Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie metody przenoszenia kropelek w celu niezawodnego przygotowania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

DOI:

10.3791/68340

⸱

19 września 2025

 ,  ,  , 
1The Biorobotics Institute, Sant'Anna School of Advanced Studies - Pisa, 2Department of Excellence in Robotics & AI, Sant'Anna School of Advanced Studies

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten przewodnik dla początkujących przedstawia ogólny protokół przygotowania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) metodą przenoszenia kropel, omawiając krytyczne etapy i dostarczając informacji, które pomogą w możliwych korektach wymaganych dla różnych zastosowań, w tym biologii syntetycznej i mikrorobotyki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich dwóch dekad metoda przenoszenia kropel, znana również jako emulsja odwrócona, emulsja podwójna, przeniesienie fazowe lub przeniesienie emulsji, okazała się korzystna w przygotowywaniu gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV), a w szczególności do ładowania ich różnymi ładunkami, odgrywając w ten sposób kluczową rolę w biologii syntetycznej. Ze względu na skuteczność enkapsulacji i prostotę wykonania, jest ona szeroko stosowana do opracowywania sztucznych komórek. W literaturze obserwuje się dużą zmienność kilku parametrów, co prowadzi do skrajnie zmiennych wyników. Wynika to częściowo z dostosowań wymaganych dla różnych potrzeb i zastosowań tej wszechstronnej metody, jednak może okazać się dezorientujące dla badaczy podchodzących do tej techniki po raz pierwszy.

Aby zapewnić początkującym podstawową wiedzę na temat metody i roli parametrów krytycznych, przedstawiono protokół wraz ze wskazówkami na temat podstawowych zasad fizykochemicznych leżących u podstaw powstawania GUV poprzez przenoszenie kropel. Ten przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania GUV zawiera zatem rozważania i praktyczne sugestie oparte na literaturze i bezpośrednim doświadczeniu.

Biorąc pod uwagę możliwe źródła zmienności, kilka aspektów uznaje się za krytyczne: wrażliwość fosfolipidów na światło, utlenianie i hydrolizę; wybór oleju do rozpuszczenia fosfolipidów (roztworu lipidów lub LS); oraz odzysk GUV po odwirowaniu. Proponowane są opłacalne środki mające na celu zminimalizowanie zakłóceń tlenu i wilgotności atmosferycznej. Aby pomóc w identyfikacji odpowiednich kombinacji oleju i fosfolipidów, ogólny protokół został uzupełniony o dyskusję na temat istotnych właściwości fizykochemicznych LS. Wreszcie, aby uniknąć niepraktycznych procedur, zaproponowano prostą i bezpieczną metodę całkowitego usunięcia fazy olejowej za jednym razem i odzyskania czystej dyspersji GUV. Środki te przyspieszają wdrażanie dostosowań do nowych kompozycji GUV, potencjalnie poszerzając ich zastosowanie w biologii syntetycznej i pokrewnych dziedzinach, w tym mikrorobotyce.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wdrażając wcześniej opisaną technikę wytwarzania liposomów1, Pautot i in. ustalili protokół wytwarzania pęcherzyków lipidowych o średnicy od 0,1 do 1 μm2. Metoda przenoszenia kropelek szybko okazała się skuteczna w produkcji jeszcze większych pęcherzyków (o średnicy przekraczającej 1 μm)3, zyskując coraz większą popularność ze względu na prostotę wykonania i wysoką skuteczność kapsułkowania. Rzeczywiście, w porównaniu z metodami pęcznienia (takimi jak pęcznienie żelu lub elektroformacja), protokół ten zmniejsza objętość roztworu ładunkowego wymaganego do utworzenia porównywalnej liczby pęcherzyków i związanych z nimi odpadów4. GUV mogą być montowane z interfejsów płynów za pomocą alternatywnych metod o porównywalnej wydajności enkapsulacji. Jednak w porównaniu z tymi opartymi na chipach mikroprzepływowych 5,6 lub ciągłą enkapsulacją kropelkową (cDICE)7, transfer kropel oferuje najprostszą konfigurację w przystępnej cenie w każdym laboratorium z podstawowym wyposażeniem. Co więcej, metody mikroprzepływowe mogą prowadzić do powstawania GUV z niepożądanymi wtrąceniami oleju w membranie. Z tych powodów przenoszenie kropelek jest metodą z wyboru do załadunku GUV cennych ładunków w dziedzinie sztucznych komórek 3,8,9,10, a ostatnio mikrorobotyki 11,12.

Metoda opiera się na tworzeniu płatków błon poprzez stabilizację granicy faz woda/olej za pośrednictwem fosfolipidów. Najpierw fosfolipidy rozpuszcza się w oleju (roztworze lipidów, LS), a następnie przygotowuje się emulsję typu woda w oleju z roztworem wodnym zawierającym pożądany ładunek GUV (roztwór wewnętrzny, IS) w oleistym LS. Emulsja jest następnie przenoszona do probówki, w której inny roztwór wodny (nazwany roztworem zewnętrznym, OS) został wcześniej zrównoważony z LS, tworząc granicę faz woda-olej. GUV powstają, gdy kropelki wody są zmuszane do przekroczenia tego interfejsu OS/LS przez wirowanie: wewnętrzna ulotka GUV tworzy się na powierzchni kropel IS, podczas gdy zewnętrzna ulotka tworzy się między OS i LS (rysunek 1).

Opisano wiele wariantów protokołów z parametrami dostosowanymi do ewentualnych potrzeb eksperymentalnych. Pierwsza szeroko zakrojona próba optymalizacji procesu została opisana przez Moga i wsp.13, podczas gdy Zhang i wsp. zebrali większość istotnych przykładów w niedawnym przeglądzie14. Pomimo wielu opisanych parametrów wpływających na protokół, nie ma wskazówek, w jaki sposób można przeprowadzić proces optymalizacji dla nowej formuły GUV, ani najlepszych praktyk w zakresie odzyskiwania i manipulacji GUV po produkcji. Opierając się na dostępnej literaturze naukowej i naszym bezpośrednim doświadczeniu, przedstawiamy tutaj ogólny protokół tworzenia GUV, omawiając jednocześnie podstawowe zasady. W ten sposób dostarczamy wskazówek przydatnych do optymalizacji nowatorskich preparatów GUV oraz dwóch środków ostrożności, które zawsze mają zastosowanie do protokołu: przygotowanie LS w kontrolowanym środowisku oraz metodę łatwego usuwania górnej fazy olejowej w celu odzyskania czystej próbki GUV. Wybraliśmy dwa przykłady: jeden z 240 mM sacharozy jako IS i 0,2 mM DOPC w oleju silikonowym AR20 jako LS (stan E [pusty], patrz tabela 1), a drugi złożony z 0,2% 1,1 μm mikrocząstek polistyrenu w 240 mM sacharozy jako IS i 3,18 mM DOPC w oleju mineralnym jako LS (warunek P [z cząstkami], zob. tabela 1). Obie próbki wyprodukowano z 240 mM glukozy jako OS. Wybraliśmy tę osmolarność, aby uzyskać GUV, które w warunkach fizjologicznych mają rozluźnioną błonę lipidową (niskie napięcie błony).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie metody przenoszenia kropel. (A) W oddzielnych fiolkach przygotowuje się trzy roztwory: fosfolipidy w oleju (faza żółta) w celu utworzenia roztworu lipidowego, roztwór zawierający sacharozę (w cyjanie) jako roztwór wewnętrzny i równomolowy roztwór glukozy (biały) jako roztwór zewnętrzny. (B) LS jest następnie mieszany z IS, aby utworzyć stabilną emulsję, następnie (C) interfejs między OS i LS może się zrównoważyć, zanim (D) emulsja zostanie wylana na niego. (E) Kropelki wody są zmuszane do przekraczania granicy faz LS/OS przez siłę odśrodkową, aby (F) umożliwić tworzenie się GUV. Rysunek nie jest w skali i ma na celu jedynie przedstawienie schematu metody. Skróty: LS = roztwór lipidów; IS = roztwór wewnętrzny; OS = rozwiązanie zewnętrzne; GUV = gigantyczny pęcherzyk jednopłytkowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: O ile nie zaznaczono inaczej, procesy przeprowadza się w temperaturze pokojowej.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotowanie roztworów wodnych (IS i OS)
    1. W dwóch różnych łodziach wagowych odważyć 2,16 g glukozy i ilość sacharozy określoną w tabeli 1. Dodaj proszki do dwóch zlewek o pojemności 150 ml, dodaj 40 ml ultraczystej wody i wymieszaj, mieszając.
    2. Przenieść roztwory do dwóch butli o pojemności 50 ml i dodać ultraczystą wodę do 50 ml w celu uzyskania 240 mM roztworów glukozy i sacharozy o stężeniach wskazanych w tabeli 1. Przykryj cylindry kawałkiem parafilmu i wymieszaj roztwory, kilkakrotnie odwracając cylindry.
    3. Przefiltruj roztwory za pomocą strzykawek o pojemności 50 ml i filtrów 0,22 μm, aby zapobiec zanieczyszczeniu mikroorganizmami.
    4. Dla warunku P należy przygotować następującą mieszaninę: 2 μl 100 mg/ml 1,1 μm dyspersji cząstek polistyrenu, 24 μl roztworu sacharozy przygotowanego w kroku 1.1.1 i ultraczystą wodę do 100 μl (zawiesina końcowa: 0,2% mikrocząstek w 240 mM roztworze sacharozy). Roztwory należy przechowywać w temperaturze +4 °C przez okres do 1 tygodnia lub przygotować 1 ml porcji w probówkach o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.
  2. Ustawienie komory rękawicowej w celu przygotowania LS w kontrolowanym środowisku
    1. Wytnij pięć kawałków rurki silikonowej o średnicy wewnętrznej 7 mm, średnicy zewnętrznej 13 mm i długościach wskazanych w tabeli 2 (rury od 1 do 5).
    2. Wyciąć cztery kawałki rury silikonowej o średnicy wewnętrznej 3 mm, średnicy zewnętrznej 7 mm i długościach wskazanych w tabeli 2 (rury od 6 do 9).
    3. Podłącz jeden koniec rury 1 do zaworu dwudrogowego, a drugi koniec do złącza trójdrogowego (Rysunek 2A).
    4. Podłącz rurę 2 do pozostałych końców zaworu dwudrogowego, a następnie podłącz rurę 3 i rurę 4 do złącza trójdrogowego, przy czym rura 3 jest podłączona do końca przeciwnego do rury 1 (rysunek 2A).
    5. Podłączyć wolny koniec rury 4 do wlotu komory rękawicowej (rura wlotowa, rysunek 2B).
    6. Podłączyć zawór trójdrogowy dostarczony z komorą rękawicową do wylotu, a następnie podłączyć zawór do rury 5 (rura wylotowa, rysunek 2C).
    7. Podłącz jeden koniec rury 6 do igły 18 G, a drugi koniec do złącza dwukierunkowego. Powtórz to z rurą 7 i igłą 21 G (Rysunek 2D).
    8. Umieścić dwie igły w nasadce fiolki z przegrodą: ta nasadka z igłami pozwoli na kontrolowany dopływ azotu i odpływ azotu i chloroformu. Przechowuj nakrętkę w pustej probówce bez nakrętki o pojemności 50 ml, aby uniknąć kontaktu z igłami (Rysunek 2D).
    9. Wcisnąć i włożyć odpowiednio rurki 8 i 9 do otworów wlotowych i wylotowych od wewnętrznej strony komory rękawicowej (Rysunek 2E).
  3. Przygotowanie LS
    1. Przesunąć komorę rękawicową do środka lub obok kaptura chemicznego. Otwórz komorę rękawicy i umieść krystalizator wypełniony cząstkami krzemionki na dnie komory (rysunek 2F). Przykryj krystalizator białą powierzchnią nośną i przykryj ją ręcznikami papierowymi.
    2. Włożyć wszystkie niezbędne materiały do komory rękawicy (rysunek 2G): higrometr, 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholinę (DOPC) w roztworze chloroformu, olej(e) (tabela) (tabela 1), czyste fiolki z ciemnego szkła o pojemności 20 ml (otwarte i z odpowiednimi nakrętkami), strzykawkę Hamilton (tabela 1), mikropipetę P10000 i końcówki. Umieścić szklaną fiolkę zawierającą roztwór chloroformu na uchwycie z pierścieniem korkowym, zlewce o pojemności 150 ml lub innym odpowiednim uchwycie jak najbliżej boku operatora.
      UWAGA: Ten środek ostrożności zapobiegnie przechylaniu się butelek spowodowanemu napompowaniem i opróżnieniem rękawic podczas cykli próżni i przepływu azotu.
    3. Zamknij komorę rękawicy, upewniając się, że dwie połówki nie mogą się zsunąć, i uszczelnij je plastikowymi dostarczonymi z komorą rękawicy.
    4. Zamknij zawór wylotowy i zanurz rurkę 5 w zlewce o pojemności 500 ml wypełnionej do połowy wodą (Rysunek 2H).
    5. Podłącz regulowany zaworem koniec rury wlotowej (rura 2) do przewodu podciśnieniowego, a drugi koniec do azotu (rura 3, rysunek 2A). Komora rękawicowa jest teraz całkowicie ustawiona, jak pokazano na rysunku 2J.
    6. Otwórz zawór i przewód podciśnieniowy, aż rozhermetyzowanie napompuje rękawice do punktu, w którym będą zbyt sztywne, aby się zgiąć. Zamknij przewód podciśnieniowy i zawór.
    7. Otwierać azot do momentu, gdy ciśnienie obniży powietrze z rękawic do punktu, w którym wyjdą one z komory rękawicy. Zamknij przewód azotu.
    8. Powtórz kroki od 1.3.6 do 1.3.7 co najmniej 10 razy, upewniając się, że wilgotność wewnętrzna spadnie poniżej 40%.
    9. Kontroluj ciśnienie wewnętrzne za pomocą podciśnienia i azotu, aby ułatwić operatorowi noszenie rękawic.
    10. Za pomocą strzykawki Hamilton przenieść objętość DOPC w roztworze chloroformu wskazaną w Tabeli 1 do fiolki z ciemnego szkła. Zamknąć fiolkę z nasadką z igłami przygotowaną w kroku 1.2.9.
    11. Podłącz rurę 6 do rury 8 i rurę 7 do rury 9 za pomocą złączy dwukierunkowych (Rysunek 2I).
    12. Zdejmij rękawice i otwórz zawór wylotowy.
      UWAGA: Drugi operator może pomóc w krokach od 1.3.13 do 1.3.15, aby przyspieszyć proces.
    13. Bardzo powoli otwierać przepływ azotu i sprawdzić przepływ gazu, obserwując pęcherzyki w zlewce, w której wcześniej umieszczono rurę 5 (krok 1.3.4). Stopniowo dostosowuj przepływ azotu, aż osiągnie stosunkowo wysoką szybkość, przy której poszczególne pęcherzyki pozostają obserwowalne. Pozwól azotowi płynąć przez 3 minuty, a następnie zamknij przewód azotu.
      UWAGA: Nadmierne ciśnienie azotu może spowodować rozproszenie roztworu DOPC w chloroformie w fiolce, zmniejszając ilość fosfolipidów dostępnych dla kolejnego roztworu lipidowego (LS). Dodatkowo, wysokie ciśnienie zwiększa ryzyko wydalenia igieł z fiolki. Dlatego tak ważne jest, aby dokładnie dostosować przepływ azotu do optymalnego poziomu, który delikatnie miesza chloroform, nie powodując niekontrolowanego rozpryskiwania.
    14. W międzyczasie przygotuj łaźnię wodną w krystalizatorze i podgrzej ją w temperaturze 80 °C na gorącej płycie.
    15. Poczekaj, aż ostatni pęcherzyk znajdzie się w zlewce, a następnie zamknij zawór wylotowy. Ponownie założyć rękawice i odłączyć rury 8 i 9 od złączy dwukierunkowych.
    16. Sprawdzić, czy cały chloroform wyparował z ciemnej fiolki, a następnie otworzyć ją i przesunąć nakrętkę z powrotem do probówki o pojemności 50 ml. Otwórz butelkę z olejem, przenieś wymaganą objętość oleju (Tabela 1) do ciemnej fiolki i zamknij ją nakrętką. Zdejmij rękawice i otwórz komorę rękawicową.
    17. Uszczelnij LS za pomocą parafilmu. Energicznie wirować fiolkę przez co najmniej 30 sekund. Inkubować w temperaturze 80 °C przez 30 minut w łaźni wodnej przygotowanej zgodnie z etapem 1.3.14. Energicznie wirować fiolkę przez co najmniej 30 sekund. Inkubować w temperaturze pokojowej przez noc.
    18. Kontynuuj przygotowanie GUV lub przechowuj je w temperaturze +4 °C przez okres do 1 tygodnia.
      UWAGA: W asymetrycznych preparatach GUV można użyć dwóch różnych LS jako granicy faz i emulsji w celu uzyskania dwóch różnych płatków membrany15.

2. Produkcja GUV

  1. Ustawienie pojemnika w celu łatwego usuwania oleju
    1. Nożyczkami odetnij nakrętkę z probówki o pojemności 5 ml. Wywierć otwór o średnicy ~8 mm w środku nasadki i sprawdź, czy otwór jest wystarczająco szeroki, aby umożliwić dopasowanie i zablokowanie końcówki P1000 (Rysunek 3A). Jeśli otwór jest zbyt wąski, powtórz dwa poprzednie kroki; Jeśli jest zbyt szeroka, wyrzuć nasadkę i uruchom ponownie z nową z kroku 2.1.1.
    2. Wytnij kawałek papieru ściernego o wymiarach 2 x 5 cm i przeszlifuj otwór. Umieść dziurawe nasadki z powrotem na probówce o pojemności 5 ml i odwiruj przy 3,000 × g przez 5 minut, aby usunąć wszystkie resztki plastiku z otworu. Zdejmij nakrętkę i wyrzuć tubkę.
    3. Odetnij nakrętkę z nowej probówki o pojemności 5 ml i zastąp ją nasadką z otworem. Umieść O-ring na górze nasadki i włóż końcówkę P1000 przez otwór. Zablokuj O-ring między końcówką a nasadką i sprawdź, czy końcówki nie można wepchnąć dalej w dół rurki (Rysunek 3B). Napełnij probówkę o pojemności 5 ml 5,5 ml OS przez końcówkę.
  2. Tworzenie interfejsu OS/LS
    1. Przygotować łaźnię wodną w krystalizatorze i podgrzać ją w temperaturze 50 °C na gorącej płycie.
    2. Energicznie obracać fiolkę LS przygotowaną w sekcji 1.3 przez co najmniej 30 sekund. Podgrzewać LS w temperaturze 50 °C w łaźni wodnej przez 30 minut.
    3. Roztwory wodne przygotowane w sekcji 1.1 należy równoważyć w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut.
    4. Odpipetować 300 μl OS w probówce o pojemności 1,5 ml lub probówce o pojemności 5 ml zmodyfikowanej zgodnie z punktem 2.1. Powoli odpipetuj 100 μl LS na wierzch OS, upewniając się, że w probówce uformowały się dwie odrębne i ciągłe fazy. Pozwól interfejsowi zrównoważyć się przez 10 minut.
      UWAGA: Aby umożliwić utworzenie jednorodnej monowarstwy fosfolipidów, LS powinien być jednorodnie rozłożony na wierzchu OS (Rysunek 4A). Jeśli warstwa LS nie jest ciągła, rozprowadź objętość LS za pomocą mikropipety lub zwiększ objętość LS (może to być bardzo pomocne w przypadku olejów o dużej lepkości, takich jak parafina).
  3. Tworzenie emulsji woda w oleju
    1. W probówce o pojemności 2 ml odpipetuj pipetą, w tej kolejności, 250 μl LS i 6,25 μl IS, aby uzyskać 2,5% emulsję typu woda w oleju.
      UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że taki stosunek wody do oleju najprawdopodobniej zapewnia stabilną emulsję, zwiększając w ten sposób wskaźnik powodzenia protokołu (ilustracja 5). Aby zwiększyć wydajność GUV, zalecamy zwiększenie objętości emulsji, a nie stosunku IS/LS.
    2. Wymieszaj dwie fazy, stosując jedną lub więcej z następujących metod, aż mieszanina stanie się jednorodna i stabilna: wirowanie, mechaniczne mieszanie nad standardowym stojakiem na mikroprobówki lub stukanie palcem w probówkę (sprawdź Rysunek 5 dla przykładów jednorodnej emulsji).
    3. Przenieść 200 μl emulsji na powierzchnię styku OS/LS przygotowaną w ppkt 2.2.
    4. Jeśli używasz probówki o pojemności 1,5 ml, po prostu zamknij probówkę; jeśli używasz zmodyfikowanej probówki 5 ml z sekcji 2.1, umieść gumową nasadkę na końcówce i ostrożnie przenieś probówkę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  4. Przenoszenie kropelek przez wirowanie
    1. Odwirować probówki w temperaturze pokojowej zgodnie ze wskazówkami podanymi w tabeli 1. Pod koniec wirowania sprawdzić, czy na dnie probówki znajduje się nieprzezroczysty osad, a w górnej części czysta jest przezroczysta faza olejowa.

3. Odzyskiwanie GUV

  1. Usuwanie oleju
    UWAGA: W zależności od potrzeb eksperymentalnych olej można usunąć w trzech różnych alternatywnych etapach.
    1. Jeśli GUV zostały przygotowane w standardowych probówkach o pojemności 1,5 ml, powoli usuwaj olej za pomocą pipety P1000 i P200 do ostatnich kropli, upewniając się, że granulka nie jest naruszona.
      UWAGA: Węższe końcówki pomagają w usuwaniu oleju, więc włożenie końcówki do mniejszych objętości (10-200 μl) do końcówki P1000 poprawi dokładność tego kroku.
    2. Jeśli mamy do czynienia z wieloma preparatami GUV w różnych probówkach o pojemności 1,5 ml, usuń olej za pomocą kolby Büchnera. Podłącz jeden kawałek grubej rurki silikonowej (średnica wewnętrzna 7 mm, zewnętrzna 13 mm) do przewodu podciśnieniowego i włóż kolejną rurkę na otwór kolby, uszczelniając ją gumową uszczelką. Na drugim końcu tej rury włóż końcówkę P1000, owiń ją parafilmem, odetnij około 3 mm końcówki i włóż ją do końcówki P200. Otwórz odkurzacz i zassaj olej końcówką P200, a następnie zamknij odkurzacz i usuń ostatnie krople za pomocą pipety P200.
    3. Jeśli GUV zostały przygotowane w pojemniku opisanym w kroku 2.1, zdejmij końcówkę z tuby, upewniając się, że gumowa nasadka nie odpada (Rysunek 3D). Następnie wyrzuć końcówkę i zachowaj gumową nasadkę, O-ring i nasadkę z otworem do ponownego użycia.
    4. Za pomocą mikropipety P1000 usuń OS z probówki (rysunek 3E), pozostawiając około 50 μl objętości, upewniając się, że osad nie jest naruszony.
    5. Zmień końcówkę, ponownie zawieś granulkę w pozostałej objętości i przenieś ją do czystej probówki o pojemności 2 ml.
  2. Myjnie GUV
    UWAGA: Celem tych kroków jest usunięcie śladów fazy olejowej, które nie zostały usunięte w kroku 3.1. W razie potrzeby kroki 3.2.1 i 3.2.2 należy powtarzać, aż do momentu, gdy w rurce nie zaobserwuje się kropli oleju.
    1. Napełnij probówkę 2 ml OS i odwiruj przy 1 500 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usuń OS, pozostawiając około 50 μl objętości, upewniając się, że osad nie jest naruszony.
    3. Powtórz dwa ostatnie kroki.
  3. Wyrównanie głośności
    UWAGA: Zamieszczamy tę sekcję, aby umożliwić porównanie plonów między różnymi preparatami GUV.
    1. Za pomocą mikropipety P200 ponownie zawiesić osad w 50 μl objętości pozostałej z ostatniego powtórzenia kroku 3.2.2.
    2. Zmierz tę objętość, ustawiając pipetę na 20 i zwiększając objętość z końcówką zanurzoną w dyspersji GUV bez dotykania ścianki probówki, aby umożliwić przepływ cieczy wewnątrz końcówki.
    3. Dodaj OS, aby osiągnąć końcową objętość 100 μl.

4. Obserwacja i analiza wymiarowa

  1. Akwizycja obrazu mikroskopowego
    1. Delikatnie wymieszaj dyspersję GUV, stukając palcem w probówkę.
    2. Załadować do komory Burkera 10 μl próbki GUV i odczekać co najmniej 5 minut, aby GUV mogły osiąść na dnie komory.
    3. Obserwuj próbkę pod mikroskopem z kontrastem fazowym. Używając linii Burkera jako odniesień, poruszaj się po próbce i uzyskaj co najmniej 20 obrazów, upewniając się, że obszary obserwacji nie nakładają się na siebie.
  2. Analiza wymiarowa
    1. Załaduj obrazy do ImageJ.
    2. Aby obliczyć współczynnik konwersji pikseli/μm, wybierz jeden obraz przedstawiający kwadrat komory Burkera o wymiarach 50 x 50 μm (prawidłową identyfikację można znaleźć w karcie katalogowej producenta), a następnie wybierz narzędzie do zaznaczania linii prostej , narysuj linię między dwoma kolejnymi rogami kwadratu i zmierz linię, klikając Analizuj | Miara. Powtórz 3x i oblicz wartość średnią.
    3. Ustaw współczynnik konwersji, klikając Analizuj | Ustaw skalę. Wstaw wartość z kroku 4.2.2 w polu Odległość w pikselach, a następnie wstaw wartość 50 w polu Znana odległość i μm w jednostce długości.
    4. Kliknij Analizuj | Ustaw miary i zaznacz pole Obszar . Wybierz narzędzie do zaznaczania owalu , a następnie kliknij lewym przyciskiem myszy i przytrzymaj Shift, aby nałożyć wynikowy okrąg wokół GUV. Zmierz średnicę, klikając Analizuj | Miara. Powtórz tę czynność dla każdego GUV na każdym obrazie.
    5. W oknie Wyniki kliknij Plik | Zapisz jako..., aby wyeksportować plik csv obszaru GUV, a następnie przeanalizuj rozkład rozmiaru za pomocą skryptu dostępnego na GitHub16.
      UWAGA: Możliwe jest pominięcie kroku 4.2.3 i uruchomienie skryptu określającego współczynnik konwersji piksel/μm. Aby obliczyć tę wartość, należy podzielić wartość uzyskaną w kroku 4.2.2 przez 50.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optymalna preparacja GUV charakteryzuje się utworzeniem klarownej fazy olejowej i wyraźnego osadu (rysunek 4A). W przypadkach, gdy kropelki wody nie przekształcają się w GUV, zwykle zapadają się i pozostawiają resztki fosfolipidów na granicy faz OS/LS (Rysunek 4C). Efekt ten jest najprawdopodobniej spowodowany agregacją fosfolipidów i innych cząsteczek z fazy olejowej, wynikającą z niedostatecznej równowagi fosfolipidów na granicy faz woda/olej. Niemniej jednak, pomimo braku widocznego granulatu lub obecności zanieczyszczeń na granicy faz, GUV mogą nadal tworzyć się, umożliwiając kontynuowanie procesu. Chociaż etapy mycia nie są całkowicie skuteczne w usuwaniu wszystkich zanieczyszczeń fosfolipidowych, znacznie pomagają w eliminowaniu kropelek oleju, poprawiając ogólną jakość próbki (porównaj rysunek 6A i rysunek 6B).

Stosowanie starych LS lub LS przygotowanych w warunkach wysokiej wilgotności często skutkuje zmniejszeniem dyspersji GUV przy mniejszej wydajności i wyższej zawartości nieuporządkowanych agregatów, które najprawdopodobniej są tworzone przez fosfolipidy i inne cząsteczki z fazy olejowej (rysunek 6C). Dla LS przygotowanego w warunkach wysokiej wilgotności zaobserwowaliśmy współczynniki zmienności powyżej 0,8 w produkcji GUV (przy próbkach zawierających bardzo mało GUV), podczas gdy dla LS przygotowanego w zmodyfikowanej komorze rękawicowej współczynnik zmienności wynosił poniżej 0,5.

Różne warunki wirowania mogą mieć wpływ na wydajność i jakość GUV. Na podstawie analizy jakościowej stwierdzono, że 20 minut w stężeniu 3300 × g jest dobrym warunkiem dla GUV z sacharozą (próbka E). Zmniejszenie prędkości (45 min przy 500 × g) skutkowało zmniejszeniem plonu, natomiast zwiększenie (5 min przy 16 600 × g) doprowadziło do większego tworzenia się nieuporządkowanych agregatów fosfolipidowych. Słaba siła odśrodkowa może uniemożliwić wielu kropelkom przejście przez granicę faz OS/LS, stąd zmniejszona wydajność, podczas gdy silna siła może nie zapewnić wystarczającej ilości czasu na organizację fosfolipidów na zewnętrznej warstwie podczas skrzyżowania granicy faz (ryc. 7). Enkapsulacja mikrocząstek może być również zoptymalizowana poprzez dostosowanie parametrów wirowania, pod warunkiem, że gęstość masy mikrocząstek jest w przybliżeniu zgodna z gęstością IS. W tym celu zmniejszenie przyspieszenia wirowania (a co za tym idzie wydłużenie czasu wirowania) pozwala na bardziej jednorodne zamknięcie cząstek, unikając pękania błony fosfolipidowej z powodu siły wywieranej przez cząstki stałe (przykład dobrej enkapsulacji pokazano na rysunku 6D , podczas gdy badanie optymalnych parametrów wirowania jest nadal w toku17).

Ponieważ na dyfuzję fosfolipidów może mieć wpływ faza olejowa, można przeprowadzić prosty test jakościowy w celu oceny stabilności emulsji (ryc. 5). Za pomocą barwnika barwiącego (Brilliant Blue FCF) rozpuszczonego w stanie ciesielskim w celu poprawy wizualizacji, można przygotować emulsje o różnych proporcjach wody do oleju i obserwować je w czasie. Utratę stabilności można uwidocznić poprzez agregację kropel wody i wynikające z tego oddzielenie od fazy olejowej. Ponieważ duże kropelki (widoczne gołym okiem) są mniej podatne na przekształcenie w GUV, zalecamy stosowanie warunków emulsji, które zapewniają najmniejszą separację faz.

Wpływ zmian w protokole można zweryfikować za pomocą analizy rozkładu rozmiaru, jak opisano w sekcji 4 protokołu: średnice GUV można zmierzyć za pomocą ImageJ na podstawie obrazów mikroskopu z kontrastem fazowym, a rozkład wielkości można przeanalizować za pomocą skryptu dostępnego na GitHub16. Zgodnie z tym protokołem można było na przykład zaobserwować wzrost GUV o większych średnicach, gdy wybrano olej mineralny zamiast oleju silikonowego AR20 (ilustracja 8).

figure-results-1
Rysunek 2: Konfiguracja komory rękawicowej. Rysunek ten przedstawia główne modyfikacje komory rękawicowej w celu przygotowania roztworu lipidowego. (A) przyłącze wlotowe z azotem i próżnią; B) połączenie wlotowe z komorą rękawicy; (C) zawór wylotowy; (D) nasadka z łożyskiem igłowym do odparowywania rozpuszczalnika; E) cienkie rurki do odparowywania rozpuszczalników; (F) cząsteczki krzemionki pochłaniające wilgoć; (G) elementy przeznaczone do umieszczenia w komorze rękawicy: cyfrowy termohigrometr (1), roztwór lipidów w rozpuszczalniku organicznym (2), uchwyt pierścienia korkowego (3), szklana strzykawka (4), otwarta nakrętka z przegrodą i igłami (5), roztwór oleju (6), otwarta ciemna fiolka z nakrętką (7), końcówki 10 ml (8), pipeta P10000 (9); (H) koniec rury wylotowej zanurzony w wodzie; (I) fiolka zamknięta nasadką z igłami połączoną z wlotem i wylotem; (J) schematy zmodyfikowanej komory rękawicowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Pojemnik ułatwiający usuwanie oleju. Główne etapy przygotowania GUV w pojemniku w celu łatwego usunięcia oleju zgodnie z sekcją 2.1 protokołu. (A) W nasadce probówki o pojemności 5 ml wierci się otwór, aby umożliwić dopasowanie końcówki P1000; następnie (B) nasadkę umieszcza się na pustej probówce o pojemności 5 ml z końcówką włożoną w otwór przez O-ring. (C) Roztwory umieszcza się w probówce zgodnie z sekcjami protokołu 2.2 i 2.3, końcówkę zakrywa się, a probówkę umieszcza się w probówce o pojemności 50 ml. GUV przygotowane z 0,2 mM DOPC w oleju silikonowym zostały załadowane 230,7 mM sacharozy i 3,1 mM Brilliant Blue FCF w celu poprawy wizualizacji. (D) Po odwirowaniu górna faza olejowa jest uwięziona w końcówce wraz z częścią bufora GUV (który wydaje się cyjanowy, ponieważ część kropelek nie przekształca się w GUV i uwalnia barwnik w OS). Dzięki gumowej nasadce końcówkę można łatwo wyjąć z probówki o pojemności 5 ml wraz z zawartością płynu, umożliwiając w ten sposób szybkie i łatwe usunięcie całej fazy olejowej. (E) Granulat GUV można łatwo zebrać z dna probówki w postaci klarownej dyspersji, bez widocznego zanieczyszczenia olejem, co zweryfikowano (F) za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Podziałka = 20 μm. Skróty: LS = roztwór lipidów; IS = roztwór wewnętrzny; OS = rozwiązanie zewnętrzne; GUV = gigantyczny pęcherzyk jednowarstwowy; DOPC = 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Formacja GUV. Przykłady (A) granicy faz OS/LS, (B) czystej pastylki GUV z klarowną fazą olejową oraz (C) pastylki GUV z zanieczyszczeniami na granicy faz OS/LS (szczątki i granulki wydają się czerwonawe, ponieważ IS tej populacji GUV został uzupełniony 1,65 mM barwnikiem New Coccine w celu poprawy wizualizacji). Skróty: LS = roztwór lipidów; IS = roztwór wewnętrzny; OS = rozwiązanie zewnętrzne; GUV = gigantyczny pęcherzyk jednopłytkowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 5: Stabilność emulsji przy różnych proporcjach oleju i wody w oleju. Rysunek przedstawia stabilność emulsji w czasie, w zależności od rodzaju oleju i zastosowanego stosunku woda/olej (w/o). IS składał się z 230,7 mM sacharozy i 3,1 mM Brilliant Blue FCF, aby poprawić wizualizację emulsji. Emulsje przygotowane na bazie oleju mineralnego są mniej stabilne niż ich odpowiedniki wykonane z oleju silikonowego AR20. Efekt ten jest dodatkowo wzmacniany wraz ze wzrostem współczynników w/o. Chociaż emulsje w oleju silikonowym AR20 są znacznie bardziej stabilne, ich stabilność również spada wraz ze wzrostem współczynnika w/o, przy czym separacja faz jest widoczna natychmiast po emulgowaniu (olej silikonowy AR20 przy 10%). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Ryc. 6: Obserwacja GUV za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym. 20-krotne powiększenie GUV obciążonych sacharozą przygotowanych z LS złożonego z 3,18 mM DOPC w oleju mineralnym. A) próbka odzyskana po usunięciu oleju; B) próbka odzyskana po etapach mycia; (C) słaby uzysk GUV uzyskany z LS przygotowanego w środowisku o nieuregulowanej wilgotności tlenu i wilgotności; (D) GUV obciążone mikrocząstkami. Podziałka = 10 μm; Krople oleju są zakreślone, a przykłady nieuporządkowanych agregatów fosfolipidów i cząsteczek oleju są oznaczone strzałką. Skróty: LS = roztwór lipidów; GUV = gigantyczne pęcherzyki jednowarstwowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 7: Wpływ różnych warunków wirowania na tworzenie GUV. Obrazy z kontrastem fazowym GUV obciążonych sacharozą przygotowane za pomocą LS złożonego z 0,2 mM DOPC w oleju silikonowym AR20. Rysunek przedstawia jakościowe porównanie GUV przy (A) 16 600 × g przez 5 min, (B) 3 300 × g przez 20 min i (C) 500 × g przez 45 min. Podczas gdy wysoka prędkość wirowania powoduje większą obecność agregatów fosfolipidów, niska prędkość wirowania prowadzi do zmniejszenia wydajności. Podziałka = 50 μm. Skróty: LS = roztwór lipidów; GUV = gigantyczny pęcherzyk jednowarstwowy; DOPC = 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 8: Analiza rozkładu wielkości. Porównanie dwóch próbek GUV obciążonych sacharozą otrzymanych z (A) 0,2 mM DOPC w oleju mineralnym i (B) 0,2 mM DOPC w oleju silikonowym AR20 (*próbka została rozcieńczona 10x, aby umożliwić wyraźne rozróżnienie GUV pod mikroskopem z kontrastem fazowym). Analiza przeprowadzona zgodnie z sekcją 4 protokołu wykazała przesunięcie rozkładu wielkości w kierunku większych średnic próbki oleju mineralnego w odniesieniu do próbek oleju silikonowego AR20. Jednak wydajność próbki silikonu jest prawie 20 razy wyższa. Skróty: GUV = gigantyczny pęcherzyk jednopłytkowy; DOPC = 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

KrokWarunek EWarunek POpis
1.1.14,11 gr17,11 grMasa sacharozy
1.1.12,16 gr2,16 grMasa glukozy
1.1.2240 mM1000 mMStężenie sacharozy
1.1.2240 mM240 mMStężenie glukozy
1.3.2Olej silikonowyOlej mineralnyFaza olejowa dla LS
1.3.2Szklana strzykawka 0,1 mlSzklana strzykawka 0,5 mlSzklana strzykawka do przenoszenia DOPC w roztworach chloroformu
1.3.1063 μL500 μLObjętość DOPC w roztworze chloroformu
1.3.1610 ml5 mlObjętość oleju
2.4.13300 g 20 minut500 g 45 minutWarunek wirowania

Tabela 1: Różnice w protokole. W tabeli przedstawiono warianty dla różnych etapów protokołu (wskazane w pierwszej kolumnie) w celu przygotowania dwóch różnych populacji GUV: GUV obciążonych sacharozą (warunek E) i GUV obciążonych mikrocząstkami (warunek P).

IDZwiązane z tym krokiŚrednica wewnętrzna (mm)Średnica zewnętrzna (mm)Długość (mm)
11.2.1; 1.2.371350
21.2.1; 1.2.4; 1.3.571350
31.2.1; 1.2.4; 1.3.5713100
41.2.1; 1.2.4; 1.2.57132000
51.2.1; 1.2.6; 1.3.137132000
61.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
71.2.2; 1.2.7; 1.3.113750
81.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200
91.2.2; 1.2.9; 1.3.11; 1.3.1537200

Tabela 2: Przewody do przyłączy gazu i podciśnienia w komorze rękawicy. W tabeli podano wymiary rur silikonowych używanych do łączenia komory rękawicy z przewodami azotu i podciśnienia. Identyfikatory referencyjne są udostępniane w celu ułatwienia procesu montażu.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody wytwarzania GUV można podzielić na dwie główne grupy: metody oparte na pęcznieniu z substratów poprzez hydratację oraz metody oparte na montażu z granicy faz płynów. Metody z pierwszej grupy są bardzo skuteczne w dostarczaniu dużych populacji GUV do biofizycznej charakterystyki błon lipidowych lub białek transbłonowych. Z kolei metody takie jak przenoszenie kropelkowe są wybierane przede wszystkim do hermetyzacji ładunku ze względu na mniejsze zużycie ładunków i wyższą skuteczność hermetyzacji18.

Z tego powodu mnóstwo różnych ładunków zostało zamkniętych w GUV, co sprawia, że przenoszenie kropel jest procesem referencyjnym dla sztucznych komórek 3,8,9,10 i możliwym rozwiązaniem do budowy nowych mikrorobotów biomimetycznych11,12. Aby modulować właściwości fizykochemiczne błon GUV, można uwzględnić różne cząsteczki, takie jak fosfolipidy jonowe10, kwasy tłuszczowe19, polimery, takie jak PEG20 lub cholesterol21 (chociaż cząsteczki hydrofobowe, takie jak cholesterol, mają wysokie powinowactwo do oleju, co skutkuje mniejszą kontrolą składu błony w odniesieniu do metod pęcznienia22). Protokół jest na tyle wszechstronny, że pozwala na te modyfikacje, ale niektóre kroki mają większy wpływ niż inne.

Aby omówić krytyczne znaczenie metody, opisaliśmy tutaj protokół przygotowania dwóch różnych populacji GUV: jednego preparatu GUV zawierającego roztwór sacharozy i jednego preparatu GUV zawierającego mikrocząstki. Różnice w protokole są wyszczególnione w tabeli 1 jako warunek E (pusty) i warunek P (z cząstkami). Metoda ta pozwala na tworzenie GUV poprzez przenoszenie kropelek wody z fazy olejowej do fazy wodnej w procesie bistabilnym napędzanym przez fosfolipidy23 i pod wpływem właściwości fizykochemicznych wszystkich trzech zaangażowanych faz: IS, OS i LS.

Spośród tych trzech, LS jest najbardziej wrażliwy ze względu na podatność fosfolipidów na światło, utlenianie i hydrolizę 24,25,26. Z tego powodu początkowy etap odparowania rozpuszczalnika organicznego używanego do długotrwałego przechowywania fosfolipidów w temperaturze -20°C (zazwyczaj chloroformu lub metanolu) musi być przeprowadzony w bursztynowych fiolkach pod przepływem azotu lub argonu. Jeśli niski poziom wilgotności w środowisku laboratoryjnym nie zostanie zapewniony, fosfolipidy mogą ulec uszkodzeniu13, 14, 27. W związku z tym LS powinien być przygotowany w zamkniętym środowisku, takim jak komora rękawicowa lub ekonomiczna zmodyfikowana komora rękawicowa opisana w niniejszym protokole. Po dodaniu oleju do filmu lipidowego, LS można usunąć z komory rękawicy, a całkowite rozpuszczenie fosfolipidów odbywa się poprzez wirowanie i podgrzewanie roztworu.

Chociaż niektóre protokoły obejmują sonikację na tym etapie13, miejscowy wzrost temperatury może prowadzić do jeszcze nieopisanych uszkodzeń dla niektórych preparatów LS. Z tego powodu podgrzewanie roztworu w łaźni wodnej może zapewnić lepiej kontrolowany i jednorodny proces. Aby jeszcze bardziej zmniejszyć ryzyko uszkodzenia LS, protokół ten sugeruje użycie dwóch różnych temperatur: ponieważ rozpuszczenie nowo przygotowanego LS wymaga większej energii niż poprzednio rozpuszczony LS (ze względu na gęstsze upakowanie cząsteczek fosfolipidów w folii rozprowadzanej na powierzchni szklanej fiolki), przyjmuje się 80 °C do pierwszego rozpuszczenia filmu lipidowego i 50 °C po prostu do ponownego rozpuszczenia fosfolipidów tuż przed ich używać. Ponieważ wzrost zmienności wydajności w czasie obserwuje się zwykle w przypadku 3,18 mM DOPC w oleju mineralnym (rysunek 4C), stosowanie LS w ciągu tygodnia jest ogólnie zalecaną praktyką. Niemniej jednak niektóre kombinacje oleju i fosfolipidów mogą mieć wydłużoną żywotność, a użycie komory rękawicowej wydaje się również poprawiać stabilność LS w czasie.

Dostosowanie błon GUV za pomocą określonych kombinacji fosfolipidów może wymagać dostosowanych implementacji protokołu. Aby poruszać się między wszystkimi możliwymi wariantami, można uzyskać wskazówki na podstawie właściwości fizykochemicznych LS. Na krytyczne stężenia micelarne (CMC) i dyfuzyjność fosfolipidów w LS mają wpływ interakcje chemiczne z cząsteczkami w roztworze28. Na tworzenie się kropelek wody w emulsji IS/LS ma zatem wpływ to, jak szybko fosfolipidy mogą dyfundować w fazie olejowej i docierać do granicy faz woda/olej, tworząc stabilną monowarstwę (wewnętrzną ulotkę membrany). Różnice w dyfuzyjności zaobserwowano dla dwóch olejów wykorzystanych w tym protokole, przy czym olej silikonowy AR20 zapewnia wyższą stabilność emulsji IS/LS (ryc. 6). Ponieważ najbardziej stabilną emulsję dla obu olejów zaobserwowano, gdy woda była zdyspergowana w stosunku 2,5% (zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami w oleju mineralnym13), ustaliliśmy to jako ogólnie obowiązujący stosunek.

Niemniej jednak, ponieważ wyższe współczynniki mogą zapewnić użyteczne cechy (np. POPC w oleju mineralnym wykazał przesunięcie w kierunku większych GUV13), zalecamy przeprowadzenie wstępnego testu jakościowego, takiego jak ten przedstawiony na rysunku 6, aby uzyskać wgląd w stabilność emulsji, a co za tym idzie, oczekiwaną skuteczność enkapsulacji. W tym miejscu radzimy czytelnikom, aby nie polegali na precyzyjnym czasie lub iteracjach procedur tworzenia emulsji, ponieważ skuteczność zależy ściśle od operatora lub przyjętego instrumentu. Zamiast tego zapewniamy punkt kontrolny, aby pomóc operatorowi zrozumieć, kiedy jakość emulsji jest wystarczająco dobra, aby - przynajmniej teoretycznie - zmaksymalizować szanse na przekształcenie kropelek w GUV. Dyfuzyjność fosfolipidów w oleju wpływa również na ich zdolność do przegrupowywania się podczas przenoszenia kropelek i tworzenia zewnętrznej płatki błony GUV 2,7,18,29. Temu krokowi sprzyja odpowiednia równowaga interfejsu LS/OS. Podczas gdy czas inkubacji przyjęty w tym protokole jest zgodny z ogólnymi zaleceniami18, z pomiarami napięcia międzyfazowego z poprzednich raportów7 i naszymi wstępnymi eksperymentami, GUV przygotowane z różnymi LS mogą skorzystać na dłuższym czasie inkubacji.

Na tworzenie się ulotki zewnętrznej ma również wpływ prędkość kropel wody przechodzących przez granicę faz LS/OS, co jest związane z gęstością i lepkością trzech faz30. Różnice gęstości muszą być zawsze zgodne z kolejnością: IS > OS > LS. Jest to niezbędne, aby umożliwić najpierw sedymentację kropel IS w kierunku granicy faz LS/OS, a następnie przejście przez granicę faz w celu przekształcenia w GUV i ich sedymentacji w kierunku dna rury. Chociaż proces ten może zachodzić spontanicznie, nawet gdy woda dejonizowana jest używana zarówno jako IS, jak i OS23, różnica w gęstości między IS i OS została wprowadzona, aby sprzyjać tworzeniu się GUV31. Najczęstszą parą do tego celu jest sacharoza w IS i glukoza w OS: przy stężeniach równomolowych wymaganych do zapobieżenia uszkodzeniom tworzących się GUV w wyniku stresu osmotycznego, sacharoza zapewnia gęstszy roztwór niż glukoza. Ponieważ różnica w gęstości wzrasta wraz z osmolarnością tych roztworów, wydajność GUV zmienia się odpowiednio, przy czym powyżej 600 mOsm13 nie obserwuje się dalszej poprawy.

Optymalne warunki wirowania są ściśle związane z gęstością i lepkością trzech faz oraz dyfuzyjnością fosfolipidów. W przypadku braku pełnej charakterystyki trzech faz, należy poddać badaniom przesiewowym wiele warunków. Na podstawie badań jakościowych (rys. 4E i rys. 5) oraz wstępnej analizy systematycznej17 udało się określić dobre warunki wirowania dla dwóch próbek opisanych w niniejszym protokole; Jednak jakość próbek może ulec poprawie, jeśli przebada się więcej warunków. Gdy równowaga między dyfuzyjnością fosfolipidów w LS a gęstością i lepkością trzech faz nie jest odpowiednio zachowana, fosfolipidy nie mają wystarczająco dużo czasu, aby zrównoważyć się na granicy LS / OS i prawidłowo przegrupować się, gdy kropelki wody przemieszczają się w kierunku OS. Często prowadzi to do powstania białawego osadu na granicy faz lub tuż pod nim, prawdopodobnie składającego się z fosfolipidów i innych cząsteczek fazy olejowej ciągniętych przez kropelki, które nie łączą się w GUV podczas wirowania.

Enkapsulacja jednorodnego roztworu może być napędzana przez zwiększenie gęstości IS przy zachowaniu równowagi osmotycznej z OS (jak w przypadku pary sacharoza-glukoza), ale enkapsulacja dyspersji mikrocząstek wymaga, aby gęstość fazy wodnej odpowiadała gęstości mikrocząstek32. Na skuteczność hermetyzacji ładunku wpływa również skład chemiczny roztworu/dyspersji ładunku. Wcześniejsze doniesienia wykazały negatywny wpływ na wydajność GUV spowodowany wieloma halogenkami metali alkalicznych33 lub zmianami pH13, najprawdopodobniej z powodu interakcji lub przesunięć w ładunku netto obojecznie jonowych hydrofilowych głów fosfolipidów. W związku z tym hermetyzacja reakcji biologicznych (takich jak enzymatyczna lub bezkomórkowa synteza białek) często wymaga kompromisu, ponieważ pH i stężenia soli (takie jak KCl lub NaCl) muszą być dostosowane do poziomów, które nie są optymalne dla samej reakcji. Niemniej jednak nawet złożone mieszaniny reakcyjne, takie jak bezkomórkowa synteza białek, mogą być modyfikowane w celu uzyskania funkcjonalnych sztucznych komórek opartych na GUV34.

Z praktycznego punktu widzenia, chociaż metoda przenoszenia kropelek oferuje bardzo prosty proces, odzyskiwanie GUV z systemu operacyjnego może stwarzać pewne ograniczenia. Aby pomóc w usunięciu oleju z górnej fazy po etapie wirowania, możliwe jest użycie dwóch końcówek pipet w celu dokładniejszego usunięcia (krok protokołu 3.1.1) lub kolby Buchnera w celu szybszego usunięcia w przypadku przygotowania wielu próbek (krok protokołu 3.1.2). Niemniej jednak, ponieważ olej nie jest całkowicie usunięty, konieczne jest wykonanie etapu mycia w celu uzyskania czystej dyspersji GUV (krok protokołu 3.2). Chociaż etapy płukania doprowadziły do skutecznego usunięcia resztek kropelek oleju bez znaczącej utraty GUV (Rysunek 4A,B), przejście to może być trudniejsze w przypadku oleju o wysokiej lepkości i może być bardzo czasochłonne, gdy przygotowywanych jest wiele preparatów GUV. Opisano alternatywną metodę obejścia usuwania oleju i odzyskania GUV z dna rurki przez otwór przebity za pomocą igły35. Proces ten może jednak nie pozwolić na pełne odzyskanie granulatu GUV, jeśli rurka nie zostanie przebita we właściwej pozycji, a ponadto jest potencjalnie szkodliwa dla operatora.

Aby wspomóc regenerację GUV, przedstawiamy tutaj nowe i proste podejście do szybkiego usuwania fazy olejowej. Polega to na uwięzieniu górnej, mniej gęstej fazy olejowej w zakorkowanej końcówce pipety, tak aby po odwirowaniu końcówkę można było usunąć w taki sposób, aby nie kapał płyn. Ta prosta strategia pozwala na szybkie i łatwe usunięcie całej fazy olejowej za jednym razem, konsekwentnie upraszczając ten czasochłonny krok.

Aby ocenić skuteczność protokołu, zaimplementowano kilka metod automatycznego wykrywania GUV w celu przyspieszenia zliczania i analizy rozkładu wielkości. Znakowanie GUV za pomocą sond fluorescencyjnych zapewnia prostą i skuteczną strategię stosowaną zarówno w cytometrii przepływowej36,37, jak i obrazowaniu mikroskopowym w połączeniu z algorytmami wykrywania okręgów 13,37,38,39. Ostatnio badane są narzędzia oparte na sztucznej inteligencji do wykrywania obiektów, aby usprawnić ten proces40,41. Jednak barwniki fluorescencyjne mogą potencjalnie wpływać na właściwości GUV, wprowadzając w ten sposób artefakty do analizy. W przypadku wykluczenia wykrywalnego sygnału fluorescencyjnego, mikroskopia pozostaje najbardziej niezawodną opcją, przy czym mikroskopia z kontrastem fazowym jest preferowaną metodą optymalnej wizualizacji18 i zastosowania algorytmów wykrywania okręgów38.

Alternatywnie możliwe jest wykorzystanie szczególnych właściwości określonych preparatów do unikalnych strategii wykrywania. Na przykład Hadorn i wsp. wykorzystali obecność elektrolitów w stanie inwazyjnym do wykrywania GUV za pomocą licznika ogniw opartego na impedancji33. Gdy żadna z tych zautomatyzowanych lub specyficznych dla receptury metod nie jest wykonalna, ręczna adnotacja po okręgu pozostaje uniwersalną alternatywą. W takich przypadkach ImageJ oferuje praktyczne narzędzie do przyspieszenia procesu i łatwego wyodrębnienia surowych pomiarów średnicy zgodnie z opisem w tym protokole.

Pomimo szerokiego zastosowania metody przenoszenia kropelk, niewiele uwagi poświęca się procesom optymalizacji wymaganym dla nowatorskich preparatów GUV. W tej pracy zebraliśmy informacje dostępne w literaturze, aby wdrożyć systematyczny protokół w celu sterowania i uproszczenia tej optymalizacji. W tym praktycznym przewodniku omówiono podstawowe zasady związane z produkcją nowatorskich preparatów GUV oraz odzyskiwaniem próbki o minimalnym stopniu zanieczyszczenia olejem, co jest często pomijanym aspektem protokołu 13,14. Chociaż przewidzenie optymalizacji, której wymaga żadna formuła GUV, nie jest możliwe, ten przewodnik zawiera przydatne wskazówki i spostrzeżenia, które przyspieszą wdrażanie nowatorskich GUV, potencjalnie prowadząc do zastosowań obejmujących sztuczne komórki i mikroroboty.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki te są częścią projektu CELLOIDS (Cell-inspired particle-based intelligent microrobots), który otrzymał dofinansowanie Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (umowa o grant nr 948590). Prace te były częściowo wspierane przez Komisję Europejską w ramach projektu NextGenerationEU BRIEF. Dziękujemy Michele Ibrahimi za wsparcie techniczne przy ustawianiu komory rękawicowej oraz za przydatną dyskusję na temat wdrożenia pojemnika do łatwego usuwania oleju.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m Membrana z mieszanych estrów celulozy  Filtry strzykawkoweMerckSLGSVR255F
Probówki 1,5 mlKlasa biologiczna06.0279.00
100 μ Szklana strzykawka LMerck20737
Zlewka 150 mlAvantor 213-1123Co najmniej 3
20 ml fiolki z ciemnego szkła ND24Avantor 548-9001A
2 ml probówkiKlasa biologiczna07.3534.99
Butla 50 mlAvantor 612-3843
500 μ Szklana strzykawka LHamilton549-1166
Probówka Falcon 50 mlMerckCLS352070
Strzykawka 50 ml Fisher NaukowyZobacz materiał 8SS50L1
Probówki 5 mlGreiner bio-one622201
Zlewka 600 mlAvantor 213-1126
Bü Kolba ChneraMerckZ740682
Pierścienie korkowe do kolb okrągłodennychAvantor 217-1000
KrystalizatorHolenderNumer katalogowy: 080474A
D-(+)-glukozaSigma-AldrichKontroler G8270
D-(+)-sacharozaSigma-AldrichZobacz materiał S9378
Cyfrowy termohigrometrBohlender powiedział:V1863-07
DOPC (Protokół DOPC)Badania Avanti850375C
WiertarkaDremel4000
Sól disodowa erioglaucyny (błękit brylantowy FCF)Sigma-Aldrich861146
Igła do strzykawki G18Terumo (Ziemia)AN1838R1
Igła do strzykawki G21Terumo (Ziemia)AN2138R1
Komora rękawicowaBel-ArtF50030-0000 powiedział:Jeśli to możliwe, można użyć schowka na rękawiczki, ale w laboratoriach o niskim poziomie wilgotności może to nie być konieczne
Mieszadło magnetyczne z płytą grzejnąSprzęt laboratoryjny LLG6.263 448
Lekki olej mineralnySigma-Aldrich330779
Nowa kokcynaSigma-Aldrich199737
O-ring z kauczuku nitrylowego O-ring, otwór 8 mm, średnica zewnętrzna 12 mmJęzyk RS196-4863
Otwarte nakrętki z przegrodą ND24Avantor 548-0031A
Mikropipeta P1000Fisher Naukowy12346132
Mikropipeta P10000Avantor 89079-978
Mikropipeta P200Fisher Naukowy12326132
Ręczniki papieroweAvantor KIMB6657
ParafilmAvantor 291-1214
Końcówki do pipet (1000)Eppendorf powiedział:0030000919
Końcówki do pipet (10000)Eppendorf powiedział:0030000765
Końcówki do pipet (200)Eppendorf powiedział:0030000870
Cząstki polistyrenu, 1,1 i mikro; mSigma-AldrichLB11-1ML
Gumowa nasadkaBioclass S.r.l.12.2300.05
Gumowa uszczelka stożkowaAvantor 217-0211
Nakrętki  Zobacz materiał ND24Avantor 548-0161A
Olej silikonowy AR20Sigma-Aldrich10836
Rura silikonowa (średnica wewnętrzna 1,6 mm, średnica zewnętrzna 3 mm)Język RS667-8441
Rura silikonowa (średnica wewnętrzna 6 mm, średnica zewnętrzna 12 mm)Język RS273-2541Co najmniej 6 m
Skrzyżowanie trójdrożneJęzyk RS795-405
Skrzyżowanie dwukierunkoweJęzyk RS419-7287
Zawór dwudrogowyKlekot91280
Woda ultraczystaThermo Fisher Naukowy 22934Jeśli jest to możliwe, produkt ten można zastąpić wodą oczyszczoną za pomocą systemów Milli-Q
Nożyczki uniwersalneBochem (Okręg wyborczy)4154

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Träuble, H., Grell, E. Carriers and specificity in membranes. IV. Model vesicles and membranes. The formation of asymmetrical spherical lecithin vesicles. Neurosci Res Program Bull. 9 (3), 373-380 (1971).
  2. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  3. Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
  4. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).
  5. Ernits, M., et al. Microfluidic production, stability and loading of synthetic giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 14 (1), 14071(2024).
  6. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), (2011).
  8. Elani, Y., Law, R. V., Ces, O. Vesicle-based artificial cells as chemical microreactors with spatially segregated reaction pathways. Nat Commun. 5 (1), 5305(2014).
  9. Heili, J. M., et al. Controlled exchange of protein and nucleic acid signals from and between synthetic minimal cells. Cell Syst. 15 (1), 49-62.e4 (2024).
  10. Shimane, Y., Kuruma, Y. Rapid and facile preparation of giant vesicles by the droplet transfer method for artificial cell construction. Front Bioeng Biotechnol. 10, 873854(2022).
  11. Sato, Y., Hiratsuka, Y., Kawamata, I., Murata, S., Nomura, S. M. Micrometer-sized molecular robot changes its shape in response to signal molecules. Sci Robot. 2 (4), eaal3735(2017).
  12. De Remigis, E., et al. Infiltration of cell-inspired ultra-deformable magnetic microrobots in restrictive environments. IEEE Trans Med Robot Bionics. 7 (1), 123-129 (2024).
  13. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the inverted emulsion method for high-yield production of biomimetic giant unilamellar vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  14. Zhang, Y., Obuchi, H., Toyota, T. A practical guide to preparation and applications of giant unilamellar vesicles formed via centrifugation of water-in-oil emulsion droplets. Membranes. 13 (4), 440(2023).
  15. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  16. Palagi, S. GUV-dimensional-analysis. , https://github.com/microrobotlab/GUV-dimensional-analysis/tree/v1.0 (2025).
  17. De Remigis, E., et al. Optimisation of encapsulation technique for confining microparticles in lipid membranes. Zenodo. 2023, DOI: 10.5281/zenodo.8069819 (2023).
  18. Dimova, R., Stano, P., Marques, C. M., Walde, P. Preparation methods for giant unilamellar vesicles. Giant Vesicle Book. , 3-20 (2019).
  19. Tyler, A. I. I., Greenfield, J. L., Seddon, J. M., Brooks, N. J., Purushothaman, S. Coupling phase behavior of fatty acid containing membranes to membrane bio-mechanics. Front Cell Dev Biol. 7, (2019).
  20. Hamada, S., et al. Giant vesicles functionally expressing membrane receptors for an insect pheromone. Chem Commun. 50 (22), 2958(2014).
  21. Roberti, E., Petrocelli, E. L., Cecchi, D., Palagi, S. Dimensions, stability, and deformability of DOPC-cholesterol giant unilamellar vesicles formed by droplet transfer. Open Res Eur. 5 (77), (2025).
  22. Weakly, H. M. J. Several common methods of making vesicles (except an emulsion method) capture intended lipid ratios. Biophys J. 123 (19), 3452-3462 (2024).
  23. Ito, H., et al. Dynamical formation of lipid bilayer vesicles from lipid-coated droplets across a planar monolayer at an oil/water interface. Soft Matter. 9 (40), 9539-9547 (2013).
  24. Reis, A., Spickett, C. M. Chemistry of phospholipid oxidation. Biochim Biophys Acta BBA Biomembr. 1818 (10), 2374-2387 (2012).
  25. Storage and handling of lipids. , https://avantiresearch.com/tech-support/storage-handling-of-lipids (2025).
  26. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  27. Faizi, H. A., Tsui, A., Dimova, R., Vlahovska, P. M. Bending rigidity, capacitance, and shear viscosity of giant vesicle membranes prepared by spontaneous swelling, electroformation, gel-assisted, and phase transfer methods: a comparative study. Langmuir. 38 (34), 10548-10557 (2022).
  28. Lehtinen, O. -P., et al. Effect of temperature, water content and free fatty acid on reverse micelle formation of phospholipids in vegetable oil. Colloids Surf B Biointerfaces. 160, 355-363 (2017).
  29. Takahashi, H., Ogawa, A. Preparation of a millimeter-sized supergiant liposome that allows for efficient, eukaryotic cell-free translation in the interior by spontaneous emulsion transfer. ACS Synth Biol. 9 (7), 1608-1614 (2020).
  30. Whittenton, J., Harendra, S., Pitchumani, R., Mohanty, K., Vipulanandan, C., Thevananther, S. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
  31. Hamada, T., Miura, Y., Komatsu, Y., Kishimoto, Y., Vestergaard, M., Takagi, M. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
  32. Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
  33. Hadorn, M., Boenzli, E., Hotz, P. E. A quantitative analytical method to test for salt effects on giant unilamellar vesicles. Sci Rep. 1 (1), 168(2011).
  34. Toparlak, ÖD., et al. Artificial cells drive neural differentiation. Sci Adv. 6 (38), eabb4920(2020).
  35. Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoc. 9 (7), 1578-1591 (2014).
  36. Matsushita-Ishiodori, Y., Hanczyc, M. M., Wang, A., Szostak, J. W., Yomo, T. Using imaging flow cytometry to quantify and optimize giant vesicle production by water-in-oil emulsion transfer methods. Langmuir. 35 (6), 2375-2382 (2019).
  37. Caliari, A., Hanczyc, M. M., Imai, M., Xu, J., Yomo, T. Quantification of giant unilamellar vesicle fusion products by high-throughput image analysis. Int J Mol Sci. 24 (9), 8241(2023).
  38. van Buren, L., Koenderink, G. H., Martinez-Torres, C. DisGUVery: a versatile open-source software for high-throughput image analysis of giant unilamellar vesicles. ACS Synth Biol. 12 (1), 120-135 (2023).
  39. Pazzi, J., Subramaniam, A. B. Nanoscale curvature promotes high yield spontaneous formation of cell-mimetic giant vesicles on nanocellulose paper. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (50), 56549-56561 (2020).
  40. Ekosso, C., Liu, H., Glagovich, A., Nguyen, D., Maurer, S., Schrier, J. Accelerating the discovery of abiotic vesicles with AI-guided automated experimentation. Langmuir. 41 (1), 858-867 (2025).
  41. Lee, I. -H., Passaro, S., Ozturk, S., Ureña, J., Wang, W. Intelligent fluorescence image analysis of giant unilamellar vesicles using convolutional neural network. BMC Bioinformatics. 23 (1), 48(2022).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Transfer emulsjibiologia syntetycznaenkapsulacja w p cherzykachzawiesina lipidowausuwanie fazy olejowejmikrorobotykaprotok wirowaniab ona fosfolipidowa

Powiązane artykuły