Artykuł metodologiczny

Desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą pod wpływem fluorescencji ze spektrometrią mas z indukowaną laserem spektrometrią mas z jonizacji poszczególnych komórek nerwowych szczura

DOI:

10.3791/68376

⸱

23 maja 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Chemistry, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois Urbana-Champaign, 4Neuroscience Program, University of Illinois Urbana-Champaign

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje użycie mikroMS do sterowanej fluorescencją, jednokomórkowej spektrometrii mas MALDI-2, umożliwiając lepsze profilowanie molekularne pierwotnych komórek neuronalnych szczura.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiary pojedynczych komórek są kluczowe dla zrozumienia bogatej heterogeniczności czasochemicznej mózgu. Spektrometria mas (MS) z jonizacją laserową/desorpcyjną wspomaganą matrycą (MALDI) jest w stanie bezznacznikową, wysokoprzepustową charakteryzować endogenne cząsteczki w pojedynczych komórkach. Ostatnie postępy w rozwoju spektrometrów masowych MALDI z postjonizacją indukowaną laserem (MALDI-2) zapewniają znacznie zwiększoną czułość wykrywania różnych lipidów i innych małych cząsteczek. Jednak obrazowanie SM dużych próbek za pomocą MALDI-2 w rozdzielczości komórkowej jest zbyt wolne w większości zastosowań. W tym protokole komórki pierwotne są izolowane i rozpraszane na szkiełkach przewodzących. Względne lokalizacje komórek są określane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej na całym szkiełku, a następnie dokładnej korejestracji współrzędnych mikroskopii ze współrzędnymi stopnia spektrometru mas MALDI-2. Ukierunkowana analiza MS tylko w lokalizacjach komórek zapewnia wysokowydajne, jednokomórkowe pomiary z dużym pokryciem analitu i zmniejszonym rozmiarem danych w porównaniu z obrazowaniem MS całej próbki. Opisujemy krytyczne etapy niezbędne do przygotowania pojedynczej komórki, obrazowania fluorescencyjnego na całym szkiełku, aplikacji matrycy i spektrometrii mas MALDI-2.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lipidy i metabolity są podstawą funkcji komórkowej i służą jako niezbędne składniki błon, źródeł energii i cząsteczek sygnałowych1,2. Jednak ich skład i liczebność mogą się znacznie różnić między poszczególnymi komórkami, odzwierciedlając różnice w typach komórek oraz stanach rozwojowych i funkcjonalnych3,4,5. Analiza tych różnic ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zmienności biologicznej i identyfikacji odrębnych subpopulacji komórek. Techniki pomiaru pojedynczych komórek, takie jak sekwencjonowanie RNA, zapewniają przydatne profile transkryptów specyficzne dla komórki6. Jednak te pomiary na poziomie transkryptu nie odzwierciedlają bezpośrednio rzeczywistych komórkowych ilości lipidów i metabolitów, ponieważ ekspresja genów nie zawsze koreluje z rzeczywistą obfitością tych analitów. Specjalistyczne metody bezpośrednich pomiarów lipidów i metabolitów są zatem niezbędne do kompleksowej analizy składu chemicznego pojedynczych komórek i ich populacji.

Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) wspomaganej laserową desorpcją/jonizacją (MALDI) jest narzędziem do mapowania przestrzennego endogennych biomolekuł in situ7,8. Zazwyczaj w przypadku MALDI laser UV jest używany do ablacji materiału z cienkiej warstwy próbki skrystalizowanej z matrycą organiczną, tworząc pióropusz jonów i obojętnych cząsteczek. Powstałe jony są następnie rozdzielane przez analizator MS i wykrywane w spektrometrze mas. Biorąc pod uwagę dokładne pozycjonowanie nowoczesnych stopni spektrometru masowego, laser może być ustawiony tak, aby celować w określone obszary próbki lub rastrować w różnych regionach w celu generowania obrazów molekularnych przez MSI. MSI w komórkowej lub subkomórkowej rozdzielczości przestrzennej (< 10 μm), osiągnięty dzięki skupionej wiązce laserowej i dokładnemu ruchowi stolika, może być wykorzystany do uzyskania informacji chemicznych o poszczególnych komórkach9,10. Jednak pomiary MSI w tej skali są nieefektywne, szczególnie w przypadku próbek o niskiej docelowej gęstości komórek, ze względu na ilość czasu poświęconego na obrazowanie pustych obszarów między komórkami. Ponadto wykrywalność wielu analitów jest ograniczona ze względu na małą objętość pobieranych próbek. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy oparte na obrazie podejście MALDI MS do wysokoprzepustowej analizy pojedynczych komórek11,12. W tym podejściu lokalizacje rozproszonych komórek są programowo określane na podstawie obrazów fluorescencyjnych całego szkiełka i wykorzystywane do kierowania stolika spektrometru mas do pozycji, w których znajdują się pojedyncze komórki o określonych parametrach (np. wielkości i kształcie), a następnie są analizowane za pomocą naświetlania laserem MALDI. Wcześniejsze prace wykorzystujące to ukierunkowane podejście zostały wykorzystane do scharakteryzowania lipidów, peptydów i innych biomolekuł w heterogenicznych populacjach komórek5,13.

Biorąc pod uwagę ograniczony masowo charakter pojedynczych komórek, liczba analitów wykrywanych w takich próbkach jest zazwyczaj mniejsza niż ta obserwowana bezpośrednio z tkanki. Dlatego, aby zwiększyć pokrycie analitem w analizie stwardnienia rozsianego w pojedynczych komórkach, kluczowe znaczenie ma zwiększenie czułości wykrywania analitu. Jednym z ostatnio opracowanych podejść, które pomaga w przezwyciężeniu tego wyzwania wykrywania, jest MALDI z laserową postjonizacją (MALDI-2), która, jak wykazano, zwiększa czułość dla szerokiej gamy analitów9,14,15,16. W rezultacie, MALDI-2 generuje bardziej kompleksowe zestawy danych pojedynczych komórek i zapewnia głębsze pokrycie molekularne w próbkach o ograniczonej masie, takich jak izolowane komórki.

Celem tej metody jest uzyskanie pomiarów lipidów z tysięcy pojedynczych komórek. W tym celu opisujemy przepływ pracy, który umożliwia wysokoprzepustową spektrometrię mas MALDI-2 w pojedynczej komórce i można go ogólnie rozszerzyć na dowolne podejście do spektrometrii mas oparte na sondzie z precyzyjną kontrolą etapu17. W tym przepływie pracy tkanka z obszaru (regionów) mózgu będącego przedmiotem zainteresowania jest preparowana, a poszczególne komórki są uzyskiwane z tkanki po procedurze dysocjacji papainy. Komórki są następnie znakowane barwnikiem jądrowym i rozpraszane na przewodzących szkiełkach przewodzących wytrawionych znacznikami odniesienia, gdzie mogą przylegać. Następnie wykonywane są obrazy całego preparatu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Matryca jest osadzana w procesie sublimacji, generując powtarzalną jednorodną warstwę krystaliczną i wysoki stosunek sygnału do szumu do analizy MS w jednej komórce. Korzystając z oprogramowania open source microMS11, względne współrzędne lokalizacji komórek z obrazu mikroskopowego są mapowane i wyrównywane ze współrzędnymi stopnia spektrometru mas za pomocą rejestracji punktowej przy użyciu znaczników odniesienia wytrawionych na szkiełkach, na których zdeponowano komórki. Wreszcie, korzystając z tych informacji, z każdej pojedynczej komórki uzyskuje się precyzyjne, ukierunkowane widma MS, co pozwala na profilowanie tysięcy komórek w jednym przebiegu (<1 h)12,13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem użytkowania zwierząt zatwierdzonym przez Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (23228) z ścisłym przestrzeganiem zarówno krajowych, jak i ARRIVE standardów etycznego traktowania i opieki nad zwierzętami.

1. Przygotowanie materiałów i roztworów

  1. Przygotuj zmodyfikowany zbilansowany roztwór soli Geya (mGBSS) z 1,5 mM CaCl2, 4,9 mM KCl, 0,2 mM KH2PO4, 11 mM MgCl2, 0,3 mM MgSO4, 138 mM NaCl, 27,7 mM NaHCO3, 0,8 mM Na2HPO4 i 25 mM HEPES. Doprowadzić pH do 7,2 za pomocą 3 M NaOH. Zaleca się przygotowanie 1 l mGBSS i przechowywanie w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  2. Przygotuj strzykawki o pojemności 50 ml, napełniając je przygotowanym roztworem mGBSS i umieść je na lodzie do perfuzji przezsercowej. Przygotować 1 strzykawkę na każdego wyciętego szczura.
  3. Przygotuj porcje roztworu papainy zgodnie z protokołem Worthington Papain Dissociation System. Ten system zawiera cztery fiolki, jak opisano poniżej, przy czym fiolka 4 nie jest używana w tym protokole:
    Fiolka 1: sterylny zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS) z wodorowęglanem i fenolem red
    Fiolka 2: papaina z L-cysteiną i EDTA
    Fiolka 3: dezoksyrybonukleaza I (DNaza)
    Fiolka 4: inhibitor proteazy owamkoidowej z albuminą surowicy bydlęcej
    1. Dodać 5 ml EBSS (fiolka 1) do fiolki z papainą (fiolka 2) i umieścić ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut w celu rozpuszczenia papainy.
    2. Dodać 500 μl EBSS (fiolka 1) do fiolki DNazy (fiolka 3) i delikatnie wymieszać. Dodać 250 μl rozcieńczonej fiolki z DNazą (fiolka 3) do fiolki z papainą (fiolka 2). Preparat ten zawiera końcowe stężenie 20 jednostek/ml papainy, 0,005% DNazy, 0,5 mM EDTA i 1 mM L-cysteiny.
    3. Zamrozić 250 μL porcji tego przygotowanego roztworu papainy do kolejnych dysocjacji (daje ~20 porcji). Uzupełnij ten roztwór następującymi antybiotykami: 100 jednostek/ml penicyliny G, 100 μg/ml streptomycyny i 100 μg/ml gentamycyny. Można to zmodyfikować dla aplikacji użytkownika.
  4. Przygotować 150 mM roztwór octanu amonu i przechowywać go w temperaturze 4 °C. Przygotować 33% roztwór glicerolu, rozcieńczając glicerol w przygotowanym roztworze mGBSS.
  5. Wytrawiaj odniesienia na szkiełkach mikroskopowych pokrytych tlenkiem indu cyny (ITO) za pomocą pisaka do grawerowania z końcówką z węglika wolframu lub diamentu lub grawera laserowegoCO2. Po przewodzącej stronie szkiełka ITO wytraw 20-40 znaczników odniesienia w kształcie litery X wzdłuż obwodu szkiełka, aby umożliwić międzyplatformową (np. mikroskop i spektrometr masowy) rejestrację przestrzenną.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie wytrawić jednej połączonej linii otaczającej sample lub jej obszary, ponieważ zakłóca to przewodność powierzchniową między obszarem a adapterem szkiełka szklanego.

2. Przygotowanie pierwotnych komórek nerwowych

UWAGA: Tkanka hipokampa szczura jest preparowana, rozdzielana na pojedyncze komórki za pomocą papainy i umieszczana na przewodzących szkiełkach o niskiej gęstości. Izolacja komórek w ten sposób umożliwia wysokoprzepustową spektrometrię mas pojedynczych komórek endogennych lipidów.

  1. Przed sekcją zwierząt należy rozmrozić porcję przygotowanego roztworu papainy i umieścić ją w pojemniku z rurką wlotową i wylotową, dzięki której CO2 może wyprzeć powietrze wewnątrz pojemnika. Umieść ten system w łaźni wodnej ustawionej na 37 °C i kontynuuj przepływ CO2 do momentu, gdy roztwór osiągnie odpowiednie pH, jak wskazuje kolor, korzystając z tabeli kolorów pH zawartej w pakiecie systemu dysocjacji papainy Worthingtona. Docelowy pH wynosi od 7,2 do 7,4,
    UWAGA: Nie należy wlewać CO2 do roztworu enzymatycznego, ponieważ spowoduje to denaturację DNazy i utratę aktywności biologicznej. Użyj probówki wirówkowej o pojemności 50 ml z dwiema probówkami wklejonymi w pokrywkę, umożliwiając CO2 napełnienie probówki od dołu i wydostanie się z górnej rurki wylotowej.
  2. Eutanazja szczura (szczurów) zgodnie z protokołami IACUC zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi, lokalnymi i federalnymi. Tutaj 2- do 3-miesięcznych samców szczurów Sprague-Dawley są wykorzystywane i uśmiercane przez uduszenie CO2 .
  3. Przezsercowo przeprowadzić perfuzję szczura lodowatym (4 °C) roztworem mGBSS w celu usunięcia krwi z układu naczyniowego i szybkiego schłodzenia ciała zwierzęcia. Jeden z przykładów tej procedury można znaleźć w protokole We et al.18.
  4. Chirurgicznie odizoluj mózg od szczura, upewniając się, że nie uszkodzisz interesującego go obszaru mózgu. Wcześniej opublikowany przegląd tej izolacji zawiera więcej szczegółów na temat niektórych poszczególnych kroków19.
  5. Użyj rozdrabniacza do tkanek lub kostki tkankowej, aby wyciąć przekrój poprzeczny (o grubości ~ 2 mm) mózgu, aby wystawić obszar (hipokamp, korę lub prążkowie) na próbkę.
  6. Użyj stempla do biopsji o średnicy 2 mm, aby pobrać próbkę z interesującego obszaru mózgu i umieścić fragment tkanki w fiolce z roztworem papainy.
  7. Inkubować tę tkankę i roztwór papainy w temperaturze 37 °C pod ciągłym mieszaniem (np. za pomocą elektrycznego kołyska) przez 30-90 min.
    UWAGA: Czas trwania leczenia enzymatycznego powinien być zoptymalizowany w oparciu o region mózgu, szczep zwierzęcy, wiek i pożądaną wydajność komórkową (np. neurony i astrocyty z zakończeniami w porównaniu z maksymalną wydajnością komórek bez zakończeń). W przypadku tkanki hipokampa szczura typowe jest 60-90 minut. Krótsze zabiegi mogą zachować niektóre terminale, ale pozostawić wiele komórek w niezdysocjowanych skupiskach, podczas gdy dłuższe zabiegi mogą poprawić wydajność, ale zwiększyć uszkodzenia komórek, co wymaga oceny za pomocą testów żywych/martwych (np. zestaw do żywotności / cytotoksyczności ALIVE/DEAD). W przypadku badań porównawczych leczenie musi być spójne dla wszystkich typów próbek.
  8. Umieść fiolkę z tkanką i papainą na lodzie, aby schłodzić i stłumić aktywność enzymatyczną. Rozcieraj tkankę za pomocą przeciętej końcówki pipety przymocowanej do pipety o regulowanej objętości P100, aż większość tkanki zostanie wizualnie rozbita. Nie twórz pęcherzyków powietrza podczas dysocjacji, aby uniknąć nadmiernego uszkodzenia komórek.
    UWAGA: Energiczne rozcieranie powoduje wysoką wydajność komórek; Nie zachowują jednak większości swoich procesów. Delikatne rozcieranie zapewnia więcej procesów w komórkach, ale powoduje więcej komórek niezdysocjowanych. Można również stosować końcówki do pipet o różnych rozmiarach i inne metody, które można optymalizować w celu uzyskania idealnych wyników dysocjacji20.
  9. Odwirować zdysocjowane komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml mGBSS. Dodać barwnik jądrowy Hoechst 33342 do końcowego stężenia 1 μg/ml.
  10. Pobrać pipetę 100-500 μl zawiesiny komórek na wytrawione szkiełka podstawowe ITO i pozostawić na około 5 minut lub dłużej, aby komórki osiadły i przylgnęły do szkiełka.
    1. Rozcieńczenie zawiesiny komórkowej będzie musiało zostać określone empirycznie. Za pomocą mikroskopu optycznego dodaj kroplę komórek na szkiełko, aby określić przybliżoną gęstość i rozcieńczyć stamtąd, aby upewnić się, że odległość między komórkami jest wystarczająca (tj. wystarczająco większa niż rozmiar wiązki MALDI). Rozcieńczenie to można przeprowadzić na pierwszym szkiełku, a następnie rozcieńczenie można dostosować w razie potrzeby dla kolejnych szkiełek.
  11. Delikatnie odessać zawiesinę komórek ze szkiełka za pomocą systemu próżniowego zawierającego (umieszczonego w kolejności począwszy od przewodu próżniowego): 1) rurkę z wbudowanym filtrem HEPA gazu, 2) rurkę zamontowaną na kolbie filtracyjnej o pojemności 50 ml, 3) rurkę podłączoną do wlotu drugiej kolby filtracyjnej z dołączoną końcówką pipety (np. 100 μl). W przypadku przechowywania posianych komórek do wykorzystania w przyszłości, zassążoną zawiesinę należy zastąpić 33% roztworem glicerolu na 1-2 minuty i usunąć.
    UWAGA: Ten krok zapewni stabilność komórki. Dozowanie roztworu glicerolu z jednej strony przy jednoczesnym delikatnym zasysaniu z drugiej strony działa optymalnie dla utrzymania struktury komórkowej. Zawsze monitoruj wzrokowo wszystkie opisane tutaj kroki za pomocą odwróconego mikroskopu podczas przygotowywania pierwszej próbki.
  12. Nałóż 100-500 μl octanu amonu na osadzone obszary, pozostaw na około 1 minutę, a następnie odesshaj, aby wyczyścić szkiełka. W razie potrzeby powtórz czynność, aby upewnić się, że szkiełka są wolne od soli lub glicerolu.

3. Mikroskopia

UWAGA: Aby określić lokalizację zdeponowanych komórek, każdy preparat jest obrazowany za pomocą mikroskopii jasnego pola/fluorescencji. Kanał fluorescencyjny pozwala na dokładne zlokalizowanie komórek barwionych metodą Hoechsta, a obrazowanie w jasnym polu dostarcza informacji morfologicznych. Każdy mikroskop zdolny do akwizycji obrazu kafelkowego nadaje się do tego procesu.

  1. Jeśli nie zostało to zrobione wcześniej, przepłucz szkiełka 2-3 ml 150 mM octanu amonu. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla usunięcia kryształów glicerolu i soli, które mogą zakłócać obserwację mikroskopową i aplikację matrycy MALDI. Suszyć szkiełka pod delikatnym strumieniemN2 lub pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
  2. Załaduj szkiełko do stolika mikroskopowego. Ustaw ostrość mikroskopu, używając co najmniej 10 punktów podparcia rozmieszczonych równomiernie na szkiełku.
  3. Korzystając z filtrów odpowiednich do DAPI (wzbudzenie: 335-383 nm, emisja: 420-470 nm) i obrazowania w jasnym polu, uzyskaj kafelkowy obraz fluorescencyjny przy powiększeniu 5x-10x na całym szkiełku, upewniając się, że markery odniesienia (utworzone w kroku 1.5) zostały uchwycone.
    UWAGA: 5-krotne powiększenie jest zwykle wystarczające, zwłaszcza gdy trzeba zobrazować wiele slajdów. Aby uzyskać dokładniejszą morfologię komórkową, można używać obiektywów 10- lub 20x, co wiąże się z kwadratowo dłuższym czasem obrazowania i zwiększonymi rozmiarami plików.
  4. Zszyj obraz kafelkowy za pomocą oprogramowania mikroskopowego, takiego jak ZEN (Zeiss). Dokładne szycie ma kluczowe znaczenie, ponieważ wszelkie błędy na tym etapie będą rozprzestrzeniać się do ostatniego kroku rejestracji, powodując niedokładne celowanie. Aby to sprawdzić, upewnij się, że płytki przylegające pionowo nie są przesunięte. Dodatkowo rozważ uzyskanie obrazów kafelkowych z dużym nakładaniem się kafelków (20%-30%).
  5. Przetwarzaj i eksportuj każdy obraz jako plik bigTIFF w oprogramowaniu do mikroskopii. Jeśli obrazowany region jest stosunkowo mały i powoduje, że ostateczny rozmiar obrazu jest mniejszy niż 2 GB, należy użyć standardowego formatu pliku TIFF.

4. Aplikacja Matrix

UWAGA: Konsekwentna i prawidłowa aplikacja macierzy MALDI ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości danych z pojedynczych komórek. Podczas gdy sublimacja przy użyciu komercyjnego aparatu jest tutaj stosowana, aplikacja matrycy może być również wykonywana za pomocą zrobotyzowanego opryskiwacza12, airbrush21, lub domowej roboty aparatu sublimacyjnego22. Odkryliśmy, że preparaty jednokomórkowe wymagają mniej matrycy niż cienkie skrawki tkanek zwykle używane do obrazowania spektrometrii mas. Aby zmniejszyć efekty wsadowe, zaleca się nałożenie matrycy na wszystkie badane preparaty podczas jednej sesji i umieszczenie komórek z różnych grup (np. regionu mózgu lub leczenia vs. kontroli) na tym samym szkiełku, gdy tylko jest to możliwe. Wybór macierzy ma kluczowe znaczenie zarówno dla tradycyjnych przepływów pracy jednokomórkowych MALDI, jak i MALDI-2. Dla jednokomórkowego MALDI, DHB23, 9-AA24 i CHCA25 zostały pomyślnie użyte. W MALDI-2 my i inni zaobserwowaliśmy znaczne wzmocnienie sygnału za pomocą DHAP9, podczas gdy macierze takie jak NEDC16 i CHCA26 również zostały skutecznie zastosowane.

  1. Rozpuścić 20 mg 2,5-dihydroksyacetofenonu (DHAP) w 1,5 ml acetonu. Umieść szkiełka w uchwycie komory sublimacyjnej i umieść je w aparacie sublimacyjnym.
  2. Rozpuszczony roztwór matrycy odpipetować na płytkę ceramiczną i odczekać, aż aceton odparuje. Zamknij komorę sublimacyjną, aby ją uszczelnić.
  3. Napełnij komorę chłodziwa lodowatą wodą i umieść ją na górze komory.
  4. Włącz próżnię i pozwól systemowi osiągnąć równowagę przez 5 minut. Ciśnienie w układzie powinno być mniejsze niż 40 mbar.
  5. Sublimację należy rozpocząć od podgrzania komory do temperatury 200 °C przez 5 minut.
  6. Wyjmij łaźnię lodowato-wodną, ustaw temperaturę na 25 °C i umieść radiator na górze komory. Pozwól systemowi nagrzać się do temperatury pokojowej przez 5 minut, aby uniknąć kondensacji.
    UWAGA: Pojemnik z kąpielą lodowo-wodną można opróżnić i napełnić gorącą wodą, aby służyła jako radiator.
  7. Powoli odpowietrz system, otwórz komorę i wyjmij suwaki.

5. Jednokomórkowy MALDI MS

UWAGA: Dane MS z pojedynczej komórki są uzyskiwane na urządzeniu MALDI-2 timsTOF (timsTOF flex) przy użyciu pakietu microMS o otwartym kodzie źródłowym do wykrywania komórek i kierowania spektrometrem masowym. Wymaga to, aby lokalizacje pikseli obrazu optycznego docelowych komórek zostały przetłumaczone na współrzędne fizyczne stopnia spektrometru masowego.

  1. Otwórz microMS i zdziesiątkuj obrazy mikroskopowe bigTIFF za pomocą opcji Image Group (Grupa obrazów), ponieważ istnieją zarówno kanały jasnego pola, jak i fluorescencji.
  2. Za pomocą narzędzia Opcje obiektu blob zidentyfikuj optymalne parametry, które należy wybrać dla komórek docelowych. Dostosuj następujące parametry: maksymalny i minimalny rozmiar obiektu blob, aby wybrać małe lub duże obiekty blob do znalezienia; ustawienie progu, które określa, w jaki sposób określić próg kanału fluorescencji do wykrywania plam; oraz cyrkularność, która określa, jak okrągłe muszą być zidentyfikowane komórki, aby można było je uwzględnić. Dla prezentowanych tutaj danych użyliśmy następujących wartości parametrów: maksymalna cyrkularność: brak; Min. okrągłość: 0,6; próg: 75; minimalny rozmiar: 20; Maksymalny rozmiar: brak.
  3. Użyj opcji Znajdź obiekt blob, aby znaleźć obiekty blob i okno podręczne, aby zapisać listę obiektów blob pod żądaną nazwą.
  4. Użyj narzędzia Filtr odległości, aby wybrać określoną odległość, w jakiej każda komórka musi znajdować się od siebie (w przypadku tych danych, przy użyciu 5-krotnej mikroskopii fluorescencyjnej, użyliśmy filtra odległości o długości 35 pikseli). Ma to na celu zapewnienie, że komórki są wystarczająco daleko od siebie, aby można było przeprowadzić analizę pojedynczych komórek. Liczba ta jest wyrażona w jednostkach pikseli, więc poznaj konwersję piksela na μm, aby mikroskop mógł określić idealną liczbę. Użyj rozmiaru średnicy sondy laserowej plus około 20-30 μm, aby uwzględnić błędy w rejestracji.
  5. Załaduj szkiełka do instrumentu za pomocą adaptera suwaka MTP II. Wróć do komputera z microMS i za pomocą aplikacji zdalnego pulpitu uzyskaj dostęp do komputera ze spektrometrem mas.
  6. Jeśli jest to pierwszy raz, kiedy instrument jest używany, sprawdź pozycję X-Y instrumentu. Aby to zrobić, przejdź do Narzędzia i Ustawienia instrumentu. W wyskakującym okienku zostanie wyświetlony zestaw współrzędnych wraz z ich pozycjami X i Y. Wybierz każdy z tych konkretnych punktów na geometrii adaptera suwaka II w instrumencie i zaktualizuj pozycje X i Y w oknie microMS.
  7. Korzystając z elementów sterujących kamery i stolika spektrometru masowego, przejdź do łatwego do zidentyfikowania miejsca na slajdzie i skopiuj współrzędne instrumentu. W microMS znajdź odpowiednią lokalizację na obrazie mikroskopu, kliknij prawym przyciskiem myszy tę pozycję i wpisz współrzędne w lokalizacji tekstowej wyskakującego okienka. Zaokrąglij wszystkie współrzędne do najbliższej liczby całkowitej i oddziel współrzędne X i Y spacją (np. 39595 -23232).
  8. Powtórz krok 5.7., aby zarejestrować co najmniej 12 znaczników odniesienia na całym slajdzie. Po dodaniu trzech punktów rejestracyjnych, jedno z kółek zmieni kolor na czerwony, wskazując, że jest to najbardziej odległa pozycja od rejestracji. W takim przypadku usuń bieżący punkt rejestracji za pomocą shift + kliknij prawym przyciskiem myszy i spróbuj ponownie.
  9. W obszarze Plik przejdź do pozycji Zapisz, a następnie Rejestracja, aby zapisać plik rejestracji (.msreg).
  10. Po wyświetleniu obiektów blob na slajdzie zapisz plik pozycji instrumentu (.xeo), przechodząc do pozycji Plik, następnie Zapisz, a następnie pozycji instrumentu. Korzystając z oprogramowania do zdalnego pulpitu, przenieś ten plik .xeo do komputera instrumentu.
  11. Skopiuj tekst z niestandardowego pliku .xeo wygenerowanego do pliku .xeo MTP Slide Adapter II .xeo na instrumencie i zapisz go. Spowoduje to zaktualizowanie tego pliku geometrii o lokalizacje komórek.
  12. Kliknij kartę Automatyzacja i wybierz opcję Nowy..., aby uruchomić automatyczne uruchamianie. Przeciągnij wskaźnik myszy przez wyświetlony obszar próbki, aby zaznaczyć komórki, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy, aby dodać je do listy analizy. Zapisz przebieg automatyzacji i kliknij przycisk Rozpocznij automatyczne uruchamianie, aby rozpocząć pobieranie. Długość przebiegu zależy od wielu czynników, w tym liczby komórek, strzałów laserowych i częstotliwości lasera, ale ogólnie rzecz biorąc, około 5-10 komórek można analizować w trybie MALDI (częstotliwość powtarzania lasera 10 kHz), a 1-5 komórek można analizować w trybie MALDI-2 (częstotliwość powtarzania lasera 1k Hz) co sekundę.

6. Przetwarzanie danych

UWAGA: Istniejące komercyjne pakiety oprogramowania nie są dobrze przystosowane do analizy danych z jednokomórkowej spektrometrii mas o wysokiej przepustowości. Podczas gdy poszczególne widma można wizualizować, wydobycie istotnych informacji biologicznych wymaga specjalistycznych narzędzi. Aby temu zaradzić, udostępniamy ogólnodostępne oprogramowanie, które ułatwia jednokomórkową analizę danych MALDI-2 MS. Nasz zaktualizowany przepływ pracy ułatwia bezpośrednią konwersję danych jednokomórkowych do formatu imzML o otwartym kodzie źródłowym27, zapewniając zgodność z SCiLS MVS i oprogramowaniem innych dostawców. W przypadku bardziej zaawansowanej analizy danych kompletny skrypt zawiera również funkcje adnotacji lipidów, grupowania i innych narzędzi do wizualizacji obsługiwanych przez Matplotlib (wersja 3.7.3). Analizowanie i odczytywanie surowych danych jest ułatwione przez bibliotekę pyTDFSDK, zestaw funkcji zawartych w TIMSCONVERT workflow28.

  1. Zainicjuj niestandardową bibliotekę języka Python SC_MALDI2_Analysis, kopiując plik podany w pliku uzupełniającym 1 do tej samej ścieżki roboczej co Jupyter Notebook, a następnie naciśnij Shift + Enter na klawiaturze w pierwszej komórce kodu. Pozwoli nam to na późniejsze wywołanie tych funkcji i wykorzystanie ich do przetworzenia danych.
  2. Skopiuj ścieżkę do zebranych danych (plików .d firmy Bruker). Zalecamy opisowe nazywanie folderów i nazw każdego pliku, tak abyśmy mogli później przeanalizować te ścieżki plików w celu ustalenia metadanych dla każdej próbki. Uruchom importowanie plików Bruker .d i zapisz w komórce kodu listy. Spowoduje to wyświetlenie całkowitej liczby załadowanych plików .d.
  3. Uruchom komórkę kodu zatytułowaną Przetwarzanie nieprzetworzonych danych i zapisywanie w imzML. Spowoduje to odczytanie każdego dostarczonego pliku .d firmy Bruker, wykonanie pobierania wartości szczytowych na danych, a następnie zapisanie 20 ppm danych wokół każdego piku do pliku .imzML zapisanego w pliku .d.
    1. Aby znaleźć zapisane dane, otwórz lokalizację pierwszego pliku .d, a imzML i inne metadane zostaną zapisane w tej ścieżce. Na tym etapie zapisany plik imzML można zaimportować do oprogramowania dostawcy, takiego jak SCiLS Lab MVS. Aby uzyskać bardziej zaawansowaną analizę danych, kontynuuj postępowanie zgodnie ze skryptem.
  4. Załaduj zapisane dane imzML, uruchamiając polecenie Wczytywanie w wcześniej zapisanej komórce kodu pliku imzML. Spowoduje to załadowanie zapisanych danych do danych zmiennych.
  5. Uruchom komórkę Kwantowanie danych i zapisywanie macierzy danych, aby umieścić wszystkie dane wzdłuż wspólnej osi m/z, usunąć obiekty, które występują w małej obfitości (<0,1%) i usunąć wartości mniejsze niż szum (100 względna intensywność). Ta funkcja następnie ponownie grupuje dane, uśredniając każdą szczytową wartość m/z w każdym przedziale. Wynikowa macierz danych jest zapisywana jako datacube_array, przedziały m/z skojarzone z macierzą są zapisywane jako valid_mz_bins, a liczba każdego pojemnika jest zapisywana jako liczba.
  6. Aby dodać adnotacje do danych, uruchom komórkę adnotacji Eksportowanie pików dla LIPID MAPS. Spowoduje to skopiowanie wszystkich pików m/z w macierzy danych do schowka. Wklej to do pustego pliku tekstowego i zapisz, aby przesłać go na LIPID MAPS.
  7. Otwórz lipidmaps.org, a następnie wybierz MS Data Bulk Search i Search LMSD, aby wyszukać biologicznie istotne gatunki lipidów. Prześlij listę pików, wybierając plik tekstowy i wybierz odpowiednie przydukty (np. [M+H]+, [M+Na]+ i [M+K]+). Wybierz tolerancję masy odpowiednią dla Twojego spektrometru mas (my wybraliśmy +/- 0,01 m/z), wybierz wszystkie interesujące nas klasy lipidów i naciśnij Szukaj. Pobierz plik tsv.
  8. Załaduj metadane widm, uruchamiając ładowanie w ścieżkach pojedynczych komórek dla komórek metadanych. Zmień tutaj podzielony kod w oparciu o struktury ścieżek plików.
  9. Wstępnie przetworzyć dane, uruchamiając komórkę Wstępne przetwarzanie danych i adnotacja lipidowa. Spowoduje to użycie pliku tsv lipidMAPS do adnotacji zestawu danych do błędu 10 ppm, wyeliminowania lipidów o nieparzystych łańcuchach z wyników lipidMAPS, znormalizowania pozostałych danych i usunięcia cech lub komórek, które nie przekraczają określonego progu. Spowoduje to zapisanie nowo przetworzonego zestawu danych jako danych2, a zaktualizowanych metadanych widm jako updated_cell_types.
  10. Analiza danych jest wykonywana przez scanpy. Uruchom komórkę UMAP i analizy klastrów dla pojedynczych komórek, aby wybrać interesujące nas dane (tutaj wybraliśmy tylko dane MALDI-2, M2), przeskalować zestaw danych i załadować go do skanowanego obiektu AnnData w celu łatwej analizy.
    UWAGA: W tym przypadku na zbiorze danych przeprowadzono grupowanie Leiden i redukcję wymiarowości (UMAP), zwizualizowano zarówno oryginalne klasy danych, jak i klastry na UMAP, a niektóre z najbardziej istotnych statystycznie cech wśród klastrów podsumowano za pomocą funkcji rank_genes_groups_dotplot ze scanpy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd przepływu pracy dla jednokomórkowego MALDI-2 MS sterowanego fluorescencją jest pokazany w Rysunek 1. Po pierwsze, tkanka wypreparowana z docelowych obszarów mózgu (Figura 1A) jest dysocjowana na pojedyncze komórki i zdeponowana na przewodzących szkiełkach mikroskopowych pokrytych ITO (Rysunek 1B). Lokalizacje komórek są określane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego całego szkiełka ( Rysunek 1C), a następnie aplikacji ma...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysokoprzepustowe, sterowane obrazem pojedyncze komórki MALDI MS jest cennym narzędziem do zrozumienia niejednorodności chemicznej w skali pojedynczej komórki. Dodanie postjonizacji indukowanej laserem (MALDI-2) zapewnia głębsze pokrycie analitem, co ma kluczowe znaczenie w przypadku próbek o ograniczonej masie i objętości, takich jak izolowane komórki ssaków.

Podczas gdy zdecydowana większość opublikowanych przepływów pracy z lipidami i metabolitami w SM w pojedynczych komórkach wykorzystuje ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S.W.C dziękuje za wsparcie udzielone przez Peixin He and Xiaoming Chen PhD4 Fellowship oraz University of Illinois Block Grant Fellowship. Prace te były również wspierane przez National Institute on Drug Abuse w ramach nagrody nr 1. P30DA018310, National Institute on Aging w ramach nagrody nr. R01AG078797 oraz przez Biuro Dyrektora Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem nagrody S10OD032242.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2',5'-dihydroksyacetofenonSigma AldrichD107603DHAP, czystość 97%
Octan amonuSigma Aldrich238074odczynnik ACS, ≥ 97%
Axio M2 ImagerZeissN/AN/A
Dziurkacz do biopsji, 2 mmFisher Scientific12-460-399integra miltex standardowy dziurkacz do biopsji, 2mm
Chlorek wapniaSigma AldrichC4901bezwodny, proszek ≥ 97%
Eppendorf WirówkaSigma AldrichEP54050004415425 z wirnikiem FA-24x2
GentamynaSigma AldrichG1272płyn, BioReagent
Szkiełko do wytrawianiaSigma AldrichZ225568czas węglika, opakowanie 1
GlycerolSigma AldrichG7893ACS, ≥ 99,5%
Bufor HEPESSigma AldrichH3375≥ 99,5% (miareczkowanie)
Hoechst 33258 RoztwórSigma Aldrich944031 mg/ml w H2O, ≥ 98,0% (HPLC)
W linii Filtr HEPASigma AldrichWHA67225001VACU-GUARD Tarcza 60 mm, obudowa 0,45 PFTE
Szkiełka mikroskopowe z powłoką ITODelta TechnologiesCG-90IN-S11570-100Ω odporność
Chlorek magnezuSigma AldrichM8266bezwodny, ≥ 98%
Siarczan magnezuSigma Aldrich208094bezwodny, ≥ 97%
Probówki do mikrowirówekSigma AldrichHS4323Kprobówka o pojemności 1,5 ml, opakowanie 500
sztuk System dysocjacji papainyWorthington Biochemical LK003150jednym pudełku, 5 fiolek jednorazowego użytku
Penicylina-StreptomycynaSigma AldrichP4458płyn, BioReagent
Chlorek potasuSigma Aldrich529552Klasa biologii molekularnej
Fosforan potasu jednozasadowySigma AldrichP5379Odczynnik Plus
Biowęglan soduSigma AldrichS6014ACS, ≥ 99,7%
Chlorek soduSigma AldrichS9888Odczynnik ACS, ≥ 99%
Wodorotlenek soduSigma Aldrich221465odczynnik ACS, ≥ 97%, granulki
Fosforan sodu dwuzasadowySigma AldrichS9763Odczynnik ACS, ≥ 99%
SublimateHTXN/AN/A
timsTOF FleX MALDI-2BrukerN/AmicroGRID enabled
Rurki próżniowe Thermo Scientific8701-0080Rurki PVC bez ftalanów Nalgene 
wirówka odczynnika

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sunshine, H., Iruela-Arispe, M. L. Membrane lipids and cell signaling. Curr Opin Lipidol. 28 (5), 408-413 (2017).
  2. Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  3. Cheng, K. W., Su, P. R., Feller, K. J. A., Chien, M. P., Hsu, C. C. Investigating the Metabolic Heterogeneity of Cancer Cells Using Functional Single-Cell Selection and nLC Combined with Multinozzle Emitter Mass Spectrometry. Anal Chem. 96 (2), 624-629 (2024).
  4. Neumann, E. K., Comi, T. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Lipid Heterogeneity between Astrocytes and Neurons Revealed by Single-Cell MALDI-MS Combined with Immunocytochemical Classification. Ange Chem. 131 (18), 5971-5975 (2019).
  5. Bhaduri, A., Neumann, E. K., Kriegstein, A. R., Sweedler, J. V. Identification of Lipid Heterogeneity and Diversity in the Developing Human Brain. JACS Au. 1 (12), 2261-2270 (2021).
  6. Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: advances and future challenges. Nuc Acid Res. 42 (14), 8845-8860 (2014).
  7. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  8. Croslow, S. W., Trinklein, T. J., Sweedler, J. V. Advances in multimodal mass spectrometry for single-cell analysis and imaging enhancement. FEBS Lett. 598 (6), 591-601 (2024).
  9. Bien, T., Bessler, S., Dreisewerd, K., Soltwisch, J. Transmission-Mode MALDI Mass Spectrometry Imaging of Single Cells: Optimizing Sample Preparation Protocols. Anal Chem. 93 (10), 4513-4520 (2021).
  10. Rappez, L., et al. SpaceM reveals metabolic states of single cells. Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  11. Comi, T. J., Neumann, E. K., Do, T. D., Sweedler, J. V. microMS: A Python Platform for Image-Guided Mass Spectrometry Profiling. J Am Soc Mass Spec. 28 (9), 1919-1928 (2017).
  12. Xie, Y. R., et al. Multiscale biochemical mapping of the brain through deep-learning-enhanced high-throughput mass spectrometry. Nat Methods. 21 (3), 521-530 (2024).
  13. Neumann, E. K., Ellis, J. F., Triplett, A. E., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Lipid Analysis of 30 000 Individual Rodent Cerebellar Cells Using High-Resolution Mass Spectrometry. Anal Chem. 91 (12), 7871-7878 (2019).
  14. Soltwisch, J., et al. Mass spectrometry imaging with laser-induced postionization. Science. 348 (6231), 211-215 (2015).
  15. Barré, F. P. Y., et al. Enhanced Sensitivity Using MALDI Imaging Coupled with Laser Postionization (MALDI-2) for Pharmaceutical Research. Anal Chem. 91 (16), 10840-10848 (2019).
  16. McKinnon, J. C., et al. MALDI-2-Enabled Oversampling for the Mass Spectrometry Imaging of Metabolites at Single-Cell Resolution. J Am Soc Mass Spec. 35 (11), 2729-2742 (2024).
  17. Comi, T. J., Makurath, M. A., Philip, M. C., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. MALDI MS Guided Liquid Microjunction Extraction for Capillary Electrophoresis-Electrospray Ionization MS Analysis of Single Pancreatic Islet Cells. Anal Chem. 89 (14), 7765-7772 (2017).
  18. Wu, J., et al. Transcardiac Perfusion of the Mouse for Brain Tissue Dissection and Fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  19. Aboghazleh, R., et al. Rodent brain extraction and dissection: A comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
  20. Jager, L. D., et al. Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells. Adv Med Sci. 61 (1), 78-84 (2016).
  21. Chan-Andersen, P. C., Romanova, E. V., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Profiling 26,000 Aplysia californica neurons by single cell mass spectrometry reveals neuronal populations with distinct neuropeptide profiles. J Biol Chem. 298 (8), 102254(2022).
  22. Castro, D. C., Xie, Y. R., Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Sweedler, J. V. Image-guided MALDI mass spectrometry for high-throughput single-organelle characterization. Nat Methods. 18 (10), 1233-1238 (2021).
  23. Castro, D. C., et al. Single-Cell and Subcellular Analysis Using Ultrahigh Resolution 21 T MALDI FTICR Mass Spectrometry. Anal Chem. 95 (17), 6980-6988 (2023).
  24. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proc Natl Acad Sci. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  25. Krestensen, K. K., et al. Molecular Profiling of Glioblastoma Patient-Derived Single Cells Using Combined MALDI-MSI and MALDI-IHC. Anal Chem. 97 (7), 3846-3854 (2025).
  26. Niehaus, M., Soltwisch, J., Belov, M. E., Dreisewerd, K. Transmission-mode MALDI-2 mass spectrometry imaging of cells and tissues at subcellular resolution. Nat Methods. 16 (9), 925-931 (2019).
  27. Xie, Y. R., et al. Data-Driven and Machine Learning-Based Framework for Image-Guided Single-Cell Mass Spectrometry. J Proteome Res. 22 (2), 491-500 (2023).
  28. Luu, G. T., et al. TIMSCONVERT: a workflow to convert trapped ion mobility data to open data formats. Bioinformatics. 38 (16), 4046-4047 (2022).
  29. Vandergrift, G. W., et al. Experimental and Computational Evaluation of Lipidomic In-Source Fragmentation as a Result of Postionization with Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization. Anal Chem. 96 (41), 16127-16133 (2024).
  30. Zhang, Y., Parmigiani, G., Johnson, W. E. ComBat-seq: batch effect adjustment for RNA-seq count data. NAR Genom Bioinfo. 2 (3), lqaa078(2020).
  31. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Single-Cell Metabolomics: Changes in the Metabolome of Freshly Isolated and Cultured Neurons. ACS Chem Neurosci. 3 (10), 782-792 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Single Cell Mass SpectrometryMALDI Mass SpectrometryFluorescence MicroscopyMatrix ApplicationNeural Cell AnalysisLipid ProfilingHigh Throughput AnalysisSpatially Resolved AnalysisUMAP Clustering

Powiązane artykuły