Artykuł metodologiczny

Izolacja, hodowla i charakterystyka fibroblastów związanych z rakiem prostaty

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68367

⸱

1 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biotechnology and Health Science, University of Torino, 2Department of Science and Technological Innovation, University of Piemonte Orientale, 3Division of Urology, Department of Surgical Sciences, University of Turin, 4Department of Surgical Sciences and Urology, Città della Salute e della Scienza di Torino, University of Turin, 5Department of Pathology, University of Turin, and AOU Città della Salute e della Scienza

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten zapewnia kompleksową procedurę izolacji, ekspansji i unieśmiertelnienia fibroblastów z radykalnej prostatektomii. Ponadto opisano testy opracowane w celu oceny funkcjonalnych skutków przesłuchu fibroblast-komórki nowotworowe, wykorzystujące zarówno leczenie pożywką kondycjonowaną, jak i kokulturę.

Streszczenie

Zrąb guza może być aktywnie kształtowany przez komórki nowotworowe w celu przyjęcia właściwości pronowotworowych, co czyni go centralnym punktem badań nad rakiem. Wśród składników zrębu, fibroblasty związane z rakiem (CAF) - często najliczniejszy typ komórek w mikrośrodowisku guza (TME) - odgrywają kluczową rolę w promowaniu progresji raka poprzez ich interakcje z komórkami nowotworowymi i innymi składnikami zrębu. Wyjaśnienie mechanizmów stojących za tymi interakcjami wymaga solidnych metod izolowania i charakteryzowania CAF, które mogą również stanowić podstawę do opracowania nowych terapii przeciwnowotworowych ukierunkowanych na CAF. W pracy przedstawiono metodę izolowania fibroblastów zarówno z guza, jak i przyległych normalnych regionów próbek po radykalnej prostatektomii pobranych od pacjentów z rakiem prostaty (PCa). Takie podejście umożliwia jednoczesną izolację CAF i ich normalnych odpowiedników (NF) od tego samego osobnika, zapewniając sparowany system eksperymentalny. Podano szczegółowe protokoły dotyczące utrzymywania pierwotnych CAF i NF do dalszych analiz in vitro, a także ich unieśmiertelnienia w celu ułatwienia długoterminowych badań. Opisujemy również testy funkcjonalne zaprojektowane w celu porównania wpływu CAF i NF na zachowanie komórek rakowych, w tym proliferację, migrację i wzrost niezależny od zakotwiczenia. Szczegółowo opisano dwa uzupełniające się podejścia: leczenie komórek nowotworowych za pomocą pożywki kondycjonowanej pochodzącej z fibroblastów (CM) oraz bezpośrednia kohodowla fibroblastów z komórkami nowotworowymi. Łącznie metodologie te stanowią kompleksowy zestaw narzędzi do badania dynamicznych interakcji między CAF a komórkami nowotworowymi, nie tylko w PCa, ale potencjalnie w wielu nowotworach u ludzi. Co więcej, charakterystyka molekularna tych interakcji może ujawnić kluczowe mediatory onkogenezy napędzanej przez CAF, oferując obiecujące cele interwencji terapeutycznej.

Wprowadzenie

Rak prostaty (PCa) jest najczęściej diagnozowanym nowotworem u mężczyzn w prawie dwóch trzecich krajów na całym świecie. W 2022 roku zgłoszono około 1,5 miliona nowych przypadków, co spowodowało 3 97 000 zgonów na całym świecie. Liczby te sprawiają, że PCa jest drugim najczęstszym nowotworem i piątą najczęstszą przyczyną śmiertelności związanej z nowotworami wśród mężczyzn1.

PCa jest chorobą wieloogniskową i biologicznie złożoną, charakteryzującą się znaczną niejednorodnością międzynowotworową 2,3,4, różnorodnymi podtypami molekularnymi i zmiennymi wynikami klinicznymi 5,6, z których wszystkie znacząco wpływają na rokowanie i odpowiedź terapeutyczną7.

Podczas gdy krytyczna rola mikrośrodowiska guza (TME) w inicjacji i progresji guza prostaty jest dobrze znana 8,9, interakcje molekularne między komórkami nowotworowymi a otaczającym je przedziałem zrębu pozostają nie w pełni poznane. Chociaż powszechnie wiadomo, że mikrośrodowisko guza gruczołu krokowego (TME) odgrywa kluczową rolę w inicjacji i progresji guza, interakcje molekularne między komórkami nowotworowymi a otaczającym zrębem pozostają niewystarczająco zdefiniowane. TME składa się z różnych komórek zrębu, w tym komórek pochodzenia mezenchymalnego i immunologicznego, które uaktywniają się w odpowiedzi na sygnały pochodzące z guza, a następnie nabywają funkcje sprzyjające nowotworowi10,11. Wśród nich fibroblasty związane z rakiem (CAF) często stanowią najliczniejszą populację zrębu. CAF przyczyniają się do przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), promują wzrost guza oraz ułatwiają inwazję i migrację komórek rakowych 4,11,12,13. Poprzez wydzielane czynniki i bezpośrednie interakcje komórka-komórka, CAF wpływają również na proliferację, inwazję i oporność na terapię. Warto zauważyć, że CAF są populacją niejednorodną. Chociaż ogólnie związane z funkcjami pronowotworowymi, niektóre podtypy mogą odgrywać role supresyjnenowotworu 14,15. Co ważne, brak unikalnych markerów dla CAF stanowi wyzwanie dla ich precyzyjnej identyfikacji i funkcjonalnego rozbioru ich różnorodnych ról12,16.

Solidne podejście do badania funkcjonalnych przesłuchów między CAF a komórkami nowotworowymi polega na wyizolowaniu pierwotnych CAF i dopasowanych normalnych fibroblastów (NF), a następnie ocenie ich wpływu na zachowania komórek nowotworowych, takie jak proliferacja, migracja, tworzenie kolonii i wzrost niezależny od zakotwiczenia 17,18,19 . W tym artykule opisano udoskonalony, wysoce powtarzalny protokół izolacji CAF i NF z próbek radykalnej prostatektomii pacjentów wysokiego ryzyka PCa. Kluczowym elementem tego protokołu jest dokładna identyfikacja i preparacja guza i regionów wolnych od guza przez biegłego uropatologa, co pozwala na wyprowadzenie CAF i NF od tego samego pacjenta. To podejście oparte na sparowanych próbkach pomaga kontrolować heterogeniczność międzyguzową i indywidualne zmienne specyficzne dla pacjenta, które mogą wpływać na fenotypy fibroblastów 20,21,22. Aby zapewnić dostępność wystarczającej ilości tkanki nowotworowej, skupiamy się na próbkach od pacjentów z wynikiem Gleasona ≥7.

Wiarygodna charakterystyka fenotypowa izolowanych fibroblastów wymaga użycia wielu markerów w celu odróżnienia ich od innych typów komórek, w szczególności komórek nabłonkowych, które mogą mieć wspólną nakładającą się ekspresję markera16. Ponieważ pierwotne fibroblasty PCa zwykle ulegają starzeniu po 10-15 pasażach, co komplikuje długoterminowe analizy, przedstawiamy również protokół nieśmiertelności komórek poprzez stabilną ekspresję ludzkiej odwrotnej transkryptazy telomerazy (hTERT)23.

Aby zbadać funkcjonalny wpływ CAF i NF na komórki nowotworowe, przetestowaliśmy i zoptymalizowaliśmy kilka strategii eksperymentalnych. Biorąc pod uwagę, że CAF wywierają wpływ zarówno poprzez czynniki wydzielane, jak i bezpośredni kontakt komórka-komórka24, opracowywane są dwa uzupełniające się systemy testów: (1) leczenie komórek rakowych pożywką kondycjonowaną fibroblastami (CM) oraz (2) bezpośrednia kohodowla fibroblastów i komórek nowotworowych. Testy te oceniają kluczowe właściwości komórek rakowych, w tym proliferację, wzrost niezależny od zakotwiczenia i migrację. Aby ustandaryzować wpływ wydzielanych czynników, kondycjonowane pożywki z CAF i NF zostały zagęszczone i określone ilościowo (conCM) na podstawie całkowitej zawartości białka.

Wykazanie znaczących efektów funkcjonalnych za pomocą tych testów może pomóc w identyfikacji krytycznych mediatorów nowotworzenia wywołanego przez CAF, oferując potencjalne cele interwencji terapeutycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało przeprowadzone w pełnej zgodności z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi stosowania próbek klinicznych, zatwierdzonymi przez Komisję Bioetyczną Szpitala Città della Salute Molinette w Turynie we Włoszech. Wszystkie próbki zostały pobrane po podpisaniu świadomej zgody przez pacjentów biorących udział w badaniu. Poniższa sekcja zawiera szczegółowy protokół izolacji fibroblastów związanych z rakiem (CAF) i ich dopasowanych normalnych odpowiedników fibroblastów (NF). Protokół obejmuje rozwarstwienie guza i przyległych obszarów nienowotworowych, przetwarzanie tkanek, hodowlę komórkową oraz charakterystykę fenotypową i funkcjonalną izolowanych komórek. Wszystkie procedury muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego. Komórki hodowano w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 przy użyciu kompletnego zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (cDMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie etapy wirowania odbywają się przy włączonym hamulcu. Zapoznaj się z Tabelą materiałów , aby uzyskać pełną listę odczynników, materiałów i sprzętu używanego w całym protokole. Metodologia ta została zoptymalizowana dla próbek raka prostaty wysokiego ryzyka, z wynikiem Gleasona 4+3 lub wyższym.

1. Chirurgiczne rozwarstwienie próbki

UWAGA: Procedura ta została przeprowadzona na próbkach chirurgicznych pobranych z zabiegów radykalnej prostatektomii25 przeprowadzonych na pacjentach z rakiem gruczołu krokowego o wysokim stopniu złośliwości (PCa) i leczonych zgodnie ze standardowymi protokołami, w oparciu o wewnętrzne wytyczne instytucjonalne oraz ustaloną międzynarodową literaturę i najlepsze praktyki 26,27,28.

  1. Umieść gruczoł krokowy pod kapturem bezpieczeństwa biologicznego na sterylnym serwowaniu i ustaw go zgodnie z anatomicznymi punktami orientacyjnymi.
    UWAGA: Ta procedura musi być wykonana przez doświadczonego uropatologa.
  2. Za pomocą sterylnego ostrza wytnij plastry tkanek z obszarów zidentyfikowanych w raporcie z biopsji przedoperacyjnej jako nowotworowe lub wolne od komórek nowotworowych.
  3. Przeprowadzić szybką analizę kriostatyczną29 na obu próbkach tkanek, przygotowując skrawki tkanek o grubości 2,5 μm i barwiąc je hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu sprawdzenia obecności lub braku komórek nowotworowych w wybranych regionach, zgodnie z kryteriami diagnostycznymi gruczolakoraka gruczołu krokowego najnowszej edycji klasyfikacji WHO30 (patrz rysunek 1A).
    UWAGA: W przypadku wystąpienia rozbieżności należy powtórzyć proces pobierania próbek, aż do uzyskania potwierdzenia histologicznego zarówno obszarów nowotworowych, jak i nienowotworowych.
  4. Wyciąć około 10 mm2 próbki z obszarów nowotworowych i nienowotworowych, umieścić je w stożkowych probówkach o pojemności 15 ml zawierających 7 ml lodowatego buforu do przechowywania tkanek i przechowywać na lodzie do kolejnych procedur.
    UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w tym buforze w temperaturze 4 °C do 48 godzin.

2. Izolacja fibroblastów

UWAGA: Wszystkie poniższe procedury przetwarzania muszą być wykonywane na lodzie w temperaturze 4 °C, chyba że zaznaczono inaczej. Patrz rysunek 1 A, aby zapoznać się ze schematem.

  1. Dzień 1: Zważyć próbki tkanek.
    UWAGA: Średnio uzyskuje się 70-100 mg.
  2. Przenieś się do 6-centymetrowych naczyń i wykonaj cztery sekwencyjne mycia, dwa razy w 4 ml lodowatego PBS i dwa razy w 4 ml lodowatego cDMEM, oba uzupełnione 200 U/ml penicyliny, 200 μg/ml streptomycyny (2x), używając sterylnych kleszczy do przenoszenia tkanki z jednego naczynia do drugiego.
  3. Mechanicznie rozerwać tkankę, umieszczając ją na 6-centymetrowej płytce na lodzie, z 1 ml DMEM uzupełnionym 100 U/ml penicyliny-G i 100 μg/ml streptomycyny, a następnie zmielić ją na małe fragmenty (<1 mm2) za pomocą nożyczek lub ostrzy.
  4. Przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml lodowatego cDMEM. Wirować przy 754 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml lodowatego cDMEM. Ponownie odwirować przy 754 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Usunąć supernatant jak powyżej i ponownie zawiesić osad w kolagenazie II (1 mg/ml w DMEM), używając 1 ml/100 mg tkanki. Przenieś do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Ze względu na zmienność partii kolagenazy, przetestuj różne partie i upewnij się, że mają wystarczająco dużo, aby wykonać wszystkie przewidywane izolacje.
  7. Przykryj probówki folią parafinową i wytrawić próbki O/N (8-12 h) w temperaturze 37 °C z ciągłym kołysaniem.
    UWAGA: Wykonaj następujące czynności w dniu 2.
  8. Przenieść próbki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml i dodać 5 ml lodowatego cDMEM do zawiesiny komórek w celu inaktywacji kolagenazy, a następnie odwirować przy 754 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Kolagenazę utylizuje się poprzez zassanie jej do pojemnika zawierającego detergent.
  9. Odessać supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml i ponownie zawiesić osad w 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, od czasu do czasu wstrząsając.
  10. Dodać 1 ml DNazy I do próbek i dobrze wymieszać. Użyć świeżo przygotowanego roztworu o stężeniu 25 mg/ml w PBS.
    UWAGA: Leczenie DNazą I na tym etapie pomaga uzyskać roztwór jednokomórkowy.
  11. Wirować przy 754 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Użyć pipety o pojemności 10 ml do zassania supernatantu i ponownie zawiesić osad w 5 ml zimnego cDMEM. Wirować przy 754 x g przez 5 min 4 °C.
  13. Zawieś ponownie komórki w 20% FBS cDMEM. Szalkę i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95% przez co najmniej 3 dni. Uważaj, aby nie przesuwać/nie przechylać naczynia. Na 70-100 mg tkanki zawiesinę komórkową rozprowadzić w szalkach o wymiarach 2 x 3,5 cm, w 2 ml pożywki. W razie potrzeby odpowiednio zmniejsz.
    UWAGA: Mniej niż 50 mg tkanki spowoduje nieefektywne pozyskiwanie komórek. Schemat dzielenia i zamrażania pokazano na rysunku 1B.
  14. Po 3 dniach sprawdź komórki pod kątem morfologii/żywotności i wymień 2/3 pożywki, aby utrzymać czynniki wzrostu wytwarzane przez komórki. Zajmie to około 7-10 dni, aby komórki osiągnęły zbieg, wymieniając pożywkę co drugi dzień.
  15. Po zlaniu się przełóż komórki do jednego 10-centymetrowego naczynia w 20% FBS cDMEM.
  16. Wymieniaj pożywkę co drugi dzień, używając dwukrotnie pożywki 15% FBS, następnie raz 12,5%, a następnie 10%. W przypadku analiz FACS ekstrakcja i zamrażanie RNA i białek są zgodne ze schematem przedstawionym na rysunku 1B.
  17. Podziel komórki, gdy są w około 100% zlewające się (około 10 dni). Umyj 2-3 razy obfitym PBS przez 5 minut każdy. Dodaj 1% trypsyny/EDTA (2x) i umieść w inkubatorze, sprawdzając co kilka minut, czy komórki się nie odrywają.

3. Warunek hodowli

  1. Przenikaj komórki tylko wtedy, gdy są w 100% zlewne, nie więcej niż 1:3.
  2. Zamrozić podwielokrotności odpowiadające 50% zlewającego się 10-centymetrowego naczynia w 0,5 ml lodowatego podłoża do zamrażania (10% DMSO w FBS). Rozmrozić każdą porcję w naczyniu o średnicy 10 cm.
    UWAGA: Średni czas podwojenia to 80-90 godzin.

4. Analiza FACS

UWAGA: Protokół ten zapewnia wiarygodną charakterystykę populacji fibroblastów i identyfikuje potencjalne zanieczyszczenie komórkami nabłonka, śródbłonka lub odpornościowymi. Analizę FACS przeprowadza się we fragmencie 2, jak pokazano na rysunku 2A.

  1. Zbierz komórki i ponownie zawieś je w buforze FACS (PBS plus 2% FBS) w stężeniu 10-6 komórek/ml.
  2. Oznaczyć probówki do cytometrii przepływowej i dodać 1 x 105 komórek w objętości 100 μl do każdej z nich. Do barwienia 4 przeciwciałami należy przygotować 11 probówek, aby uwzględnić zarówno barwienie, jak i bramkowanie, w następujący sposób (Tabela 1)
    UWAGA: 1 probówka, brak przeciwciał (niebarwiona kontrola), do oceny autofluorescencji komórek, 1 probówka z kontrolą izotypu przeciwciała, do oceny specyficznego wiązania, 4 probówki, każda z pojedynczym przeciwciałem, do kompensacji; Koraliki kompensacyjne mogą zastąpić komórki, 4 probówki fluorescencji minus jedna (FMO) do bramkowania, z których każda pomija jedno z przeciwciał, 1 probówka ze wszystkimi 4 przeciwciałami (rzeczywista próbka). Stosuje się następujące przeciwciała znakowane fluorescencyjnie (patrz tabela materiałów): (1) Anti-EpCAM-PE (marker komórek nabłonkowych), (2) Anti-CD31-VioBlue (marker komórek śródbłonka), (3) Anti-CD45-FITC (marker komórek odpornościowych), (4) Anti-CD90-APC (marker komórek fibroblastów). Można stosować przeciwciała sprzężone z innymi fluoroforami, zgodnie z dostępnymi filtrami cytometru przepływowego. Wykonaj wszystkie czynności na lodzie, aby zachować żywotność komórek.
  3. Inkubuj komórki z blokerami receptorów krystalizacyjnych fragmentów (FcR), takimi jak oczyszczone przeciwciała anty-CD16/CD32 lub bufor blokujący (PBS 1%-2% BSA). Użyć 1-5 μl odczynnika blokującego FcR na 100 μl zawiesiny komórkowej i inkubować w temperaturze 4 °C przez 10-15 minut.
  4. Kontynuuj bezpośrednio barwienie bez prania. Dodać do probówek odpowiednie rozcieńczenia przeciwciał lub odpowiadające im kontrole izotypowe, jak określono w tabeli 1.
  5. Delikatnie wymieszać i inkubować w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut.
  6. Przemyć 2 ml buforu FACS.
  7. Wirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g, w temperaturze 4 °C.
  8. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżego buforu FACS.
  9. Dodać barwnik żywotności (jodek propidyny) zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
  10. Pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego.
  11. Użyj jednobarwnych formantów kompensacji, aby skonfigurować macierz kompensacji. Do analizy danych należy zastosować następującą strategię bramkowania na wykresach gęstości FACS:
  12. Bramkowanie rozproszenia do przodu i z boku: wykres FSC-A vs. SSC-A i zaprojektuj region wokół głównej populacji komórek, aby wykluczyć szczątki komórkowe.
  13. Dla wykluczenia dubletów: wykres FSC-A vs. FSC-W (lub FSC-H vs. FSC-A) i zaprojektować region w taki sposób, aby wykluczyć skupiska komórek, które będą wykazywać zwiększoną szerokość w stosunku do obszaru (lub zwiększoną powierzchnię w stosunku do wysokości). Zaznacz pojedyncze komórki i wykonaj tę samą procedurę, wykreślając SSC-A vs. SSC-W (lub SSC-H vs. SSC-A) w celu zwiększenia czystości populacji pojedynczej komórki.
  14. Wykreśl barwnik żywotności (tj. jodek propidyny) w porównaniu. SSC-A i wybierz ujemne komórki na żywo.
  15. Na żywych komórkach wykreśl CD326 (oś x) w porównaniu. CD31 (oś y); użyj odpowiednich próbek FMO, aby dokładnie ustawić bramki. FMO pozwala na uwzględnienie rozprzestrzeniania się fluorescencji do określonego kanału spowodowanego przez inne fluorofory.
    1. Patrząc na próbkę FMO CD326, narysuj bramkę kwadrantową, która obejmuje wszystkie komórki w lewej ćwiartce (tj. ujemną dla CD326). Powtórz tę samą procedurę, używając próbki FMO CD31 w celu dostosowania bramki, aby wszystkie komórki FMO znajdowały się w dolnych kwadrantach (tj. ujemne dla CD31). Użyj tego kwadrantu do analizy próbek i wybierz komórki w lewym dolnym kwadrancie (CD31-CD326-).
  16. Powtórz tę samą procedurę, wykreślając CD326 (oś x) w porównaniu z . CD45 (oś y), przy użyciu CD326 FMO i CD45 FMO do ustawienia bramki kwadrantowej. Użyj tego kwadrantu, aby przeanalizować wszystkie próbki i wybrać komórki w lewym dolnym kwadrancie (CD45-CD326-).
  17. Fabuła: CD90 vs. SSC-A i użyj CD90 FMO, aby ustawić region, który wyklucza komórki ujemne i zawiera tylko CD90 +. Użyj tego regionu do analizy wszystkich próbek, mierząc procentową zawartość komórek CD90+ . Reprezentatywne wyniki przedstawiono na rysunku 2A.

5. Unieśmiertelnienie fibroblastów

UWAGA: Unieśmiertelnienie populacji CAF i NF osiąga się poprzez stabilną transdukcję wektorem retrowirusowym wykazującym ekspresję hTERT. Poniżej znajdują się protokoły przygotowania zakaźnych cząstek pseudowirusowych i transdukcji komórek.

  1. Produkcja cząstek retrowirusowych
    1. Dzień 1, powlekanie poli-L-lizyną i posiewanie komórek: Pokryć 10 cm naczynie 6 ml roztworu poli-L-lizyny (0,1 mg/ml w H2O), inkubować 5 minut pod kapturem TC, aspirować i pozostawić otwarte naczynie do wyschnięcia pod kapturem przed posianiem 3 x 106 HEK293T komórek.
    2. Dzień 2: Dodaj 30 μl odczynnika do transfekcji za pośrednictwem kationów lipidów do 0,75 ml pożywki zoptymalizowanej pod kątem lipofekcji bez antybiotyków.
    3. Równolegle dodaj 2 μg wektora opakowaniowego retrowirusa pCL-Ampho i 2 μg plazmidów pBABE-puro-hTERT do kolejnego 0,75 ml pożywki zoptymalizowanej pod kątem lipofekcji bez antybiotyków.
    4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Wymieszać oba rozcieńczenia w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    6. W międzyczasie zastąp HEK293T podłoże 6 ml pożywki zoptymalizowanej pod kątem lipofekcji uzupełnionej 10% FBS.
    7. Delikatnie rozprowadzić kompleksy DNA na powierzchni naczynia i inkubować przez 6 godzin do O/N w wilgotnym inkubatorze CO2 .
    8. Dzień 3: Zastąp pożywkę 7 ml cDMEM i inkubuj przez 48 godzin.
      UWAGA: Począwszy od tego etapu, prace muszą być wykonywane w zakładzie hodowli tkankowej o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL3), zgodnie z przepisami instytucjonalnymi.
    9. W 5 dniu należy zebrać pożywkę zawierającą wirusa i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.
    10. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Transdukcja wirusa
    1. Dzień 1: Fibroblasty o niskim pasażu płytkowym przy 60% konfluencji w 2 dołkach płytki 6-dołkowej.
    2. Dzień 2: Zastąp pożywkę 1 ml wcześniej wyprodukowanego preparatu retrowirusowego pBABE-puro-hTERT zawierającego 8 μg/ml polibrenu i inkubuj przez 12-16 godzin.
    3. Dzień 3: Zastąp pożywkę zawierającą wirusa 2 ml cDMEM.
    4. Dzień 4: Po 24 godzinach rozpocznij dwie 48-godzinne rundy selekcji puromycyny (2 μg/ml).
      UWAGA: Stężenie powinno być empirycznie określone dla każdej partii antybiotyku i typu komórki, a najniższe stężenie powinno być wybrane tak, aby zabiło wszystkie komórki w ciągu 4 dni od selekcji.
    5. Dzień 8: Sprawdź, czy wszystkie niezainfekowane komórki kontrolne obumarły. Zastąp pożywkę cDMEM i pozwól zainfekowanym komórkom rosnąć, aż do zlewania się, zanim przejdą przez nie w stosunku 1:3. Pozwól komórkom osiągnąć zbieg i ponownie podzielić się 1:3. Na tym etapie komórki mogą opuścić obiekt BLS3.
      UWAGA: Przygotować zamrożone porcje tak szybko, jak to możliwe. Aby upewnić się, że doszło do unieśmiertelnienia, należy przejść komórki 5-6 razy i ocenić ich morfologię oraz współczynniki duplikacji, które nie powinny się zmieniać wraz z pasażami. Funkcjonalnie porównaj unieśmiertelnione komórki z ich pierwotnymi odpowiednikami, korzystając z metod opisanych poniżej.

6. Charakterystyka fibroblastów

  1. Fenotypowo analizuje izolowane komórki pod kątem ekspresji markerów CAF / NF i funkcjonalnie charakteryzuje ich potencjalne działanie proonkogenne na komórki nowotworowe.
    UWAGA: Oligonukleotydy i przeciwciała qPCR zoptymalizowane do oceny poziomów ekspresji markerów zarówno na poziomie RNA, jak i białka przedstawiono odpowiednio w Tabeli 2 i Tabeli Materiałów. Należy pamiętać, że przeciwciała przeciwko białku aktywującemu fibroblasty (FAP) są często nieswoiste. Należy upewnić się, że uwzględniono odpowiednie kontrole dodatnie i ujemne31,32. Do oceny przesłuchu między fibroblastami a komórkami nowotworowymi można zastosować różne metody. W tym miejscu opisano dwa alternatywne podejścia, polegające na leczeniu komórek nowotworowych kondycjonowaną pożywką (CM) pochodzącą z CAF lub NF lub kokulturą fibroblastów i komórek nowotworowych. Opisano skuteczność obu podejść w celu zwiększenia proliferacji komórek nowotworowych.

7. Przygotowanie i zagęszczenie kondycjonowanej pożywki

UWAGA: Kondycjonowana pożywka jest zagęszczona i dokładnie dozowana po pobraniu, aby ułatwić porównanie różnych komórek.

  1. Umieść komórki w odległości 70% zbiegu w 15-centymetrowym naczyniu w cDMEM.
  2. Następnego dnia należy przejść na 15 ml pożywki głodowej (DMEM bez FBS) i inkubować przez 48 godzin, aby wytworzyć CM.
  3. Zebrać CM, odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przefiltrować przez filtr 0,22 μm w celu wyeliminowania resztek komórkowych i sterylizacji.
  4. Przenieść do probówek zagęszczających (MWCO 10 000 Da) i odwirować przez 20 minut w temperaturze 2000 x g i 4 °C lub zgodnie z instrukcją producenta, aby uzyskać około 1 ml stężonego CM (conCM), tj. 15 x stężenie.
  5. Podzielić konCM i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  6. Określić ilościowo zawartość białka w pobranym conCM za pomocą kolorymetrycznego testu białkowego.
    UWAGA: Średnie uzyskane stężenie wynosi 0,5 i 2 μg/μL. Nadal można stosować niższe stężenia.

8. Test proliferacji

UWAGA: Proliferację komórek (przy użyciu ludzkich linii komórkowych PCa DU145 lub LNCaP) oceniano za pomocą przyrządu do analizy żywych komórek w dwóch różnych ustawieniach, albo traktując komórki nowotworowe za pomocą conCM, albo współhodując je z CAF lub NF. W takim przypadku należy użyć fluorescencyjnych komórek nowotworowych. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na rysunku 3.

  1. Test proliferacji po leczeniu conCM
    UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem ogniw DU145; Różne komórki mogą wymagać dostosowania.
    1. Płytki komórek nowotworowych w cDMEM na 96-dołkowej płytce (750 komórek / dołek), biorąc pod uwagę co najmniej 3 powtórzenia na warunek i inkubować O / N.
    2. Zastąp cDMEM pożywką głodową, uzupełnioną lub nie, 50 μg/ml konCM.
    3. Przenieść płytkę do komory przyrządu do analizy żywych komórek w inkubatorze.
    4. Pozostaw do ogrzania w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie rozpocznij pierwsze skanowanie.
    5. Użyj kanału kontrastu fazowego, wybierając odpowiedni obiektyw i liczbę żądanych pól/dołka (zalecane jest 10x obiektyw i 5 pól/dołek) oraz standardowy typ skanowania. Skanuj co 6 godzin przez 4-5 dni (czas trwania musi być empirycznie określony dla warunków i typów komórek).
    6. Analizę należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
    7. Oblicz dla każdego dołka (kontrpróby techniczne dla każdego warunku) zmianę krotności w stosunku do jego wartości w czasie zero. Wygeneruj odpowiednie wykresy i oceń istotność statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania.
  2. Test proliferacji podczas wspólnej hodowli
    1. Współpłytka 750 komórek DU145 z ekspresją RFP i CAF lub NF w stosunku 1:3 w cDMEM na płytce 96-dołkowej.
    2. Następnego dnia przełącz się na 2% FBS DMEM. Przenieś płytkę do komory przyrządu do analizy żywych komórek w inkubatorze i rozpocznij standardowe skanowanie co 6 godzin przez 4 dni, używając zarówno kontrastu fazowego, jak i kanału pomarańczowego.
    3. Przeprowadzić analizę proliferacji zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
    4. Oblicz dla każdego dołka (kontrpróby techniczne dla każdego warunku) zmianę krotności w stosunku do jego wartości w czasie zero. Wygeneruj odpowiednie wykresy i oceń istotność statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

9. Test migracji gojenia się ran

UWAGA: W tym miejscu przedstawiono zautomatyzowaną wersję klasycznego testu zarysowania33 do pomiaru migracji komórek przy użyciu przyrządu do analizy żywych komórek.

  1. Płytki komórek nowotworowych na 96-dołkowej płytce odpowiedniej do instrumentu do analizy żywych komórek w celu uzyskania zlewającej się monowarstwy.
  2. Następnego dnia potraktuj komórki 10 ug/ml mitomycyny C przez 2 godziny.
    UWAGA: Ten krok jest niezbędny, aby uniknąć proliferacji komórek podczas testu, co mogłoby zakłócić wyniki.
  3. Nałóż rysę na dołki zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).
  4. Przemyć 100 μl PBS w celu usunięcia oderwanych komórek.
  5. Dodać pożywkę głodową o stężeniu 50 mg/ml lub bez (kontrola).
  6. Umieścić płytkę w komorze do analizy żywych komórek w inkubatorze.
  7. Po 30 minutach zaprogramuj zalecany protokół skanowania gojenia się ran, co 4 godziny przez 1 dzień lub dłużej, w zależności od komórek i warunków.
  8. Przeanalizuj wyniki zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).

10. Wzrost niezależny od zakotwiczenia za pomocą miękkiego testu agarowego

  1. Płytki CAF lub NF przy 70% konfluencji na płytkach 12-dołkowych, pozostawiając trzy puste dołki jako kontrolę.
  2. Następnego dnia przygotuj 4x miękki roztwór podstawowy agaru (3,6%), dodając 0,45 g niskotopliwego agaru do 12,5 ml PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml w sterylnych warunkach.
  3. Rozpuścić w kuchence mikrofalowej. Uważaj na nadmierne wrzenie, które mogłoby spowodować zagęszczenie roztworu.
  4. Schłodzić w temperaturze 37 °C, a następnie przygotować 1x roztwór roboczy, rozcieńczając 1:4 wstępnie podgrzanym cDMEM.
  5. Odessać pożywkę z płytki 12-dołkowej i dodać 500 μl 1x roztworu agaru do każdej studzienki.
  6. Pozostawić do zestalenia się na 20 minut w temperaturze 4 °C, przechowując resztę roztworu agaru w temperaturze 37 °C.
  7. W międzyczasie trypsynizuj komórki nowotworowe i przygotuj zawiesinę komórkową 2 x 104 komórek/ml.
  8. Wymieszać równe objętości zawiesiny komórek i roztworu agaru 1x, pipetując wielokrotnie, i dozować 500 μl (tj. 5000 komórek) na wierzch pierwszej warstwy agaru w każdym dołku. Upewnij się, że przygotowałeś co najmniej 10% nadmiar zawiesiny komórek.
  9. Pozwól agarowi zestalić się przez inkubację przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Dodaj 1 ml cDMEM do każdej studzienki i odnawiaj ją co drugi dzień, delikatnie zasysając pożywkę od krawędzi studzienki i dodając świeżą pożywkę do środka, prawie kroplami, aby uniknąć przemieszczenia miękkiej warstwy agaru.
  11. Inkubuj, aż pojawią się łatwo widoczne kolonie. Komórki DU145 zwykle potrzebują około 12 dni, z niewielkimi zmianami.
  12. Wyrzucić pożywkę i zabarwić kolonie, dodając 200 μl roztworu chlorku tetrazolu nitroniebieskiego (1 mg/ml w PBS). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze.
  13. Po wybarwieniu kolonii wyrzuć roztwór barwnika i uzyskaj obrazy za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Umieść płytkę na stoliku mikroskopu i ustaw powiększenie na najniższą wartość (0.8x), aby upewnić się, że cała studnia jest widoczna. Użyj pokrętła zgrubnej ostrości, aby ustawić ostrość kolonii, a następnie dostosuj ustawienia oświetlenia i trybu przed zrobieniem zdjęć.
  14. Użyć odpowiedniego oprogramowania34 , aby określić ilościowo liczbę kolonii i zajmowany obszar, postępując zgodnie z krokami podanymi w pliku uzupełniającym 1.
  15. Oceń liczbę i rozkład wielkości kolonii (patrz rysunek 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pary CAF i NF od 7 pacjentów z PCa o wysokim stopniu złośliwości udało się wyizolować za pomocą tego protokołu. Wiek pacjentów w momencie operacji i wyniki Gleasona podsumowano w Tabeli 3. Aby ocenić czystość pochodnych populacji fibroblastów, pasażujące dwa pierwotne CAF i NF odłączono i wybarwiono wskazanymi przeciwciałami fluorescencyjnymi lub jodkiem propidyny w celu oceny apoptozy. Reprezentatywne wyniki późniejszej analizy FACS przedstawiono na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wyprowadzanie i analiza komórek z tkanki PCa dostarcza odpowiedniego modelu eksperymentalnego, szczególnie biorąc pod uwagę, że dostępne modele zwierzęce nie odtwarzają w pełni anatomii ludzkiej prostaty i progresji choroby37. Gruczoły krokowe szympansów są anatomicznie podobne do ludzkich, ale wykazują powolny, stochastyczny postęp choroby, a także sugerują ograniczenia etyczne. Psy różnią się znacznie pod względem budowy i patobiologii prostaty i rozwijają sporadyczne choroby prostaty związane z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez Włoskie Stowarzyszenie Badań nad Rakiem (AIRC), IG16930 i IG24851 do V.P; włoskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych (MIUR PRIN 2017 i 2022 do V.P.); Fundacja Truus i Gerrita van Riemsdijk, Liechtenstein, darowizna na rzecz V.P.; Region Piemontu (Deflect). A.S. był wspierany przez Włoską Fundację Badań nad Rakiem (FIRC) w ramach stypendium podoktorskiego, a Los Angeles było wspierane przez Fondazione Umberto Veronesi. Rysunek 2 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 12-dołkowaSarstedt powiedział:833921
Płytka 24-dołkowaSarstedt powiedział:833922
Płytka 6-dołkowaSarstedt powiedział:833920
Płytka 96-dołkowaSarstedt powiedział:833924
Mysi mAb anty-GAPDH (6C5)Sigma AldrichZobacz materiał CB1001Źródło: Mysz; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000
aSMA (Agencja Przedsiębiorczości)Sigma AldrichA5228 Źródło: Mysz; Rozcieńczenie dla WB: 1:3000
KaweolinaTechnologia sygnalizacji komórkowejCST3267Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000
CD31-VioBlueMilteny Biotec130-119-980Cytometria przepływowa Ab, marker komórek śródbłonka
CD326-PE (EpCAM)Milteny Biotec130113-826Cytometria przepływowa Ab, marker komórek nabłonkowych
CD45-FITCMilteny Biotec130-110769Cytometria przepływowa Ab, marker leukocytów Pan
CD90-APCMilteny Biotec130-114-903Cytometria przepływowa Ab, marker fibroblastów
Kolagen VI (COL6A1)Księga Abcamab182744 powiedział:Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000
Rurka stożkowa 15 mlSarstedt powiedział:62554502
Probówka stożkowa 50 mlSarstedt powiedział:62547254
Mikroprobówki Cryopure 2 mlSarstedt powiedział:72380992
Płytka hodowlana o średnicy 100 mm Corning353003
Płytka hodowlana o średnicy 100 mm Corning353025
Płytka hodowlana o średnicy 60 mm Corning353002
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma AldirchZobacz materiał D8418Zastosowanie w okapie biologicznym
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni (DMEM)Gibco (firma Gibco)11965092Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym
FAP (Język do ryb)Księga Abcamab53066 powiedział:Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:500
Odczynnik blokujący FcR, ludzkiMilteny Biotec130-059-901Blokada FC
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco (firma Gibco)16000044Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym
Końcówki z filtrem 10 i mikro; LSarstedt powiedział:703010255
Końcówki z filtrem 100 µ LSarstedt powiedział:703030255
Końcówki z filtrem 1000 µ LSarstedt powiedział:703060255
Końcówki z filtrem 20 i mikro; LSarstedt powiedział:703030265
Końcówki z filtrem 200 µ LSarstedt powiedział:703031255
Filtropur S Plus 0,20 &mikro; m Sarstedt powiedział:831826102
Kleszcz2Biol1102412
FSP1/S100A4Technologia sygnalizacji komórkowejD9F9D (13018)Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:2000
IL6 powiedział:Technologia abklonalnaZobacz materiał A0286Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000
ObrazJKrajowy Instytut ZdrowiaWersja 1.53cOprogramowanie do analizy obrazu
Incucyte Imagelock 96-dołkowa płytkaSartorious (Szeryf)BA-04857 powiedział:
Incucyte® Zestaw SX5Sartorious (Szeryf)Zestaw SX5Przyrząd do analizy żywych komórek 
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 2000ThermoFisher Naukowy11668019odczynnik do transfekcji za pośrednictwem kationów lipidów
MACS® Rozwiązanie do przechowywania tkanekMilteny Biotec130-100-008
Czytnik mikropłytek (absorbancja 600 nm)Preparat PromegaZobacz materiał GM3500
Mikroprobówki 1,5 mL Sarstedt powiedział:7269001
NCAD (Jednostka Sieciowa)Księga Abcamab18203 powiedział:Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000
Nitro Niebieski Tetrazolium Sigma Aldirchn5514 powiedział:
Parafilm Sigma AldirchHS234526B
pBABE-puro-hTERTAddgene powiedział:1771Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, użyj w okapie biologicznym
pCL-AmpułkaNovus Biological NBP2-29541Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, użyj w okapie biologicznym
PDGFRB powiedział:Santa CruzSC-432 powiedział:Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000
Penicylina-Streptomycyna (PS, 10 000 μ g/ml) Gibco (firma Gibco)15140122Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym
Mikroskop z kontrastem fazowym Olimpia Zobacz materiał BX42
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami  (PBS)Domowej robotyNaCl, 137 mM; KCl, 2,7 mM; Na2HPO4, 10 mM;KH2PO4, 1,8 mM. Autoklaw i przechowywanie w RT
Roztwór poli-L-lizynySigma AldirchZobacz materiał P8920 powiedział:Przechowywać w temperaturze 4 & deg; C, użyj w okapie biologicznym
Dichlorowodorek puromycynySigma AldirchZobacz materiał P8833 powiedział:
Secura Semi Micro BalanceSartorius Sartorius (Wyspa SarSECURA125-1S
Pipeta serologiczna 10 mL Sarstedt powiedział:861254001
Pipeta serologiczna 2 mL Sarstedt powiedział:861252001
Pipeta serologiczna 25 mL Sarstedt powiedział:861256001
Pipeta serologiczna 5 mL Sarstedt powiedział:861253001
STATYSTYKA 3CST9139Źródło: Mysz; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000
STAT3 Y705CST9131Źródło: Królik; Rozcieńczenie dla WB: 1:1000
mikroskop stereoskopowyKsięga LeicaMZ125
Strzykawka 10 mlPentaferte00202260D12
Mieszalnik TermoMixerEppendorph powiedział:22331
Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowejGibco (firma Gibco)15400054
VimSanta CruzSC-6260 powiedział:Źródło: Mysz; Rozcieńczenie dla WB: 1:2000
Koncentrator odśrodkowy Vivaspin 20 Sigma AldirchZ614602MWCO 10,000 Da 
Nożyczki Wagnera2Biol14070-12

Bibliografia

  1. Bray, F. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (6), 229-263 (2024).
  2. Yadav, S. S., Stockert, J. A., Hackert, V., Yadav, K. K., Tewari, A. K. Intratumor heterogeneity in prostate cancer. Urol Oncol. 36 (8), 349-360 (2018).
  3. Owen, J. S., Clayton, A., Pearson, H. B. Cancer-associated fibroblast heterogeneity, activation and function: Implications for prostate cancer. Biomolecules. 13 (1), 67(2023).
  4. Ge, R., Wang, Z., Cheng, L. Tumor microenvironment heterogeneity an important mediator of prostate cancer progression and therapeutic resistance. NPJ Precis Oncol. 6, 1-8 (2022).
  5. Pejčić, T., Todorović, Z., Đurašević, S., Popović, L. Mechanisms of prostate cancer cells survival and their therapeutic targeting. Int J Mol Sci. 24 (3), 2939(2023).
  6. Shoag, J., Barbieri, C. Clinical variability and molecular heterogeneity in prostate cancer. Asian J Androl. 18 (4), 543-548 (2016).
  7. Segura-Moreno, Y. Y., Sanabria-Salas, M. C., Varela, R., Mesa, J. A., Serrano, M. L. Decoding the heterogeneous landscape in the development of prostate cancer. Oncol Lett. 21 (5), 376(2021).
  8. Hägglöf, C., Bergh, A. The stroma-a key regulator in prostate function and malignancy. Cancers (Basel. 4 (2), 531-548 (2012).
  9. Teng, L. K. H., et al. Mast cell-derived SAMD14 is a novel regulator of the human prostate tumor microenvironment. Cancers (Basel). 13 (6), 1-25 (2021).
  10. Galbo, P. M., Zang, X., Zheng, D. Molecular features of cancer-associated fibroblast subtypes and their implication on cancer pathogenesis, prognosis, and immunotherapy resistance. Clin Cancer Res. 27 (9), 2636-2647 (2021).
  11. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 1-30 (2021).
  12. Pederzoli, F., et al. Stromal cells in prostate cancer pathobiology: Friends or foes. Br J Cancer. 128 (6), 930-939 (2022).
  13. Sasaki, T., Franco, O. E., Hayward, S. W. Interaction of prostate carcinoma-associated fibroblasts with human epithelial cell lines in vivo. Differentiation. 96, 40-48 (2017).
  14. Cirri, P., Chiarugi, P. Cancer-associated fibroblasts, and tumor cells: A diabolic liaison driving cancer progression. Cancer Metastasis Rev. 31 (1-2), 195-208 (2012).
  15. Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: A dynamic niche in cancer progression. J Cell Biol. 196 (4), 395-406 (2012).
  16. Kahounová, Z. The fibroblast surface markers FAP, anti-fibroblast, and FSP are expressed by cells of epithelial origin and may be altered during epithelial-to-mesenchymal transition. Cytometry A. 93 (9), 941-951 (2018).
  17. Giannoni, E., et al. Reciprocal activation of prostate cancer cells and cancer-associated fibroblasts stimulates epithelial-mesenchymal transition and cancer stemness. Cancer Res. 70 (17), 6945-6956 (2010).
  18. Paland, N., et al. Differential influence of normal and cancer-associated fibroblasts on the growth of human epithelial cells in an in vitro cocultivation model of prostate cancer. Mol Cancer Res. 7 (8), 1212-1235 (2009).
  19. Jaeschke, A., et al. Cancer-associated fibroblasts of the prostate promote a compliant and more invasive phenotype in benign prostate epithelial cells. Mater Today Bio. 8, 100073(2020).
  20. Ellem, S. J., et al. A pro-tumourigenic loop at the human prostate tumor interface orchestrated by oestrogen, CXCL12 and mast cell recruitment. J Pathol. 234 (1), 86-98 (2014).
  21. Lawrence, M. G., et al. Alterations in the methylome of the stromal tumor microenvironment signal the presence and severity of prostate cancer. Clin Epigenetics. 12 (1), 48(2020).
  22. Nguyen, E. V. Proteomic profiling of human prostate cancer-associated fibroblasts (CAF) reveals LOXL2-dependent regulation of the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 18 (7), 1410-1427 (2019).
  23. Smith, M. C., Goddard, E. T., Perusina Lanfranca, M., Davido, D. J. hTERT extends the life of human fibroblasts without compromising type I interferon signaling. PLoS One. 8 (3), e58233(2013).
  24. Kay, E. J., et al. Cancer-associated fibroblasts require proline synthesis by PYCR1 for the deposition of pro-tumorigenic extracellular matrix. Nat Metab. 4 (6), 693-710 (2022).
  25. Huynh, L. M., Ahlering, T. E. Robot-assisted radical prostatectomy: A step-by-step guide. J Endourol. 32, S28-S32 (2018).
  26. Srigley, J. R., et al. Protocol for the examination of specimens from patients with carcinoma of the prostate gland with guidance from the CAP Cancer and CAP Pathology Electronic Reporting Committees. , https://documents.cap.org/protocols/cp-prostate-2017-v4020.pdf (2017).
  27. Goldblum, J. R., Lamps, L. W., McKenney, J. K. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology E-Book. , https://books.google.it/books/about/Rosai_and_Ackerman_s_Surgical_Pathology.html?id=7ZEDwAAQBAJ (2024).
  28. Montironi, R., Beltran, A. L., Mazzucchelli, R., Cheng, L., Scarpelli, M. Handling of radical prostatectomy specimens: Total embedding with large-format histology. Int J Breast. 2012, (2012).
  29. Arcega, R. S., Woo, J. S., Xu, H. Performing and cutting frozen sections. Methods Mol Biol. 1897, 279-288 (2019).
  30. IARC. WHO Classification of Tumors, 5th edition, volume 8: Urinary and male genital tumors. , https://www.iarc.who.int/news-events/who-classification-of-tumours-5th-edition-volume-8-urinary-and-male-genital-tumours/ (2025).
  31. Sfanos, K. S., et al. If this is true, what does it imply? How end-user antibody validation facilitates insights into biology and disease. Asian J Urol. 6 (1), 10-25 (2019).
  32. Brennen, W. N., et al. Overcoming stromal barriers to immuno-oncological responses via fibroblast activation protein-targeted therapy. Immunotherapy. 13 (2), 155-175 (2021).
  33. Pinto, B. I., Cruz, N. D., Lujan, O. R., Propper, C. R., Kellar, R. S. In vitro scratch assay to demonstrate effects of arsenic on skin cell migration. J Vis Exp. (133), e58838(2019).
  34. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  35. Sauzay, C., Voutetakis, K., Chatziioannou, A. A., Chevet, E., Avril, T. CD90/Thy-1, a cancer-associated cell surface signaling molecule. Front Cell Dev Biol. 7, 444743(2019).
  36. True, L. D., et al. CD90/THY1 is over-expressed in prostate cancer-associated fibroblasts and could serve as a cancer biomarker. Mod Pathol. 23 (10), 1346(2010).
  37. Strand, D. W., Aaron, L. T., Henry, G., Franco, O. E., Hayward, S. W. Isolation and analysis of discreet human prostate cellular populations. Differentiation. 91 (4-5), 139(2015).
  38. Krönig, M., et al. Cell type-specific gene expression analysis of prostate needle biopsies resolves tumor tissue heterogeneity. Oncotarget. 6 (2), 1302-1314 (2014).
  39. Goldstein, A. S., et al. Purification and direct transformation of epithelial progenitor cells from primary human prostate. Nat Protoc. 6 (5), 656-667 (2011).
  40. Kassen, A., et al. Stromal cells of the human prostate: Initial isolation and characterization. Prostate. 28 (2), 89-97 (1996).
  41. Linxweiler, J., et al. Cancer-associated fibroblasts stimulate primary tumor growth and metastatic spread in an orthotopic prostate cancer xenograft model. Sci Rep. 10 (1), 12575(2020).
  42. Liu, A. Y., et al. Cell-cell interaction in prostate gene regulation and cytodifferentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10705-10710 (1997).
  43. Olumi, A., et al. Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium. Cancer Res. 59 (19), 5002(1999).
  44. Luthold, C., Hallal, T., Labbé, D. P., Bordeleau, F. The extracellular matrix stiffening: A trigger of prostate cancer progression and castration resistance. Cancers (Basel). 14 (12), 2887(2022).
  45. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  46. Yun, Y. R., et al. Fibroblast growth factors: Biology, function, and application for tissue regeneration. J Tissue Eng. 1 (1), 1-18 (2010).
  47. Baranyi, U., et al. Primary human fibroblasts in culture switch to a myofibroblast-like phenotype independently of TGF beta. Cells. 8 (7), 721(2019).
  48. Ortiz-Otero, N., et al. Cancer-associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

fibroblasty raka prostatyizolacja fibroblast wmikro rodowisko nowotworowepo ywka warunkowanawzrost niezale ny od pod o atest w mi kkim agarzekokultura fibroblast wzr nowotworowycharakterystyka fibroblast w

Powiązane artykuły