Artykuł metodologiczny

Jednoczesna analiza 3D uszkodzenia serca i odpowiedzi immunologicznej w ostrym zawale mięśnia sercowego z reperfuzją przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej arkusza światła

DOI:

10.3791/68347

⸱

26 września 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Vascular Medicine, West German Heart and Vascular Center, University Hospital Essen, 2Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG, 3Institute for Experimental Immunology and Imaging, University Hospital, University Duisburg-Essen

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trójwymiarowa (3D) rekonstrukcja uszkodzenia serca w reperfuzji ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI) umożliwia wierną kwantyfikację i kolokalizację powiązanych wzorców wpływających na chorobę. W tym przypadku zapewniono zautomatyzowane obrazowanie sterowane arkuszem świetlnym do jednoczesnego pomiaru uszkodzenia serca, obszaru ryzyka i odpowiedzi komórek odpornościowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożone interakcje komórkowe determinują funkcjonalną i strukturalną przebudowę tkanek podczas reperfuzyjnego ostrego zawału mięśnia sercowego (repAMI). Procesy te wykazują wyraźny rozkład przestrzenny, ponieważ uszkodzony mięsień sercowy jest podzielony na różne obszary (obszar uszkodzenia, obszar zagrożony (AAR) i obszar odległy). Trójwymiarowa (3D) wizualizacja tych obszarów jest niezbędna do analizy różnych interakcji między rezydentnymi komórkami serca a naciekającymi komórkami odpornościowymi, umożliwiając identyfikację możliwych celów leczenia. W tym miejscu opisano protokół jednoczesnej i zautomatyzowanej wizualizacji 3D i kwantyfikacji obszaru uszkodzenia serca, AAR i infiltrujących komórek odpornościowych (np. neutrofili) po repAMI. Obejmuje to dożytkowe barwienie obszaru uszkodzenia serca za pośrednictwem przeciwciał (neg CD31) i naciekanie neutrofili (Ly6G+) po wizualizacji ex vivo AAR poprzez wsteczną perfuzję przeciwciał i dalsze nietoksyczne oczyszczanie tkanek do obrazowania mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą arkusza świetlnego (LSFM). Technika ta pozwala na analizę przestrzenną komórek docelowych, np. infiltrujących komórki odpornościowe i uszkodzone obszary w nienaruszonym sercu myszy po repAMI. Tradycyjna histologia i immunohistochemia mogą być wykonywane po nietoksycznym oczyszczeniu tkanek i uzyskaniu obrazu za pomocą komputerowego przetwarzania końcowego. Pozwala to na zwielokrotnienie pozyskiwania informacji w tym samym sercu myszy, wzmacniając odporność danych i jest szczególnie istotne w przypadku bardzo złożonych urazów, takich jak repAMI.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uszkodzenie tkanek w reperfundowanym ostrym zawale mięśnia sercowego (repAMI) jest głównym czynnikiem napędzającym przebudowę serca i rozwój niewydolności serca1. Wiele miejscowych mediatorów i rezydentnych komórek serca, ale także naciekające komórki odpornościowe, wpływają na jego ekspansję w złożonej interakcji 2,3. Zrozumienie organizacji przestrzennej tych procesów jest niezbędne do zdobycia dogłębnej wiedzy potrzebnej do identyfikacji nowych celów terapeutycznych w celu ograniczenia uszkodzeń tkanek po repAMI i poprawy funkcji serca.

Ponieważ sam mięsień sercowy składa się z różnych typów komórek, szczegółowa analiza uszkodzenia serca jest trudna, ponieważ każdy typ komórek wykazuje swoją specyficzną zdolność odpornościową podczas niedokrwienia i uszkodzenia reperfuzyjnego 4,5. Jedną z ważnych cech charakterystycznych w kontekście repAMI jest znaczna utrata układu krwionośnego, której towarzyszy pogorszenie funkcji komórek śródbłonka6. Najbardziej znanym markerem używanym do przedstawiania struktury naczyniowej i analizy dysfunkcji śródbłonka u myszy i ludzi jest CD31 (znany również jako PECAM-1), cząsteczka adhezyjna ulegająca ekspresji na powierzchni komórki śródbłonka7. W różnych modelach niedokrwienia/reperfuzji utrata CD31 okazała się dobrym zastępczym markerem dla rozróżnienia uszkodzenia tkanki śródbłonka 8,9,10. Ponadto podczas repAMI rozróżnia się trzy główne przedziały urazowe w całym sercu. Tkanka serca niedotknięta urazem niedokrwienia/reperfuzji (I/R) reprezentuje odległy obszar. Mięsień sercowy za niedrożnością naczynia definiuje się jako obszar zagrożony (AAR)11,12. Po rozpoczęciu reperfuzji można różnicować wyraźny obszar tkanki serca wewnątrz AAR, który został uszkodzony przez poprzedzające niedokrwienie (obszar uszkodzenia)13. Konwencjonalna ocena uszkodzenia I/R serca u myszy wykorzystuje chlorek trifenylotetrazolu (TTC) w szeregowych grubych odcinkach wykazujących zmniejszoną aktywność metaboliczną uszkodzonych komórek serca13,14. Jednocześnie można dodać niebieskie barwienie ex vivo Evana w celu oznaczenia AAR15. Jednak te uznane metody mają kilka ograniczeń, w tym zmniejszoną możliwość jednoczesnej oceny infiltracji komórek odpornościowych, rozróżnienie uszkodzeń specyficznych dla typu komórki i dokładną rekonstrukcję tkanek 3D.

Mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych (LSFM) umożliwia wizualizację nienaruszonych, oczyszczonych całych narządów myszy z rozdzielczością sygnału fluorescencji aż do poziomu komórkowego. Niedawno wprowadzono ulepszoną nietoksyczną metodę oczyszczania tkanek z wykorzystaniem cynamonianu etylu (ECi) do wizualizacji 3D nienaruszonych serc myszy8. Aby rozwiązać problemy związane z niebieskim barwieniem TTC/Evana, zastosowano barwienie fluorescencyjne CD31 oparte na przeciwciałach dożyciowych, ujawniając uszkodzenie śródbłonka serca jako obszary bez barwienia CD31 (neg CD31) podczas repAMI8. Dodatkowe podanie ex vivo wstecznego wstrzyknięcia do aorty przeciwciałem anty-CD31 sprzężonym z fluoroforem o innym spektrum fluorescencji, jak w przypadku barwienia przyżyciowego, odpowiada za współczesny obraz 3D AAR. Co więcej, metodę tę można rozszerzyć poprzez dodanie barwienia neutrofili, co umożliwia analizę rozmieszczenia komórek oddzielonych przez odległy obszar, AAR i objętość uszkodzenia śródbłonka serca w celu lepszego zrozumienia funkcji neutrofili podczas repAMI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach doświadczalnych zostały zatwierdzone przez właściwą lokalną agencję rządową (AZ 81-02.04.2023.A059 - Landesamt für Natur-, Umwelt- und Verbraucherschutz (LANUV)) i były zgodne ze wszystkimi odpowiednimi przepisami etycznymi dotyczącymi testów i badań na zwierzętach. Eksperymenty przeprowadzono na samcach myszy C57BL/6J (w wieku 9-30 tygodni). Zwierzęta były trzymane i wykorzystywane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) w lokalnym pomieszczeniu dla zwierząt w cyklu dziennym i nocnym przez 12 godzin/12 godzin.

UWAGA: Wszystkie zabiegi chirurgiczne wykonywano w znieczuleniu dootrzewnowym przy użyciu ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) przy jednoczesnym podtrzymaniu izofluranu (1,5% obj.). Aby zmniejszyć cierpienie zwierząt, wszystkie zwierzęta otrzymały podskórne zastrzyki w dawce 0,1 mg/kg buprenorfiny przed i po znieczuleniu w ciągu dnia w połączeniu z buprenorfiną zawierającą wodę pitną przez noc. Chirurgiczny protokół indukcji repAMI został wcześniej opisany w innym miejscu16,17. Przed rozpoczęciem dożylnego wstrzykiwania przeciwciał należy przygotować dwie 6-centymetrowe szalki Petriego, które są używane do wstrzykiwania przeciwciał wstecznych ex vivo w późniejszych krokach opisanych poniżej. Jedna płytka szalka Petriego z PBS na lodzie jest potrzebna do surowego usunięcia nadmiaru otaczającej tkanki z serca (zaleca się użycie pociętych na wymiar kawałków gazy wewnątrz naczynia, aby ułatwić późniejszy proces obróbki). Do kaniulacji aorty potrzebne jest inne naczynie z stalową igłą kaniuli o sile 20 G zanurzoną w PBS na lodzie z luźnym węzłem szwu 5-0 nad wcięciem kaniuli. Unikaj lub usuwaj pęcherzyki powietrza wewnątrz kaniuli, ponieważ mogą one blokować naczynia wieńcowe i uniemożliwiać całkowitą perfuzję.

1. Wstrzyknięcie przeciwciał dożylnych

  1. Znieczulić mysz za pomocą ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).
  2. Wstrzyknąć po 10 μg bezpośrednio znakowanych mysich przeciwciał anty-CD31 (klon: MEC13.3; fluorofor: AlexaFluor 790) i mysich przeciwciał anty-Ly6G (klon: 1A8; fluorofor: AlexaFluor 647) w PBS o całkowitej objętości 5 μl na g masy ciała (100 μl dla myszy 20 g) poprzez dożylne wstrzyknięcie do żyły ogonowej.
    UWAGA: To wstrzyknięcie przeciwciała oznaczy cały śródbłonek wewnątrz serca i ma na celu ilościowe określenie wielkości uszkodzenia repAMI.
  3. Pozwól wstrzykniętym przeciwciałom krążyć przez 10 minut przed kontynuowaniem zabiegu.

2. Zbieranie serc

UWAGA: Sekcje 2 i 3 są krytyczne czasowo i muszą zostać ukończone w mniej niż 6 minut.

  1. Zwierzę należy uśmiercić przez zwichnięcie szyjki macicy 10 minut po wstrzyknięciu przeciwciał. Sprawdź śmierć, oceniając odruchy.
    UWAGA: Jeśli potrzebne są próbki krwi, pobierz je przed przejściem do następnego kroku.
  2. Umieść mysz pod mikroskopem stereoskopowym.
  3. Otworzyć jamę klatki piersiowej i naciąć odsłoniętą żyłę główną górną w pobliżu wyjścia naczynia z klatki piersiowej do szyi.
    UWAGA: Utrzymuj aortę w stanie nienaruszonym, ponieważ jest potrzebna do wstrzyknięcia przeciwciał wstecznych ex vivo .
  4. Perfuzję serca in situ przez małżowinę uszną prawego i lewego przedsionka za pomocą PBS zawierającego heparynę (20 IE/ml) za pomocą igły 27 G z pompką rolkową (70 μl/s) łącznie przez 3 minuty. Wystarczające usunięcie krwi w sercu staje się zauważalne poprzez zanikanie powierzchownego rysunku naczyniowego serca oraz wybielanie płuc i wątroby.
    UWAGA: Należy unikać perfuzji serca przez prawą lub lewą komorę, ponieważ może to powodować artefakty obrazowania podczas mikroskopii fluorescencyjnej w arkuszu świetlnym.
  5. Wyciąć serce i co najmniej 5 mm pozostałej aorty wraz z otaczającą tkanką płucną.
    UWAGA: Nie trzymaj mięśnia sercowego bezpośrednio podczas wycinania, aby uniknąć uszkodzenia tkanek i artefaktów obrazowania podczas mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego.

3. Wstrzyknięcie przeciwciał wstecznych ex vivo

  1. Przenieś serce na 6 cm szalkę Petriego z przygotowanym wcześniej lodowatym PBS i gazą.
  2. Odetnij pozostałą otaczającą tkankę płucną, tłuszczową i naczyniową, aż pozostanie tylko serce z aortą o średnicy około 5 mm.
  3. Przenieś serce do przygotowanego naczynia do kaniulacji aorty.
  4. Przeciągnij pozostałą aortę przez stalową kaniulę 20 G i podwiąż ją szwem 50 przed węzłem do wcięcia kaniuli.
    UWAGA: Końcówkę kaniuli należy docisnąć blisko zastawki aortalnej, aby zapewnić brak wycieku płynu perfuzyjnego.
  5. Ponownie podwiązać lewą przednią tętnicę zstępującą (LAD) na stałe za pomocą szwu 6-0 dokładnie w miejscu, w którym wcześniej użyto do indukcji repAMI.
  6. Wstrzyknąć 400 μl PBS zawierającego 20 μg mysiego przeciwciała anty-CD31 (klon: MEC13.3), znakowanego AlexaFluor 546, wstecznie przez wprowadzoną kaniulę.
    UWAGA: Zamknij połączenie między strzykawką do wstrzykiwań a włożoną kaniulą folią uszczelniającą, aby zapewnić całkowitą perfuzję przeciwciał przez tętnice wieńcowe. To wstrzyknięcie przeciwciała zabarwi śródbłonek tylko poza AAR i dlatego może być wykorzystane do ilościowego określenia AAR.
  7. Wyciągnij włożoną kaniulę z aorty.
  8. Przenieść serce do 15 ml polipropylenowej probówki reakcyjnej zawierającej 10 ml 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubować bez mieszania przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności.

4. Przetwarzanie i rozliczanie próbek

  1. Myć zafiksowane serce w trzech zmianach po 5 ml PBS przez 10 minut każda, w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności, zawsze mieszając z obrotem prawie nad głową, w polipropylenowych probówkach reakcyjnych o pojemności 5 ml.
  2. Odwodnić utrwalone serce w serii 5 ml rosnącego etanolu w 50%, 70% i 100% w wodzie dejonizowanej, każdy przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej w ciemności, zawsze mieszając z obrotem zbliżonym do napowietrznej w probówkach reakcyjnych z polipropylenu o pojemności 5 ml.
    UWAGA: Inkubację w 50% i 70% etanolu można przedłużyć do następnego dnia, natomiast inkubację w 100% etanolu można przedłużyć do 3 dni.
  3. Wybielać odwodnione serce w 15 ml polipropylenowych probówkach reakcyjnych zawierających 10 ml 100% etanolu z 5% DMSO i 5% H2O2 bez mieszania przez 4 godziny w temperaturze 4 °C w ciemności.
    UWAGA: Podczas procesu wybielania wewnątrz rurki może narastać ciśnienie; Zachowaj ostrożność podczas późniejszego otwierania tubki.
  4. Umyj wybielone serce w 5 ml 100% etanolu trzy razy przez 12 godzin każdy w temperaturze pokojowej w ciemności, zawsze mieszając z obrotem prawie nad głową w polipropylenowych probówkach reakcyjnych o pojemności 5 ml.
    UWAGA: Każdy etap inkubacji można przedłużyć do 3 dni.
  5. Przenieść serce do 5 ml polipropylenowej probówki reakcyjnej zawierającej 4 ml cynamianu etylu (ECi) w celu oczyszczenia tkanek i inkubować bez mieszania przez 3 dni w temperaturze pokojowej w ciemności.
    UWAGA: Oczyszczone serce może pozostać w ECi przez co najmniej 3 miesiące bez spadku intensywności fluorescencji przy prawidłowym przechowywaniu w ciemności w temperaturze RT. Nie przechowywać ECi ani próbek przechowywanych w ECi w temperaturze poniżej 6 °C, ponieważ ECi zamarza w tej temperaturze, uszkadzając próbkę w procesie.

5. Przygotowanie bloczków gumy gellan

  1. Wymieszaj 1 g gumy gellan w proszku w 100 ml podgrzanej wody z kranu (50-60 °C).
  2. Pozostaw do wymieszania za pomocą mieszadła magnetycznego do całkowitego rozpuszczenia.
    UWAGA: Jeśli proszek nie rozpuszcza się prawidłowo, podgrzej roztwór, aż zagotuje się w kuchence mikrofalowej.
  3. Przefiltruj roztwór gumy gellan przez sitko o pojemności 100 μm.
  4. Przefiltrowany roztwór przesączyć na płytką płytkę Petriego o średnicy 10 cm.
  5. Pozostaw do ostygnięcia, aż żel stwardnieje.
  6. Pokrój żel na bloki po 15 mm, 15 mm, 5 mm.
  7. Odwodnić bloki w 50 ml wznoszącej się serii etanolu przy 50% i 70% w wodzie dejonizowanej, każdy przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej, zawsze mieszając z obrotem zbliżonym do napowietrznej w jednej probówce reakcyjnej z polipropylenu o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Napełnij rurkę reakcyjną etanolem po dodaniu bloków żelu. Probówkę reakcyjną należy napełniać tylko do połowy blokami żelu.
  8. Odwodnione bloki inkubować w 50 ml 100% etanolu trzy razy przez 12 godzin każdy w temperaturze pokojowej, zawsze mieszając z obrotem zbliżonym do napowietrznej w jednej probówce reakcyjnej z polipropylenu o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Napełnij rurkę reakcyjną etanolem po dodaniu bloków żelu. Probówkę reakcyjną należy napełniać tylko do połowy blokami żelu. Bloki żelu mogą pozostawać w ostatniej probówce reakcyjnej ze 100% etanolem przez dłuższy czas, aż do oczyszczenia w ECi.
  9. Przenieść bloki do probówki reakcyjnej z polipropylenu o pojemności 50 ml zawierającej 25 ml ECi i inkubować bez mieszania przez 3 dni w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Umieść tylko kilka bloków w jednej probówce reakcyjnej z ECi, aby uniknąć usuwania artefaktów. Oczyszczone bloki mogą pozostawać w ECi przez co najmniej 6 miesięcy i być przechowywane w RT.

6. Obrazowanie

  1. Wytnij oczyszczone bloki gumy gellan do rozmiaru potrzebnego do ustabilizowania oczyszczonego serca w uchwycie na próbkę mikroskopu.
    UWAGA: Bloki gumy Gellan mogą być wielokrotnie używane.
  2. Wykrywanie sygnałów fluorescencyjnych będących przedmiotem zainteresowania (autofluorescencja, barwienie AAR [przeciwciało anty-CD31 znakowane AlexaFluor 546], przeciwciało anty-Ly6G sprzężone z AlexaFluor647 i barwienieneg CD31 [przeciwciało anty-CD31 znakowane AlexaFluor 790]) z odpowiednimi ustawieniami filtra wzbudzenia i emisji. Do akwizycji należy użyć soczewki obiektywowej 0,1 NA o odległości roboczej 17,6 mm.
    UWAGA: Wykrywaj sygnały za pomocą lasera ze światłem białym (200 mW; 480-2400 nm). Do wykrywania autofluorescencji pochodzącej z tkanki łącznej należy użyć filtra wzbudzenia pasmowoprzepustowego 470/30 nm i filtra emisyjnego pasmowoprzepustowego 525/50 nm; Barwienie CD31 przeciwciałem sprzężonym z AlexaFluor 546 wykrywa się za pomocą filtra wzbudzenia pasmowoprzepustowego 520/40 nm i filtra emisyjnego pasmowoprzepustowego 585/40 nm; Barwienie Ly6G przeciwciałem sprzężonym z AlexaFluor 647 wykrywa się za pomocą filtra wzbudzenia pasmowoprzepustowego 630/30 nm i filtra emisyjnego pasmowoprzepustowego 680/30 nm; Barwienie CD31 przeciwciałem sprzężonym z AlexaFluor 790 wykrywa się za pomocą filtra wzbudzenia pasmowoprzepustowego 740/40 nm i filtra emisyjnego pasmowoprzepustowego 824/55 nm. Czasy oświetlenia i procentowe tłumienie lasera należy dostosować do jakości sygnału.
  3. Wybierz następujące ustawienia dla obrazowania w mikroskopii z użyciem lekkich arkuszy:
    1. Wybierz arkusz NA o grubości 0,079, co daje lekką grubość arkusza 5 μm.
    2. Wybierz 10 μm jako odległość między dwiema pojedynczymi płaszczyznami z.
      UWAGA: Powoduje to niedostateczne próbkowanie, a następnie utratę precyzji śledzenia i pomiarów objętości. Aby tego uniknąć, odległość między dwiema pojedynczymi płaszczyznami Z powinna być równa połowie grubości lekkiego arkusza, czyli w tym przypadku 2,5 μm. W tym badaniu zdecydowano się na niedostateczne próbkowanie danych, ponieważ korzyści uzyskane dzięki skróceniu czasu obrazowania i skróceniu rozmiaru stosu danych przeważają nad minimalną utratą precyzji analizy.
    3. Użyj arkusza o szerokości 100%, aby uzyskać jednorodne oświetlenie próbki.

7. Przetwarzanie końcowe obrazu

UWAGA: Pozyskane cyfrowe dane obrazowe były dalej przetwarzane przy użyciu naukowego oprogramowania do przetwarzania i analizy obrazów 3D wymienionego w Tabeli Materiałów.

  1. Uruchom oprogramowanie Imaris file converter 10.1 i załaduj surowy zestaw danych do oprogramowania, przeciągając i upuszczając folder z plikami obrazów do okna konwertera plików Imaris lub klikając Przeglądaj i przechodząc do folderu z plikami obrazów.
  2. Wybierz folder wyjściowy za pomocą opcji Wybierz folder.
  3. Kliknij Rozpocznij wszystko i poczekaj, aż pliki zostaną przekonwertowane na pliki .ims Imaris.
  4. Uruchom oprogramowanie i wybierz opcję Surpass w lewym górnym rogu.
  5. Otwórz stosy obrazów, wybierając pozycję Otwórz i wybierz odpowiedni plik danych .ims.
  6. Aby utworzyć automatycznie wygenerowaną powierzchnię całego serca, wybierz opcję Widok 3D i Powierzchnie.
  7. Wybierz opcję Segment only a Region of Interest, Process Whole Image finally (Przetwarzaj cały obraz) i Object-Object Statistics (Statystyki obiektu), jednocześnie wyłączając opcję Klasyfikuj powierzchnie w sekcji Algorithm Settings (Ustawienia algorytmu ).
    UWAGA: Włączenie statystyk obiekt-obiekt umożliwia obliczanie nakładania różnych powierzchni i funkcji punktowych.
  8. Kliknij przycisk niebieskiej strzałki w prawym dolnym rogu okna Utwórz arkusz, aby przejść do kolejnych kroków.
  9. Określ trójwymiarowy obszar zainteresowania za pomocą manipulatorów znajdujących się w widoku obrazu.
  10. Przejdź do następnego kroku, wybierając kanał źródłowy (kanał autofluorescencji).
  11. Włącz opcję Gładki i wybierz ustawienie domyślne 11,8 μm.
  12. Przejdź do następnego kroku i określ próg potrzebny do stworzenia optycznie satysfakcjonującej trójwymiarowej powierzchni pojawiającej się w widoku obrazu.
  13. W ostatnim kroku dostosuj filtr powierzchniowy, wybierając liczbę wokseli jako typ filtra i określając 10 jako próg.
  14. Utwórz powierzchnię, klikając przycisk zielonej strzałki w prawym dolnym rogu sekcji Utwórz . Korzystając z arkusza Kolor , zmień materiał i kolor utworzonej powierzchni zgodnie z wymaganiami.
  15. Wygeneruj dwie dodatkowe ręcznie utworzone powierzchnie dla AAR (objętośćneg CD31 w kanale AlexaFluor 546) i objętości uszkodzenia śródbłonka serca (objętośćneg CD31 w kanale AlexaFluor 790), wybierając ponownie Widok 3D i Powierzchnie .
  16. Wybierz opcję Segmentuj tylko obszar zainteresowania, Przetwarzaj cały obraz na koniec i Statystyka obiektu-obiektu , wyłączając opcję Klasyfikuj powierzchnie w sekcji Ustawienia algorytmu , a następnie kliknij opcję Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie.
  17. Wewnątrz arkusza Board (Tablica ) wybierz XY dla orientacji, Brak dla widoczności i ręcznie dostosuj kontroler rozdzielczości do maksimum.
  18. Przejdź do arkusza modelu , kliknij ikonę Odległość i ustaw odstępy między wierzchołkami na 100 μm.
  19. Włącz opcję Rysuj i otaczaj obszaryneg CD31 w kanale AlexaFluor 546 lub kanale AlexaFluor 790 co 10 wycinków obrazu.
  20. Po zakończeniu otaczania wszystkich odpowiednich obszarów wybierz Autofit i Wykonaj Autofit.
  21. Kliknij przycisk Utwórz powierzchnię i dostosuj materiał i kolor wygenerowanych powierzchni w arkuszu kolorów .
  22. Aby wyświetlić neutrofile jako plamki Ly6G+ , wygeneruj funkcję spot, wybierając Widok 3D i Spots.
  23. Wybierz opcję Segmentuj tylko obszar zainteresowania, Przetwarzaj cały obraz na koniec i Statystyki obiektu-obiektu , wyłączając opcję Klasyfikuj miejsca w sekcji Ustawienia algorytmu .
  24. Przejdź do kolejnych kroków, używając przycisku z niebieską strzałką w prawym dolnym rogu arkusza tworzenia .
  25. Określ trójwymiarowy obszar zainteresowania za pomocą manipulatorów znajdujących się w widoku obrazu, jak wspomniano powyżej.
  26. Przejdź do następnego kroku, korzystając z kanału źródłowego (kanał AlexaFluor 647).
  27. Ustaw szacowaną średnicę XY na 10 μm, włącz modelowe wydłużenie PSF wzdłuż osi Z i ustaw szacowaną średnicę Z na 20 μm.
  28. Wyłącz odejmowanie tła.
  29. Przejdź do następnego kroku, wybierz Intensywność Min jako filtr i ustaw odpowiedni próg.
    UWAGA: Aby oszacować poziom progowy, kliknij Slice w górnej części okna programu i wybierz kanał AlexaFluor 647. Przesuń kursor nad różne miejsca w wycinku surowego obrazu reprezentujące dodatnie barwienie Ly6G i odczytaj wartość intensywności w lewym dolnym rogu okna programu.
  30. Generuj spoty, klikając przycisk zielonej strzałki w prawym dolnym rogu arkusza Utwórz .
  31. Ustaw Skalę promienia na 3,0 w sekcji Styl/jakość punktów w arkuszu tworzenia .
  32. Dostałem się do arkusza kolorów , aby dostosować kolor dodatkowy zgodnie z potrzebami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione podejście wykorzystujące mikroskopię fluorescencyjną arkuszy świetlnych (LSFM) pozwala na jednoczesną analizę AAR, uszkodzenia śródbłonka i infiltracji neutrofili po repAMI. Rysunek 1A ilustruje barwienie przeciwciałami przyżyciowymi i ex vivo myszy C57BL / 6J 24 godziny po indukcji repAMI. Przeciwciała do barwienia uszkodzenia śródbłonka serca (anty-CD31 znakowane AlexaFluor 790) i nacieku neutrofili (anty-Ly6G znakowane AlexaFluor 647) wstrzykiwano dożylnie 10 minut ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka jednostek obrazujących do wykrywania uszkodzenia tkanki serca podczas repAMI u myszy. Techniki te mają różne zalety, ale mają też ograniczenia. Barwienie zmniejszonej aktywności metabolicznej komórek serca za pomocą TTC jest najczęściej stosowaną metodą ilościowego oznaczania uszkodzenia I/R serca i może być łączone z niebieskim barwieniem Evana w celu rozróżnienia AAR 13,14,15. Jest to szybka i opłacalna metoda, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elias Haj-Yehia informuje o honorariach osobistych i innych od AstraZeneca, które wykraczają poza zgłoszoną pracę. Simon F. Merz i Lea Bornemann są obecnie zatrudnieni w Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG. Matthias Totzeck i Tienush Rassaf informują o honorariach osobistych, a inne od Edwards and Novartis, Bristol Myers Squibb, Bayer, Daiichi Sankyo i Astra Zeneca nie znajdują się w zgłoszonej pracy. Tienush Rassaf i Ulrike B. Hendgen-Cotta założyli Bimyo, firmę zajmującą się rozwojem peptydów kardioprotekcyjnych. Matthias Gunzer otrzymał ogólne fundusze na badania od Miltenyi BioTec B.V. & Co. KG. Wszyscy pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy wymieniają następujące źródła finansowania: Niemiecka Fundacja Badawcza (UMEA Clinician Scientist, FU 356/12-2, Elias Haj-Yehia; HE6317/2-1, Ulrike Hendgen-Cotta, RA969/12-1, Tienush Rassaf) oraz Niemieckie Towarzystwo Kardiologiczne (DGK, Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V., DGK02/2022, Elias Haj-Yehia). Część tych prac została wykonana w Centrum Obrazowania w Essen (IMCES), podstawowym obiekcie usługowym Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Duisburg-Essen w Niemczech. Dziękujemy pracownikom IMCES za nieustanne wsparcie techniczne i korzystanie z ich urządzeń.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła 27 GBecton Dickinson305889BD Zaćmienie
Przetwarzanie obrazu 3D i Oprogramowanie analitycznePłaszczyzna bitowaVers. 10.1.0Imaris powiedział:
Szew 5-0Serag-WiessnerIC108000Jedwab
6-0 szewEtykaEH7814 powiedział:Prolen
Zestaw do znakowania przeciwciał AlexaFluor 546InvitrogenA20183
Zestaw do znakowania przeciwciał AlexaFluor 790InvitrogenA20189
Przeciwciało przeciw myszom Ly6G (AlexaFluor 647)Legenda biologiczna127610Klon: 1A8
Sitko do komórek (100 &mikro; m)Corning431752
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Carla Rotha7029.1
EtanolCarla Rotha0911.4
Cyneninian etylu (ECi)Sigma-Aldrich112372
Oprogramowanie do konwersji plikówPłaszczyzna bitowaVers. 10.1.0Imaris powiedział:
GazaFuhrmann powiedział:10021
Guma gellan w proszkuSigma-AldrichZobacz materiał P8169Fitagel
Heparyna (25 000 IE/5 mL)LEO Pharma15261203
Nadtlenek wodoru (H2O2, 30%)Carla Rotha8070.2
Strzykawka do wstrzykiwańB Braun9161502SOmnican F
Ketamin (100 mg/ml)Bela-Pharma402581.00.00
System mikroskopu z arkuszami świetlnymiMiltenyi Biotec-Ultramikroskop Blaze
Strzykawka typu luer lockBecton Dickinson303172BD Plastipak
Mieszadło magnetyczneFirma VWR444-0572
Kamera Neo sCMOS (4,2 MP)Technologia AndorOgniwo ZL41 4.2
CelMiltenyi Biotec130-133-625MI Plan 1.1x NA 0.1, WD 17.6 mm
Paraformaldehyd (PFA, 4%)Sigma-Aldrich1.0049610% formalina, neutralnie buforowana
szalka PetriegoGreiner Bio-One632181
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco (firma Gibco)14190-094Bez MgCl2/CaCl2
Rurka polipropylenowa (15 ml)Greiner Bio-One188261
Rurka polipropylenowa (5 mL)Carla RothaEKY9.1Czarny
Rurka polipropylenowa (50 ml)Greiner Bio-One227261
Naczynie przygotowawcze do kaniulacji serca myszyHugo Sachs Elektronik73-4327Kaniula w zestawie
Oczyszczone przeciwciało anty-mysie CD31Becton Dickinson53369Klon: MEC13.3
Pompa rolkowaIsmatec powiedział:ISM597-230 powiedział:
Folia uszczelniającaBemisPM-996 (wersja angielska)Parafilm
Mikroskop stereoskopowyKsięga LeicaS6D
Rotator rurowyHeidolph powiedział:Polimax 1040 powiedział:
Laser ze światłem białymFotonika NKTEkstremalne SuperK200 mW, 480– 2400 nm
Szczep myszy WTLaboratoria Janvier-C57BL/6JRj
Ksylazyna (2%)Ceva Tiergesundheit6324464.00.00

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).
  2. Frangogiannis, N. G. Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration. Curr Opin Cardiol. 30 (3), 240-245 (2015).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction: from inflammation to fibrosis. Circ Res. 119 (1), 91-112 (2016).
  4. Koch, A., et al. Capillary endothelia and cardiomyocytes differ in vulnerability to ischemia/reperfusion during clinical heart transplantation. Eur J Cardiothorac Surg. 20 (5), 996-1001 (2001).
  5. Singhal, A. K., Symons, J. D., Boudina, S., Jaishy, B., Shiu, Y. T. Role of endothelial cells in myocardial ischemia-reperfusion injury. Vasc Dis Prev. 7, 1-14 (2010).
  6. Robbers, L. F., et al. Magnetic resonance imaging-defined areas of microvascular obstruction after acute myocardial infarction represent microvascular destruction and haemorrhage. Eur Heart J. 34 (30), 2346-2353 (2013).
  7. DeLisser, H. M., Newman, P. J., Albelda, S. M. Molecular and functional aspects of PECAM-1/CD31. Immunol Today. 15 (10), 490-495 (1994).
  8. Merz, S. F., et al. Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response. Nat Commun. 10 (1), 2312(2019).
  9. Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model. Sci Rep. 9 (1), 507(2019).
  10. Zhong, X., et al. Tubular epithelial cells-derived small extracellular vesicle-VEGF-A promotes peritubular capillary repair in ischemic kidney injury. NPJ Regen Med. 7 (1), 73(2022).
  11. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17 (4), 268-272 (2012).
  12. Arai, A. E. Magnetic resonance imaging for area at risk, myocardial infarction, and myocardial salvage. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 313-320 (2011).
  13. Botker, H. E., et al. Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection. Basic Res Cardiol. 113 (5), 39(2018).
  14. Rassaf, T., et al. Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning. Circ Res. 114 (10), 1601-1610 (2014).
  15. Haj-Yehia, E., et al. CD47 blockade enhances phagocytosis of cardiac cell debris by neutrophils. IJC Heart Vasculature. 48, 101269(2023).
  16. Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., French, B. A., Rassaf, T. A practical approach to remote ischemic preconditioning and ischemic preconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury. J Biol Methods. 3 (4), e57(2016).
  17. Michel, L., et al. Real-time pressure-volume analysis of acute myocardial infarction in mice. J Vis Exp. (137), e57621(2018).
  18. Ojha, N., et al. Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2435-H2443 (2008).
  19. Clasen, L., et al. Cardiac ischemia and reperfusion in mice: a comprehensive hemodynamic, electrocardiographic and electrophysiological characterization. Sci Rep. 13 (1), 5693(2023).
  20. Lang, C. I., et al. Expedient assessment of post-infarct remodeling by native cardiac magnetic resonance imaging in mice. Sci Rep. 11 (1), 11625(2021).
  21. Coolen, B. F., et al. Three-dimensional T1 mapping of the mouse heart using variable flip angle steady-state MR imaging. NMR Biomed. 24 (2), 154-162 (2011).
  22. Zhong, X., et al. Comprehensive cardiovascular magnetic resonance of myocardial mechanics in mice using three-dimensional cine DENSE. J Cardiovasc Magn Reson. 13 (1), 83(2011).
  23. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  25. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nat Commun. 10 (1), 1944(2019).
  26. Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. Quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy. J Vis Exp. (123), e55450(2017).
  27. Taki, J., et al. 14C-Methionine uptake as a potential marker of inflammatory processes after myocardial ischemia and reperfusion. J Nucl Med. 54 (3), 431-436 (2013).
  28. Michel, L., et al. PD1 deficiency modifies cardiac immunity during baseline conditions and in reperfused acute myocardial infarction. Int J Mol Sci. 23 (14), 7533(2022).
  29. Park, K. C., Gaze, D. C., Collinson, P. O., Marber, M. S. Cardiac troponins: from myocardial infarction to chronic disease. Cardiovasc Res. 113 (14), 1708-1718 (2017).
  30. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Curr Protoc Neurosci. 81 (2), 28.21-28.28 (2017).
  31. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using light sheet microscopy. J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).
  32. Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nat Protoc. 16 (6), 2732-2748 (2021).
  33. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  34. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  35. Merz, S. F., et al. High-resolution three-dimensional imaging for precise staging in melanoma. Eur J Cancer. 159, 182-193 (2021).
  36. Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation. Front Immunol. 11, 599495(2020).
  37. Pichardo, A. H., et al. Optical tissue clearing to study the intra-pulmonary biodistribution of intravenously delivered mesenchymal stromal cells and their interactions with host lung cells. Int J Mol Sci. 23 (22), 14171(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia arkusza wiat aanaliza uszkodze sercaodpowied immunologiczna serca3D zawa u mi nia sercowegoprzeja nianie tkanekinfiltracja neutrofiliobszar zagro onybarwienie przeciwcia amiuszkodzenie r db onkaobrazowanie serca 3D

Powiązane artykuły