Method Article

Sekwencjonowanie amplicon z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania długiego odczytu

DOI:

10.3791/68370

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Science and Innovation - National Research Foundation Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem ukierunkowanego głębokiego sekwencjonowania 18 obszarów oporności na leki u Mycobacterium tuberculosis przy użyciu platformy sekwencjonowania długiego odczytu, a następnie analizę za pomocą specyficznego dla gruźlicy pipeline'u bioinformatycznego zaprojektowanego do długoodczytowych danych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) nadal podkreśla pilną potrzebę szybkiej, opłacalnej i przyjaznej dla użytkownika metody diagnostycznej gruźlicy (TB) oraz lekoopornej gruźlicy (DR-TB). Technologie sekwencjonowania nowej generacji (NGS), zatwierdzone przez WHO, znacząco poprawiły wykrywanie DR-TB. Wśród nich ukierunkowane NGS (tNGS) umożliwiają ukierunkowane wykrywanie mutacji genetycznych związanych z opornością na leki, eliminując potrzebę tradycyjnej diagnostyki hodowlowej. Jeden z szeroko stosowanych testów tNGS zapewnia szybkie i kompleksowe testy podatności na leki, ale został przede wszystkim zoptymalizowany pod platformy sekwencjonowania z wysoką dokładnością. Jednak wysokie koszty tych systemów sekwencjonowania ograniczyły dostępność w krajach o niskich i średnich dochodach, szczególnie w całej Afryce. Przenośne technologie sekwencjonowania stanowią obiecującą alternatywę, oferując elastyczność i niższe wymagania infrastrukturalne. W tym badaniu DNA zostało wyekstrahowane z izolatów TB (RR-TB) opornych na ryfampicinę, amplifikowane za pomocą testu tNGS i sekwencjonowane na przenośnej platformie sekwencjonacyjnej. Te same produkty wzmacniające zostały również zsekwencjonowane na wysoko precyzyjnej platformie sekwencjonowania krótkich odczytów, aby służyć jako odniesienie. Dane z przenośnego sekwencera były przetwarzane za pomocą potoku bioinformatycznego zaprojektowanego do sekwencjonowania długiego odczytu, natomiast dane sekwencjonowania krótkiego odczytu analizowano za pomocą ugruntowanej aplikacji internetowej. Analiza wykazała, że podejście sekwencjonowania długiego odczytu skutecznie zidentyfikowało warianty związane z rezystancją wysokich częstotliwości wykrywane przez sekwencjonowanie krótkich odczytów, ale wykazywało ograniczenia w wykrywaniu wariantów niskoczęstotliwościowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gruźlica (TB) nadal jest główną przyczyną śmiertelności na całym świecie i stanowi stałe wyzwanie dla zdrowia publicznego, zwłaszcza w krajach o niskich i średnich dochodach 1,2. Pomimo inicjatyw mających na celu wzmocnienie środków kontroli gruźlicy, postępy są powolne, częściowo z powodu trudności w osiągnięciu szybkich, precyzyjnych, kosztowo efektywnych i kompleksowych technik diagnostycznych 3,4,5. Chociaż molekularne metody diagnostyczne, takie jak testy liniowe (LPA) oraz zautomatyzowane testy amplifikacji kwasów nukleinowych (NAAT), przyspieszyły identyfikację gruźlicy i lekoopornej gruźlicy (DR-TB), ich ograniczone wykrywanie mutacji ogranicza dokładne testy podatności na leki (DST). To ograniczenie jest szczególnie istotne w krajach o wysokim obciążeniu gruźlicą 6,7,8,9.

Aby rozwiązać te ograniczenia, Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaleciła zastosowanie technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS), które stały się potężnymi narzędziami do monitorowania gruźlicy i wykrywania oporności10,11. Zarówno podejścia sekwencjonowania całego genomu (WGS), jak i celowanego NGS (tNGS) oferują szersze pokrycie mutacji, umożliwiając identyfikację wariantów związanych z opornością w wielu lekach 8,12,13,14,15. Chociaż sekwencjonowanie całego genomu (WGS) dostarcza kompleksowego raportu DST, jego uzależnienie od hodowli sprawia, że nie nadaje się do szybkiej diagnostyki, ponieważ hodowla może trwać do sześciu tygodni15, 16, 17. Ukierunkowane NGS oferuje lepszą alternatywę, ponieważ nie zależy od kultury; Sekwencjonowanie można wykonać bezpośrednio z próbek klinicznych18. W związku z tym WHO zaleciła stosowanie trzech testów tNGS dla DST: Deeplex Myc-TB test: Ten test wykrywa oporność na ryfampicynę, izoniazyd, fluorochinolony, aminoglikozydy (amikacyna, kanamycynę, kapreomycynę), ethambutol, pirazynamid oraz etionamid 19,20,21. Test gruźlicy Sentinel: Celuje w oporność na ryfampicynę, izoniazyd, fluorochinolony oraz leki drugiego wyboru wstrzykiwalne18,20. Test AQ-TB: Wskazuje oporność na ryfampicynę, izoniazyd, fluorochinolony oraz leki drugiego wyboru do zastrzyków. Testy te zostały zoptymalizowane do pracy na platformie krótkich odczytów ze względu na wysoką dokładność20. Platformy długoodczytowe ONT MinION natomiast zapewniają dane w czasie rzeczywistym, przenośność oraz potencjał opłacalnej implementacji22,23. Jednak powszechne stosowanie NGS jest ograniczone przez wymagania infrastrukturalne i koszty, zwłaszcza w przypadku systemów krótkoodczytowych10.

Test Deeplex jest najbardziej kompleksowym z trzech zalecanych testów. Test został pierwotnie zaprojektowany do przeprowadzenia multipleksowego PCR na 18 obszarach związanych z opornością na 13 leków przeciwgruźlicy. Jednak WHO zaleciła go dla 10 leków przeciwgruźlicowych, co wskazuje na wystarczającą wrażliwość i swoistość. To badanie zoptymalizowało go do użycia z ONT MK1B MinION, platformą sekwencjonowania długiego odczytu. Przenośny i wielokrotnego użytku system komórek przepływowych tej platformy zmniejsza zarówno infrastrukturę, jak i potencjalne koszty sekwencjonowania na próbkę 4,22,23. Chociaż opracowano inne testy kompatybilne z długim odczytem, mają one zwykle ograniczony zakres DST, zwykle skierowane tylko do wąskiego zakresu genów oporności. Dla porównania, test oferuje szeroki zakres celów, co czyni go bardziej kompleksowym narzędziem diagnostycznym dla zdecentralizowanego DST24,25. Szczegółowa lista celów genomowych wzmocnionych przez test oraz ich powiązania leków znajduje się w Tabeli 1, podkreślającej możliwości diagnostyczne testu25.

Przed ekstrakcji DNA próbki muszą zostać zdekontaminowane i inaktywowane w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3), zgodnie z niezbędnymi środkami bezpieczeństwa 25,26,27. W każdym przebiegu należy uwzględnić wewnętrzne wzmocnienie i zewnętrzne kontrole, a zanieczyszczenia śledzić poprzez negatywne kontrole i rutynowe oceny laboratoryjne25. Ważne metryki jakości, takie jak głębokość odczytu, szerokość zasięgu i skuteczność wzmacniania, powinny być oceniane po sekwencjoningu. Dla sekwencjonowania celowanego WHO zaleca minimalną głębokość odczytu 100x dla każdego ampliconu oraz odpowiednie pokrycie wszystkich obszarów docelowej oporności na leki, aby umożliwić wykrywanie drobnych wariantów obecnych na poziomie ≥5%28. Światowa Organizacja Zdrowia popiera te ukierunkowane metody sekwencjonowania do identyfikacji oporności na leki pierwszego i drugiego planu, zakładając, że systemy zapewnienia jakości są ustanowione oraz że wszystkie regiony docelowe są odpowiednio pokryte28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te zostały przeprowadzone w ramach projektu TS ELiOT, który uzyskał etyczną aprobatę od Komitetu ds. Etyki Badań Ludzkich (HREC) na Uniwersytecie w Stellenbosch (N21/09/093) 20 października 2021 roku. Dodatkowo uzyskała zgodę od Western Cape Health Research na korzystanie z obiektów rządowych. Próbki zostały zebrane we współpracy z NHLS Green Point i Uniwersytetem Stellenbosch, na podstawie numeru zatwierdzenia SU HREC N09/11/296. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie próbki

  1. Inaktywacja ciepła
    1. Inkubować hodowle MGIT w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę, aby osiągnąć całkowitą inaktywację cieplną w warunkach BSL-3.
    2. Przejdź do ekstrakcji DNA metodąInstaGene 29.
  2. Ekstrakcja DNA
    1. Włóż 5 mL hodowli MGIT inaktywowanej termicznie do probówki 15 mL.
    2. Wirówka w dawce 4000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Ostrożnie usuń supernatant pipetowaniem, pozostawiając osad.
    4. Dodaj 200 μL odczynnika DNA do ekstrakcji chelatacyjnej do osadu i inkubuj w temperaturze 56 °C przez 15 minut.
    5. Przelej roztwór do rurki z nakrętką o pojemności 2 mL i dodaj do każdej trzy szklane kulki o średnicy 2 mm.
    6. Przez 10 sekund rozproszyć komórki i umieścić rurki w inkubatorze w suchej kąpieli w temperaturze 100 °C na 8 minut.
    7. Homogenizuj próbki za pomocą homogenizatora do ubijania koralików w następujących ustawieniach: 3 cykle po 20 sekund przy 4,0 m/s.
    8. Wiruj w 12 000 x g przez 15 minut w RT i ostrożnie przelej 130 μL supernatantu (cieczy zawierającej DNA) do probówki o pojemności 1,5 mL, unikając osadów i zanieczyszczeń.
    9. Ponownie zawiesij koraliki przez przepychanie lub wirowanie i dodaj 156 μL koralików do probówki 1,5 mL zawierającej wyodrębnione DNA.
    10. Powoli pipetuj w górę i w dół 10 razy, żeby wymieszać i inkubować w RT przez 5 minut.
    11. Umieść rurki na magnetycznym stojaku na 5 minut, aby oddzielić kulki związane z DNA.
      UWAGA: Przezroczysty supernatant powinien pojawić się nad zwartym osadem ciemnych kulek magnetycznych po boku rurki skierowanej do magnesu, co wskazuje na gotowość do usunięcia supernatantu.
    12. Zdejmij nadmiar pipetą bez naruszania koralików.
    13. Dodaj 100 μL świeżo przygotowanego etanolu 80% do kulki na stojaku i odstaw na 30 sekund, a następnie usuń etanol. Powtórz proces mycia.
    14. Susz granulki na powietrzu w RT przez 5 minut. Upewnij się, że kulka jest matowa i nie pozostanie widoczna ciecz, zanim przejdziesz do kolejnego kroku.
    15. Wyjmij rurkę z magnetycznej szafki.
    16. Dodaj 25 μL Nukleazy Wolnej Wody (NFW) bezpośrednio do suszonych kulek i zawiesisz je, delikatnie pipetując w górę i w dół 10 razy.
    17. Inkubuj w RT przez 5 minut.
    18. Wróć lampę do magnetycznego racku na kolejne 5 minut.
    19. Ostrożnie przenieś wyeludowane DNA (supernatant) do nowej probówki 1,5 mL.
    20. Zmierz stężenie DNA za pomocą wysokoczułego fluorescencyjnego odczynnika ilościowego dsDNA.
      UWAGA: DNA można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C lub stosować PCR.
  3. Wzmacnianie (PCR)
    1. Multipleks PCR i czyszczenie po PCR, zgodnie z instrukcjami producenta25.
    2. Zmierz stężenie DNA za pomocą wysokoczułego fluorescencyjnego odczynnika ilościowego dsDNA.
  4. Elektroforeza żelowa
    1. Przygotuj żel agarozowy o stężeniu 2%, rozpuszczając proszek agarozowy w buforze 1x TAE przez podgrzewanie w mikrofalówce, aż do całkowitego stopienia.
    2. Dodaj 5 μL nietoksycznego fluorescencyjnego żelu DNA do roztopionej agarozy i dokładnie wymieszaj.
    3. Wlej mieszankę żelową do tacy do odlewania żelu wyposażonej w grzebień, aby uformować wgłębienia.
    4. Pozwól żelowi zastygnąć w RT.
    5. Po zastygnięciu usuń grzebień i umieść pojemnik żelowy w zbiorniku elektroforezy wypełnionym buforem 1x TAE.
    6. Załaduj 5 μL drabiny DNA kb zmieszanej z 5 μL bufora obciążającego do pierwszego dołu.
    7. Dla każdego produktu PCR wymieszaj 5 μL produktu z 5 μL bufora obciążeniowego i załaduj do poszczególnych otworów.
    8. Uruchom żel na 100 V przez godzinę.
    9. Wizualizuj pasma DNA za pomocą systemu dokumentacji żelowej z transiluminacją.

2. Przygotowanie biblioteki ONT

  1. Przygotowanie do końca
    1. Oblicz 100 ng z każdej próbki amplikonu na podstawie stężenia i przenieś wymaganą objętość do czystej rurki PCR.
    2. Aby obliczyć całkowitą masę (w ng) amplikonów w danej próbce, pomnoży stężenie próbki (ng/μL) przez jej pozostałą objętość (μL) po kontroli jakości (QC).
      UWAGA: Na przykład, jeśli próbka ma stężenie 2 ng/μL i pozostałą objętość 1 μL po QC, całkowita masa ampliconu wynosi:
      Masa całkowita = 2 ng/μL × 1 μL = 45 ng
      Aby przygotować 10 ng amplikonów do sekwencjonowania, użyj wzoru rozcieńczenia:
      C1V1 = C2V2
      Gdzie: C1 = 45 ng, V1 = nieznane, C2 = 10 ng, V2 = 1 μL, V1 = (C2 ×V 2) / C1 = (10 ng × 1 μL) / 45 ng = μL
      Dlatego μL początkowej próbki ampliconu powinno posłużyć do uzyskania 10 ng DNA do sekwencjonowania.
    3. Dostosuj całkowitą objętość każdej próbki do 12,5 μL za pomocą NFW.
    4. Delikatnie mieszaj próbki, pipetując w górę i w dół 10 razy i krótko obracaj.
    5. Do każdej próbki dodaj 1,75 μL buforu reakcyjnego do naprawy końca i A-tailing oraz 0,75 μL mieszanki enzymów endrepair i A-tailing.
    6. Dokładnie wymieszaj, pipetując pipetami w górę i w dół 10 razy, a następnie krótko skręcaj.
    7. Inkubuj rurki w termocyklerze w temperaturze 25 °C przez 30 minut, a następnie w 65 °C przez 30 minut.
      UWAGA: Na tym etapie, jeśli użytkownik zdecyduje się przerwać proces, zaleca się użycie koralików do oczyszczania przygotowanego DNA. Oczyszczone DNA można następnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie siedem dni.
  2. Ligacja kodów kreskowych natywnych
    1. Rozmroz i przygotuj kulki magnetyczne do oczyszczania DNA i wyboru rozmiaru, koralików do czyszczenia paramagnetycznego DNA, EDTA oraz natywnych kodów kreskowych (NB01-96) zgodnie z instrukcjami producenta, a następnie umieść je w lodzie.
    2. W nowych probówkach PCR dodaj kolejno: 2,75 μL wody wolnej od nukleazy, 1 μL DNA przygotowanego na zakończenie, 1,25 μL natywnych kodów kreskowych (NB01-96) oraz 5 μL mieszanki enzymów ligacyjnych DNA.
    3. Każdą reakcję wymieszaj przez delikatne pipetowanie 10 razy, krótko zakręć w mikrowirówce i inkubuj przez 20 minut w RT.
    4. Dodaj 1 μL EDTA do każdego dołka, dokładnie wymieszaj pipetowaniem i krótko zakręcaj.
    5. Próbki z kodem kreskowym w basenie umieszczone w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
    6. Ponownie zawiesij kulki oczyszczające DNA przez wirowanie i dodaj 0,7x całkowitą objętość zebranej próbki (np. dla 23 próbek o objętości 253 μL dodaj 177,1 μL koralików).
    7. Wymieszaj roztwór przez pipetowanie i inkubuj na HulaMixerze przez 10 minut w stanie RT.
    8. Przygotuj 2 mL etanolu 80%, mieszając 1600 μL czystego etanolu z 400 μL NFW.
    9. Umieść lampę na magnetycznym stojaku na 5 minut, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna.
    10. Usuń i wyrzuć supernatant bez naruszania granulki.
    11. Umyj kulki świeżo przygotowanym 80% etanolem 700 μL, nie naruszając granulki, a następnie usuń i wyrzuć etanol.
    12. Powtórz krok mycia etanolem.
    13. Krótko wiruj rurkę, wracaj do magnetycznego stojaka i usuń resztki etanolu.
    14. Pozwól koralikom wyschnąć na powietrzu przez 30 sekund.
    15. Wyjmij rurkę z magnetycznego stojaka, ponownie zawiesz kulki w 35 μL wodzie wolnej od nukleazy delikatnym przemieszczeniem i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    16. Wróć lampę do magnetycznego stojaka, aż eluata stanie się przezroczysta i bezbarwna.
    17. Przelej 35 μL eluatu do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL na kolejne kroki.
      UWAGA: Na tym etapie biblioteka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. Ligacja i czyszczenie adaptera
    1. Przygotuj zestaw szybkiego odczynnika ligacji DNA zgodnie z instrukcjami producenta i umieść go w lodzie.
    2. Wymieszaj Native Adapter (NA) i Quick Ligase przez pipetowanie, a następnie umieść na lodzie.
    3. Rozmroź bufor elucijny (EB) w stanie RT, wiru, wiruj i umieść go na lodzie.
    4. Rozmraź Short Fragment Buffer (SFB) w stanie RT, rozkręć wir, wirować i umieścić na lodzie.
    5. W probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL o niskim wiązaniu wymieszaj następujące składniki: 30 μL zebranej próbki z kodem kreskowym, 5 μL Native Adapter (NA), 10 μL buforu reakcji szybkiego wiązania oraz 5 μL szybko działającej ligazy DNA T4.
    6. Delikatnie pipetuj do wymieszania, krótko wiruj i inkubuj przez 20 minut w RT.
    7. Ponownie zawiesijcie kulki oczyszczające DNA przez wirowanie i dodajcie 20 μL (0,4x) kulek do reakcji.
    8. Delikatnie mieszaj przez pipetowanie i inkubuj na HulaMixerze przez 10 minut w RT.
    9. Osadz kulki na magnetycznym stojaku i zasysaj supernatant, nie naruszając granulki.
    10. Przemyj kulki, dodając 125 μL Short Fragment Buffer (SFB), ponownie zawiesij przez przepchnięcie, krótko wiruj i wróć do magnetycznej stojaki.
    11. Rozpuszczaj koraliki i aspiruj nadmiar; Powtórz ten krok mycia raz.
    12. Krótko wiruj, oddaj rurkę do magnetycznego stojaka i zasysaj resztki supernatantu.
    13. Wyjmij rurkę z magnetycznego stojaka i ponownie zawiesz kulki w 15 μL Buforu Elution (EB).
    14. Krótko wiruj i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby wyluczyć DNA.
    15. Umieść rurkę na magnetycznym stojaku, rozpuszczaj kulki do momentu, aż eluat stanie się przezroczysty i bezbarwny, a następnie wssaj 15 μL eluatu do czystej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
    16. Określ 1 μL eluzji.
    17. Rozcieńcz bibliotekę do 20 fmol (oblicz za pomocą kalkulatora NEB) i użyj 12 μL z przygotowanej biblioteki 20 fmol do sekwencjonowania na komórce przepływowej R10.4.1.
      UWAGA: Biblioteka może być teraz przechowywana w temperaturze -20 °C, co pozwala na wielokrotne użytkowanie.
  4. Podstawkowanie i załadowanie komórki przepływowej sekwencjonowania nanoporów
    1. Rozmrażaj Bufor Sekwencjonujący (SB), Kulki Biblioteczne (LIB), Flow Cell Tether (FCT) i Flow Cell Flush (FCF) w RT, mieszaj je przez wirowanie i skręcaj.
    2. Przygotuj mieszankę do płynu komórek, łącząc 5 μL albuminy surowicy bydłej (BSA, 50 mg/mL), 30 μL Flow Cell Tether (FCT) oraz 1170 μL Flow Cell Flush (FCF), mieszając roztwór przez inwersję i pipetowanie.
    3. Otwórz port gazujący komórki przepływowej, zasysaj ~20 μL bufora, aby usunąć pęcherzyki powietrza, załaduj 800 μL mieszanki do portu gazującego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza i odczekaj 5 minut.
    4. Przygotuj bibliotekę, mieszając 37,5 μL Buforu Sekwencjonującego (SB), 25,5 μL Bibliotecznych Kulek (LIB) lub Roztwóru Bibliotecznego (LIS) oraz 12 μL biblioteki DNA o masie 20 fmol w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, dokładnie mieszając przez pipetowanie.
    5. Ponownie załóż komorę przepływową, delikatnie podnosząc pokrywę portu próbki komórki przepływowej, ładując 200 μL mieszanki do portu gazującego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza i przygotowując bibliotekę do załadunku.
    6. Delikatnie mieszaj przygotowaną bibliotekę przez pipetowanie i ładuj 75 μL biblioteki do portu próbek komórek sekwencjonujących krople, upewniając się, że każda kropla trafia do portu przed dodaniem kolejnej.
    7. Zamknij pokrywę portu próbki komórki przepływowej, upewniając się, że korek wchodzi do portu próbki komórki przepływowej, a następnie zamknij port do próbki komory.
    8. Podłącz przenośne urządzenie sekwencjonujące do komputera (z nieprzerwanym zasilaniem) i rozpocznij sekwencjonowanie za pomocą oprogramowania do sterowania i analizy sekwencjonującej.
  5. Parametry oprogramowania
    UWAGA: Ta aplikacja programowa, opracowana przez ONT, jest wykorzystywana do kompleksowego zarządzania kolejnościami oraz generowania szczegółowych raportów.
    1. Aby rozpocząć proces sekwencjonowania, wybierz opcję Start , a następnie Rozpocznij sekwencjonowanie.
      UWAGA: Następnie zostanie poproszony o wyznaczenie folderu do przechowywania plików i podanie nazwy dla swojego sekwencjonowania, na przykład "sequencing_run_1". Następnie kliknij Continue do ustawień , aby wybrać odpowiednią nazwę zestawu, np. library-sequencing-amplicons-native-barcoding-v14-sqk-nbd114-96, i dostosować pożądany czas działania, na przykład 20 h (maksymalny czas działania to 72 h).
    2. Następnie wybierz typ pliku wyjściowego, wybierając spośród opcji takich jak POD5 dla odczytów surowych wyjść oraz FASTQ dla wyjść bazowych. Następnie wybierz model FAST-Basecalling.
    3. Proszę zauważyć, że niektóre z domyślnych ustawień to częste skanowanie porów co 1,5 godziny, minimalny czas odczytu 200 bp oraz minimalny wynik jakości 8. Na koniec przejrzyj ustawienia i rozpocznij proces czytania.

3. Analiza po sekwencjonowaniu

  1. Wymagania systemowe
    UWAGA: Przewodnik po tworzeniu środowiska i analizie danych sekwencjonowania ampliconów Mycobacterium tuberculosis z wykorzystaniem pipeline'u ONT-TB-NF. Instrukcje są dostosowane zarówno do użytkowników Windows (przez WSL), jak i macOS.
    1. Użyj następujących - System operacyjny: Windows 10/11 (z WSL2) lub macOS; Pamięć: Minimum 8 GB RAM (zalecane 16 GB); Pojemność: co najmniej 50 GB wolnej przestrzeni na dysku; Internet: Wymagany do pobierania pakietów i danych; Uprawnienia: Możliwość instalowania oprogramowania i zarządzania środowiskiem.
  2. Upewnij się, że masz następujące ustawienia środowiska: Użytkownicy Windows (używając WSL2). Włącz WSL2.
    1. Otwórz PowerShell jako administrator i uruchom: wsl - install.
    2. Zrestartuj komputer po poleceniu.
  3. Zainstaluj Ubuntu
    1. Po ponownym uruchomieniu uruchom Microsoft Store, wyszukaj Ubuntu i zainstaluj preferowaną wersję (np. Ubuntu 22.04 LTS).
    2. Uruchom Ubuntu z menu Start .
    3. Utworz nową nazwę użytkownika i hasło UNIX, gdy pojawi się poproszona o to.
    4. Lista pakietów aktualizacji: sudo apt update & sudo apt upgrade -y.
  4. Użytkownicy macOS
    1. Zainstaluj Homebrew (jeśli nie jest jeszcze zainstalowany): /bin/bash -c "$(curl -fsSL https://raw.githubusercontent.com/Homebrew/install/HEAD/install.sh)".
    2. Instalacja wymaganych pakietów: brew install git wget
  5. Instalacja Condy lub Mamby
    1. Odwiedź stronę Miniconda do pobrania, aby pobrać odpowiedni instalator dla systemu operacyjnego.
    2. Aby zainstalować Minicondę, uruchom instalator i postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie. Po zakończeniu instalacji proszę o ponowne uruchomienie terminala.
    3. Konfiguruj kanały Conda:
      Conda config --add channels defaults
      Conda config --add channels bioconda
      Conda config --Add channels conda-forge
    4. Instalacja Mambaforge (Mamba)
      Dla Linuksa:
      wget
      https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh
      Dla macOS:
      Wget https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-MacOSX-arm64.sh
    5. Zainstaluj Mambaforge: uderz Mambaforge-*.sh
    6. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby zakończyć instalację i zrestartuj terminal, aby aktywować Mamba.
  6. Zakładanie potoku ONT-TB-NF
    1. Stwórz nowe środowisko Conda: conda create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    2. Alternatywnie, użyj Mamba: mamba create -n ont_tb_env samtools=1.15.1 minimap2=2.24 nanoplot=1.40.2 mosdepth=0.3.3 flye=2.9.1 nanofilt fastqc bedtools -c bioconda
    3. Aktywuj środowisko: aktywuj ont_tb_env
    4. Zainstaluj Nextflow: curl -s https://get.nextflow.io | Bash, Sudo MV Nextflow /usr/local/bin/
    5. Sklonuj repozytorium ONT-TB-NF: git clone https://github.com/HKU-BAL/ONT-TB-NF.git
      cd ONT-TB-NF
    6. Pobierz wymagane obrazy Docker (jeśli używasz Dockera)
      docker pull hkubal/clair3:v0.1-r12
      Docker pull quay.io/biocontainers/tb-profiler:4.3.0--pypyh5e36f6f_0
  7. Uruchamianie potoku
    1. Łącz pliki Basecalled FASTQ każdego z próbek niezależnie, używając następującego polecenia.
      Kot *.fastq.gz > concatenated.fastq.gz
      NextFlow uruchom run_tb_amplicon.nf \
      read_fq /ścieżka/do/concatenated.fastq.gz \
      sample_name SAMPLE_ID \
      amplicon_bed /ścieżka/do/amplicon_regions.łóżka \
      Nici 16 \
      output_dir /absolute/path/to/output_directory
  8. Pliki wyjściowe i interpretacja
    1. Po pomyślnym uruchomieniu upewnij się, że potok generuje następujące wyjścia w określonym katalogu wyjściowym:
      1. Odczyty wyrównane: pliki *.bam.
      2. Wywołania wariantów: *.vcf plików zawierających SNP i indele.
      3. Raporty podsumowujące: pliki *.csv lub *.tsv podsumowujące mutacje oporności na leki oraz inne istotne wskaźniki.
      4. Raporty kontroli jakości: pliki *.htmL generowane przez narzędzia takie jak MultiQC.
      5. Logi: Szczegółowe logi wykonania potoku.
      6. Pliki pośrednie: przechowywane w katalogu roboczym/(można je usunąć po pomyślnym uruchomieniu).
        UWAGA: W przypadku napotykania błędów uprawnień niezbędne jest zweryfikowanie, czy posiada się odpowiednie uprawnienia do odczytu i zapisu plików, a także do wykonywania skryptów. W kwestii środowiskowych prosimy o uruchomienie odpowiedniego środowiska Conda przed uruchomieniem rurociągu. Dla osób korzystających z profili Dockera konieczne jest potwierdzenie, że Docker jest zarówno zainstalowany, jak i działający. Dodatkowo należy skrupulatnie monitorować zasoby systemowe, aby uniknąć ograniczeń pamięci lub pamięci podczas działania. Przegląd tych metodologii przedstawiono na Rysunku 1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wybrana metoda ekstrakcji DNA została wybrana ze względu na jej efektywność i lepszą wydajność w porównaniu z innymi szybkimi metodami. Konsekwentnie generował wysokiej jakości genomowe DNA (gDNA), a integracja kroku oczyszczania opartego na koralikach pomogła zminimalizować czas przetwarzania i obniżyć koszty próbki. Osiągnięto to poprzez wyeliminowanie potrzeby dodatkowych ocen kontroli jakości, takich jak pomiary spektrofotometryczne, a fluorometria była jedynym narzędziem do ilościowania DNA. Stężenia po PCR okazały ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Platforma sekwencjonowania długiego odczytu wykazała w tym badaniu znaczące zalety, zwłaszcza zdolność do szybkiego sekwencjonowania przy konsekwentnie dużej szerokości pokrycia. We wszystkich skutecznie zsekwencjonowanych izolatach osiągnięto szerokość pokrycia na poziomie 99,9%, co wskazuje na niemal pełną reprezentację regionów genomowych związanych z opornością. Średnia głębokość pokrycia wszystkich docelowych genów wynosiła 4462X, przy czym gen eis wykazywał najwyższą głębię 22 242,08X, a gen rrs n...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy wyrazić szczere podziękowania Centrum SAMRC ds. Gruźlicy na Uniwersytecie w Stellenbosch za zapewnienie niezbędnych zasobów i udogodnień. Jesteśmy również głęboko wdzięczni badaniu TS ELiOT za dostarczenie próbek, które były integralną częścią tego badania.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL & Rurki wiążące Lo-bining o pojemności 1,5 mL lub 2 mLEppendorfEP0030108051-250EA
Drabina 1kbThermo Fisher ScientificSM0311
2 mL rurki z nakrętkąScientific Specialties IncP2TUB056C-0001.5ST
Sterylne szklane koraliki 2 mmSigma-AldrichZ273627-1EA
AMPure XP BeadBeckman ColterA63881
Deeplex Myc-TB GenoScreen20090205
Komora elektroforezyThermo Fisher ScientificA25977
Alkohol etylowy, czystySigma-AldrichE7023-500ML
Homogenizator FastPrepMP Biomedicals116005500
Końcówki pipet filtrujących (10 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-10-R
Końcówki pipet filtrujących (1000 i mikro; L) Bio-Smart ScientificFT-1000-R
Końcówki pipety filtracyjne (20 & mikro; L) Bio-Smart ScientificFT-20-R
Końcówki pipet filtrujących (200 & micro; L) Bio-Smart ScientificFT-200-R
Flow-cell Oxford Nanopore TechnologiesFLO-MIN114
Blok grzewczyEppendorf5382000031
Macierz InstaGeneBio-RadBBRD7326030
Magnetyczny Rack Thermo Fisher Scientific  12321D
MikrowirówkaEppendorf 5406000046
MinionOxford Nanopore TechnologiesMK1B
Zestaw do kodowania kreskowego Native-barcode V14 Oxford Nanopore TechnologiesSQK-NBD114.24
NEB Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367
Moduł szybkiego ligowania NEBNextNEBE6056
NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing ModuleNEBE7546
Woda wolna od nukleazy (NFW)Thermo Fisher ScientificAM9937
Pipety (P10, P20, P200 i P1000)EppendorfEP3123000918-1EA
Rurki do analizy qubitówThermo Fisher ScientificQ32856
Qubit dsDNA HS Zestaw TestowyThermo Fisher ScientificQ33231
Fluorometr kubitówThermo Fisher ScientificQ33226
SYBR Safe DNA Gel SzczepThermo Fisher ScientificS33102
UltraPure AgaroseThermo Fisher Scientific17852
Transiluminator Universal Hood III (System Molecular Imager Gel Doc XR)Bio-Rad170-8170
Mieszacz wirowyLasecWMBB0L0E0216

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuberculosis report. Baltimore Health News. , WHO. (2022).
  2. WHO Malaria Department report. Report 20-23. , WHO. (2023).
  3. The End Strategy TB. 53 (1), WHO. 1689-1699 (2015).
  4. Cabibbe, A. M., et al. Application of targeted nextgeneration sequencing assay on a portable sequencing platform for culturefree detection of drugresistant tuberculosis from clinical samples. J Clin Microbiol. 58 (10), e0063220(2020).
  5. Jouet, A., et al. Deep amplicon sequencing for culturefree prediction of susceptibility or resistance to 13 antituberculous drugs. Eur Respir J. 57 (3), 2002338(2021).
  6. NG, K. C. S., et al. How well do routine molecular diagnostics detect Rifampin. J Clin Microbiol. 57 (1), e0128723(2019).
  7. MacLean, E., Kohli, M., Weber, S. F., Suresh, A. Advances in molecular diagnosis of tuberculosis. J Clin Microbiol. 58 (10), e0158219(2020).
  8. Sibandze, D. B., et al. Rapid molecular diagnostics of tuberculosis resistance by targeted stool sequencing. Genome Med. 14 (1), 42(2022).
  9. Shah, M., Chihota, V., Coetzee, G., Churchyard, G., Dorman, S. E. Comparison of laboratory costs of rapid molecular tests and conventional diagnostics for detection of tuberculosis and drugresistant tuberculosis in South Africa. BMC Infect. Dis. 13 (1), 352(2013).
  10. Hu, T., Chitnis, N., Monos, D., Dinh, A. Nextgeneration sequencing technologies: An overview. Hum Immunol. 82 (10), 801-811 (2021).
  11. Pervez, M. T., et al. A comprehensive review of performance of nextgeneration sequencing platforms. Biomed Res Int. 2022, 3457806(2022).
  12. Tafess, K., et al. Targetedsequencing workflows for comprehensive drug resistance profiling of Mycobacterium tuberculosis cultures using two commercial sequencing platforms: Comparison of analytical and diagnostic performance, turnaround time, and cost. Clin Chem. 66 (6), 809-820 (2020).
  13. Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. WHO rapid communication. , WHO. https://www.who.int/publications/i/item/9789240076372 (2023).
  14. Hazra, D., et al. Impact of wholegenome sequencing of Mycobacterium tuberculosis on treatment outcomes for MDRTB/XDRTB: A systematic review. Pharmaceutics. 15 (6), 1408(2023).
  15. Shea, J., et al. Comprehensive wholegenome sequencing and reporting of drug resistance profiles on clinical cases of Mycobacterium tuberculosis in New York State. J Clin Microbiol. 55 (6), 1871-1882 (2017).
  16. Meehan, C. J., et al. Whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis: Current standards and open issues. Nat Rev Microbiol. 17 (10), 533-545 (2019).
  17. Heupink, T. H., Verboven, L., Warren, R. M., Van Rie, A. Comprehensive and accurate genetic variant identification from contaminated and lowcoverage Mycobacterium tuberculosis whole genome sequencing data. Microb Genom. 7 (1), e000555(2021).
  18. Wang, X., et al. Interpretation of the third edition of WHO consolidated guidelines on tuberculosis: Module 3: Diagnosis: Rapid diagnostics for tuberculosis detection. Chin J Antituberc. 46 (2), 120-130 (2024).
  19. Kambli, P., et al. Targeted nextgeneration sequencing directly from sputum for comprehensive genetic information on drugresistant Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis. 127 (1), 102051(2021).
  20. Use of targeted nextgeneration sequencing to detect drugresistant tuberculosis. Rapid Communication. , WHO. 1-8 (2023).
  21. Nandlal, L., Perumal, R., Naidoo, K. Rapid molecular assays for the diagnosis of drugresistant tuberculosis. Infect Drug Resist. 15 (1), 4971-4984 (2022).
  22. Dippenaar, A., et al. Nanopore sequencing for Mycobacterium tuberculosis: A critical review of the literature, new developments, and future opportunities. J Clin Microbiol. 60 (5), e0123422(2022).
  23. Chan, W. S., et al. Rapid and economical drug resistance profiling with nanopore MinION for clinical specimens with low bacillary burden of Mycobacterium tuberculosis. BMC Res Notes. 13 (1), 123(2020).
  24. Feuerriegel, S., et al. Rapid genomic first and secondline drug resistance prediction from clinical Mycobacterium tuberculosis specimens using DeeplexMycTB. Eur Respir J. 57 (4), 2004784(2021).
  25. GenoScreen product brochure. Deeplex MycTB. , GenoScreen. (2023).
  26. Mtafya, B., et al. A practical approach to render tuberculosis samples safe for application of tuberculosis molecular bacterial load assay in clinical settings without a biosafety level 3 laboratory. Tuberculosis. 138 (1), 102194(2023).
  27. Suganthi, P., Usharani, B., Venkateswari, R., Muthuraj, M. Biosafety practices in mycobacteriology laboratory. Research Advances in Microbiology and Biotechnology. 3, B P International (a part of SCIENCEDOMAIN International). Chennai. 1-39 (2023).
  28. consolidated guidelines on tuberculosis. Module 4: Treatment and care. WHO guideline. , WHO. (2022).
  29. Williams, J., et al. Matrixbased DNA extraction for targeted nextgeneration sequencing on decontaminated sputum samples. J Vis Exp. (181), e68147(2025).
  30. Delahaye, C., Nicolas, J. Sequencing DNA with nanopores: Troubles and biases. PLoS One. 16 (2), e0245534(2021).
  31. Zhao, K., et al. Rapid identification of drugresistant tuberculosis genes using direct PCR amplification and Oxford Nanopore Technology sequencing. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2022, 8845672(2022).
  32. Tagliani, E., et al. Culture and nextgeneration sequencingbased drug susceptibility testing unveil high levels of drugresistantTB in Djibouti: Results from the first national survey. Sci Rep. 7 (1), 15076(2017).
  33. Smith, C., Halse, T. A., Shea, J., Modestil, H., Fowler, R. C. Assessing nanopore sequencing for clinical diagnostics: For Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 59 (7), e0123421(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Long Read SequencingAmplicon SequencingDrug Resistant TuberculosisTargeted NGSPortable SequencingDNA Library PreparationResistance Variant DetectionFlow Cell PrimingGel ElectrophoresisBioinformatics Pipeline

Related Articles