Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany model myszy do indukowania raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelita grubego przy użyciu azoksymetanu i siarczanu dekstranu sodu do badań immunologicznych i terapeutycznych nowotworów

DOI:

10.3791/68351

⸱

25 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Therapeutics, University of Florida College of Medicine, 2Department of Anatomy and Cell Biology, University of Florida College of Medicine, 3Department of Immunology, H. Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute, 4University of Florida Health Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak jelita grubego wywołany zapaleniem jelita grubego wywołany przez azoksymetan (AOM)/siarczan dekstranu (DSS) jest sprawdzonym i opłacalnym podejściem do modelowania autochtonicznych guzów jelita grubego u myszy. Przedstawiamy zaktualizowany protokół i omawiamy kluczowe kwestie dotyczące optymalizacji dawki DSS w zależności od płci oraz wpływu mikrobiomu na rygor, odporność i odtwarzalność.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Azoksymetan (AOM, czynnik uszkadzający DNA) i siarczan dekstranu sodowy (DSS, środek wspomagający zapalenie jelita grubego) mogą indukować nowotwory w jelicie grubym myszy o wysokiej penetracji. Model raka jelita grubego związanego z mysim zapaleniem jelita grubego (CAC) indukowany przez AOM/DSS stanowi złoty standard w badaniu raka jelita grubego związanego ze stanem zapalnym, biorąc pod uwagę jego dokładność w rekapitulacji charakterystyki klinicznej ludzkiego CAC. Do zalet modelu należą: jego pochodzenie i rozwój z tkanki endogennej, kompetencja immunologiczna zachowująca pełny repertuar interakcji nowotwor-układ immunologiczny, zdolność adaptacji do wielu szczepów myszy, wygoda 3-miesięcznego opóźnienia oraz stosunkowo niskie koszty. Pomimo tych zalet, kilka wyzwań ogranicza skuteczność protokołu. Zmienność w dawkowaniu DSS i penetracji guza w różnych badaniach prowadzi do niespójnych obserwacji. Ponadto różnice w mikrobiocie jelitowej przyczyniają się do zwiększonej zmienności eksperymentalnej, co negatywnie wpływa na moc statystyczną. Różnice płci w odpowiedzi na OZUZ/DSS dodatkowo komplikują interpretację wyników. Co więcej, zmienność DSS między partiami utrudnia odtwarzalność wyników. Sprostanie tym wyzwaniom ma kluczowe znaczenie dla zwiększenia wiarygodności i możliwości zastosowania tego modelu w badaniach przedklinicznych. Aby rozwiązać ten problem, wykorzystując myszy C57BL/6J jako model, udoskonaliliśmy ustalony protokół o strategie skutecznej optymalizacji w celu zwiększenia odtwarzalności i harmonizacji między badaniami. Obejmują one zalecenia dotyczące miareczkowania dawki DSS zarówno u samców, jak i samic myszy, wdrożenie homogenizacji mikrobioty przed każdym cyklem DSS w celu złagodzenia niejednorodności flory jelitowej między klatkami. Etapy te znacznie zmniejszyły zmienność i poprawiły odtwarzalność, co zaowocowało solidną indukcją CAC. Uznając kluczową rolę stanu zapalnego i komórkowych mechanizmów immunologicznych w rozwoju CAC, protokół opisuje również procedury przetwarzania tkanek odpowiednie do izolacji RNA lub białka oraz do profilowania cytokin zapalnych z guzów okrężnicy i otaczającej tkanki okrężnicy. Ostatecznie, zastosowanie tej metody zapewnia bardziej rygorystyczną, solidną i powtarzalną produkcję CAC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak jelita grubego (CRC) jest trzecim najczęściej występującym nowotworem na świecie i główną przyczyną zgonów związanych z rakiem1,2. W porównaniu ze sporadycznym CRC, rak jelita grubego związany z zapaleniem jelita grubego (CAC) powstaje w wyniku długotrwałego, powtarzającego się uszkodzenia jelit u pacjentów z nieswoistym zapaleniem jelit (IBD)3,4, charakteryzuje się wyższym stopniem złośliwości i tendencją do wieloogniskowej prezentacji w młodszym wieku. Ze względu na te czynniki, CAC na ogół wymaga bardziej agresywnego leczenia z mniej korzystnymi wynikami klinicznymi5. Chociaż CAC jest uważany za odrębną jednostkę, przynajmniej częściowo, ze względu na unikalny czas nabycia mutacji i nadmierną rolę zapalnych mechanizmów immunologicznych i mikrobiomu, CAC i sporadyczne CRC mają wiele podobieństw w odniesieniu do ogólnych krajobrazów genomowych i cech patogenetycznych. Aby pogłębić naszą wiedzę na temat raka jelita grubego w ogóle, a CAC w szczególności, oraz aby udoskonalić strategie terapeutyczne, niezbędne są solidne modele przedkliniczne.

Wśród różnych modeli używanych do badania CRC, najczęściej stosowany jest model CAC indukowany przez AOM/DSS i jest uważany za obecny złoty standard6,7. Model ten, zapoczątkowany silną mutagenną zniewagą spowodowaną przez OZUZ, opiera się na powtarzających się atakach zapalenia jelita grubego wywołanych przez DSS, które ściśle naśladują ludzkie IBD, takich jak choroba Leśniowskiego-Crohna i wrzodziejące zapalenie jelita grubego, które są dobrze znanymi czynnikami ryzyka CAC8. Model AOM/DSS ma kilka kluczowych zalet w porównaniu z innymi podejściami in vivo. W przeciwieństwie do metod polegających na wstrzyknięciu egzogennego materiału inicjującego raka w celu ustalenia guzów bocznych lub nawet ortotopowych, CAC indukowany przez AOM/DSS jest autochtoniczny, co oznacza, że inicjacja guza następuje endogennie, a progresja raka rozwija się w natywnym mikrośrodowisku tkankowym, co lepiej odzwierciedla jego biologię i historię naturalną. W przeciwieństwie do ksenoprzeszczepów ludzkich linii komórkowych lub materiału pochodzącego od pacjenta, który może być hodowany tylko u myszy z obniżoną odpornością, jest immunokompetentny, co umożliwia badanie interakcji rak-układ odpornościowy. W przeciwieństwie do genetycznie modyfikowanych modeli wytwarzających nowotwory z określonymi czynnikami genetycznymi, jest niezależny od predefiniowanych mutacji, co pozwala na szersze modelowanie szlaków sygnałowych raka i mechanizmów edukacji immunologicznej. Wreszcie, model AOM/DSS można łatwo dostosować do wielu różnych szczepów myszy, eliminując potrzebę długotrwałych programów hodowlanych, dzięki czemu jest to opłacalne zarówno czasowo, jak i kosztowo. Jednak czynniki takie jak płeć zwierzęcia, dawkowanie DSS i różnice w mikrobiocie jelitowej mogą wprowadzać zmienność, wpływając na odtwarzalność i komplikując jej zastosowanie w badaniach translacyjnych.

Naszym celem było udoskonalenie tego protokołu, aby złagodzić wpływ tych czynników, które leżą u podstaw niespójności w zakresie zapalenia jelita grubego i nowotworzenia CAC. Istnieje znaczna zmienność w stężeniach DSS stosowanych do wywoływania ostrego stanu zapalnego, zapalenia jelita grubego lub przewlekłego stanu zapalnego oraz CAC9,10. DSS jest polimerem, a średnia masa cząsteczkowa może się różnić w zależności od partii i producenta, co wpływa na zmienność wyników eksperymentalnych. Dlatego ważne jest, aby przetestować każdą partię DSS, aby zapewnić spójność między badaniami. Ponadto na zakres stanu zapalnego wywołanego przez DSS duży wpływ ma mikrobiom jelitowy, który może się znacznie różnić między obiektami myszy na całym świecie, a nawet między różnymi miejscami przetrzymywania i koloniami w tej samej instytucji11,12. Ta zmienność składu mikrobiologicznego może wpływać na wyniki modelu i przyczyniać się do niespójnych wyników13. Wspólne trzymanie zwierząt z różnych grup eksperymentalnych, gdy tylko jest to możliwe, ma kluczowe znaczenie dla zmniejszenia zmienności, ale może nie wystarczyć do rozwiązania tego problemu zakłócającego, ponieważ społeczności drobnoustrojów ulegają stochastycznemu dryfowi w czasie i prowadzą do efektów klatkowych w modelach przewlekłego stanu zapalnego14. Ponieważ protokół AOM/DSS obejmuje długotrwałe leczenie w celu utrzymania przewlekłego stanu zapalnego, wdrożyliśmy homogenizację mikrobioty poprzez okresowe mieszanie ściółki ze wszystkich klatek, w których przebywają zwierzęta leczone OZOM/DSS. Praktyka ta pomaga ujednolicić środowisko mikrobioty, co skutkuje zmniejszoną zmiennością eksperymentalną. Poza tym obserwacje wskazują, że efekty DSS mogą się różnić w zależności od płci zwierzęcia15,16, co może prowadzić do zróżnicowanych reakcji w stanie zapalnym i rozwoju raka. Udoskonaliliśmy istniejący protokół, miareczkując DSS osobno u samic i samców myszy, aby wybrać odpowiednią dawkę DSS dla obu płci, zapewniając bardziej jednolite wyniki i dostarczając krytycznych danych wejściowych do obliczeń mocy statystycznej w celu określenia optymalnej wielkości próby zarówno u samców, jak i samic myszy.

Ogólnie, aby zwiększyć odtwarzalność modelu AOM/DSS, przedstawiamy ustandaryzowany zestaw wytycznych dotyczących protokołów, które uwzględniają i łagodzą te czynniki zakłócające. Stosujemy techniki homogenizacji mikrobiomu, a także opisujemy precyzyjne dostosowanie dawkowania DSS w celu uzyskania bardziej spójnych i powtarzalnych wyników, poprawiając w ten sposób użyteczność modelu AOM/DSS i harmonizację między różnymi badaniami. Nasz protokół wyróżnia się tym, że wykazuje zmniejszoną zmienność w porównaniu z klatkami homogenizowanymi mikrobiotą i zawiera jasne instrukcje krok po kroku dotyczące wdrażania tych praktyk odtwarzalności. W rezultacie, mniejsza zmienność wewnątrz grupy spowodowana tymi udoskonaleniami protokołu prowadzi do zmniejszenia wielkości próby niezbędnej do osiągnięcia pożądanej mocy statystycznej w wykrywaniu różnic między grupami eksperymentalnymi. Ten zoptymalizowany protokół jest dostosowany do potrzeb badaczy, którzy chcą dostosować model AOM/DSS do własnych modeli mysich i projektów eksperymentalnych, niezależnie od szczepu lub płci, w celu badania mechanizmów nowotworzenia, celów terapeutycznych lub badania dynamiki komórek odpornościowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach muszą być przeprowadzane zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonym protokołem, aby zapewnić humanitarne obchodzenie się z nimi i przestrzeganie standardów etycznych. Opisane tutaj badania zostały zatwierdzone przez University of Florida Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Optymalizacja dozowania DSS

  1. Uzyskaj myszy w wieku, rasie i źródle do wykorzystania w głównym eksperymencie, z równym rozkładem samców i samic. Oznacz każdą mysz za pomocą stempla w ucho, znaku ogona lub innej zatwierdzonej metody indywidualnego śledzenia. Zmierz i zapisz początkową masę ciała każdego zwierzęcia.
    UWAGA: Samce myszy powinny być trzymane razem przed odsadzeniem i nie powinny być przenoszone między klatkami, aby zminimalizować walkę.
  2. Jeśli korzystasz z automatycznego podlewania, na tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu przerzuć zwierzęta do butelek z wodą i jednocześnie zablokuj dysze klatkowe (metalowe rurki do syłka w klatce) sterylnymi zatyczkami.
    UWAGA: Upewnij się, że wszelkie zmiany w dostarczaniu wody, takie jak zablokowane automatyczne dysze wody pitnej, są zatwierdzone przez IACUC lub odpowiedni organ regulacyjny nadzorujący humanitarne wykorzystanie zwierząt. Klatki dla zwierząt mogą wymagać codziennych kontroli w celu zapewnienia nieprzerwanego dostępu do wody pitnej.
  3. Przygotować roztwór DSS, rozpuszczając DSS w autoklawowanej sterylnej wodzie pitnej o różnych stężeniach od 1,5% do 5% (w/v), za pomocą mieszadła magnetycznego i płytki mieszającej. Odczekaj 30 minut w temperaturze pokojowej, aż proszek DSS całkowicie rozpuści się w wodzie. Wodę DSS należy przygotowywać świeżo co tydzień i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.
  4. Napełnij dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml wodą DSS o każdym stężeniu (jedna dla mężczyzn, jedna dla kobiet) i bezpiecznie przymocuj autoklawowaną sterylną dyszę do picia, aby zapobiec wyciekom.
  5. Podawaj wodę DSS w każdym stężeniu samicom i samcom myszy, przy czym 3 myszy w każdej klatce otrzymują to samo stężenie. Używaj sterylnej wody pitnej bez DSS jako kontroli negatywnej. Wymieniaj wodę DSS co drugi dzień.
  6. Podawać wodę DSS przez 7 dni. Codziennie rejestruj masę ciała każdej myszy.
  7. W dniu 8 przestaw wszystkie zwierzęta z powrotem na normalną wodę pitną.
  8. W dniu 8 oceń nasilenie biegunki na podstawie konsystencji stolca, korzystając ze standardowego systemu punktacji, jak opisano17 i zapisz wyniki. Punktacja "1" oznacza miękki, ale nadal uformowany stolec, "2" oznacza bardzo miękki stolec, a "3" oznacza biegunkę.
  9. W dniu 8 zbierz 2-3 świeże granulki kału i oceń na obecność krwi utajonej (patrz Tabela Materiałów). Odnotować obecność lub brak krwi w próbce.
  10. Oceń krwawienie z jelit na podstawie kombinacji dwóch kryteriów punktacji, konsystencji stolca (0-3) i obecności krwi w stolcu (0-3), aby uzyskać łączny wynik w zakresie od 0 do 6.
  11. Od 9 do 12 dnia codziennie rejestruj masę ciała każdej myszy i ściśle monitoruj zwierzęta leczone DSS pod kątem znacznej utraty masy ciała i ciężkiej biegunki. Niezwłocznie poddać eutanazji zwierzęta, które osiągnęły lub przekroczyły humanitarne punkty końcowe poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla (CO2 ) lub inną odpowiednią metodą, zgodnie z zatwierdzonym protokołem wykorzystania zwierząt i ustalonymi wytycznymi etycznymi.
  12. Od dnia 13 do dnia 18 kontynuuj monitorowanie zwierząt i codziennie rejestruj masę ciała każdej myszy, aż do całkowitego powrotu do stanu sprzed eksperymentu.
  13. Określ optymalne stężenie DSS, ponieważ powoduje to ok. 20% utratę masy ciała, której towarzyszy miękki, ale wciąż uformowany stolec. Optymalna dawka DSS może się różnić w zależności od samców i samic, szczepów myszy, wieku, partii DSS i obiektów dla zwierząt.

2. Indukcja CAC

  1. Dzień 0-6: Leczenie OZUŚ Dzień 7-28: 1 cykl leczenia DSS
    1. Przygotowanie wywaru AOM: Rozpuść AOM w proszku w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, aby osiągnąć stężenie wyjściowe 10 mg/ml. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,45 μm, rozprowadzić 1 ml porcji do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do jednego roku.
      UWAGA: AOM jest lotnym czynnikiem rakotwórczym i należy obchodzić się z nim ostrożnie pod kapturem bezpieczeństwa biologicznego, przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE), zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi bezpieczeństwa. AOM i wszelkie materiały zanieczyszczone AOM powinny być utylizowane zgodnie z protokołami usuwania niebezpiecznych odpadów chemicznych instytucji. Obowiązkiem badacza jest uzyskanie z wyprzedzeniem niezbędnych atestów środowiskowych, zdrowotnych i bezpieczeństwa.
    2. W przypadku korzystania z automatycznego pojenia w klatce, na 1 tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu zablokuj automatyczną dyszę wody pitnej i przełącz zwierzęta na butelki z wodą w celu aklimatyzacji, jak w kroku 1.2.
    3. W dniu 0 należy zważyć i zapisać masę ciała każdej myszy, aby obliczyć całkowitą wymaganą ilość OZUO. Następnie należy obliczyć całkowitą objętość AOM (1 mg/ml końcowego stężenia roboczego) na podstawie masy ciała każdego zwierzęcia, aby osiągnąć dawkę 10 mg/kg, np. 200 μl dla myszy o masie 20 g.
    4. Przed każdym użyciem rozmrozić wymaganą liczbę nowych podwielokrotności 10 mg/ml AOM na lodzie. Rozcieńczyć każdą 1 ml porcji AOM w 9 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aby osiągnąć stężenie robocze 1 mg/ml.
    5. Podawać OZUŚ myszom we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Wykonaj tę procedurę w komorze bezpieczeństwa biologicznego, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak podwójne rękawice i maska N95 dla optymalnej ochrony.
      UWAGA: Wyrzuć wszelkie resztki roztworu AOM zgodnie z wymaganiami dotyczącymi usuwania niebezpiecznych odpadów chemicznych.
    6. W dniu 3 przenieś zwierzęta poddane leczeniu OZUŚ do czystych klatek. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej podczas pracy z klatkami zanieczyszczonymi AOM i innymi materiałami ochronnymi.
      UWAGA: Zabrudzoną ściółkę klatki i wszelkie resztki jedzenia należy usunąć zgodnie z zatwierdzonymi przez instytucję procedurami usuwania niebezpiecznych odpadów chemicznych.
      UWAGA: AOM i jego metabolity są całkowicie wydalane w ciągu 72 godzin po podaniu18, po czym można usunąć zabrudzoną ściółkę klatki.
    7. W 7. dniu należy przeprowadzić homogenizację mikrobioty jelitowej, aby zminimalizować zmienność między klatkami. Aby to zrobić, pobierz próbki 25% ściółki z każdej klatki, dokładnie wymieszaj i rozprowadź z powrotem do każdej klatki.
      UWAGA: Powstrzymaj się od zmiany klatek w ciągu tygodnia leczenia DSS i przez pięć dni po jego zakończeniu. W razie potrzeby skoordynuj usługę zmiany klatek hodowlanych w obiekcie.
    8. Indukcję zapalenia jelita grubego należy zainicjować poprzez podanie DSS w wodzie pitnej za pomocą stożkowych probówek o pojemności 50 ml wyposażonych w odpowiednie dysze. Codziennie sprawdzaj myszy, aby upewnić się, że zwierzęta mają nieograniczony dostęp do wody DSS. Wymieniaj wodę DSS co drugi dzień. Codziennie rejestruj masę ciała każdej myszy.
    9. W dniu 14 zastąp wodę DSS normalnymi butelkami z wodą pitną. Kontynuuj ścisłe monitorowanie zwierząt pod kątem bólu i stresu.
    10. W dniach 14-19 waż każdą mysz dziennie. Eutanazja zwierząt, które tracą więcej niż 25% masy ciała lub jeśli zwierzę osiągnie którykolwiek z humanitarnych punktów końcowych określonych w zatwierdzonym protokole opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. Dodatkowo monitoruj i rejestruj wszelkie przypadki krwawienia z odbytu.
  2. Dzień 7-28: 1 cykl leczenia DSS
    1. W 7. dniu należy przeprowadzić homogenizację mikrobioty jelitowej, aby zminimalizować zmienność między klatkami. Aby to zrobić, pobierz próbki 25% ściółki z każdej klatki, dokładnie wymieszaj i rozprowadź z powrotem do każdej klatki.
      UWAGA: Powstrzymaj się od zmiany klatek w ciągu tygodnia leczenia DSS i przez pięć dni po jego zakończeniu. W razie potrzeby skoordynuj usługę zmiany klatek hodowlanych w obiekcie.
    2. Indukcję zapalenia jelita grubego należy zainicjować poprzez podanie DSS w wodzie pitnej za pomocą stożkowych probówek o pojemności 50 ml wyposażonych w odpowiednie dysze. Codziennie sprawdzaj myszy, aby upewnić się, że zwierzęta mają nieograniczony dostęp do wody DSS. Wymieniaj wodę DSS co drugi dzień. Codziennie rejestruj masę ciała każdej myszy.
    3. W dniu 14 zastąp wodę DSS normalnymi butelkami z wodą pitną. Kontynuuj ścisłe monitorowanie zwierząt pod kątem bólu i stresu.
    4. W dniach 14-19 waż każdą mysz dziennie. Eutanazja zwierząt, które tracą więcej niż 25% masy ciała lub jeśli zwierzę osiągnie którykolwiek z humanitarnych punktów końcowych określonych w zatwierdzonym protokole opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania. Dodatkowo monitoruj i rejestruj wszelkie przypadki krwawienia z odbytu.
  3. Dzień 29-49: 2 cykl leczenia DSS
    1. Powtórz homogenizację mikrobioty wraz z podawaniem DSS, postępując zgodnie z tymi samymi procedurami, co w krokach 2.2.1-2.2.4. Opcjonalnie: Po drugim i/lub trzecim cyklu DSS wykonaj kolonoskopię zgodnie z wcześniejszym opisem19.
  4. Dzień 50-70: 3 cykl leczenia DSS
    1. Powtórz homogenizację mikrobioty wraz z podawaniem DSS, postępując zgodnie z tymi samymi procedurami, co w krokach 2.2.1-2.2.4. Ponieważ myszy mają tendencję do utraty największej masy ciała trzy dni po trzecim cyklu DSS, należy ściśle monitorować wszystkie zwierzęta pod kątem nadmiernej utraty masy ciała lub jakichkolwiek oznak krwawienia z odbytu w tym okresie i zapewnić wilgotną karmę w celu leczenia wspomagającego, jeśli jest to wskazane.

3. Ocena ciężkości zapalenia jelita grubego i patologii CAC

  1. W dniu 70 zbierz 2-3 świeże granulki kału od każdej myszy, aby przetestować obecność krwi utajonej i/lub markerów stanu zapalnego, takich jak lipokalina-220, aby ocenić nasilenie zapalenia jelita grubego. Użyj odpowiednich odczynników/zestawów (patrz lista materiałów i sprzętu) i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi przeprowadzania testów, które pokrótce opisano poniżej.
  2. Aby przygotować próbki kału do oceny poziomu markera stanu zapalnego lipokaliny-2, umieść świeże granulki kału w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Rozpuścić granulki w 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą mieszalnika wirowego, aż do uzyskania jednolitego roztworu. Odwirować roztwór o stężeniu 10 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Supernatant może być natychmiast użyty do testu ELISA lipokaliny-2 lub przechowywany w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
  3. Wykonaj test ELISA lipokaliny-2 na myszy zgodnie z instrukcjami producenta zestawu. Przeprowadzenie pilotażowych eksperymentów z seryjnym rozcieńczaniem w celu określenia optymalnego rozcieńczenia próbek kału w stosunku do standardów.
    UWAGA: Oczekuje się, że poziomy lipokaliny-2 wzrosną co najmniej 1000-krotnie u myszy leczonych DSS w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi leczonymi wodą20.
  4. Oceń nasilenie zapalenia jelita grubego za pomocą systemu oceny biegunki17 zgodnie z opisem w krokach 1.8-1.10.
  5. W 70. dniu poddać zwierzęta eutanazji przez uduszenie CO2 lub przy użyciu innej zatwierdzonej metody humanitarnej.
  6. Spryskaj okolice brzucha każdego zwierzęcia 70% etanolem, aby zminimalizować zanieczyszczenie podczas kolejnych etapów.
  7. Użyj cienkich kleszczy chirurgicznych, aby podnieść skórę i warstwę otrzewnej. Wykonaj poziome nacięcie nożyczkami, aby odsłonić jamę brzuszną.
  8. Wyciągnij jelito cienkie na zewnątrz i zidentyfikuj jelito ślepe. Delikatnie unieś jelito ślepe i okrężnicę za pomocą kleszczy. Ostrożnie wypreparuj okrężnicę, przecinając krezkę i związane z nią naczynia krwionośne za pomocą nożyczek, unikając nakłuwania lub przecinania okrężnicy.
  9. Przetnij kość miednicy i skórę otaczającą obszar odbytniczo-odbytniczy, aby odsłonić całą dystalną okrężnicę. Ważne jest, aby wypreparować całą okrężnicę z nienaruszoną dystalną częścią, ponieważ większość nowotworów zwykle występuje w tym regionie.
  10. Umieść wypreparowaną okrężnicę na czystym pasku bibuły filtracyjnej, delikatnie ją prostując.
  11. Zmierz długość dwukropka linijką i udokumentuj to zdjęciem. Dołącz linijkę do zdjęcia, aby uzyskać skalę.
  12. Oczyść plamy Peyera na zewnętrznej stronie jelita grubego, uważając, aby nie przebić tkanki.
  13. Opłucz okrężnicę w zimnym, sterylnym PBS.
  14. Przymocuj końcówkę mikropipety o pojemności 200 μl (bez filtra) do strzykawki o pojemności 3 ml za pomocą folii parafinowej. Użyj tej konfiguracji, aby napełnić strzykawkę sterylnym PBS, włóż końcówkę pipety do światła okrężnicy i delikatnie przepłucz zawartość jelita grubego 2-3 razy, zapewniając całkowite usunięcie granulek kału.
  15. Delikatnie rozciągnij okrężnicę na czystym, wstępnie zwilżonym pasku bibuły filtracyjnej. Rozetnij okrężnicę wzdłuż i połóż ją płasko na bibule filtracyjnej.
  16. Zidentyfikuj większe guzy, które zwykle prezentują się jako wydatne pęcherzyki wystające ze ściany okrężnicy o zapalnym, czerwonym wyglądzie.
  17. W przypadku mniejszych guzów należy zachować szczególną ostrożność podczas identyfikacji. Użyj sterylnej pętli bakteryjnej, aby delikatnie zbadać powierzchnię okrężnicy pod kątem wszelkich nierówności lub nierówności. Upewnij się, że wszelkie wykryte guzki nie są pozostałościami węzłów chłonnych lub naczyń krwionośnych znajdujących się na zewnątrz ściany okrężnicy.
  18. Użyj suwmiarki cyfrowej, aby zmierzyć szerokość i długość każdego guza.
  19. Zapisz liczbę guzów oraz wielkość i lokalizację każdego guza na wstępnie wydrukowanej mapie jelita grubego.

4. Ocena histologiczna

  1. Użyj dwóch par kleszczy z cienką końcówką, aby chwycić oba boczne końce dystalnej okrężnicy. Zwiń dwukropek od dystalnego końca do bliższego końca w kształt szwajcarski, jak opisano w innym miejscu21. Upewnij się, że dystalny koniec znajduje się w środku rolki, a bliższy koniec tworzy najbardziej zewnętrzną warstwę.
  2. Zabezpiecz każdą szwajcarską okrężnicę za pomocą igły 271/2-G.
  3. Umieść każdą zabezpieczoną okrężnicę w zwijanej okrężnicy w odpowiednio oznakowanej kasecie na tkanki.
  4. Zanurz kasety tkankowe zawierające szwajcarskie okrężnice w 4% paraformaldehydzie (PFA) w sterylnym PBS. Pozostaw tkanki w utrwalaczu przez 24 godziny.
  5. Po 24 godzinach przenieś tkanki do 70% etanolu. Tkanki można przechowywać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C przez okres do trzech miesięcy.
  6. Szwajcarska bułka może być używana do wielu badań histopatologicznych, w tym konwencjonalnego barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E), immunohistochemii i immunofluorescencji.

5. Pobieranie tkanek w celu izolacji białek i RNA z guzów i otaczającej je okrężnicy

  1. Pracuj na lodzie i używaj wstępnie schłodzonych probówek i odczynników, aby zachować integralność materiału biologicznego.
  2. Po ocenie guza należy wyciąć guzy i zebrać je do wstępnie schłodzonych, wstępnie znakowanych probówek z odpowiednim buforem (patrz poniżej) na lodzie. W zależności od projektu eksperymentalnego, połącz wszystkie guzy z tego samego zwierzęcia lub przetwarzaj je indywidualnie. W razie potrzeby podobnie zbierz ~1 cm kawałki otaczającej tkanki jelita grubego nienowotworowej.
  3. Izolacja białek
    1. Dodaj 0,5 ml szklanych kulek o grubości 800 μm i 400 μl buforu do lizy (1% NP-40 w 150 mM NaCl z 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) i 1% koktajlu inhibitorów proteazy i fosfatazy do każdej probówki do homogenizacji tkanek i przenieś tkankę okrężnicy/guza do każdej probówki.
    2. Homogenizować tkankę okrężnicy/guza za pomocą homogenizatora tkankowego na bazie kulek przy 6 M/S przez 30 s, powtórzyć dwa razy w celu pełnej homogenizacji.
      UWAGA: Umieść probówki na lodzie między cyklami, aby zapobiec przegrzaniu próbki w wyniku homogenizacji mechanicznej.
    3. Po homogenizacji odessać 150 μl lizatu (supernatantu) i przenieść do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    4. Odwirować lizat w temperaturze 10 000 g w temperaturze 4 °C, aby osadzać dowolny nierozpuszczalny materiał. W razie potrzeby przenieść supernatant do czystej probówki.
    5. Określić ilościowo całkowite stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) lub innej odpowiedniej metody.
    6. W razie potrzeby dostosować całkowite stężenie białka do 4 mg/ml dla każdej próbki z tym samym buforem do lizy.
    7. Lizaty białkowe należy natychmiast zużyć do dalszych testów, takich jak immunoblotting lub analiza cytokin, lub przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania.
  4. Oczyszczanie RNA:
    1. Po rozbiorze umieść okrężnicę/guzy w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i zanurz w 200 μl odpowiedniego odczynnika do konserwacji RNA.
      UWAGA: Punkt pauzy: świeża tkanka okrężnicy/guza może być błyskawicznie zamrożona w ciekłym azocie i przechowywana w temperaturze -80°C do późniejszego przetworzenia
    2. Rozmrozić okrężnicę/tkankę nowotworową na lodzie.
    3. Przenieś okrężnicę/guz do probówki do homogenizacji tkanek zawierającej 500 μl odpowiedniego buforu do lizy odpowiedniego do izolacji RNA i 200 μl szklanych kulek do mielenia.
    4. Homogenizować za pomocą homogenizatora tkankowego na bazie kulek z prędkością 6 M/S przez 30 s trzy razy, z dwuminutową przerwą między każdym cyklem.
      UWAGA: Przenoś probówkę na lodzie między cyklami, aby zapobiec degradacji RNA w wyniku przegrzania podczas homogenizacji mechanicznej.
    5. Przenieś 300 μl lizatu do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    6. W razie potrzeby wyizolować całkowite RNA, stosując odpowiednią procedurę oczyszczania RNA. Zmierz stężenie RNA, czystość i jakość/integralność, zgodnie z potrzebami do dalszego użytku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy optymalizację dawki DSS dla naszych warunków eksperymentalnych. Dawkowanie DSS musi zostać ponownie skalibrowane dla każdego obiektu dla zwierząt, szczepu myszy, projektu badania i partii DSS. W tym badaniu myszy C57BL / 6J umieszczono w specyficznym, wolnym od patogenów wiwarium w wentylowanych klatkach ze standardową napromieniowaną 18% białkiem dietą gryzoni ad libitum. Zarówno samce, jak i samice myszy zaczynają tracić na wadze począwszy od 5 dnia po umieszczeniu w wodzie DSS, osiągając najniższą wagę trzy dni po odstawieniu DSS (Rysunek 1A,C). W dniu największej utraty wagi samce myszy wykazywały około 15% utratę wagi, podczas gdy samice myszy wykazywały około 20% utratę masy ciała (Rysunek 1B,D). Na podstawie tych wyników określiliśmy, że optymalna dawka dla naszych specyficznych warunków eksperymentalnych wynosiła 3,0% dla kobiet i 3,25% dla mężczyzn. Schemat leczenia OZUA/DSS jest opisany w Rysunek 2A, z homogenizacją mikrobiomu zachodzącą na początku każdego cyklu leczenia DSS, aż do zakończenia eksperymentu w celu złagodzenia efektów klatki i zmienności. Typowa dynamika utraty i powrotu do zdrowia zwierząt przez cały czas trwania eksperymentu jest pokazana na Rysunek 2B. Zwierzęta w pełni wracają do pierwotnej masy ciała w ciągu dwóch tygodni po zaprzestaniu podawania DSS. Dobrze skalibrowany model zapalenia jelita grubego DSS skutkuje miękkimi, ale nadal uformowanymi granulkami stolca zamiast biegunki (wynik konsystencji stolca 1-2), z okazjonalnym wykrywaniem krwi utajonej w kale wskazującej na subkliniczne krwawienie i kilkoma przypadkami widocznej krwi w stolcu (ocena obecności krwi 1-2)17. Aby dokładniej ocenić nasilenie zapalenia jelita grubego, pobrano próbki kału w celu analizy poziomów markera stanu zapalnego lipokaliny-2. Obecność krwi utajonej nie została wykryta u myszy otrzymujących regularną wodę pitną przez cały czas trwania eksperymentu, w przeciwieństwie do zwierząt leczonych DSS (Rysunek 2C). Konsekwentnie, poziomy lipokaliny-2 były podwyższone około 1,000-krotnie u myszy leczonych AOM / DSS w porównaniu z kontrolami AOM / tylko wodą (Rysunek 2D).

Na końcu przeprowadziliśmy sekcję okrężnicy i policzyliśmy guzy za pomocą mapy zapisu guza (Rysunek 3A). Zapalenie jelita grubego DSS skutkuje znacznie krótszą długością jelita grubego, w przeciwieństwie do kontroli AOM/tylko z wodą (Ryc. 3B). Co więcej, u zwierząt leczonych AOM/DSS rozwijają się widoczne guzy jelita grubego, z których większość tworzy się na dystalnym końcu (Ryc. 3C). Badanie histologiczne wycinków okrężnicy wybarwionych H&E wykazało znaczną erozję komórek nabłonka, naciek immunologiczny i owrzodzenie u myszy AOM / DSS (Figura 4A). Nasilenie histopatologii jelita grubego można określić ilościowo za pomocą ustalonych systemów punktacji dla mysiego CAC wywołanego DSS, w oparciu o cztery parametry (Rysunek 4B): naciek immunologiczny i obrzęk (0-3), owrzodzenie (0-3), morfologia nabłonka okrężnicy (0-4) i nowotwory (0-4)22,23,24. Wyniki takich ocen, zastosowane do przykładów histologicznych w Rysunek 4A, są przedstawione w Rysunek 4C. Proliferację nabłonka jelita grubego oceniano za pomocą analizy immunohistochemicznej przy użyciu barwienia Ki67, wykazując, że leczenie DSS sprzyja proliferacji komórek nabłonka jelita grubego. Dodatkowo skrawki jelita grubego mogą być wykorzystane do barwienia immunofluorescencyjnego różnych markerów, takich jak marker angiogenezy CD31 (Figura 4D,E).

Dalej ocenialiśmy wpływ homogenizacji mikrobioty na eksperymentalne punkty końcowe, takie jak stopień zapalenia jelita grubego, utrata masy ciała i skumulowane obciążenie guzem u każdego zwierzęcia. Jedna grupa myszy była trzymana w klatkach, które zostały poddane mieszaniu i redystrybucji zabrudzonej ściółki w dniu 0 w celu osiągnięcia homogenizacji mikrobioty, wraz ze zwierzętami kontrolnymi w klatkach, w których ta manipulacja została pominięta. Zwierzęta w obu grupach otrzymywały 2,5% wody DSS przez 7 dni. Podczas gdy średnie poziomy markera stanu zapalnego lipokaliny-2 w kale na klatkę w dniu 8 nie różniły się znacząco między grupami (test t Welcha), zaobserwowaliśmy znacznie mniejszą zmienność między punktami danych w klatkach, które przeszły homogenizację mikrobioty (Rysunek 5A, test F Welcha do porównania wariancji, p<0.0001). Konsekwentnie, do dnia 8, wszystkie zwierzęta wykazywały podobny stopień utraty masy ciała w porównaniu z wartością wyjściową dnia 0. Jednak myszy w grupie homogenizacji mikrobioty wykazywały mniejszą zmienność w utracie masy ciała w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 5B). Co więcej, w 10-tygodniowym protokole indukcji CAC (Rysunek 2A) z (homogenizacją mikrobioty) i bez (kontrolnego) mieszania ściółki klatkowej przed każdym cyklem DSS, skumulowane obciążenie guzem na mysz było bardziej spójne w grupie homogenizowanej mikrobiotą w porównaniu z kontrolami, które były znacznie bardziej zmienne (Rysunek 5C). Ogólnie rzecz biorąc, dane te dostarczają mocnych dowodów na to, że homogenizacja mikrobioty znacznie poprawia solidność i odtwarzalność modelu AOM/DSS.

figure-results-1
Rysunek 1. Miareczkowanie dawki DSS u samców i samic myszy. (A-D) Procentowa zmiana masy ciała w porównaniu z dniem 0 u 14-tygodniowych samców (A, B) i samic (C, D) myszy typu dzikiego C57BL/6J utrzymywanych na wodzie ze wskazanymi stężeniami DSS (1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% dla samców i 2%, 3%, 4% dla samic). (A, C) Zwierzętom podawano DSS przez 7 dni i monitorowano pod kątem utraty masy ciała do 12 dni. B i D wykazują utratę masy ciała samców myszy w dniu 8 (B) i samic myszy w dniu 9 (D) od początku leczenia DSS. Dane prezentowane są w postaci średnich ± SEM; n=3 w A i B, n=4 w C i D. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Oś czasu i monitorowanie CAC indukowanego przez AOM/DSS. (A) Oś czasu eksperymentu CAC indukowanego przez AOM/DSS. (B) Masa ciała w stosunku do dnia 0 u eksperymentalnych samic myszy typu dzikiego C57BL/6J leczonych OZOM/DSS (czerwony) lub kontrolnych (tylko AOM, bez DSS,). Wszystkie zwierzęta otrzymały jedną dawkę OZUŚ (10 mg/kg) i zostały losowo przydzielone do trzech cykli 3% DSS (czerwony) lub normalnej wody pitnej (kontrolny,) przez łącznie 70 dni. Dane prezentowane są w postaci średnich ± SEM, n=2 i 11. (C) Test hemokultyzmu kałowego od samic myszy z grupy kontrolnej (tylko AOM) lub leczonej DSS (AOM i 1,5% DSS). (D) Poziomy lipokaliny-2 w kale od 6 kontrolnych (tylko AOM,) lub 35 leczonych (AOM i 1,5% DSS, czerwony) samic myszy w dniu 70. Dane są prezentowane jako średnie ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Makroskopowa ocena jelita grubego. (A) Przykład mapy zapisu nowotworu. (B) Reprezentatywne obrazy jelita grubego od samic myszy z grupy kontrolnej (tylko AOM) lub leczonej DSS (AOM i 1,5% DSS) w 70 dniu. Skrócenie długości jelita grubego wskazuje na większy stan zapalny u zwierząt leczonych DSS. pręt - 5 mm; , p=0,002, test sumy rang Manna-Whitneya; n=12 i 30. (C) Reprezentatywne obrazy patologii jelita grubego z guzami w 70 dniu od samic myszy leczonych OZUŚ i 3% DSS (guzy są zakreślone i oznaczone czarnymi trójkątami). Pręt - 5 mm. Callout - powiększony widok dystalnych obszarów okrężnicy z guzami; pręt - 1 mm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Ocena histologiczna CAC. (A) Reprezentatywne wybarwione H&E skrawki okrężnicy walcowanej szwajcarsko od myszy leczonych AOM/DSS i kontrolnych (tylko AOM) w dniu 70 z powiększonymi obszarami dystalnymi od 3 zwierząt pokazanych po prawej stronie. Dwukropki kontrolne pokazują nienaruszoną organizację krypty okrężnicy. Okrężnice myszy leczonych OZUŚ / DSS charakteryzują się pogrubieniem podśluzówkowym (groty strzał), naciekaniem immunologicznym (strzałki), zakłóceniem lub utratą architektury krypty (gwiazda), erozją warstwy nabłonkowej, przerostem nabłonka lub nabłonkiem dysplastycznym (okręgi) z tworzeniem gruczolaka i gruczolakoraka (zaznaczone linią przerywaną). Bar - 500 μm. (B) System punktacji histopatologicznej stosowany do oceny nasilenia fenotypu CAC. (C) Przykład wyników histologicznych jelita grubego od myszy leczonych wyłącznie OZOMUŚ lub myszy leczonych OZOM/DSS pokazanych w A. (D) Reprezentatywne barwienie immunohistochemiczne dla markera proliferacji Ki67 w okrężnicy walcowanej szwajcarsko od zwierząt leczonych OZUŚ po 1 lub 3 cyklach DSS. Proliferujące komórki Ki67-dodatnie (brązowe) lokalizują się na dnie krypt okrężnicy, ale rozprzestrzeniają się w górę i atakują wewnątrz krypt z inicjacją CAC i bardziej zaawansowaną patologią. Bar - 100 μm. (E). Reprezentatywne barwienie immunofluorescencyjne oceniające unaczynienie na podstawie markera śródbłonka CD31 (czerwony) i barwione przeciwstawnie DAPI w celu wizualizacji jąder (niebieskich) w odcinkach okrężnicy od myszy leczonych AOM/DSS. Bar - 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Homogenizacja mikrobioty zmniejsza zmienność stanu zapalnego jelita grubego i obciążenie guzem CAC. (A) Średni poziom lipokaliny-2 w kale u myszy leczonych 2,5% DSS w dniu 8. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu testu t Welcha w celu porównania średnich poziomów lipokaliny-2 w kale między dwiema grupami (p = 0,137, n = 6 i 12 klatek). Dodatkowo przeprowadzono test F na wariancje, który dał wartość p równą 0,0001, wskazując na znaczące różnice we wariancji między obiema grupami. (B) Średni ubytek masy ciała u zwierząt leczonych OZUZ/DSS otrzymujących wodę DSS w 8 dniu. Podczas gdy średnia utrata masy ciała między obiema grupami nie różni się znacząco (test t Welcha, p = 0,194, n = 6 i 12), wariancja w obrębie grup jest znacząco różna (test F, p = 0,027). (C) Obciążenie guzem na mysz po 10 tygodniach leczenia OZUŚ/DSS. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu testu t Welcha w celu oceny różnic w średnim obciążeniu guzem między grupami (p = 0,211, n = 8 i 18) oraz testu F w celu oceny różnicy między wariancjami (p = 0,013). (A-C) Niebieskie wykresy skrzypcowe przedstawiają grupę, która przeszła homogenizację mikrobioty, podczas gdy zielone wykresy skrzypcowe reprezentują grupę kontrolną (bez homogenizacji mikrobioty), ns - nieistotne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół AOM/DSS został po raz pierwszy wprowadzony w 1996 roku przez Okayasu i wsp.25 i od tego czasu został uznany za doskonały model do wiernego naśladowania inicjacji i progresji raka jelita grubego od normalnej tkanki do zmian gruczolakowatych i ostatecznie raka, jak wykazano przez Suzuki i wsp. w 2006 r.26, zwłaszcza w kontekście zapalenia okrężnicy. W kolejnych badaniach oceniano wpływ OZUŚ i OZUZ/DSS na różne szczepy myszy, a także wpływ różnych czasów leczenia na fenotyp i penetrację guza 26,27,28. W 2018 roku Christopher Williams i jego grupa opublikowali zaktualizowany protokół29, który położył kluczowe podstawy do rozwoju tej metodologii. Ostatnie postępy wykazały ponadto przydatność modelu AOM/DSS do badań odporności błony śluzowej poprzez integrację metod izolacji jelitowych nacieków immunologicznych i immunofenotypowania za pomocą cytometrii przepływowej30.

Jedną z głównych zalet protokołu AOM/DSS jest łatwa adaptacja do praktycznie każdego szczepu myszy, co skłania do badań nad wpływem różnych środowisk genetycznych. W związku z tym Suzuki i wsp. porównali podatność na karcynogenezę jelita grubego indukowaną przez OZOM/DSS w czterech różnych szczepach myszy, wykorzystując penetrację gruczolaka jelita grubego jako odczyt, uzyskując następujące wyniki: BALB/c > C57BL/6N > DBA/2N = C3H/HeN26. Dodatkowe badania wykazały, że myszy FVB/N łatwiej rozwijają guzy jelita grubego po wielokrotnym leczeniu AOM w porównaniu ze szczepami C57BL / 6J i 129 / SvJ27. Warto zauważyć, że rozwój dobrze zróżnicowanego gruczolakoraka jelita grubego z prawie 100% penetracją odnotowano u myszy FVB / N w 10-tygodniowym protokole indukcji AOM / DSS CAC31. Odkrycia te łącznie sugerują, że różne szczepy myszy mogą nie być jednakowo podatne na leczenie OZUŚ/DSS, przyczyniając się do różnic w nowotworzeniu i dodatkowo podkreślając potrzebę spójnego zestawu wytycznych dotyczących harmonizacji i odtwarzalności protokołu AOM/DSS w różnych szczepach myszy, obiektach inwentarskich i innych zmiennych. Wśród nich znaczna zmienność mikrobiomu jelitowego utrudnia odtwarzalność badań skoncentrowanych na zapaleniu i penetracji guza 9,10. W szczególności skład mikrobiomu jelitowego, w tym gatunków Duncaniella muricolitica i Alistipes okayasuensis, może mieć ogromny wpływ na nasilenie zapalenia jelita grubegoDSS 13. Inne badanie podkreśliło znaczenie składu mikrobioty w indukcji CAC, wykazując, że myszy z niedoborem NLRP3 wykazywały zaostrzony fenotyp zapalenia jelita grubego charakteryzujący się zwiększoną obecnością gromady bakteryjnej Bacteroidetes (w szczególności Prevotellaceae) i TM710.

Pomimo popularności tej metody, istniejące protokoły AOM/DSS nie rozwiązały istotnego problemu dużej zmienności obserwowanej u zwierząt w grupach eksperymentalnych32. Aby sprostać temu wyzwaniu, opracowaliśmy zestaw zaleceń dotyczących optymalizacji i harmonizacji protokołów poprzez wdrożenie miareczkowania DSS (z uwzględnieniem płci zwierząt) i homogenizacji mikrobioty. Nasze podejście ma na celu zmniejszenie zmienności i zwiększenie odtwarzalności modelu AOM/DSS w różnych szczepach zwierzęcych, projektach eksperymentalnych i punktach końcowych. Chociaż nie możemy podać konkretnych zaleceń dotyczących wielkości próby, liczba powtórzeń eksperymentalnych będzie zależała od konkretnego projektu badania i oczekiwanych wielkości efektów dla każdego eksperymentu. Mniejsza zmienność wewnątrz grupy osiągnięta dzięki tym udoskonaleniom wymaga mniejszej liczby zwierząt w każdym stanie, aby osiągnąć tę samą moc statystyczną w wykrywaniu tych różnic. Przewidujemy, że te ulepszenia będą dalej promować etyczne wykorzystywanie zwierząt, odpowiedzialne zarządzanie funduszami badawczymi i redukcję pracy, prowadząc do zwiększenia wydajności.

Model AOM/DSS ma znaczącą wartość translacyjną w badaniu ludzkiego raka jelita grubego związanego z zapaleniem jelita grubego. Biorąc pod uwagę wyzwania związane z modelowaniem raka jelita grubego u ludzi ze względu na jego złożoną etiologię, należy podkreślić, że chociaż model AOM/DSS może dostarczyć pewnych informacji na temat patogenezy sporadycznego raka jelita grubego, jest najbardziej odpowiedni do badań nad nowotworami złośliwymi związanymi ze stanem zapalnym. Co więcej, rak wywołany przez OZUZ/DSS ma niską częstość występowania przerzutów33,34 i dlatego nie nadaje się do badania rozprzestrzeniania się przerzutów. Pomimo tych ograniczeń, model AOM/DSS jest wysoce wnikliwy, niezawodny, wykazuje istotną dla człowieka histopatologię i dokładnie naśladuje postęp choroby od zapalenia przez dysplazję do gruczolakoraka, a wszystko to przy zachowaniu opłacalności. W tym protokole przedstawiamy zalecenia dotyczące generowania powtarzalnych wyników i minimalizowania czynników zakłócających w oparciu o istniejące przepływy pracy 8,35.

Identyfikacja optymalnej dawki DSS poprzez eksperymenty pilotażowe dawka-odpowiedź, uwzględniające płeć zwierząt jako zmienną biologiczną 16,36,37, jest pierwszym krytycznym krokiem w kierunku ustanowienia solidnego protokołu AOM/DSS (Rysunek 1). Stwierdziliśmy, że leczenie 3% DSS przez 7 dni spowodowało bardziej znaczący spadek masy ciała u kobiet (~20%) w porównaniu z mężczyznami (~15%) (Figura 1B, D). Jednak samce myszy mogą być bardziej, mniej lub równie wrażliwe na DSS w porównaniu z samicami. Może to być spowodowane różnymi szczepami myszy i różnicami w składzie mikrobiomu jelitowego w obiektach zwierzęcych, co wymaga ponownego dostosowania stężenia DSS dostosowanego do każdego konkretnego zestawu eksperymentów. Optymalne stężenie DSS jest kompromisem między maksymalizacją stanu zapalnego okrężnicy a indukcją guza bez przekraczania tolerowanej toksyczności. Z naszego doświadczenia wynika, że równowaga ta jest najprawdopodobniej osiągana przy dawkach DSS, co skutkuje utratą masy ciała o około 20% po pierwszym cyklu. Zwierzęta mają tendencję do utraty mniejszej masy ciała w drugim cyklu leczenia, ale większe zmniejszenie masy ciała obserwuje się na ogół w trzecim cyklu DSS, potencjalnie z powodu tworzenia się guza w okrężnicy. W związku z tym utrata masy ciała o 25% może być przyjęta jako humanitarny punkt końcowy dla instytucjonalnych protokołów wykorzystania zwierząt. Co więcej, dobrze skalibrowane zapalenie jelita grubego DSS skutkuje miękkimi, ale nadal uformowanymi granulkami stolca, a nie biegunką i sporadycznie dodatnim testem hemokultywowanym, ale kilkoma przypadkami widocznych śladów krwi w stolcu, przy czym oczekuje się, że zwierzęta w pełni wyzdrowieją w ciągu dwóch tygodni po zaprzestaniu podawania DSS.

DSS jest polimerem o masie cząsteczkowej w zakresie od 36 000 do 50 000 Da. Ze względu na zmienność między partiami w produkcji DSS, konieczne jest przeprowadzanie eksperymentów z rekalibracją dawki DSS dla każdej nowej partii produktu. Aby zachować spójność, praktyczne jest oszacowanie całkowitej ilości DSS potrzebnej do zakupu całego badania z tej samej partii. Co więcej, protokół ten opisuje również kroki mające na celu standaryzację składu mikrobioty w całej eksperymentalnej kohorcie myszy podczas indukcji CAC, łagodząc w ten sposób potencjalne efekty klatkowe w celu zmniejszenia zmienności. Jako dodatkowy środek ostrożności w celu zminimalizowania wpływu klatek zaleca się, aby zwierzęta z różnych grup doświadczalnych były trzymane razem, gdy tylko jest to możliwe. W zależności od konkretnych celów eksperymentalnych i polityki etycznego wykorzystywania zwierząt, rozważania te powinny znaleźć odzwierciedlenie w doświadczeniach pilotażowych. Dryf mikrobioty może być również przyspieszony przez zmianę ściółki w mokrej klatce z nieszczelnymi butelkami do picia. Najlepiej jest powstrzymać się od zmiany klatki podczas porodu DSS i przez pięć dni po jej zakończeniu. Stosowanie probówek o pojemności 50 ml do podawania wody DSS zmniejsza ryzyko wycieku i minimalizuje straty DSS. Te względy logistyczne mogą wymagać ścisłej współpracy między personelem badawczym a technikami opieki nad zwierzętami świadczącymi usługi zmiany klatek i hodowli.

W tym protokole zapewniamy również podstawowy przepływ pracy związany z pobieraniem tkanek i komórek, a także gromadzeniem danych. Obejmuje to badanie na obecność krwi utajonej (ryc. 2C) i mapowanie guzów (ryc. 3A). Model AOM/DSS jest odpowiedni dla myszy immunokompetentnych, co czyni go idealnym systemem do badania mikrośrodowiska immunologicznego guza ze względu na całkowicie nienaruszony układ odpornościowy38,39, w przeciwieństwie do podejść ksenoprzeszczepowych. Warto zauważyć, że jest podatny na eksperymentalne zaburzenia układu odpornościowego lub składników zrębu, czy to poprzez genetyczny system Cre-Lox do wkłuwania/wyłączania genów specyficznych dla typu komórki lub kaset reporterowych, czy też wszczepianie lub zubożenie określonych populacji komórek. Na przykład, łącząc model OZUŚ / DSS z przeszczepem szpiku kostnego, wcześniej zbadaliśmy, w jaki sposób mutacje w układzie krwiotwórczym modulują nasilenie i obciążenie CAC40. Aby pomóc w takich badaniach, istnieją doskonałe opublikowane metody izolowania żywotnych leukocytów naciekających nowotwór, odpowiednich do dalszych analiz, takich jak immunofenotypowanie, testy funkcjonalne i multiomika jednokomórkowa41. Wreszcie, ze względu na wysoką penetrację i stałą latencję, model AOM/DSS nadaje się do przedklinicznych badań terapeutycznych wykorzystujących całkowite obciążenie guza jako podstawowy odczyt.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo sfinansowana przez nagrody NIH R01 DK121831 (OAG) i R01 AI067846 (DA). OAG był również wspierany przez Fundację Edwarda P. Evansa i Fundację Rodziny Oxnard. DA jest wspierany przez nagrodę Merit Society. UFHCC jest ośrodkiem onkologicznym wyznaczonym przez NCI (P30 CA247796).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Azoksymetan w proszkuSigma-AldrichCAS 25843-45-2, Cat# A4586Czynnik rakotwórczy do wywoływania guzów jelita grubego
Mikrowirówkastołowa NA&nbsp; BRAK DANYCHDo przygotowania próbki 
Myszy C57BL/6JJackson Laboratory000664Szczep i wiek odpowiednio do każdego konkretnego badania
Probówki stożkowe, 50 mlFisher14955239Do podawania wody DSS
Sól sodowa siarczanu dekstranu, MW ca 40 000Cayman Chemical 23250Aby wywołać inflmmację jelita grubego 
Etanol, 70%Fisher 43655223Do dezynfekcji powierzchni roboczych i narzędzi preparacyjnych
Szlifowanie kulek szklanych, 800 i mikro; m VWR12621-148Aby ułatwić homogenizację tkanki okrężnicy/guza
HemoCue America  Beckman Coulter Hemoccult ICT Immunochemiczny zestaw do badania utajonej krwi utajonej w kaleHemoCue America 395065ANumer katalogowy: 23280010 Dowykrywania krwi utajonej w kale
Strzykawka insulinowa 27GX5/8 1CC BD 3294-12Do wstrzyknięć AOM Bloker
LixitNANABlokowanie automatycznego dostarczania wody do klatek dla myszy, jeśli są obecne (dostarczane przez zakład dla zwierząt, sterylne) 
Mieszadło magnetyczne i mieszadło NANA Rozwiązać DSS 
Homogenizator kulek mikroprobówkowych, BeadBlaster 24 BenchmarkD2400Do homogenizacji okrężnicy/guza
myszy Lipocalin-2/NGAL DuoSet ELISAR& D SystemsNr katalogowy DY1857Aby wykryć lipokalinę-2 w próbkach kału
Roztwór NP-40, 10%Thermo Fisher Scientific85124Do lizy guza / okrężnicy
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermo Fisher ScientificA65453Do ilościowego określania stężenia białka w całkowitych lizatach tkanek lub dowolnej innej odpowiedniej metody
Koktajl inhibitorów proteaz i fosforanów FisherPI78440Przygotowanie próbek do analizy cytokin/białek 
Bufor RLTplusQiagen1053393Do izolacji RNA lub dowolnej innej odpowiedniej metody izolacji RNA
później RNApóźniej ThermoFisher ScientificAM7021Do konserwacji próbek tkanek przed izolacją RNA
Zestaw RNeasy Microprep QIAGEN74004Do izolacji RNA lub innej metody izolacji i oczyszczania RNA, w zależności od potrzeb
Dysza do butelki na wodę dla gryzoni (30 mm)VisionTyp EDo podawania wody lub roztworu DSS
Sterylne nożyczki i kleszczeNANA Dorozwarstwiania tkanek
Igły strzykawkowe, 27G x 1/2 cala długości (krótkie)BD 305109Do utrwalania tkanki w okrężnicy w bułce szwajcarskiej 
Strzykawki, Luer lock, 3 mlBD 309657Do płukania okrężnicy przed preparacją i stopniem oceny stopnia zaawansowania
TapeStationAgilentDo oceny stężenia RNA i jakości/integralności
Teklad 2918Evigo BioproductsT.2918M.15Standardowa dieta dla gryzoni, 18% białka, napromieniowana
Kaseta na tkankiVWR#87002-472Aby zachować próbkę do zatopienia
Waga laboratoryjna ładowana od góry, 0-220 gNANADo ważenia zwierząt
Bibuła WhatmanVWR InternationalCat# 28298-020Do oceny stopnia zaawansowania wypreparowanych okrężnic do patologii ogólnej i liczenia nowotworów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morgan, E., et al. Global burden of colorectal cancer in 2020 and 2040: Incidence and mortality estimates from globocan. Gut. 72 (2), 338-344 (2023).
  2. Siegel, R. L., Wagle, N. S., Cercek, A., Smith, R. A., Jemal, A. Colorectal cancer statistics 2023. CA Cancer J Clin. 73 (3), 233-254 (2023).
  3. Lu, C., et al. Survival outcomes and clinicopathological features in inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer: A systematic review and meta-analysis. Ann Surg. 276 (5), e319-e330 (2022).
  4. Porter, R. J., Arends, M. J., Churchhouse, A. M. D., Din, S. Inflammatory bowel disease-associated colorectal cancer: Translational risks from mechanisms to medicines. J Crohns Colitis. 15 (12), 2131-2141 (2021).
  5. Pan, Q., et al. Genomic variants in the mouse model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate improperly mimic human colorectal cancer. Sci Rep. 7 (1), 25(2017).
  6. Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 39-61 (2013).
  7. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10, 9(2011).
  8. Thaker, A. I., Shaker, A., Rao, M. S., Ciorba, M. A. Modeling colitis-associated cancer with azoxymethane (aom) and dextran sulfate sodium (dss). J Vis Exp. (67), e4100(2012).
  9. Chen, Y., Zhang, P., Chen, W., Chen, G. Ferroptosis mediated DSS-induced ulcerative colitis associated with Nrf2/Ho-1 signaling pathway. Immunol Lett. 225, 9-15 (2020).
  10. Elinav, E., et al. Nlrp6 inflammasome regulates colonic microbial ecology and risk for colitis. Cell. 145 (5), 745-757 (2011).
  11. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. Am J Physiol. 274 (3), G544-G551 (1998).
  12. Bleich, A., Fox, J. G. The mammalian microbiome and its importance in laboratory animal research. ILAR J. 56 (2), 153-158 (2015).
  13. Forster, S. C., et al. Identification of gut microbial species linked with disease variability in a widely used mouse model of colitis. Nat Microbiol. 7 (4), 590-599 (2022).
  14. Mccafferty, J., et al. Stochastic changes over time and not founder effects drive cage effects in microbial community assembly in a mouse model. ISME J. 7 (11), 2116-2125 (2013).
  15. Wagnerova, A., et al. Sex differences in the effect of resveratrol on dss-induced colitis in mice. Gastroenterol Res Pract. 2017, 8051870(2017).
  16. Son, H. J., et al. Effect of estradiol in an azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mouse model of colorectal cancer: Implication for sex difference in colorectal cancer development. Cancer Res Treat. 51 (2), 632-648 (2019).
  17. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  18. Fiala, E. S. Investigations into the metabolism and mode of action of the colon carcinogens 1,2-dimethylhydrazine and azoxymethane. Cancer. 40 (5 Suppl), 2436-2445 (1977).
  19. Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nat Protoc. 1 (6), 2900-2904 (2006).
  20. Chassaing, B., et al. Fecal lipocalin 2, a sensitive and broadly dynamic non-invasive biomarker for intestinal inflammation. PLoS One. 7 (9), e44328(2012).
  21. Dooley, S. A., et al. Optimized protocol for intestinal swiss rolls and immunofluorescent staining of paraffin embedded tissue. J Vis Exp. (209), e66977(2024).
  22. Cooper, H. S., Murthy, S. N., Shah, R. S., Sedergran, D. J. Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis. Lab Invest. 69 (2), 238-249 (1993).
  23. Arthur, J. C., et al. Intestinal inflammation targets cancer-inducing activity of the microbiota. Science. 338 (6103), 120-123 (2012).
  24. Karrasch, T., Kim, J. S., Muhlbauer, M., Magness, S. T., Jobin, C. Gnotobiotic IL-10-/-;NF-Kappa B(egfp) mice reveal the critical role of TLR/NF-Kappa B signaling in commensal bacteria-induced colitis. J Immunol. 178 (10), 6522-6532 (2007).
  25. Okayasu, I., Ohkusa, T., Kajiura, K., Kanno, J., Sakamoto, S. Promotion of colorectal neoplasia in experimental murine ulcerative colitis. Gut. 39 (1), 87-92 (1996).
  26. Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Nakagama, H., Tanaka, T. Strain differences in the susceptibility to azoxymethane and dextran sodium sulfate-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis. 27 (1), 162-169 (2006).
  27. Nambiar, P. R., et al. Preliminary analysis of azoxymethane induced colon tumors in inbred mice commonly used as transgenic/knockout progenitors. Int J Oncol. 22 (1), 145-150 (2003).
  28. Arnesen, H., et al. Induction of colorectal carcinogenesis in the C57BL/6J and a/j mouse strains with a reduced dss dose in the aom/dss model. Lab Anim Res. 37 (1), 19(2021).
  29. Parang, B., Barrett, C. W., Williams, C. S. AOM/DSS model of colitis-associated cancer. Methods Mol Biol. 1422, 297-307 (2016).
  30. Eich, C., Vogt, J. F., Langst, V., Clausen, B. E., Hovelmeyer, N. Isolation and high-dimensional flow cytometric analysis of tumor-infiltrating leukocytes in a mouse model of colorectal cancer. Front Immunol. 15, 1295863(2024).
  31. Barderas, R., et al. Sporadic colon cancer murine models demonstrate the value of autoantibody detection for preclinical cancer diagnosis. Sci Rep. 3, 2938(2013).
  32. Dzhalilova, D., Zolotova, N., Fokichev, N., Makarova, O. Murine models of colorectal cancer: The azoxymethane (AOM)/dextran sulfate sodium (DSS) model of colitis-associated cancer. PeerJ. 11, e16159(2023).
  33. Rosenberg, D. W., Giardina, C., Tanaka, T. Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).
  34. Pothuraju, R., et al. Colorectal cancer murine models: Initiation to metastasis. Cancer Lett. 587, 216704(2024).
  35. Neufert, C., Becker, C., Neurath, M. F. An inducible mouse model of colon carcinogenesis for the analysis of sporadic and inflammation-driven tumor progression. Nat Protoc. 2 (8), 1998-2004 (2007).
  36. Lee, S. M., et al. The effect of sex on the azoxymethane/dextran sulfate sodium-treated mice model of colon cancer. J Cancer Prev. 21 (4), 271-278 (2016).
  37. Jang, S., Han, H., Oh, Y., Kim, Y. Sex differences in inflammation correlated with estrogen and estrogen receptor-beta levels in azoxymethane/dextran sodium sulfate-induced colitis-associated colorectal cancer mice. Heliyon. 10 (6), e28121(2024).
  38. Xin, B., et al. Enhancing the therapeutic efficacy of programmed death ligand 1 antibody for metastasized liver cancer by overcoming hepatic immunotolerance in mice. Hepatology. 76 (3), 630-645 (2022).
  39. Rivera, M., et al. Patient-derived xenograft (pdx) models of colorectal carcinoma (crc) as a platform for chemosensitivity and biomarker analysis in personalized medicine. Neoplasia. 23 (1), 21-35 (2021).
  40. Feng, Y., et al. Hematopoietic-specific heterozygous loss of dnmt3a exacerbates colitis-associated colon cancer. J Exp Med. 220 (11), (2023).
  41. Mcmanus, D., Novaira, H. J., Hamers, A. aJ., Pillai, A. B. Isolation of lamina propria mononuclear cells from murine colon using collagenase e. J Vis Exp. (151), e59821(2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model azoksymetanu i DSSrak jelita grubego u myszyrak zwi zany ze stanem zapalnymhomogenizacja mikrobiotymiareczkowanie dawki DSSmyszy C57BL 6Jprofilowanie cytokinprzetwarzanie tkanek
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły