W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetyzujących i ich wirusów odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu współczesnej różnorodności biologicznej mórz i wód słodkich oraz dynamiki ekosystemów, a także wpływu czynników związanych ze zmianą klimatu (np. wzrostu temperatury i zakwaszenia) na trajektorie ewolucyjne gatunków i składu społeczności. Niestety, różnorodność wirosfery nie sprzyja jednemu uniwersalnemu pobieraniu próbek i eksperymentalnemu przepływowi pracy. Rzeczywiście, każdy system wirusowy ma unikalne cechy, które wymagają modyfikacji standardowych protokołów w wirusologii, aby osiągnąć cele badawcze. Chociaż odkrycie i charakterystyka wirusa wymaga podejść specyficznych dla systemu docelowego, w przypadku wszystkich wirusów cele badawcze są podobne: wyizolować wirusa; określić zakres hostów; potwierdzić infekcję produkcyjną; i scharakteryzować wirusa, gospodarza i dynamikę wirus-gospodarz. Solidne opisy systemów wirus-gospodarz składają się w minimalnym stopniu z wyjaśnienia morfologii, fizjologii, biochemii i profili omicznych. Dalsze informacje można uzyskać, manipulując systemem poprzez zmianę czynników, takich jak liczba infekcji, temperatura, pH, przełącznik gospodarza, ukierunkowana ewolucja lub stosowanie leków w celu obserwacji odpowiedzi systemu wirus-gospodarz. Nasze laboratorium bada wirusy w różnych dziedzinach życia (archeony, bakterie i eukarya). W tym raporcie szczegółowo opisano metody pobierania próbek mikroorganizmów fotosyntetycznych ze strefy eufotycznej środowiska słodkowodnego i morskiego, ze szczególnym uwzględnieniem izolacji bakteriofagów (tj. cyjanofagów) sinic. Sinice są kluczowymi gatunkami o krytycznym znaczeniu dla produkcji pierwotnej i obiegu składników odżywczych w tych ekosystemach wodnych. Opisany przepływ pracy rozciąga się od pobierania próbek wody na różnych głębokościach do charakterystyki cech systemu wirus-gospodarz przy użyciu hodowli płynnych i stałych pożywek, zaawansowanych metod molekularnych/genetycznych i podejść analitycznych. Opisane metody można dostosować do wykrywania bakteriofagów i wirusów w systemach wirus-gospodarz w różnych dziedzinach życia.
Wprowadzenie
Scharakteryzowanie dynamiki infekcji i ewolucyjnych relacji między sinicami a ich gospodarzami jest kluczem do zrozumienia obecnego i przyszłego stanu ekosystemów morskich i słodkowodnych. Zaawansowane techniki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości i nowoczesne metody analityczne umożliwiają szybkie sekwencjonowanie genomów cyjanofagów (i gospodarza) w celu zbadania relacji wirus-gospodarz 1,2. Jednak przepływy pracy rozpoczynają się od pobierania próbek środowiskowych w celu wyizolowania i zidentyfikowania wirusów i ich gospodarzy 3,4,5
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pobieranie próbek środowiskowych
UWAGA: Niniejszy protokół opisuje pobieranie próbek na morzu pod kątem mikroorganizmów fotosyntetycznych ze strefy eufotycznej w promieniu 5 mil od linii brzegowej u wybrzeży południowej Kalifornii. Protokół został jednak dostosowany do pobierania próbek z jezior, zamarzniętych jezior lub gorących źródeł geotermalnych (ryc. 1).
- Pobieranie próbek środowiskowych na morzu wzdłuż południowego wybrzeża Kalifornii
UWAGA: Statek o głębokości 6 m, głębokiej literze V, w konsoli środkowej (tj. łódź) z dwoma silnikami zaburtowymi o mocy 150 KM, był zał....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Użycie przenośnego generatora elektrycznego zasilanego benzyną, pompy do przesyłu wody oraz odpornych na zgniecenie przewodów stanowi skuteczną metodę pobierania próbek wody z oceanów, jezior, zamarzniętych jezior i innych środowisk wodnych (np. lagun) z wybranych głębokości (Rysunek 1, trzy górne rzędy). W przypadku wysokotemperaturowych wód kwasowych z geotermalnych gorących źródeł, basenów i kotłów błotnych, które mogą charakteryzować się pH < 4 i temperaturą powyżej 90 °C, wymagane je.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wirosfera jest rozległa i zróżnicowana, co wymaga różnych podejść eksperymentalnych do badania różnych systemów wirusowych. Obejmuje to różne strategie izolowania wirusów i ich gospodarzy z różnych środowisk oraz różne metody przetwarzania, aby zapewnić, że czyste kultury gospodarzy i ich wirusów mogą być produkowane z surowych próbek. Te czyste kultury mogą być stosowane w testach infekcji SVSH, zarówno na pożywkach stałych, jak i w kulturach płynnych, dzięki czemu można uzyskać cechy systemu i analizy ilościowe dynamik.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Badanie to zostało częściowo sfinansowane przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (NSF) grant OISE nr 1856091 (PI-Ceballos) oraz grant NSF DBI nr 2119968 (PI-Ceballos). Autorzy doceniają wkład dr Chinnapong Wangnai i dr Chakrit Tachaapaikoon z Uniwersytetu Technologicznego Króla Mongkuta w Thonburi (Tajlandia), którzy zapewnili odpowiednio filmowanie i wsparcie terenowe w zakresie pobierania próbek środowiskowych. Autorzy dziękują również dr Jorge Armando Leiva Sanabria z Uniwersytetu Kostaryki - Guanacaste za pomoc w uzyskaniu pozwoleń na pobieranie próbek z parków narodowych w Kostaryce oraz pomoc w pobieraniu próbek z basenów geotermalnych. Autorzy dziękują równi....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pompa transferowa ze stali nierdzewnej o mocy 1 KM | Utilitech, Charlotte, Karolina Północna, Stany Zjednoczone | N/A | |
| Probówki 1,5 ml | www.eppendorf.com | 30123611 | |
| Koncentrator wirowy 10K NMWL Centricon Plus 70 | www.sigmaaldrich.com | UFC701008 | |
| Kolby Erlenmeyera z przegrodą o pojemności 250 ml | www.sigmaaldrich.com | CLS4450250 | |
| Generator inwerterowy o mocy 3800 W | WEN Products, West Dundee, IL, Stany Zjednoczone | WEN 56380i | |
| 3K NMWL Amicon 15 mL | www.sigmaaldrich.com | UFC800308 | |
| Kolby Erlenmeyera z przegrodą o pojemności 500 ml | www.sigmaaldrich.com | CLS4450500 | |
| Dzbanki na wodę o pojemności 5 galonów | www.homedepot.com | N/A | |
| 80 stóp długości, 0,5 cala średnica, nylon | https://facomex.mx/producto/combo/ | N/A | |
| Konsola środkowa Sailfish 2660 o głębokości 26 stóp z dwoma silnikami zaburtowymi Yamaha o mocy 150 KM | https://yamahaoutboards.com/ | N/A | |
| Octan amonu (CH3CO2NH4) | www.sigmaaldrich.com | 631618 | |
| Kwas borowy (H3BO3) | www.sigmaaldrich.com | 10043353 | |
| Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2. 2H2O) | www.sigmaaldrich.com | 10035048 | |
| Wirówka 5920 R | www.eppendorf.com | 5948000107 | |
| Kwas cytrynowy (C6H8O7) | www.sigmaaldrich.com | 77929 | |
| Azotan kobaltu(II) sześciowodny [Co(NO3)2.6H2O] | www.sigmaaldrich.com | 10026229 | |
| Elastyczny wąż gumowy odporny na zawalanie | swanhose.com | CELTF58050 | |
| Pięciowodny siarczan miedzi(II) (CuSO4.5H2O) | www.sigmaaldrich.com | 7758998 | |
| Probówki wirówkowe Corning 50 ml | www.sigmaaldrich.com | CLS430291 | |
| Fosforan dipotasowy (K2HPO4) | www.sigmaaldrich.com | 7758114 | |
| Kwas disodowy etylenodiaminotetraoctowy (Na2EDTA) | www.sigmaaldrich.com | 6381926 | |
| DS-11 FX+_Microvolume oraz spektrofotometr i florometr | www.denovix.com | N/A | |
| Taśma klejąca | www.homedepot.com | N/A | |
| Rurki Eppendorfa | www.sigmaaldrich.com | EP022364120 | |
| Etanol | www.sigmaaldrich.com | 64175 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) | www.sigmaaldrich.com | 60004 | |
| Cytrynian żelazowo-amonowy (C6H8O7· xFe3+· yNH3) | www.sigmaaldrich.com | 1185575 | |
| Rurki PVC Flex-plus niebieskie | www.carlonsales.com | 12008-750 | |
| Innova S44i - Wytrząsarka do inkubatora sztaplowanego | www.eppendorf.com | 2231001081 | |
| LVEM5 Stacjonarna mikroskopia elektronowa Microscope_Transmission elektronowa (TEM) | delongamerica.com | N/A | |
| Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4,7 H2O) | www.sigmaaldrich.com | 10034998 | |
| Chlorek manganu(II) czterowodny (MnCl2.4H2O) | www.sigmaaldrich.com | 13446349 | |
| Mushroom Anchor powlekany winylem/30 lbs | www.homedepot.com | N/A | |
| szalki Petriego, polistyren | www.sigmaaldrich.com | Zobacz materiał P5481 powiedział: | |
| Kubek filtracyjny z membraną polieterosulfonową (PES) o średnicy 0,22 mm | www.sigmaaldrich.com | Z358193-1CS | |
| Kubek filtracyjny z membraną polieterosulfonową (PES) o średnicy 0,45 mm | www.sigmaaldrich.com | Z370622-1CS | |
| Ksantogenian etylu potasu (C2H5OCSSK) | www.sigmaaldrich.com | 140896 | |
| Węglan sodu (Na2CO3) | www.sigmaaldrich.com | 497198 | |
| Dodecylosiarczan sodu [CH3(CH2)11OSO3Na] | www.sigmaaldrich.com | 151213 | |
| Molibdenian sodu dwuwodny (Na2MoO4.2H2O) | www.sigmaaldrich.com | 10102406 | |
| Azotan sodu (NaNO3) | www.sigmaaldrich.com | 7631994 | |
| Tris(hydroksymetylo)metylo]-2-aminoetanosulfonowy aci (TES) (C6H15NO6S) | www.sigmaaldrich.com | 7365448 | |
| Triton X-100 | www.sigmaaldrich.com | Zobacz materiał T8787 TGL | |
| Chlorowodorek Trizma (Tris-HCl) | www.sigmaaldrich.com | 1185531 | |
| Pompa próżniowa/ciśnieniowa | Cole'a-Parmera; Vernon Hills, Illinois, Stany Zjednoczone | EW-79204-00 | |
| Rurki winylowe | www.homedepot.com | N/A | |
| Siarczan siedmiowodny (ZnSO4.7H2O) | www.sigmaaldrich.com | 7446200 |
Bibliografia
- Zhang, D., You, F., He, Y., Te, S. H., Gin, K. Y. H. Isolation and characterization of the first freshwater cyanophage infecting Pseudanabaena. J Virol. 94 (17), 10-1128 (2020).
- Dong, Z. Isolation, Characterization and Ecological Dynamics of Tropical Fresh....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
