śledzenia wielu sygnałów w tych samych komórkach2. Wiele z tych bioczujników opiera się na domenach wiążących ligandy, w których zdarzenia wiązania indukują zmiany konformacyjne, które zmieniają właściwości fluorescencyjne3,4. Genetycznie kodowane biosensory stały się niezbędnymi narzędziami do obrazowania in vivo w wielu systemach5, umożliwiając monitorowanie poziomów jonów i metabolitów w czasie i przestrzeni w wysokiej rozdzielczości1. Wczesne biosensory były jednak ograniczone pod względem zakresu dynamiki i stosunku sygnału do szumu (SNR)6. Niedawne postępy w dziedzinie biosensorów intensiometrycznych z pojedynczym fluoroforem opartych na konformacyjnie wrażliwych białkach fluorescencyjnych (csFP) znacznie poprawiły wydajność. Niemniej jednak różnice w poziomach ekspresji białek mogą wpływać na pomiary in vivo przy użyciu genetycznie kodowanych biosensorów opartych na fluoroforze6, które są powszechnie stosowane do wizualizacji cząsteczek sygnałowych i metabolitów w żywych komórkach7,8. Biosensory intensiometryczne z pojedynczym fluoroforem nie pozwalają na normalizację poziomów ekspresji biosensorów, które mogą ulegać wahaniom in vivo. Włączenie referencyjnego białka fluorescencyjnego może jednak przekształcić biosensory z pojedynczym fluoroforem w wersje ratiometryczne z podwójnym fluoroforem, umożliwiając bardziej wiarygodne oceny ilościowe9. Ze względu na straty energii w procesach nieradiacyjnych, widmo emisji fluorescencji jest przesunięte względem widma absorpcyjnego, zjawisko znane jako przesunięcie Stokesa10. Duże białka fluorescencyjne z przesunięciem Stokesa (LSSFP) zostały zastosowane jako optymalne fluorofory referencyjne w biosensorach ratiometrycznych z podwójnym fluoroforem9,11. Najnowszym osiągnięciem jest opracowanie monochromatycznie pobudliwych biosensorów Matrioszki Green-Apple (GA), znanych jako GA-MatryoshCaMP6s, które zawierają czerwony LSSFP, zwany LSSmApple12. W połączeniu z mikrourządzeniami, takimi jak systemy mikroprzepływowe, genetycznie kodowane bioczujniki oparte na fluoroforze oferują minimalnie inwazyjne podejście do ilościowego obrazowania ratiometrycznego przy użyciu technik takich jak mikroskopia konfokalna. Ta integracja umożliwia szybkie obrazowanie i monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki małych cząsteczek w pojedynczych komórkach w warunkach stresu środowiskowego. Na przykład biosensory cAMP i glukozy zostały z powodzeniem zastosowane w drożdżach. W połączeniu ze zmutowanymi szczepami, te bioczujniki pomogły wyjaśnić kluczowe sieci regulacyjne rządzące pobieraniem cukru13,14. Pomimo znacznego postępu, technologie te nie osiągnęły jeszcze pełnego potencjału do badania krytycznych zagadnień biologicznych dotyczących dynamiki małych cząsteczek in vivo15. W związku z tym ich powszechne zastosowanie w laboratoriach pozostaje ograniczone, a ustandaryzowane metodologie do szerszego wdrożenia nadal są niestandardowe.

W porównaniu do tradycyjnych metodologii opierających się na nieratiometrycznych biosensorach z pojedynczym fluoroforem lub pomiarach na poziomie masowym, nasz protokół oparty na biosensorach GA Matryoshka umożliwia obrazowanie pojedynczych komórek o wysokiej rozdzielczości z ilościową analizą ratiometryczną. Integrując duży fluorofor z przesunięciem Stokesa jako wewnętrzne odniesienie, metoda kompensuje zmienność ekspresji biosensorów, co było kluczowym ograniczeniem wcześniejszych projektów. Dodatkowo, połączenie z urządzeniami mikroprzepływowymi pozwala na precyzyjną kontrolę warunków środowiskowych, oferując poprawę w porównaniu z konwencjonalnymi komorami perfuzyjnymi lub statycznymi systemami hodowli12. Podejście to zapewnia również wyraźne korzyści w badaniu dynamicznych interakcji między drobnoustrojami a ich gospodarzami, takich jak interakcje roślina-patogen i symbiotyczne asocjacje, takie jak mikoryzy, w przypadku których rozdzielczość przestrzenna i czasowa na poziomie komórkowym jest niezbędna do odkrycia molekularnych mechanizmów komunikacji i wymiany składników odżywczych.

W tym kontekście, przedstawiamy szczegółowy protokół krok po kroku do ratiometrycznego obrazowania biosensorów u mikrobów. Chociaż protokół ten jest specjalnie zoptymalizowany do wdrożenia u drożdży, może być dostosowany do stosowania w innych drobnoustrojach, w tym bakteriach, i rozszerzony na organizmy niemodelowe, takie jak drobnoustroje związane z roślinami. Na przykład bioczujniki mogą być używane w połączeniu z systemami mikroprzepływowymi do ilościowego obrazowania fluorescencyjnego sygnalizacji wapniowej u drożdży, umożliwiając monitorowanie reakcji wapnia w czasie rzeczywistym pod wpływem stresu środowiskowego14.

Ten protokół ma na celu pomóc badaczom w efektywnym wdrażaniu nowo zaprojektowanych biosensorów, a tym samym przyspieszyć eksplorację procesów biologicznych poprzez obrazowanie fluorescencyjne oparte na biosensorach w systemach mikrobiologicznych. Zawiera praktyczne zalecenia dotyczące warunków hodowli drożdży, optymalnych ustawień wzbudzenia/emisji oraz kompatybilności z powszechnie stosowanymi szczepami drożdży (np. K601 i W303-1A MAT-a). Godne uwagi ograniczenia obejmują fotowybielanie podczas długotrwałych sesji obrazowania oraz wyzwania związane z ekspresją biosensorów w próbkach biologicznych. Ponieważ wiele czynników może wpływać na wynik eksperymentów z obrazowaniem biosensorów in vivo, ten protokół krok po kroku ma również na celu pomóc naukowcom w przewidywaniu i pokonywaniu potencjalnych wyzwań, ułatwiając w ten sposób powtarzalne implementacje.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Racjonalne projektowanie biosensorów ratiometrycznych (Rysunek 1)

UWAGA: Interesujące białko wiążące jest wybierane jako domena sensoryczna na podstawie odpowiednich kryteriów, w tym (i) specyficzności, (ii) powinowactwa, (iii) informacji strukturalnych i (iv) rearanżacji konformacji po związaniu liganda. Specyficzność zapewnia, że bioczujnik selektywnie reaguje na cząsteczkę docelową bez reaktywności krzyżowej. Uważa się, że powinowactwo jest zgodne z oczekiwanym zakresem stężeń cząsteczki docelowej w kontekście biologicznym. Informacje strukturalne, pochodzące z danych eksperymentalnych lub modeli obliczeniowych, takich jak te generowane przez AlphaFold, zapewniają wgląd w trójwymiarową organizację domeny sensorycznej i zmiany konformacyjne wywołane przez ligand. Te spostrzeżenia są wykorzystywane do identyfikacji odpowiednich punktów wprowadzania fluoroforów. Następnie opracowywana jest strategia walidacji w celu oceny responsywności i zakresu dynamicznego biosensora, w zależności od zamierzonych zastosowań.

  1. Skonstruuj projekt Matrioszki in silico, wstawiając kasetę Green-Apple Matryoshka12 do domeny sensorycznej w taki sposób, że krążenie permutowane Zielone Białko Fluorescencyjne (cpGFP), które jest wrażliwe na zmiany konformacyjne, reaguje na indukowane wiązaniem ligandów rearanżacje domeny czuciowej.
    1. Użyj oprogramowania do wizualizacji molekularnej, takiego jak Chimera, aby przeanalizować strukturę domeny wiązania. Jeśli struktura trójwymiarowa nie jest dostępna, użyj AlphaFold, aby wygenerować wiarygodny model.
    2. Zidentyfikuj elastyczne pętle w strukturze białka jako słabe punkty i potencjalne miejsca insercji dla kasety z podwójnym fluoroforem, wybrane tak, aby uniknąć zakłócenia ogólnej funkcji lub stabilności białka.
    3. Użyj ponownie AlphaFold, aby przewidzieć strukturę białka chimerycznego zawierającego wstawioną kasetę dual-FP, potwierdzając, że insercja nie wprowadza niekorzystnych zmian strukturalnych.
    4. Sklonuj konstrukty biosensora w plazmidowe DNA, które umożliwia ekspresję w komórkach drożdży. W szczególności należy wprowadzić gen kodujący nowo zaprojektowany bioczujnik do wektora wahadłowego drożdży pAG416, który zawiera odpowiednie elementy do ekspresji drożdży, przy użyciu odpowiedniej techniki klonowania12,13,14.
    5. Po sklonowaniu przekształć rekombinowany plazmid w komórki bakteryjne w celu amplifikacji plazmidowego DNA. Użyj oczyszczonego plazmidowego DNA do transformacji drożdży.
    6. Wprowadź oczyszczony plazmid do komórek drożdży poprzez transformację za pośrednictwem glikolu polietylenowego (PEG), jak opublikowano16. Komórki drożdży transformowane płytkowo na pożywce z niedoborem uracylu, która selekcjonuje dodatnie klony zawierające plazmid przenoszący marker selekcyjny URA3.

2. Przygotowanie próbki

  1. Transformanty drożdżowe z ekspresją GA-Matrioszki należy rozmieścić na selektywnych płytkach pożywki (tj. SC-Ura) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni, aby umożliwić wzrost kolonii.
    UWAGA: Szczep drożdży jest nosicielem auksotrofii ura3, która jest uzupełniona przez gen URA3 na plazmidzie, umożliwiając selekcję na pożywkach z niedoborem uracylu. Plazmid kodujący biosensor zawiera kasetę, która uzupełnia auksotrofię (np. pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6s).
  2. Wytwarzanie transformantów drożdżowych ze szczepu K601/W303-1A MAT-a (genotyp: ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1-1 leu2-3 leu2-112 can1-100). Wykonaj transformację za pomocą wektora wyrażenia powszechnie używanego dla Saccharomyces cerevisiae, takiego jak pAG41612.
  3. Po przemianie hodować komórki drożdży w temperaturze 30 °C na pożywce SC-Ura, przygotowanej na litr w następujący sposób, aż pojawią się niezależnie przekształcone kolonie: 0,77 g CSM-Ura, 6,7 g drożdżowej zasady azotowej (YNB) z siarczanem amonu, 20 g glukozy, 20 g agaru i adeniny dodane do końcowego stężenia 150 μM.
  4. Przygotuj kompetentne komórki drożdży i przeprowadź transformację za pośrednictwem PEG 3350 zgodnie z ustalonym protokołem16.
  5. W przypadku eksperymentów z pułapką mikroprzepływową należy rozprowadzić 25% zapasów glicerolu na płytkach SC-Ura i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2 dni, aby umożliwić wzrost niezależnych pojedynczych kolonii. Zawiesić poszczególne kolonie w 5 ml płynnej pożywki SC-Ura i inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem, aż OD600 osiągnie 0,5-1,0, dzięki czemu nadają się do załadowania do systemu perfuzyjnego.

3. Przygotowanie systemu perfuzyjnego (Rysunek 2)

  1. Przygotuj płytkę mikroprzepływową dla haploidalnych komórek drożdży, ładując ją 50 μl komórek drożdży eksprymujących biosensory GA-Matrioszka, wraz z końcową pożywką SC-Ura do wzrostu i roztworem buforowym do leczenia (np. NaCl lub sorbitol).
    1. Usuń roztwór do przechowywania ze studzienek 1-8. Odessać roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) ze studzienek i dodać 400 μl sterylnej wody.
    2. Umyj studzienki 1-6 i 8. Mycie 1: Odessać sterylny roztwór wodny ze studzienek 1-8 i dodać 400 μl sterylnej wody. Pranie 2: Powtórz pranie, odsysając i dodając 400 μl sterylnej wody. Mycie 3: Powtórz jeszcze raz z 400 μl sterylnej wody.
    3. Końcowe napełnienie studzienek 1-6: Odessać roztwór wodny i dodać 300 μl końcowych roztworów perfuzyjnych/wzrostowych, takich jak SC-Ura do wzrostu drożdży lub buforowego roztworu zawierającego anality będące przedmiotem zainteresowania do obróbki.
    4. Ładowanie komórek w studzience 8: Dodać 50 μl zawiesiny komórek drożdży (OD600=0,5-1,0).
  2. Uszczelnij płytki kolektorem platformy mikroprzepływowej z kontrolowaną temperaturą i podłącz go do systemu obrazowania żywych komórek. Kolektory utrzymują stabilne środowisko termiczne w temperaturze 28 °C, a rurki i pompa zapewniają prawidłowe uszczelnienie i ciągłą perfuzję.
    1. Dopasuj płytkę do kolektora. Włącz odkurzacz. Włącz platformę mikroprzepływową.
    2. Naciśnij Seal i poczekaj, aż zaświeci się zielone światło. Otwórz oprogramowanie platformy mikroprzepływowej, utwórz nowy eksperyment i wybierz z listy rozwijanej odpowiednią płytkę drożdżową.
    3. Kliknij przycisk Uruchom sekwencję zalewania cieczą. Kliknij przycisk Uruchom sekwencję ładowania komórek, aby załadować komórki drożdży ze studzienki 8 do komory hodowlanej, gdzie zostaną uwięzione i będą hodowane pod ciągłą perfuzją selektywnej pożywki SC-Ura przez noc w temperaturze 10 kPa w temperaturze 28 °C.
    4. Na karcie Tryb ręczny kliknij opcję Uruchom sekwencję niestandardową lub użyj Edytora protokołu, aby ustawić parametry eksperymentalne, takie jak temperatura przy 30 °C, natężenie przepływu przy 10 kPa, czas trwania kroku (np. 10 min) i kanały do otwarcia dla perfuzji.
  3. Hodować komórki przez noc w komorze hodowlanej pod ciągłą perfuzją z selektywną pożywką SC-Ura w temperaturze 28 °C i pod ciśnieniem 10-17 kPa.

4. Ratiometryczne obrazowanie fluorescencyjne (Rysunek 3, Rysunek 4 i Wideo 1)

  1. Oceń wzrost komórek i fluorescencję za pomocą szybkiej wizualizacji mikroskopowej.
    1. Umieść płytkę mikroprzepływową na stoliku mikroskopu odwróconego. Skoncentruj się na środku obszaru wyświetlania, aby zlokalizować komórki.
    2. Użyj mikroskopii jasnego pola i/lub mikroskopii fluorescencyjnej, aby ocenić morfologię komórek, żywotność i ekspresję biosensorów.
  2. Zbadaj dynamikę stanu ustalonego wapnia w precyzyjnie kontrolowanych warunkach, korzystając z systemu mikroprzepływowego i kompatybilnych płytek mikroprzepływowych4,12,13,14.
  3. Obrazowanie żywych komórek można wykonać za pomocą odwróconego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego o powiększeniu 100x i aperturze numerycznej (NA) 1,40. Monitoruj biosensory z podwójnym fluoroforem za pomocą pobudzania GFP i LSSmApple przy długości fali 488 nm za pomocą lasera argonowego. Zbierz sygnały emisyjne przy długości fali 520 nm dla GFP i 610 nm dla LSSmApple (Rysunek 5) i przeprowadź eksperymenty ratiometrycznego obrazowania fluorescencyjnego w celu ilościowego określenia dynamicznych odpowiedzi biosensora. Zmierz stosunek intensywności emisji (GFP/LSSmApple) w czasie, aby monitorować zmiany wywołane analitem.

5. Analiza obrazu za pomocą oprogramowania open-source (Rysunek 6)

  1. Pobierz CellProfiler lub inne podobne oprogramowanie z oficjalnego repozytorium i zainstaluj je na lokalnej stacji roboczej.
  2. Uporządkuj obrazy z poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w kolejności sekwencyjnej (np. img_001.tif, img_002.tif itp.), aby zapewnić zgodność z automatycznym przetwarzaniem wsadowym.
  3. Uruchom oprogramowanie i zainicjuj nowy potok analizy, wybierając pozycję Nowy projekt. Zaimportuj sekwencję obrazów poklatkowych do obszaru roboczego potoku.
  4. Włącz moduł IdentifyPrimaryObjects, aby wykrywać pojedyncze komórki w każdej ramce na podstawie sygnału fluorescencji lub kryteriów morfologicznych.
  5. Dodaj moduł TrackObjects, aby ustanowić czasowe powiązania między komórkami w ramkach, umożliwiając śledzenie pojedynczych komórek w czasie.
  6. Dołącz moduł MeasureObjectIntensity do ilościowego określenia parametrów intensywności fluorescencji (np. średniej, mediany i intensywności zintegrowanej) dla każdej śledzonej komórki.
  7. Użyj modułu ExportToSpreadsheet, aby skompilować i wyeksportować dane ilościowe do formatu tabelarycznego (np. CSV) w celu dalszej analizy.
  8. Analizuj wyeksportowane dane za pomocą narzędzi statystycznych lub do wizualizacji danych, takich jak arkusze kalkulacyjne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby osiągnąć sukces w obrazowaniu ratiometrycznym biosensorów w systemach mikrobiologicznych, należy sprostać kilku wyzwaniom technicznym.

System ekspresji: Pierwszym wyzwaniem jest wybór systemu ekspresji; czy oparty na plazmidach, zintegrowany chromosomalnie, napędzany przez konstytutywne lub indukowalne promotory, z subkomórkowymi znacznikami celowania lub bez nich. Czynniki te mogą znacząco wpływać na stabilność, toksyczność i lokalizację biosensora w komórkach (Rysunek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetycznie kodowane bioczujniki oparte na fluoroforze umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym stężeń analitu wewnątrzkomórkowego w żywych komórkach1. Te bioczujniki zazwyczaj działają poprzez przekształcanie zmian konformacyjnych w sygnały optyczne, które można wykryć zarówno ratiometrycznie, jak i intensywnie. Bioczujniki intensiometryczne opierają się na zmianach intensywności fluorescencji z pojedynczego FP, dzięki czemu są wrażliwe na zmiany obfitości biosensorów, co prowadzi do poten...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te badania zostały sfinansowane przez Katedrę Młodszej Profesury z francuskiej "Agence National de la Recherche (ANR)- PROJET N° ANR-24-CPJ1-0014-01to M.S. i wspierane przez granty z hiszpańskiej "Agencia Estatal de Investigación (AEI), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades" (TED2021-129691B-I00), a także stypendium Uniwersytetu w Maladze (B1-2022_03) przyznane V.C.R. Chcielibyśmy podziękować Centrum Zaawansowanego Obrazowania (CAi) Uniwersytetu Heinricha Heinego oraz Centrum Obrazowania Wieloskalowego w Lyonie (LyMIC) z Uniwersytetu w Lyonie za owocną dyskusję na temat obrazowania biosensorowego i/lub dostępu do systemów mikroskopowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarSigma-Aldrich Co.A5306-250G
CellASIC ONIX płytka do haploidalnych komórek drożdży Merck KGaAY04C-02-5PK
CellASIC ONIX2Merck KGaACAX2-S0000
CSM-UraThermo Fisher Scientific11387899
D-glukozaSigma-Aldrich Co.G8270-100G
D-SorbitolSigma-Aldrich Co.S1876-10MG
NaClSigma-Aldrich Co.S9888-25G
pAG416 GPD GA-MatryoshCaMP6sNA7Do ekspresji GA-MatryoshCaMP6s w drożdżach
TCS SP8 STEDLeicaNA
Szczep drożdży K601 / W303-1A MAT-aNA8ade2-1 ura3-1 his3-11 trp1- 1 leu2-3 leu2-112 can1-100
YNBBocaScientificGCM16.0500
α-Mating Factor octanowa sólSigma-Aldrich Co.T6901-.5MG

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38, 2833-2841 (2009).
  2. Mehta, S., et al. Single-fluorophore biosensors for sensitive and multiplexed detection of signalling activities. Nat Cell Biol. 20, 1215-1225 (2018).
  3. Deuschle, K., et al. Rapid metabolism of glucose detected with FRET glucose nanosensors in epidermal cells and intact roots of Arabidopsis RNA-silencing mutants. Plant Cell. 18, 2314-2325 (2006).
  4. Kaper, T., Lager, I., Looger, L. L., Chermak, D., Frommer, W. B. Fluorescence resonance energy transfer sensors for quantitative monitoring of pentose and disaccharide accumulation in bacteria. Biotechnol Biofuels. 1, 1-10 (2008).
  5. Yoshinari, A., et al. Using genetically encoded fluorescent biosensors for quantitative in vivo imaging. Arabidopsis Protoc. , 303-322 (2021).
  6. Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1833, 1787-1797 (2013).
  7. Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiol. 187, 485-503 (2021).
  8. Frei, M. S., Mehta, S., Zhang, J. Next-generation genetically encoded fluorescent biosensors illuminate cell signaling and metabolism. Ann Rev Biophys. 53 (1), 275-297 (2024).
  9. Ast, C., et al. Ratiometric Matryoshka biosensors from a nested cassette of green-and orange-emitting fluorescent proteins. Nat Commun. 8, 431(2017).
  10. Stokes, G. G. On the change of refrangibility of light. , Philosoph Transact Royal Soc London. 463-562 (1852).
  11. Santos, E. M., et al. Design of Large Stokes Shift Fluorescent Proteins Based on Excited State Proton Transfer of an Engineered Photobase. J Am Chem Soc. 143, 15091-15102 (2021).
  12. Ejike, J. O., et al. A Monochromatically Excitable Green-Red Dual-Fluorophore Fusion Incorporating a New Large Stokes Shift Fluorescent Protein. Biochemistry. , (2023).
  13. Bermejo, C., Haerizadeh, F., Sadoine, M. S., Chermak, D., Frommer, W. B. Differential regulation of glucose transport activity in yeast by specific cAMP signatures. Biochem J. 452, 489-497 (2013).
  14. Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem J. 432, 399-406 (2010).
  15. Nasu, Y., Shen, Y., Kramer, L., Campbell, R. E. Structure-and mechanism-guided design of single fluorescent protein-based biosensors. Nat Chem Biol. 17, 509-518 (2021).
  16. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc. 2, 31-34 (2007).
  17. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9, 676-682 (2012).
  18. Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: properties and evaluation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1833, 1787-1797 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fizjologia mikrobiologicznadynamika ma ych cz steczekbiosensory fluoroforoweobrazowanie in vivoodpowiedzi mikrobiologiczneurz dzenia perfuzyjneilo ciowa fluorescencjaobrazowanie pojedynczych kom rek
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły