Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68379

⸱

3 lipca 2025

 , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative Systems Biology Program, University of California, Merced

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Streszczenie

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetyzujących i ich wirusów odgrywa kluczową rolę w zrozumieniu współczesnej różnorodności biologicznej mórz i wód słodkich oraz dynamiki ekosystemów, a także wpływu czynników związanych ze zmianą klimatu (np. wzrostu temperatury i zakwaszenia) na trajektorie ewolucyjne gatunków i składu społeczności. Niestety, różnorodność wirosfery nie sprzyja jednemu uniwersalnemu pobieraniu próbek i eksperymentalnemu przepływowi pracy. Rzeczywiście, każdy system wirusowy ma unikalne cechy, które wymagają modyfikacji standardowych protokołów w wirusologii, aby osiągnąć cele badawcze. Chociaż odkrycie i charakterystyka wirusa wymaga podejść specyficznych dla systemu docelowego, w przypadku wszystkich wirusów cele badawcze są podobne: wyizolować wirusa; określić zakres hostów; potwierdzić infekcję produkcyjną; i scharakteryzować wirusa, gospodarza i dynamikę wirus-gospodarz. Solidne opisy systemów wirus-gospodarz składają się w minimalnym stopniu z wyjaśnienia morfologii, fizjologii, biochemii i profili omicznych. Dalsze informacje można uzyskać, manipulując systemem poprzez zmianę czynników, takich jak liczba infekcji, temperatura, pH, przełącznik gospodarza, ukierunkowana ewolucja lub stosowanie leków w celu obserwacji odpowiedzi systemu wirus-gospodarz. Nasze laboratorium bada wirusy w różnych dziedzinach życia (archeony, bakterie i eukarya). W tym raporcie szczegółowo opisano metody pobierania próbek mikroorganizmów fotosyntetycznych ze strefy eufotycznej środowiska słodkowodnego i morskiego, ze szczególnym uwzględnieniem izolacji bakteriofagów (tj. cyjanofagów) sinic. Sinice są kluczowymi gatunkami o krytycznym znaczeniu dla produkcji pierwotnej i obiegu składników odżywczych w tych ekosystemach wodnych. Opisany przepływ pracy rozciąga się od pobierania próbek wody na różnych głębokościach do charakterystyki cech systemu wirus-gospodarz przy użyciu hodowli płynnych i stałych pożywek, zaawansowanych metod molekularnych/genetycznych i podejść analitycznych. Opisane metody można dostosować do wykrywania bakteriofagów i wirusów w systemach wirus-gospodarz w różnych dziedzinach życia.

Wprowadzenie

Scharakteryzowanie dynamiki infekcji i ewolucyjnych relacji między sinicami a ich gospodarzami jest kluczem do zrozumienia obecnego i przyszłego stanu ekosystemów morskich i słodkowodnych. Zaawansowane techniki sekwencjonowania o wysokiej przepustowości i nowoczesne metody analityczne umożliwiają szybkie sekwencjonowanie genomów cyjanofagów (i gospodarza) w celu zbadania relacji wirus-gospodarz 1,2. Jednak przepływy pracy rozpoczynają się od pobierania próbek środowiskowych w celu wyizolowania i zidentyfikowania wirusów i ich gospodarzy 3,4,5. Ze względu na różnorodność wirosfery nie ma jednego protokołu pobierania próbek i charakteryzowania wszystkich wirusów i bakteriofagów. Rzeczywiście, każdy system hosta wirusa ma swoje unikalne cechy. Niemniej jednak cele wyjściowe są podobne niezależnie od badanego systemu wirusowego: wyizolowanie wirusa; określić zakres hostów; wykazać produktywną infekcję u jednego lub więcej gospodarzy; Scharakteryzuj dynamikę infekcji wirusem, gospodarzem i wirusem-gospodarzem przy użyciu podejść jakościowych i ilościowych. Zaawansowana wiedza na temat systemu wirusowego może być badana poprzez zakłócanie systemu. Zmiana parametrów, takich jak wielokrotność infekcji (MOI)6, temperatura, pH, szczep gospodarza lub stosowanie leków w celu określenia, jak system reaguje, zapewnia dodatkowy wgląd w naturę dynamiki wirus-gospodarz. Bardziej zaawansowane manipulacje, takie jak ewolucja ukierunkowana, mogą dostarczyć dodatkowych informacji na temat potencjalnej trajektorii ewolucyjnej systemu oraz tego, jak koewolucyjne punkty końcowe mogą wpływać na większą społeczność mikrobiologiczną i ekosystem.

W tym badaniu przedstawiamy modelowy (ale łatwo adaptowalny) protokół pobierania próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych, takich jak cyjanobakterie i mikroalgi, które odgrywają kluczową rolę w obiegu składników odżywczych i produkcji pierwotnej w ekosystemach morskich, słodkowodnych i innych ekosystemach wodnych 7,8,9,10,11 . Przebieg pracy koncentruje się na izolowaniu gospodarzy ze stref eufotycznych środowisk morskich i słodkowodnych oraz ich wirusów i bakteriofagów, które są kluczowymi czynnikami napędzającymi te ekosystemy12. Zarówno wirusy, jak i bakteriofagi wpływają zarówno na struktury populacji eukariotycznej, jak i prokariotycznej oraz silnie wpływają na różnorodność i produktywność ekosystemów13. W związku z tym celem jest zapewnienie protokołu próbkowania i przepływu pracy po próbkowaniu, który ułatwia wzbogacanie hostów i wirusów do badania: pojedynczego wirusa/jednego hosta, wielu wirusów/jednego hosta, pojedynczego wirusa/wielu hostów i dynamiki wielu wirusów/wielu hostów; -substraty omiczne leżące u podstaw dynamiki infekcji wirus-gospodarz; oraz potencjalne trajektorie koewolucyjne i ewolucyjne punkty końcowe, które mają wpływ na badany system wirus-gospodarz oraz na większy ekosystem, z którego wirusy i gospodarz zostali wyekstrahowani.

W szczególności opisujemy przebieg pracy związany z pobieraniem próbek środowiskowych, wstępnym przetwarzaniem próbek w terenie (tj. przed dotarciem do laboratorium), przetwarzaniem końcowym w celu izolacji bakteriofagów (i wirusów), wzbogacaniem mieszanych kultur mikroorganizmów w celu identyfikacji dopuszczalnych gospodarzy, opracowywaniem izolatów pojedynczej kolonii domniemanych gospodarzy, potwierdzaniem dobrej wiary Relacja wirus-gospodarz (tj. infekcja produkcyjna) i charakteryzowanie podstawowych właściwości infekcji (np. zjadliwość). Testy infekcji nie tylko pozwalają na obliczenie względnej zjadliwości (V, R)14 i odporności gospodarza (R,R)15, ale obejmują również etapy ekstrakcji próbek kultur w kluczowych punktach czasowych w celu zbadania substratów -omicznych, które leżą u podstaw obserwowanej fizjologii (tj. dynamiki interakcji wirus-gospodarz). Na koniec omawiamy potencjalne pułapki, rozwiązywanie problemów i rozwiązania, a także sposoby modyfikowania wybranych kroków w celu ukierunkowania na określone taksony. Przepływ pracy ma zastosowanie do systemów cyjanofag-cyjanobakterie, phycodnavirus-mikroalgi i termofilne systemy fuzelowirus-archeon 16,17, wykazując jego użyteczność w charakterystyce wirusów we wszystkich trzech domenach życia: bakteriach, eukaryi i archeonach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie próbek środowiskowych

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje pobieranie próbek na morzu pod kątem mikroorganizmów fotosyntetycznych ze strefy eufotycznej w promieniu 5 mil od linii brzegowej u wybrzeży południowej Kalifornii. Protokół został jednak dostosowany do pobierania próbek z jezior, zamarzniętych jezior lub gorących źródeł geotermalnych (ryc. 1).

  1. Pobieranie próbek środowiskowych na morzu wzdłuż południowego wybrzeża Kalifornii
    UWAGA: Statek o głębokości 6 m, głębokiej literze V, w konsoli środkowej (tj. łódź) z dwoma silnikami zaburtowymi o mocy 150 KM, był załadowany sprzętem badawczym (Tabela materiałów). Do pobierania próbek ze strefy eufotowej wybrano trzy miejsca: a) stanowisko 1: N 30° 15.436, W 117° 31.551; b) stanowisko 2: N 33° 12.521, W 117° 25.275; oraz c) stanowisko 3: N 32° 59.914, W 117° 17.058. W każdym z tych miejsc w południe pobrano 20 litrów próbek wody z trzech różnych głębokości w każdym miejscu: < 3 m (próbka powierzchniowa), 6 m i 14 m.
    1. Zespół pompy transferowej: Po dotarciu do każdego miejsca pobierania próbek rozłóż kotwicę łodzi i zapisz współrzędne GPS z systemu nawigacyjnego. Zmontować układ pobierania próbek.
      1. Krótko mówiąc, zamontuj jeden koniec rurki PVC flex-plus o średnicy wewnętrznej 2.54 cm (50 stóp) do sitka ssącego o średnicy 2.54 cm, aby zapobiec przedostawaniu się dużych zanieczyszczeń do układu pompy. Zabezpiecz połączenie sitka z rurką taśmą klejącą. Zamontuj przeciwległy koniec rurki do kolektora dolotowego pompy transferowej ze stali nierdzewnej o mocy 1 KM.
      2. Podłącz gumowy elastyczny wąż o średnicy wewnętrznej 10 stóp o średnicy wewnętrznej 10 stóp do wylotu pompy. Podłącz przewód elektryczny pompy transferowej do zasilanego gazem generatora inwerterowego o mocy 3800 W. Po zmontowaniu zalej pompę transferową i przetestuj, czy system pompy jest sprawny (Rysunek 1, górny rząd).
    2. Ważenie rurki przesyłowej: Przymocuj jeden koniec nylonowej liny morskiej o długości 25 m i średnicy 1,25 cm do oczka kotwy do grzybów o wadze 14 kg. Użyj taśmy klejącej, aby przymocować linę do niebieskiej rurki PVC co 3 m z sitkiem ssącym ustawionym około 1 m nad kotwicą, aby zapobiec osadzaniu się sitka w piasku lub uderzaniu o skały pod wodą. Użyj kotwicy, aby zanurzyć rurkę przesyłową (niebieska rurka PVC) i uniknąć tworzenia przez silne prądy podwodne dużego kąta między łodzią a rurą, co dałoby niedokładne głębokości próbki. Opuść zespół kotwy/liny i rurki na głębokość.
    3. Ekstrakcja próbek wody morskiej: Gdy końcówka rurki z sitkiem znajdzie się na żądanej głębokości, włącz generator i pompę. Ponownie zalej pompę lub potrząśnij rurką przesyłową, aby woda zaczęła pompować z głębokości. Gdy stały przepływ wody jest przenoszony z głębokości, wylej 1-2 objętości rurki z powrotem do oceanu, aby upewnić się, że woda z żądanej głębokości przepływa przez pompę. Próbki wody należy pobrać do 20-litrowych dzbanków na wodę (Rysunek 1, górny rząd, po prawej).
    4. Transport próbki do stacji terenowej: Napełnić 20 litrów dzbanka na wodę do około 18 litrów, aby umożliwić wymianę gazową (np.O2/CO2) między próbkami wody a przestrzenią nad wodą podczas transportu. Przed zakręceniem dzbanków na wodę zapisz temperaturę, pH i zasolenie z próbek surowej wody. Następnie przykryj i umieść dzbanki z wodą na lodzie w schowku pod pokładem i przykryj lekkim prześcieradłem, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji na światło słoneczne i wysokie temperatury.
  2. Wstępne przetwarzanie próbek wody w terenie
    UWAGA: Po przybyciu do obiektu na lądzie (np. pokoju hotelowego/sali konferencyjnej/stacji terenowej) podjęto szereg etapów wstępnego przetwarzania w celu ochrony zawartości drobnoustrojów w próbkach wody i oddzielenia różnych frakcji próbek wody morskiej w zależności od wielkości cząstek.
    1. Zespół systemu filtracji: Przymocuj jeden koniec kawałka przezroczystej rurki winylowej o średnicy wewnętrznej 9,525 mm o długości 1 m do wlotu króćca węża na porcie próżniowym przenośnej pompy próżniowej z membraną powietrzną. Przymocuj przeciwległy koniec tego samego węża do zespołu kubka próżniowego filtra o pojemności 1.0 l, 0.45 μm. Użyj kolejno zespołów kubków filtracyjnych 0,45 μm i 0,22 μm, aby oddzielić różne frakcje próbki wody morskiej, jak opisano poniżej.
    2. Aby przetestować system pod kątem wycieków lub uszkodzonych/rozdartych filtrów, przefiltruj 0,25 l wody morskiej przez kubek filtracyjny z membraną polieterosulfonową (PES) o średnicy 0,45 μm. Nieszczelny system pokaże ssanie między filtrem a kratą, gdy próbka wody morskiej zostanie całkowicie przefiltrowana.
    3. Filtracja przez kubek filtracyjny z membraną PES 0,45 μm: Aby wyizolować mikroorganizmy fotosyntetyczne (np. mikroalgi i sinice), celem jest przefiltrowanie 2 l próbki wody morskiej przez kubek filtracyjny z membraną PES o średnicy 0,45 μm za pomocą dwóch kubków filtracyjnych o pojemności 1 l (lub czterech kubków filtracyjnych o pojemności 500 ml). Wszystkie butelki z filtratem należy odpowiednio oznaczyć rozmiarem filtra, głębokością, z której pobrano próbkę, datą i oznaczeniem miejsca pobierania próbek. Na koniec zakręć nakrętkę i przykryj butelki zawierające filtr 0,45 μm półprzezroczystą szmatką lub rękawem, aby zapobiec nadmiernemu nasłonecznieniu.
      UWAGA: Nie pozwól, aby filtr w kubku filtra wysechł. Zawsze utrzymuj cienką warstwę płynu na filtrze. Filtr będzie gromadził zanieczyszczenia biologiczne (np. komórki). Jeśli filtr zostanie zatkany zanieczyszczeniami, ostrożnie odkręć zespół kubka i odłóż zużyty kubek filtra na bok, ale nie wyrzucaj zatkanego kubka. Załóż nowy filtr 0,45 μm i kontynuuj.
    4. Filtracja przez zespół kubka filtracyjnego z membraną PES 0,22 μm: Aby wyizolować duże wirusy eukariotyczne, należy użyć 1 l filtratu 0,45 μm z poprzedniego kroku (krok 1.2.3) i przefiltrować przez kubek filtracyjny 0,22 μm. Odpowiednio oznaczyć butelkę ultrafiltratu rozmiarem filtra, głębokością, z której pobrano próbkę, datą i oznaczeniem miejsca pobierania próbek. Na koniec zakręcić nakrętkę i przykryć butelkę zawierającą ultrafiltrat 0,22 μm (z filtratu filtratu 0,45 μm).
      UWAGA: Nie pozwól, aby filtr w kubku filtra wysechł. Zawsze utrzymuj cienką warstwę płynu na filtrze. Filtr będzie gromadził zanieczyszczenia biologiczne, które zawierają próbki biologiczne. Jeśli filtr zostanie zatkany, odkręć zespół kubka i odłóż na bok zużyty kubek filtra. Nie wyrzucaj zatkanego kubka. Załóż nowy filtr 0,22 μm i kontynuuj.
    5. Zagęścić biomasę z filtra 0,45 μm: Wlać 48 ml filtratu (z filtracji 0,22 μm) do każdej z dwóch sterylnych stożkowych probówek wirówkowych z polipropylenu o pojemności 50 ml. Użyj sterylnego skalpela, aby równomiernie przeciąć wzdłuż najbardziej zewnętrznej krawędzi zużytego filtra 0,45 μm w zespole kubka. Użyj sterylnych kleszczy, aby usunąć wypełniony biomasą i wilgotny filtr. Przetnij go na pół. Zwiń połowę bibuły filtracyjnej do jednej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Powtórz z drugą połową membrany filtracyjnej i drugą rurką. Zakręć nakrętki tubek i zabezpiecz przezroczystą folią. Oznacz rurkę.
    6. Skoncentrować dużą biomasę wirusa z filtra 0,22 μm: Wlej 14 ml ultrafiltratu do każdej z dwóch sterylnych stożkowych probówek wirówkowych z polipropylenu o pojemności 15 ml. Użyj sterylnego skalpela, aby przeciąć wzdłuż zewnętrznej krawędzi zużytego filtra 0,22 μm w zespole kubka. Użyj sterylnych kleszczy, aby usunąć wypełniony biomasą i wilgotny filtr. Przetnij go na pół. Zwiń i włóż połowę bibuły filtracyjnej do jednej ze stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Powtórzyć te czynności dla drugiej połowy membrany filtracyjnej i drugiej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przykręć nakrętki tubek i zabezpiecz przezroczystą folią (np. Parafilm). Oznacz każdą probówkę rozmiarem filtra (tj. 0,22 μm), miejscem, głębokością i datą.
    7. Zachowaj pozostały filtrat 0,45 μm, a także pozostały filtrat 0,22 μm do wysyłki z powrotem do laboratorium. Powtórzyć cały proces filtracji (kroki od 1.2.2 do 1.2.6) dla każdej głębokości i miejsca pobierania próbek.
      UWAGA: Ultrafiltrat jest używany w laboratorium jako baza pożywki (z rodzimymi minerałami i innymi składnikami odżywczymi).
      Mikroskopia surowych próbek (opcjonalnie): Weź jedną stożkową probówkę o pojemności 50 ml z filtrem 0,45 μm i delikatnie wstrząśnij. Za pomocą plastikowego zakraplacza (lub pipetora) pobrać 30-50 ml wody morskiej ze stożkowej probówki o pojemności 50 ml i przygotować szklane szkiełko mikroskopowe z próbką i szkiełkiem nakrywkowym. Korzystając z mikroskopu polowego i komputera, view zawartość szkiełka mikroskopu, aby wykryć i zarejestrować cechy obserwowanych mikroorganizmów (Rysunek 2D).

2. Przetwarzanie próbek w celu zagęszczenia wirusów / bakteriofagów i wzbogacenia gospodarzy

UWAGA: Niniejszy protokół opisuje pierwsze etapy przetwarzania wymagane po dotarciu próbek do laboratorium z terenu. Transport samolotem i pojazdem drogowym może wymagać innych względów. Żywotność próbki środowiskowej zmniejszy się wraz z nagłymi zmianami temperatury, pH, zasolenia, ekspozycji lub braku ekspozycji na światło, stężenia rozpuszczonych gazów (np. CO2 i O2 ) oraz czasu między ekstrakcją środowiskową a przetwarzaniem laboratoryjnym.

  1. Wirowanie zagęszczające i przechowujące wirusy i bakteriofagi
    UWAGA: Gdy próbki dotrą do laboratorium, przetworzenie w ciągu 8 godzin po przybyciu może zminimalizować utratę żywych drobnoustrojów z powodu upływu czasu między ekstrakcją próbki a przybyciem do laboratorium. Poniższe kroki pozwolą uzyskać podwielokrotności skoncentrowanej zawiesiny bakteriofagów (lub wirusów) (tj. zapasów roboczych) do długotrwałego przechowywania i stosowania.
    1. Zagęszczanie ultrafiltratu: Dla każdej głębokości pobierania próbek w zależności od miejsca, wyślij pozostałe ~800 ml ultrafiltratu do laboratorium. Użyj odśrodkowego filtra wirowego 3K NMWL 15 ml i odwiruj przy 6000 x g przez 10-20 minut, aby zagęścić 50-100 ml ultrafiltratu do 1,0-1,5 ml. Przygotować siatki do obrazowania TEM, jak opisanowcześniej 16 , aby ocenić, czy w powstałym skoncentrowanym ultrafiltracie znajdują się jakiekolwiek cząstki wirusopodobne (VLP). W przypadku wykrycia VLP należy podzielić koncentrat na 100 ml podwielokrotności. Przechowywać w temperaturze 4 °C (lub -20 °C w przypadku dłuższego przechowywania).
    2. Zagęszczanie cząstek z filtra 0,22 μm: Za pomocą sterylnego skalpela delikatnie zeskrobać zanieczyszczenia z filtrów 0,22 μm do ultrafiltratu w probówkach o pojemności 50 ml, w których filtry zostały przetransportowane. Użyj zespołu kubka koncentratora wirowego 10K NMWL, aby zagęścić 50-200 ml zawiesiny do objętości ~3 ml retentatu próbki. Przygotuj siatki do obrazowania TEM zgodnie z wcześniejszym opisem16 , aby określić, czy na powierzchni filtra 0,22 μm mogą znajdować się VLP z filtratu 0,45 μm. W przypadku wykrycia VLP należy podzielić koncentrat na 100 ml porcji i przechowywać w temperaturze 4 °C (lub -20 °C w przypadku dłuższego przechowywania).
  2. Koncentrat wirowy i retentat wzbogacający z filtrów 0,45 μm.
    UWAGA: Mieszane kultury mikroorganizmów mogą zawierać żywicieli dla wirusów i bakteriofagów wyizolowanych powyżej (kroki 2.1.1 i 2.1.2). Koncentracja wirowa i wzbogacenie mieszanych kultur dostarczają zasobów roboczych, z których można rozwinąć czyste kultury domniemanych gospodarzy (patrz krok 3).
    1. Zagęszczanie mieszanin zawiesin: Dla każdej głębokości pobierania próbek w zależności od miejsca, wyślij z powrotem ~100 ml ultrafiltratu z filtrem 0,45 μm wypełnionym resztkami komórek do laboratorium. Za pomocą sterylnego skalpela zeskrobać zanieczyszczenia z filtra 0,45 μm do ultrafiltratu w probówkach o pojemności 50 ml, w których zostały przetransportowane. Odwirować próbkę o masie 2000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania granulatu biomasy. Zawiesić osad w 5 ml rozcieńczonego w stosunku 1:8 pożywki BG-111 8 przez delikatne rozcieranie pipetą.
    2. Wzbogacający retentat z filtra 0,45 μm: Przygotować sześć równoległych kultur w 250 ml kolbach Erlenmeyera z przegrodami zawierającymi: 50 ml pożywki BG-11 (3 kolby) i mieszaninę ultrafiltratu z miejsca próbki (40 ml) plus BG-11 (10 ml). Zaszczepić każdą kolbę 0,5 ml koncentratu komórkowego (od kroku 2.2.1). Inkubować z łagodnym wytrząsaniem w fotobioreaktorze przez co najmniej 7-10 dni w temperaturze 25 °C przy natężeniu światła ustawionym na 20-40 mmol fotonów/m2/s.19 Gdy wzrost jest silny (np. OD730 nm = 0,8), odwirować przy 2000 x g, 10 min, 4 °C do osadzania. Zawiesić osad w 10 ml pożywki BG-11 rozcieńczonej w stosunku 1:8, delikatnie rozcierając pipetą. Przygotować 10-20 porcji 0,5 ml zawiesiny komórek w zakręcanych krioprobówkach do przechowywania w temperaturze -80 °C.

3. Opracowywanie czystych kultur mikroorganizmów żywicieli o pojedynczym genotypie

UWAGA: Protokół ten opisuje procedury izolowania i oczyszczania domniemanych gospodarzy mikrobiologicznych dla wirusów i bakteriofagów z kultur mieszanych przetworzonych z pobranych próbek środowiskowych. Wiele fenotypów gospodarzy można wyizolować i oczyścić, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo wykrycia pobłażliwych gospodarzy dla wirusów i bakteriofagów obecnych w przechowywanych próbkach wody (kroki 2.1.1-2.1.2).

  1. Nakładanie pasków na płytki i wybór izolatów z pojedynczą kolonią
    UWAGA: Wiele czystych kultur o pojedynczym genotypie jest opracowywanych z kultur mieszanych w celu zwiększenia prawdopodobieństwa wyizolowania podatnego i pobłażliwego gospodarza wirusów lub bakteriofagów wychwyconych podczas pobierania próbek środowiskowych oraz w celu zbadania zakresu gospodarzy wirusów i bakteriofagów.
    1. Opracowanie izolatów pojedynczej kolonii (SCI) zgodnie z poniższym opisem.
      1. Przygotuj płytki agarowe BG-1120. Rozmrozić na lodzie jedną podwielokrotność mieszaniny zawiesiny, która była przechowywana w temperaturze -80 °C (od etapu 2.2.2). Użyj sterylnej pętli, aby rozprowadzić koncentraty komórkowe na płytkach agarowych BG-11 przy użyciu standardowych technik20. Inkubować płytki z prążkami w fotobioreaktorze przez ~10 dni w temperaturze 25 °C ze światłem o natężeniu 20-40 mmol foton/m2/s lub do momentu, gdy na płytkach pojawią się kolonie.
      2. Przygotuj ~10 kultur nasiennych w probówkach hodowlanych o pojemności 20 ml z 5 ml pożywki BG-11 i/lub 5 ml mieszanki ultrafiltratu z miejsca próbki i BG-11. Wybierz SCI z płytki za pomocą sterylnej wykałaczki i zaszczep każdą probówkę indywidualnie, wrzucając jedną wykałaczkę do każdej probówki. Inkubować z łagodnym wytrząsaniem w fotobioreaktorze przez co najmniej 10-15 dni w temperaturze 25 °C przy natężeniu światła ustawionym na 20-40 mmol fotonu/m2/s lub do momentu wykrycia wzrostu (np. OD730nm = 0,4-0,8).
        UWAGA: Jeśli na pierwszej płytce smugowej znajduje się wiele fenotypów kolonii (np. morfologia, przezroczystość, kolor), wybierz poszczególne kolonie do inokulacji z zakresu fenotypów kolonii.
    2. Rozwijanie czystych kultur zwierząt roboczych: Po wykryciu dodatniego wzrostu kultur nasiennych, powtarzaj procedury smugowe, aż na płytkach pojawi się tylko jeden fenotyp kolonii (Rysunek 3B i Rysunek 4B). Zwiększ liczbę kultur nasiennych do 50 ml w kolbach z przegrodami o pojemności 250 ml (rysunki 3C i 4C), jak opisano powyżej (krok 2.2.2). Przygotuj ~20 porcji 0,5 ml zawiesiny komórek SCI i odpipetuj do 1,0 ml zakręcanych krioprobówek do przechowywania w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Do opracowania czystych kultur cyjanobakterii mogą być wymagane antybiotyki lub leki przeciwgrzybicze (np. imipenem, cykloheksymid) w celu zmniejszenia zanieczyszczenia kultur21. Procedura posiewu jest punktem zwrotnym, w którym można ukierunkować izolację sinic lub mikroalg. Parametry światła podczas inkubacji mogą różnić się pod względem natężenia światła lub cykli włączania i wyłączania.
  2. Charakterystyka pojedynczego genotypu i przechowywanie zapasów roboczych
    UWAGA: Aby potwierdzić izolację i wzbogacenie poszczególnych przypuszczalnych genotypów gospodarza, czyste kultury są charakteryzowane morfologicznie i genetycznie.
    1. Charakterystyka morfologiczna: Gdy cykle hodowli płynnej i pracy z płytkami z pożywkami stałymi doprowadzą do fenotypu pojedynczej komórki, należy scharakteryzować morfotypy drobnoustrojów zarówno za pomocą mikroskopii świetlnej (ryc. 2A-C), jak i, jeśli to możliwe, transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) i/lub skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM; Rysunek 3A i Rysunek 4A). Pod mikroskopią świetlną (np. Powiększenie 60x-100x) można zaobserwować zieloną, jasnobrązową lub przezroczystą jednokomórkową, kolonialną, nitkowatą, spiralną, rozgałęzioną lub włoskową organizację komórkową. Wskaże to możliwe przypisanie taksonomiczne.
    2. Charakterystyka genetyczna: Walidacja izolacji pojedynczego genotypu mikroorganizmu poprzez ekstrakcję DNA z przypuszczalnych czystych kultur, a następnie częściowe sekwencjonowanie genomu. U cyjanobakterii gen 16S rRNA jest często celem (Figura 5A)22. Analiza filogenetyczna 16S może zidentyfikować grupowanie taksonomiczne22. W mikroalgach 18S rRNA jest często ukierunkowane23. W przypadku izolatów będących przedmiotem zainteresowania lub nowych izolatów można kontynuować sekwencjonowanie całego genomu.

4. Opracowywanie zawiesin wirusa/bakteriofaga o pojedynczym genotypie

UWAGA: Protokół ten opisuje procedury izolowania i oczyszczania wielu zawiesin wirusów i bakteriofagów o pojedynczym genotypie z próbek środowiskowych.

  1. Rozcieńczanie i TEM koncentratów VLP
    UWAGA: Korzystając z testów TEM i płyteknazębnych 24, uzyskuje się potwierdzenie, że VLP są prawdziwymi bakteriofagami (lub wirusami), które infekują komórki gospodarza.
    1. Transmisyjna mikroskopia elektronowa filtratów (0,45 μm i 0,22 μm): Użyć koncentratów z filtracji 0,45 μm i 0,22 μm próbek wody surowej (patrz krok 2.1) w celu przygotowania siatek TEM16 i obrazu w celu zbadania niejednorodności cząstek wirusa (tj. różnorodności morfotypów). Rozcieńczyć próbki, które skutkują siatkami o wysokiej konfluencji (np. 90%) przed wykonaniem kolejnych kroków, aby osiągnąć konfluencję 30%-50%. Ręczne liczenie cząstek lub użycie oprogramowania do obrazowania może być wykorzystane do oszacowania zbieżności komórek na siatkach.
      UWAGA: Duża konfluencja na siatkach może skutkować oczyszczeniem trawników żywicielskich na płytach z litych podłoża, a nie pojawieniem się pojedynczych płytek, które można wybrać. W związku z tym rozcieńczanie próbek przed testami płytki nazębnej może zaoszczędzić czas. Alternatywnie, wiele płytek trawnika gospodarza może być testowanych pod kątem interakcji gospodarz-wirus przy użyciu seryjnych rozcieńczeń koncentratów VLP.
    2. Wykrywanie aktywności bakteriofagów (lub wirusów) na trawnikach gospodarzy: Na płytkach agarowych BG-11 wyhoduj przypuszczalne trawniki gospodarza z sinic (lub mikroalg) z zapasów roboczych (krok 3.1.2). Odpipetować 0,5 ml zawiesiny VLP w 4,5 ml podłoża na trawniki (Rysunek 6A, po lewej) i delikatnie obracać, aż cała powierzchnia trawnika zostanie pokryta zawiesiną. Inkubować w fotobioreaktorze przez 3-10 dni w temperaturze 25 °C przy natężeniu światła 20-40 mmol fotonów/m2/s lub do momentu, gdy na płytkach pojawią się blaszki (ryc. 6A, po prawej).
  2. Zeskrobywanie blaszek miażdżycowych i tworzenie zawiesin wirusa lub bakteriofaga o pojedynczym genotypie
    UWAGA: Poprzez zeskrobywanie pojedynczych fenotypów blaszek miażdżycowych i rozmnażanie bakteriofaga w płynnych kulturach gospodarza, potwierdza się interakcje gospodarz-bakteriofag (lub gospodarz-wirus) w dobrej wierze, co pozwala na opracowanie zapasów roboczych bakteriofagów (lub wirusów) do testów infekcji. Zapasy robocze bakteriofagów (lub wirusów) muszą być naważane jedną z kilku metod (np. qPCR, testy płytki nazębnej), aby można było przeprowadzić testy infekcji przy określonej wielokrotności infekcji (MOI).
    1. Izolowanie i rozmnażanie jednego genotypu bakteriofaga (lub wirusa): Gdy na płytkach pojawią się pojedyncze blaszki (dzięki odpowiedniemu rozcieńczeniu koncentratu VLP), użyj sterylnej pętli, aby zeskrobać pojedynczą płytkę. Zakręć pętlę w 10 ml kultury nasion gospodarza (Rysunek 6B, po lewej). Inkubować z łagodnym wytrząsaniem (np. 70-120 obr./min) w fotobioreaktorze przez 3-10 dni w temperaturze 25 °C przy natężeniu światła ustawionym na 20-40 mmol fotonu/m2/s lub do momentu, gdy na dnie probówki zostaną wykryte krople OD730 nm lub szczątki komórek, co wskazuje na śmierć/lizę komórki (ryc. 6B, po prawej)25.
      UWAGA: Jeśli na trawnikach gospodarzy tworzą się płytki nazębne, ale w płynnej kulturze nie ma oznak infekcji, płytki nazębne mogły zostać utworzone przez bakteriocynę26 , a nie przez bakteriofaga (lub wirusa). TEM może wspomagać testy płytkowe, wskazując śmierć komórki w wyniku infekcji bakteriofagowej (lub wirusowej).
    2. Kwantyfikacja miana stad roboczych bakteriofagów (lub wirusów): Izolację bakteriofagów (lub wirusów) uzyskuje się przy użyciu metod filtracji i koncentracji wirowej opisanych powyżej. Określić ilościowo miana zawiesin bakteriofagów (lub wirusów) za pomocą seryjnych testów płytki rozcieńczającej27. Alternatywnie należy przeprowadzić ekstrakcję DNA i sekwencjonowanie całego genomu wirusa oraz filogenetykę (Figura 5B) w celu opracowania starterów do przeprowadzania mianowania bakteriofagów opartego na qPCR w celu ustalenia zapasów roboczych do kolejnych testów infekcji.
      UWAGA: Rozmnażanie pojedynczych genotypów bakteriofagów (lub wirusów) można zwiększyć do 50 ml lub 100 ml hodowli, jeśli miano lub objętości zapasów roboczych są zbyt niskie dla potrzeb doświadczalnych. Należy wziąć pod uwagę charakter układu wirus-gospodarz (np. wysoka zjadliwość lub niska zjadliwość), wielość infekcji (MOI), która jest planowana do testów infekcji, oraz liczbę testów infekcji, które zostaną wykonane w ramach projektu podczas opracowywania zapasów roboczych bakteriofagów (lub wirusów). Nie zaleca się rozmrażania i ponownego zamrażania zapasów wirusów. Rozmrozić i użyć jednego pełnego zapasu wirusa z powtórzeń tego samego preparatu o tym samym mianie dla każdego doświadczenia. Inne techniki mianowania mogą uzupełniać opisane metody, w tym jonizacja elektronrozpylająca/spektrometria mas (ESI/MS)28.

5. Testy zakażeń

UWAGA: Protokół ten opisuje testy infekcji gospodarz-(lub gospodarz-wirus), które są używane do: jakościowego charakteryzowania zjadliwości, zakresu gospodarza i fenotypu infekcji (wskaźnik strategii replikacji) na pożywkach stałych; i ilościowo ocenić kinetykę wzrostu, zjadliwość wirusa14 i odporność gospodarza15 w hodowli płynnej.

  1. Określanie względnej zjadliwości bakteriofagów (lub wirusów) i zakresu żywiciela na podłożach stałych
    UWAGA: Wszystkie testy pożywek stałych, w tym testy punktowe na trawniku, testy płytki nazębnej z seryjnym rozcieńczaniem na jednej płytce i testy na płytkach oporności gospodarza, dostarczają danych jakościowych na temat parametrów infekcji bakteriofag-gospodarz, takich jak zjadliwość wirusa, zakres gospodarza i strategia replikacji. Testy wzrostu kultur płynnych pozwalają na bardziej ilościowe pomiary i modelowanie dynamiki wirus-gospodarz.
    1. Testy punktowe na trawniku: Aby określić zakres żywicieli, przygotuj trawniki wielu domniemanych gospodarzy wyizolowanych z próbek środowiskowych lub ze szczepów nabytych z innych laboratoriów lub kolekcji kultur. Na trawnikach umieść 2 μl zawiesiny bakteriofagów (lub wirusów) na trawniku za pomocą pipety. Na oddzielnym obszarze tej samej płytki znajdź tę samą objętość Triton X-100 i nanoczystej (18 MW) wody jako kontrole dodatnie i ujemne, odpowiednio16. Przeprowadź wiele testów spot-on-law z danym bakteriofagiem (lub wirusem) na wielu gospodarzach, aby ocenić zakres gospodarzy bakteriofaga16. Fenotypy blaszki dają wgląd w strategię replikacji bakteriofagów (lub wirusów). Blaszki z ostrymi obwódkami i przezroczyste aż do agaru wskazują na replikację lityczną, podczas gdy blaszki z rozproszonymi obwódkami lub aureolą mogą wskazywać na replikację nielityczną16,17.
      UWAGA: Alternatywnie, testy płytki rozcieńczanej seryjnie na pojedynczej płytce wskazują, czy istnieje liniowa zależność między wielkością płytki nazębnej a mianem bakteriofagów. Użyj markera z tyłu talerza, aby podzielić talerz na siatkę lub sekcje koła. Następnie, używając tej samej objętości (tj. 2 ml), ale z rozcieńczeniami zawiesiny bakteriofagów (np. 1:1, 1:4, 1:16, 1:64), przeprowadź test punktowy na trawniku na pojedynczej płytce gospodarza.
    2. Testy odporności gospodarza: Aby określić, czy zestaw bakteriofagów może powodować infekcję na danym żywicielu, przygotuj trawnik gospodarza na talerzu, jak opisano powyżej. Za pomocą markera z tyłu talerza podziel talerz na siatkę lub odcinki koła. Następnie umieść 2 ml każdej zawiesiny bakteriofaga (lub wirusa) w jednej sekcji siatki (lub ciasta), używając Triton X-100 i wody nanoczystej jako kontroli. Jeśli wszystkie zawiesiny bakteriofagów (lub wirusów) zostaną dodane przy równych mianach, należy ocenić jakościowo względną zjadliwość między szczepami bakteriofagów (lub wirusami) na gospodarzu (tj. większa blaszka nazębna = bardziej zjadliwy wirus).
  2. Kwantyfikacja zjadliwości, odporności i wzrostu w testach infekcji płynnych kultur
    UWAGA: Wstępne wyniki jakościowe stanowią podstawę do ukierunkowania na określone pary bakteriofag-gospodarz i przeprowadzenia bardziej ilościowych analiz dynamiki interakcji wirus-gospodarz. W hodowli płynnej generowana jest krzywa wzrostu zakażonego gospodarza i porównywana ze wzrostem niezakażonego (kontrolnego) gospodarza.
    1. Wykonaj test infekcji pojedynczym wirusem/pojedynczym gospodarzem w płynnej kulturze, jak opisano poniżej.
      1. Ustanowić równoległe płynne kultury (~ 6-12) mikroorganizmu (np. cyjanobakterii), który okazał się podatny i pobłażliwy za pomocą testów na płytkach z pożywką stałą (krok 5.1) w albo: 1,0 l (320 ml hodowli), 500 ml (160 ml kultury) lub 250 ml (80 ml kultury) - przegrodowe kolby hodowlane, jak opisano wcześniej17. We wcześniej zdefiniowanym punkcie czasowym (zwykle 0,5 lub 1 czas podwojenia gospodarza) zaszczepić podzbiór równoległych kultur o równoważnej gęstości komórek (np. OD730 nm = 0,08) w trzech powtórzeniach zawiesiną bakteriofagów, używając odpowiedniej objętości wymaganej do uzyskania wstępnie wybranej wielokrotności infekcji (MOI) z dostępnym mianem zapasu roboczego.
      2. Pozostaw inne równoległe kultury (również w trzech egzemplarzach) niezaszczepione (tj. niezakażone) jako kontrole. Opcjonalnie należy zaszczepić trzeci zestaw równoległych kultur innym szczepem bakteriofaga (lub wirusa) w celu porównania wybranych par bakteriofag-gospodarz. Pozwól kulturom rosnąć w fotobioreaktorze przez 3-10 dni w temperaturze 25 °C przy natężeniu światła ustawionym na 20-40 mmol fotonów/m2/s.
      3. Wygeneruj krzywe wzrostu gospodarza, wykonując odczyty OD730 nm w regularnych odstępach czasu (np. 8 godzin) z kultur zakażonych bakteriofagami i niezakażonych (kontrolnych) (Figura 7A). Zastosować weryfikację TEM niezakażonych kultur kontrolnych (Figura 7C) i produktywną infekcję w hodowlach komórek gospodarza (Figura 7D). Efekty cytopatyczne29,30 są łatwo widoczne w większości zakażonych komórek, podczas gdy komórki niezakażone nie wykazują oznak transformacji morfologicznej lub stresu.
    2. Analiza bazowa dla testów zakażeń kulturami płynnymi: Z testów zakażeń płynnymi kulturami pojedynczego wirusa/jednego gospodarza (SVSH) można uzyskać kilka podstawowych wskaźników, takich jak: maksymalna właściwa szybkość wzrostu (μ max)31, względna zjadliwość bakteriofagów (lub wirusów)14 i względna odporność gospodarza15- w celu uzyskania bardziej ilościowego opisu dynamiki bakteriofag-gospodarz lub wirus-gospodarz (Figura 7B). Standardowe wskaźniki podlegające raportowaniu obejmują szybkość wzrostu (często podawaną jako maksymalna właściwa szybkość wzrostu lubμ maksimum) oraz względną zjadliwość (VR)14 w porównaniu z kontrolą niezakażonego gospodarza i/lub oddzielnym bakteriofagiem na tym samym hoście. Można również podać inne wskaźniki, takie jak nośność systemu (asymptota N) i względna odporność gospodarza (R,R)15.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Użycie przenośnego generatora elektrycznego z silnikiem benzynowym, pompy do przesyłu wody oraz odpornych na zgniecenie przewodów stanowi skuteczną metodę pobierania próbek wody z oceanów, jezior, zamarzniętych jezior i innych środowisk wodnych (np. lagun) z wybranych głębokości (Rycina 1, trzy górne rzędy). W przypadku wysokotemperaturowych wód kwasowych w gorących źródłach geotermalnych, basenach i kotłach błotnych, które mogą charakteryzować się pH < 4 i temperaturą powyżej 90 °C, wyma...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wirosfera jest rozległa i zróżnicowana, co wymaga różnych podejść eksperymentalnych do badania różnych systemów wirusowych. Obejmuje to różne strategie izolowania wirusów i ich gospodarzy z różnych środowisk oraz różne metody przetwarzania, aby zapewnić, że czyste kultury gospodarzy i ich wirusów mogą być produkowane z surowych próbek. Te czyste kultury mogą być stosowane w testach infekcji SVSH, zarówno na pożywkach stałych, jak i w kulturach płynnych, dzięki czemu można uzyskać cechy systemu i analizy ilościowe dynamik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Badanie to zostało częściowo sfinansowane przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (NSF) grant OISE nr 1856091 (PI-Ceballos) oraz grant NSF DBI nr 2119968 (PI-Ceballos). Autorzy doceniają wkład dr Chinnapong Wangnai i dr Chakrit Tachaapaikoon z Uniwersytetu Technologicznego Króla Mongkuta w Thonburi (Tajlandia), którzy zapewnili odpowiednio filmowanie i wsparcie terenowe w zakresie pobierania próbek środowiskowych. Autorzy dziękują również dr Jorge Armando Leiva Sanabria z Uniwersytetu Kostaryki - Guanacaste za pomoc w uzyskaniu pozwoleń na pobieranie próbek z parków narodowych w Kostaryce oraz pomoc w pobieraniu próbek z basenów geotermalnych. Autorzy dziękują również panu Enrique Marroquinowi, Jr. (Uniwersytet Kalifornijski w Merced) i pani Alexii Maceda (University of Maine, Orono, ME, USA), którzy pomogli w pobraniu próbek odpowiednio u wybrzeży południowej Kalifornii i jezior w północnej Minnesocie. Autorzy dziękują i doceniają wsparcie techniczne pani Socheata Hour, która obliczyła parametry infekcji dla zestawu danych φSBL14-SWII.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pompa transferowa ze stali nierdzewnej o mocy 1 KM Utilitech, Charlotte, Karolina Północna, Stany ZjednoczoneN/A
Probówki 1,5 mlwww.eppendorf.com30123611
Koncentrator wirowy 10K NMWL Centricon Plus 70 www.sigmaaldrich.comUFC701008
Kolby Erlenmeyera z przegrodą o pojemności 250 ml www.sigmaaldrich.comCLS4450250
Generator inwerterowy o mocy 3800 W WEN Products, West Dundee, IL, Stany ZjednoczoneWEN 56380i
3K NMWL Amicon 15 mL www.sigmaaldrich.comUFC800308
Kolby Erlenmeyera z przegrodą o pojemności 500 ml www.sigmaaldrich.comCLS4450500
Dzbanki na wodę o pojemności 5 galonów www.homedepot.comN/A
80 stóp długości, 0,5 cala średnica, nylon https://facomex.mx/producto/combo/N/A
Konsola środkowa Sailfish 2660 o głębokości 26 stóp z dwoma silnikami zaburtowymi Yamaha o mocy 150 KM https://yamahaoutboards.com/N/A
Octan amonu (CH3CO2NH4)www.sigmaaldrich.com631618
Kwas borowy (H3BO3)www.sigmaaldrich.com10043353
Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2. 2H2O)www.sigmaaldrich.com10035048
Wirówka 5920  Rwww.eppendorf.com5948000107
Kwas cytrynowy (C6H8O7)www.sigmaaldrich.com77929
Azotan kobaltu(II) sześciowodny [Co(NO3)2.6H2O]www.sigmaaldrich.com10026229
Elastyczny wąż gumowy odporny na zawalanie swanhose.comCELTF58050
Pięciowodny siarczan miedzi(II) (CuSO4.5H2O)www.sigmaaldrich.com7758998
Probówki wirówkowe Corning 50 ml www.sigmaaldrich.comCLS430291
Fosforan dipotasowy (K2HPO4)www.sigmaaldrich.com7758114
Kwas disodowy etylenodiaminotetraoctowy (Na2EDTA)www.sigmaaldrich.com6381926
DS-11 FX+_Microvolume oraz spektrofotometr i florometrwww.denovix.comN/A
Taśma klejąca www.homedepot.comN/A
Rurki Eppendorfawww.sigmaaldrich.comEP022364120
Etanolwww.sigmaaldrich.com64175
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)www.sigmaaldrich.com60004
Cytrynian żelazowo-amonowy (C6H8O7· xFe3+· yNH3)www.sigmaaldrich.com1185575
Rurki PVC Flex-plus niebieskie www.carlonsales.com12008-750
Innova S44i - Wytrząsarka do inkubatora sztaplowanegowww.eppendorf.com2231001081
LVEM5 Stacjonarna mikroskopia elektronowa Microscope_Transmission elektronowa (TEM)delongamerica.comN/A
Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4,7 H2O)www.sigmaaldrich.com10034998
Chlorek manganu(II) czterowodny (MnCl2.4H2O)www.sigmaaldrich.com13446349
Mushroom Anchor powlekany winylem/30 lbswww.homedepot.comN/A
szalki Petriego, polistyrenwww.sigmaaldrich.comZobacz materiał P5481 powiedział:
Kubek filtracyjny z membraną polieterosulfonową (PES) o średnicy 0,22 mmwww.sigmaaldrich.comZ358193-1CS
Kubek filtracyjny z membraną polieterosulfonową (PES) o średnicy 0,45 mmwww.sigmaaldrich.comZ370622-1CS
Ksantogenian etylu potasu (C2H5OCSSK)www.sigmaaldrich.com140896
Węglan sodu (Na2CO3)www.sigmaaldrich.com497198
Dodecylosiarczan sodu [CH3(CH2)11OSO3Na]www.sigmaaldrich.com151213
Molibdenian sodu dwuwodny (Na2MoO4.2H2O)www.sigmaaldrich.com10102406
Azotan sodu (NaNO3)www.sigmaaldrich.com7631994
Tris(hydroksymetylo)metylo]-2-aminoetanosulfonowy aci (TES) (C6H15NO6S)www.sigmaaldrich.com7365448
Triton X-100 www.sigmaaldrich.comZobacz materiał T8787 TGL
Chlorowodorek Trizma (Tris-HCl)www.sigmaaldrich.com1185531
Pompa próżniowa/ciśnieniowa Cole'a-Parmera; Vernon Hills, Illinois, Stany ZjednoczoneEW-79204-00
Rurki winylowe www.homedepot.comN/A
Siarczan siedmiowodny (ZnSO4.7H2O)www.sigmaaldrich.com7446200

Bibliografia

  1. Zhang, D., You, F., He, Y., Te, S. H., Gin, K. Y. H. Isolation and characterization of the first freshwater cyanophage infecting Pseudanabaena. J Virol. 94 (17), 10-1128 (2020).
  2. Dong, Z. Isolation, Characterization and Ecological Dynamics of Tropical Freshwater Cyanophages. , National University of Singapore. Doctoral dissertation (2022).
  3. Sime-Ngando, T. Environmental bacteriophages: viruses of microbes in aquatic ecosystems. Front Microbiol. 5, 355(2014).
  4. Sigee, D. C. Freshwater microbiology: biodiversity and dynamic interactions of microorganisms in the aquatic environment. , John Wiley & Sons. (2005).
  5. Jacquet, S., Miki, T., Noble, R., Peduzzi, P., Wilhelm, S. Viruses in aquatic ecosystems: important advancements of the last 20 years and prospects for the future in the field of microbial oceanography and limnology. Adv Oceanography Limnol. 1 (1), 97-141 (2010).
  6. Tucker, S., Pollard, P. Identification of cyanophage Ma-LBP and infection of the cyanobacterium Microcystis aeruginosa from an Australian subtropical lake by the virus. Appl Environ Microbiol. 71 (2), 629-635 (2005).
  7. Bhardwaj, A., et al. Cyanobacteria: a key player in nutrient cycling. Cyanobacteria. , 579-596 (2024).
  8. Douterelo, I., et al. Methodological approaches for studying the microbial ecology of drinking water distribution systems. Water Res. 65, 134-156 (2014).
  9. Brandt, J. P., Flannigan, M. D., Maynard, D. G., Thompson, I. D., Volney, W. J. A. An introduction to Canada's boreal zone: ecosystem processes, health, sustainability, and environmental issues. Environ Rev. 21 (4), 207-226 (2013).
  10. Ramanan, R., Kim, B. H., Cho, D. H., Oh, H. M., Kim, H. S. Algae-bacteria interactions: evolution, ecology and emerging applications. Biotechnol Adv. 34 (1), 14-29 (2016).
  11. Atkinson, C. L., Capps, K. A., Rugenski, A. T., Vanni, M. J. Consumer-driven nutrient dynamics in freshwater ecosystems: From individuals to ecosystems. Biol Rev. 92 (4), 2003-2023 (2017).
  12. Mojica, K. D., Brussaard, C. P. Factors affecting virus dynamics and microbial host-virus interactions in marine environments. FEMS Microbiol Ecol. 89 (3), 495-515 (2014).
  13. Graham, E. B., et al. Microbes as engines of ecosystem function: when does community structure enhance predictions of ecosystem processes. Front Microbiol. 7, 214(2016).
  14. Ceballos, R. M., Stacy, C. L. Quantifying relative virulence: when µ max fails and AUC alone just is not enough. J General Virol. 102 (1), 001515(2021).
  15. Hour, S., Pierce, A. J., Heng, S. Y., Plymale, R., Ceballos, R. M. Quantifying Resilience in Single-Host/Single-Virus Infections. Appl Microbiol. 5 (1), 18(2025).
  16. Ceballos, R. M., et al. Differential virus host-ranges of the Fuselloviridae of hyperthermophilic Archaea: implications for evolution in extreme environments. Front Microbiol. 3, 295(2012).
  17. Ceballos, R. M., Drummond, C. G., Stacy, C. L., Padilla-Crespo, E., Stedman, K. M. Host-dependent differences in replication strategy of the Sulfolobus spindle-shaped virus strain SSV9 (aka, SSVK1): infection profiles in hosts of the family Sulfolobaceae. Front Microbiol. 11, 1218(2020).
  18. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).
  19. Kliphuis, A. M., Janssen, M., van den End, E. J., Martens, D. E., Wijffels, R. H. Light respiration in Chlorella sorokiniana. J Appl Phycol. 23, 935-947 (2011).
  20. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. J Vis Exp. (111), e54001(2016).
  21. Noroozi, M., Amozegar, M. A., Rahimi, R., Shahzadeh Fazeli, S. A., Bakhshi Khaniki, G. The isolation and preliminary characterization of native cyanobacterial and microalgal strains from lagoons contaminated with petroleum oil in Khark Island. Biol J Microorg. 5 (20), 33-41 (2017).
  22. Nübel, U., Garcia-Pichel, F., Muyzer, G. PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (8), 3327-3332 (1997).
  23. Tragin, M., Lopes dos Santos, A., Christen, R., Vaulot, D. Diversity and ecology of green microalgae in marine systems: an overview based on 18S rRNA gene sequences. Perspect. Phycol. 3 (3), 141-154 (2016).
  24. Uchida, H., et al. A coupled assay system for the lysis of cyanobacteria. Japanese J Water Treatment Biol. 34 (1), 67-75 (1998).
  25. Drummond, C. Characterization of Sulfolobus. Spindle-shaped Virus replication. , Portland State University. (2010).
  26. Flores, E., Wolk, C. P. Production, by filamentous, nitrogen-fixing cyanobacteria, of a bacteriocin and of other antibiotics that kill related strains. Arch Microbiol. 145, 215-219 (1986).
  27. Wick, C., McCubbin, P. Characterization of purified MS2 bacteriophage by the physical counting methodology used in the integrated virus detection system (IVDS). Toxicol Methods. 9 (4), 245-252 (1999).
  28. Marei, E. M., Elbaz, R., Hammad, A. Induction of temperate cyanophages using heavy metal-copper. Int J Microbiol Res Rev. 5 (5), 472(2013).
  29. Bratchkova, A., Kroumov, A. D. Microalgae as producers of biologically active compounds with antibacterial, antiviral, antifungal, antialgal, antiprotozoal, antiparasitic and anticancer activity. Acta Microbiol Bulgarica. 36 (3), 79-89 (2020).
  30. Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. The virulence index: a metric for quantitative analysis of phage virulence. Phage. 1 (1), 27-36 (2020).
  31. Omata, T., Murata, N. Isolation and characterization of three types of membranes from the cyanobacterium (blue-green alga) Synechocystis PCC 6714. Arch Microbiol. 139, 113-116 (1984).
  32. Wilson, W. H., Joint, I. R., Carr, N. G., Mann, N. H. Isolation and molecular characterization of five marine cyanophages propagated on Synechococcus sp. strain WH7803. Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3736-3743 (1993).
  33. Grasso, C. R., et al. A review of cyanophage-host relationships: Highlighting cyanophages as a potential cyanobacteria control strategy. Toxins. 14 (6), 385(2022).
  34. Srivastava, A., Gupta, N., Mishra, A. K. Cyanophages: interacting mechanism and evolutionary significance. Cyanobacteria. , 255-282 (2024).
  35. Cai, L., et al. Abundant and cosmopolitan lineage of cyanopodoviruses lacking a DNA polymerase gene. ISME J. 17 (2), 252-262 (2023).
  36. Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach. Preslia. 86 (4), 295-335 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wirusy cyjanobakteriidynamika wirus gospodarzizolacja bakteriofag wtransmisyjna mikroskopia elektronowatest plackowyokre lanie zakresu gospodarzysekwencjonowanie wysokoprzepustoweanaliza filogenetyczna
Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.