Artykuł metodologiczny

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

DOI:

10.3791/68384

⸱

20 czerwca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ICFO-Institut de Ciències Fotòniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, 2Ophthalmology Group, Hospital Universitari Vall d'Hebron, Vall d'Hebron Institut de Recerca (VHIR)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy siatkówki pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych to skomplikowane struktury 3D, które naśladują ludzką siatkówkę, oferując potężną platformę do badania rozwoju siatkówki, mechanizmów chorobowych i potencjalnych strategii terapeutycznych. Co więcej, ponieważ pochodzą one od pacjentów, stają się coraz bardziej popularne, ponieważ są bardzo obiecujące jako narzędzie medycyny spersonalizowanej. W przeciwieństwie do konwencjonalnych hodowli komórkowych 2D, organoidy siatkówki zachowują natywną architekturę 3D siatkówki, co pozwala na bardziej realistyczne odwzorowanie i umożliwia bardziej fizjologicznie istotne badania. Jednak ich złożoność strukturalna, wysoka gęstość komórkowa i zróżnicowany skład stanowią poważne wyzwanie dla charakterystyki.

Aby sprostać tym wyzwaniom i poszerzyć naszą wiedzę na temat dojrzewania organoidów siatkówki przy jednoczesnym zachowaniu kontekstu 3D, połączyliśmy metody oczyszczania optycznego z immunoznakowaniem, aby zobrazować całą strukturę organoidów z całą mocą za pomocą mikroskopii konfokalnej. W tym celu zastosowaliśmy metodę oczyszczania kompatybilną z obiektywami o niskiej i wysokiej aperturze numerycznej, ułatwiając obrazowanie pełnej objętości i uchwycenie niektórych obszarów zainteresowania z rozdzielczością komórkową. Korzystając z tego podejścia, zidentyfikowaliśmy morfologię i rozmieszczenie w 3D trzech głównych ścieżek neuronalnych odpowiedzialnych za przekazywanie informacji wzrokowej: fotoreceptorów czopków i pręcików, komórek afektywnych dwubiegunowych i zwojowych. Nasze odkrycia rzucają więcej światła na techniki wizualizacji w celu zajęcia się organizacją przestrzenną komórek siatkówki w organoidzie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidy siatkówki

Organoidy siatkówki to złożone struktury 3D, które naśladują ludzką siatkówkę, oferując cenną platformę do badania rozwoju siatkówki, mechanizmów chorobowych i potencjalnych strategii terapeutycznych1. Utrzymują naturalną architekturę 3D siatkówki, wykazują wierność transkryptomiczną i kompetencje funkcjonalne, odtwarzając fototransdukcję i łączność synaptyczną2. Ponadto ściśle naśladują rozwój in vivo 3,4, co pozwala na bardziej realistyczne odwzorowanie w porównaniu z płaskimi hodowlami komórkowymi. W poprzednich badaniach Isla-Magrané i in. ustanowili dwuetapowy protokół w celu uzyskania organoidów wielogałkowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w celu modelowania cech komórkowych ludzkiego oka w fazie rozwoju 5,6. Ze względu na niedobór tkanki płodowej, badania nad rozwojem ludzkiego oka zostały ograniczone do badań anatomicznych.

Organoidy siatkówki uzyskane za pomocą tego protokołu wykazywały prawidłowe warstwowanie i zawierały wszystkie główne podtypy komórek siatkówki, takie jak fotoreceptory, komórki dwubiegunowe, komórki zwojowe, komórki amakrynowe i poziome oraz makroglej, wraz z kluczowymi cechami morfologicznymi oraz prawidłową organizacją przestrzenną i połączeniami. Modele organoidowe, choć stanowią potencjalne rozwiązanie, wykazują znaczną zmienność, co utrudnia osiągnięcie spójnych wyników. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zastosowania różnych zaawansowanych technologii w bardziej wiarygodnych modelach ludzkich. Do tej pory organoidy te były badane tylko przy użyciu przekrojów histologicznych, ponieważ ich złożony skład komórkowy, gęstość i rozmiar utrudniają penetrację światła, co skutkuje słabą wydajnością obrazowania optycznego w głębszych warstwach, ograniczając w ten sposób kompleksową analizę.

Obrazowanie z pełnym mocowaniem

Tradycyjne techniki histologiczne, które polegają na cięciu i barwieniu utrwalonych tkanek, mogą dostarczyć szczegółowych informacji o określonych regionach, ale nie są w stanie uchwycić ogólnej architektury i relacji przestrzennych w całym organoidzie. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, obrazowanie całościowe staje się cennym narzędziem do badania organoidów siatkówki. Obrazowanie w całości umożliwia wizualizację całego organoidu w jego nienaruszonej formie 3D, zachowując przestrzenny rozkład typów komórek i składników macierzy zewnątrzkomórkowej. Takie podejście jest szczególnie korzystne dla badania składu komórkowego w obrębie organoidów i między nimi, zapewniając pełniejsze zrozumienie ich procesów rozwojowych i organizacji funkcjonalnej. Jednak ze względu na ich gęstość komórkową i zagęszczenie, organoidy siatkówki są nieprzezroczyste (ryc. 1, niewyjaśnione). Naturalna nieprzezroczystość próbek powoduje rozpraszanie światła, co utrudnia szczegółową wizualizację struktur wewnętrznych za pomocą mikroskopii. Tutaj techniki czyszczenia optycznego okazują się potężnym narzędziem.

Techniki oczyszczania optycznego

Oczyszczanie optyczne odnosi się do zabiegów fizykochemicznych, które sprawiają, że grube próbki biologiczne stają się przezroczyste poprzez homogenizację gradientów współczynnika załamania światła (RI) tkanki w celu dopasowania do gradientów środka czyszczącego i usuwania substancji pochłaniających światło7. Metody te radykalnie zmniejszają rozpraszanie światła i zwiększają przezroczystość. Ta transformacja pozwala nam zobaczyć cały organoid siatkówki, umożliwiając kompleksową analizę jego skomplikowanej organizacji komórkowej i morfologii za pomocą technik obrazowania całego montażu. W praktyce osiąga się to poprzez impregnację próbki substancją o wysokim RI oraz usunięcie lipidów i pigmentów.

Dostępne są różne metody oczyszczania, różniące się różnymi aspektami (np. stopień przezroczystości, kompatybilność z technikami mikroskopowymi, próbkami i cząsteczkami fluorescencyjnymi, wykonalność, czas trwania), ale żadna z nich nie wyróżnia się jako najlepszy wspólny protokół8. Są one podzielone na cztery główne grupy: (1) proste zanurzenie, (2) hydrofobowe na bazie rozpuszczalników organicznych, (3) oparte na hiperhydratacji i (4) oparte na transformacji tkankowej lub zatapianiu hydrożelu, jak ładnie podsumowali Avilov i wsp.7. Wszystkie metody obejmują etap dopasowania RI, zwykle poprzez zanurzenie próbki w roztworze, który odpowiada średniemu RI tkanki. W metodach hydrofobowych lipidy i woda są usuwane przez zanurzenie próbki w rozpuszczalniku organicznym o rosnącym stężeniu (takim jak metanol lub propanol).

Prezentowany protokół jest zoptymalizowaną metodą, która integruje oczyszczanie optyczne z immunoznakowaniem, aby ułatwić wizualizację 3D organoidów siatkówki w całości za pomocą mikroskopii konfokalnej, umożliwiając obrazowanie pełnej objętości przy zachowaniu integralności strukturalnej. Takie podejście pozwala na identyfikację kluczowych typów komórek siatkówki w organoidzie, zapewniając naukowcom potężne narzędzie do badania dojrzewania organoidów siatkówki i organizacji przestrzennej w fizjologicznie istotnym kontekście.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie niestandardowych fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych

UWAGA: Takie podejście służy jako alternatywa dla stosowania komercyjnych przeciwciał fluorescencyjnych (zobacz dyskusję na temat zalet wytwarzania fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych). Co więcej, protokół ten może być stosowany do koniugacji fluoroforów z przeciwciałami pierwszorzędowymi w przypadku, gdy ma być przeprowadzona bezpośrednia immunofluorescencja, a fluorescencyjne przeciwciało pierwszorzędowe nie jest dostępne na rynku. Kontrolowanie stosunku fluoroforu do przeciwciał poprzez dostosowanie ilości fluoroforu w reakcji znakowania daje jaśniejsze sprzężone przeciwciała. Jednak przeciwciała drugorzędowe wytwarzane na zamówienie są mniej stabilne, a stężenie powstałego koniugatu jest 10 razy niższe niż w przypadku komercyjnych przeciwciał fluorescencyjnych. Protokół ten jest adaptacją pracy opisanej przez Bálinta iwsp.9.

  1. Rozpuścić 1 mg fluoroforu w bezwodnym DMSO i podwielokrotność porcji do probówek, aby uzyskać końcowe 0,02 mg fluoroforu na probówkę. Usuń wszystkie DMSO za pomocą szybkiego koncentratora próżniowego, pracującego przez 1 godzinę i 30 minut. Porcje należy przechowywać w temperaturze -20 °C z dala od światła. W przypadku Alexa Fluor 405 ultraczysty H2O jest odpowiednim rozpuszczalnikiem do wytwarzania podwielokrotności.
  2. W celu przeprowadzenia reakcji znakowania należy rozpuścić jedną podwielokrotność fluoroforu w 1-10 μl DMSO (lub ultraczystymH2Odla Alexa Fluor 405).
    UWAGA: Dokładna ilość DMSO jest określana za pomocą poprzednich kontrolnych testów koniugacyjnych. Testy te wykonuje się, gdy ma być użyta nowa partia fluoroforu (lub gdy kończy się poprzednia partia fluoroforu) lub gdy nowy fluorofor jest używany po raz pierwszy w koniugacji. Test koniugacji kontrolnej polega na przeprowadzeniu reakcji znakowania różnymi ilościami fluoroforu w celu określenia optymalnego stosunku fluoroforu do przeciwciała w koniugacie. W naszym przypadku optymalna proporcja zazwyczaj mieści się w przedziale od 3 μl do 5 μl.
  3. Inkubować 50 μl drugorzędowej IgG (lub pierwotnej), 6 μl 1 MNaHCO3 i 1-5 μl fluoroforu przez 40 minut w temperaturze pokojowej (RT) na platformie bujanej, chroniąc przed światłem.
  4. Podczas gdy reakcja postępuje, należy przygotować kolumny wykluczające wielkość oczyszczania, zdejmując ich pokrywki i pozwalając buforowi przejść przez nie. Zrównoważyć kolumnę (po jednej na każdą reakcję znakowania), przepuszczając przez kolumnę 3 x 2-3 ml PBS. W przypadku, gdy ostatni etap równowagi zakończy się przed zakończeniem inkubacji, należy ponownie założyć pokrywki, aby uniknąć ich wyschnięcia i poczekać, aż zakończy się reakcja znakowania.
    UWAGA: Kolumny wykluczające wielkość oczyszczania działają grawitacyjnie. Upewnij się, że kolumna w żadnym momencie nie wyschnie, w przeciwnym razie reakcja oczyszczania nie będzie przebiegać prawidłowo.
  5. Po zakończeniu reakcji (etap 1.3) dodać 140 μl PBS do reakcji znakowania, aby uzyskać objętość około 200 μl i wymieszać ją. Dodaj ten roztwór do środka kolumny, pozwól próbce dostać się do kolumny, a po wymyciu ostatniej kropli wypchnij, dodając 550 μl PBS. Gdy ciecz przestanie opadać, wymyj przez dodanie 300 μl PBS i zbierz w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  6. Obliczyć stężenie przeciwciał i współczynniki znakowania, mierząc absorbancję próbki przy długości fali 280 nm i absorbancję użytych fluoroforów. Zastosuj prawo Beera-Lamberta, aby określić stężenie (w molarności) w następujący sposób:
    figure-protocol-1
    Gdzie A oznacza absorbancję, ε współczynnik ekstynkcji molowej, a CF280 jest miarą absorbancji właściwego fluoroforu przy 280 nm, która służy jako współczynnik korygujący. Następnie stężenie przeciwciała wynosi:
    figure-protocol-2
    A współczynnik etykietowania wynosi:
    figure-protocol-3
  7. Znakowane przeciwciała należy przechowywać w temperaturze 4 ºC, chroniąc przed światłem, przez okres do 6 miesięcy.

2. Znakowanie immunofluorescencyjne

  1. Utrwalić organoidy za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej przez 45 minut.
    UWAGA: OPCJONALNIE: Inkubować organoidy z roztworem pobierającym antygen (kroki 2.2 i 2.3) w celu zwiększenia immunoreaktywności antygenów.
  2. Przygotować 40 ml roztworu do odzyskiwania antygenu, mieszając 0,117 mg triwodnego cytrynianu sodu w ultraczystymH2Oi dostosować do pH 9.
  3. Inkubować organoidy z roztworem do odzyskiwania antygenu, lekko wstrząsając (30 obr./min) w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę.
  4. Przepuszczalność organoidów za pomocą PBST (PBS z 1% Triton X-100) z łagodnym wstrząsaniem w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.
  5. Zablokuj organoidy roztworem blokującym (2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z 0,1% Triton X-100) w temperaturze pokojowej na noc (lub przez 1 dzień).
    UWAGA: Stężenia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych zależą od konkretnego przeciwciała. Do immunofluorescencji próbek z całej góry stosujemy wyższe stężenie w porównaniu z próbkami przekrojowymi. Przeciwciało pierwszorzędowe inkubujemy w stężeniu 10 μg/ml, co w większości przypadków odpowiada 1:100 z podstawowego przeciwciała (tabela 1). Inkubujemy nasze specjalnie wykonane przeciwciała drugorzędowe w stężeniu 20-50 μg/ml.
  6. Inkubować organoidy z pierwszorzędowymi przeciwciałami rozcieńczonymi w roztworze płuczącym (0,1% BSA z 0,1% Triton X-100) w temperaturze 4 °C przez 2 dni, lekko wstrząsając.
  7. Myć organoidy przez 3 x 15 minut w roztworze myjącym, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej (RT).
  8. Inkubować organoidy z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w roztworze płuczącym w temperaturze 4 °C przez 2 dni, lekko wstrząsając.
  9. Myć organoidy przez 3 x 15 minut w roztworze myjącym, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Po znakowaniu immunologicznym można inkubować wybrane barwniki fluorescencyjne. Zwykle używamy markerów jąder fluorescencyjnych, takich jak DAPI (1:1,000) i DRAQ5 (1:500) lub falloidyna (1:100) do wizualizacji sieci filamentów aktynowych.
  10. Inkubować organoidy z barwnikami fluorescencyjnymi rozcieńczonymi w roztworze myjącym w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z łagodnym wstrząsaniem.
  11. Myć organoidy przez 3 x 15 minut w roztworze myjącym, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej (RT).

3. Czyszczenie optyczne za pomocą FluoClear BABB

UWAGA: 1-Propanol może zagrozić plastikowym pojemnikom, szczególnie w przypadku długotrwałego narażenia. Aby być bezpiecznym, używaj szklanych pojemników.

  1. Etap odwodnienia
    1. Przygotować roztwory 1-propanolu w ultraczystymH2Oo podanych procentach (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%), a następnie dostosować do pH 9,5 za pomocą trimetyloaminy.
      UWAGA: Trietyloamina jest toksyczna w przypadku wdychania. Praca pod wyciągiem. Roztwory mogą być ponownie użyte, jeśli są odpowiednio przechowywane (dobrze zamknięty pojemnik). Dostosuj pH przed użyciem.
    2. Próbki inkubować z rosnącym gradientem roztworów 1-propanolu (15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%) przez 2 godziny każda w temperaturze 30 °C, lekko wstrząsając.
    3. Próbki inkubować ze 100% 1-propanolem przez noc w temperaturze 30 °C, lekko wstrząsając.
  2. Krok rozliczenia
    UWAGA: BABB to silna mieszanina rozpuszczalników, która jest znana ze swojej zdolności do rozpuszczania lub znacznego uszkadzania wielu tworzyw sztucznych. Aby być bezpiecznym, używaj szklanych pojemników z kompatybilnymi pokrywkami i pracuj wewnątrz dygestorium.
    1. Przygotuj BABB, mieszając alkohol benzylowy (BA) i benzoesan benzylu (BB) w stosunku 1:2.
    2. Zanurz próbki w BABB w temperaturze pokojowej na noc.
    3. Przed obrazowaniem odśwież BABB.
      UWAGA: W przypadku organoidów o średnicy ~1 mm BABB wywołuje efekt oczyszczania, który jest widoczny w ciągu kilkudziesięciu minut. W zależności od wielkości i charakteru próbki, stopień oczyszczenia może być różny i/lub wymagać dłuższego czasu ekspozycji na roztwór czyszczący. Zalecamy uzyskanie obrazów przed i po zanurzeniu w BABB w celu ulepszenia protokołu czyszczenia.
    4. Próbki oczyszczone z BABB należy przechowywać przez długi czas w temperaturze 4 °C. Chronić przed światłem, aby zachować fluorescencję.

4. Akwizycja obrazu w całości

  1. Za pomocą szklanej pipety umieść organoid na szalce Petriego ze szklanym dnem z kroplą BABB. Upewnij się, że próbka styka się z powierzchnią szkła nakrywkowego.
    UWAGA: Należy uważać, aby kropla BABB zawierająca próbkę nie stykała się z plastikowymi krawędziami naczynia, w przeciwnym razie stopi plastik, pogarszając próbkę i jakość obrazowania.
  2. Korzystając z odwróconego konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w obiektywy o małym i dużym powiększeniu, uzyskaj obrazy Z-stack, aby uzyskać pełny wgląd 3D w próbkę ze szczegółami komórkowymi.
    UWAGA: W tym badaniu użyto obiektywu powietrznego 0,4 z aperturą numeryczną (NA) 10x i obiektywu NA 1,4 z 63x, o wielkości kroku odpowiednio 3,5 μm i 1 μm.

5. Przetwarzanie obrazu

  1. Ponownie skalibruj rozmiar kroku akwizycji Z-stack, biorąc pod uwagę niedopasowanie współczynnika załamania światła (RI) między roztworem czyszczącym a medium zanurzeniowym.
    1. Oblicz rozmiar ponownie skalibrowanego kroku w następujący sposób:
      figure-protocol-4
      W przypadku próbki osadzonej w BABB, zobrazowanej za pomocą obiektywu pneumatycznego o rozmiarze kroku 3,5 μm, będzie ona następująca:
      figure-protocol-5
    2. Za pomocą ImageJ zmień głębokość woksela (kliknij Obraz | Właściwości...) dla ponownie obliczonego rozmiaru kroku.
  2. Tworzenie projekcji obrazu stosu Z.
    1. Korzystając z ImageJ, dokładnie sprawdź stos Z (kliknij Obraz | Stosy | Widoki ortogonalne). Pojawią się widoki XY, XZ i YZ organoidu siatkówki.
    2. Zapisz żądane obszary zainteresowania (kliknij na Plik | Zapisz jako...).
  3. Utwórz animację renderu 3D stosu Z za pomocą oprogramowania do obróbki (patrz Tabela materiałów).
    1. Wybierz kanały, które mają być wizualizowane, zaznaczając ich pola wyboru.
    2. Dostosuj płaszczyzny Z, aby uwidocznić wnętrze próbki (włącz opcję Przycinanie w polu wyboru).
    3. Nagraj animację za pomocą edytora filmów (włącz opcję Edytor filmów w polu wyboru). Przeciągnij i upuść oraz powiększaj i pomniejszaj bezpośrednio za pomocą myszy. Kliknij przycisk Dodaj, aby dołączyć inny klip do animacji. Jeśli dostosowujesz płaszczyzny Z, włącz opcję Przycinanie płaszczyzn (kliknij Ustawienia...| zaznacz pole Przycinanie płaszczyzn).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1: Porównanie trzech metod rozliczania. Po lewej: Obrazy w jasnym polu próbek (A) nieoczyszczonych i (B-D) oczyszczonych. Po prawej: Stos Z z ortogonalnymi widokami xz i yz 90 organoidów siatkówki DIV wybarwionych markerem jądrowym DRAQ5 (żółty) uzyskanych za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w 10-krotny obiektyw powietrzny (RI = 1,00). (A) Nieoczyszczony organoid siatkówki (N = 3). Organoidy siatkówki utrwalone PFA nie są wystarczająco przezroczyste do wizualizacji 3D. (B) Organoid oczyszczony z fruktozy/glicerolu (N = 3). C) Organoid zatwierdzony przez ECi (N = 3). (D) Organoid oczyszczony przez FluoClear BB (N = 3). Podziałka = 100 μm. Skróty: BF = jasne pole; CLSM = konfokalny laserowo-skaningowy mikroskop fotograficzny; RI = współczynnik załamania światła; PFA = paraformaldehyd; ECi = cynamonian etylu; BABB = alkohol benzylowy/benzoesan benzylu; DIV = dni in vitro. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Porównanie metod usuwania optycznego w badaniach immunofluorescencyjnych w organoidach neuroretinalnych

W tym miejscu przedstawiamy wyniki trzech metod oczyszczania, aby wykazać skuteczność FluoClear BABB w przekształcaniu organoidów siatkówki w przezroczystość. Na rycinie 1 obserwujemy organoidy siatkówki oczyszczone za pomocą fruktozy/glicerolu (figura 1B), ECi (figura 1C) i FluoClear BABB (figura 1D). Testowane metody oczyszczania zostały wybrane, ponieważ udowodniono, że wszystkie10,11 są kompatybilne z barwieniem immunofluorescencyjnym i zachowują fluorescencję z białek endogennych (np. GFP obecnego w GCaMPs).

Fruktoza/Glicerol12 to nietoksyczny, prosty protokół oczyszczania zanurzeniowego, który nie wymaga odwodnienia, co znacznie skraca czas przetwarzania w porównaniu z innymi metodami. Doniesiono, że jest skuteczny w przezroczystości organoidów pochodzących z różnych tkanek: dróg oddechowych, nerek, wątroby i ludzkiego raka piersi12.

ECi (Ethyl Cinnamate)11 jest zatwierdzonym przez FDA aromatem spożywczym i dodatkiem do kosmetyków13,14, jest uważany za nieszkodliwy i okazał się doskonałym odczynnikiem oczyszczającym tkanki ssaków. Jest znany ze swojej zdolności szybkiego usuwania i minimalnych zniekształceń tkanek. Jest klasyfikowana jako hydrofobowa metoda oczyszczania, ale w porównaniu z rozpuszczalnikami na bazie BABB jest nietoksyczna i dłużej zachowuje fluorescencję białek fluorescencyjnych (do 14 dni). Jak to zwykle bywa w większości protokołów oczyszczania, ECi wymaga wcześniejszego etapu odwodnienia. W celu uzyskania optymalnych wyników etap ten osiąga się poprzez zanurzenie próbki w roztworach o stopniowo rosnącym stężeniu alkoholu. Ponieważ ECi nie jest szkodliwy, po oczyszczeniu próbki można nią bezpiecznie manipulować i przechowywać w plastikowych pojemnikach. Jednak etapy odwadniania są wykonywane przy użyciu 1-propanolu, rozpuszczalnika organicznego, który musi być manipulowany pod wyciągiem i przechowywany w szklanych pojemnikach.

FluoClear BABB10 jest wariantem protokołu hydrofobowego opartego na alkoholu benzylowym/benzoesanie benzylu (BABB) jako roztworze dopasowującym współczynnik załamania światła. Wiadomo, że jest bardzo toksyczny i, dlatego należy obchodzić się z nim ostrożnie. FluoClear BABB został opisany jako ulepszona wersja, która zachowuje GFP i RFP lepiej niż poprzednie wersje i pozwala na stosowanie 1-propanolu lub tert-butanolu jako środków odwadniających.

Aby ocenić skuteczność trzech metod oczyszczania, zobrazowaliśmy płaszczyzny Z za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw powietrzny 10x NA0,4, zapewniający duże pole widzenia (FoV) 2,5 x 2,5 x 2,56 mm, aby uchwycić całą objętość organoidu siatkówki. Użyliśmy organoidów siatkówki w pośrednim etapie dojrzewania (90 dni in vitro (DIV)), które zawierają wszystkie neurony siatkówki (komórki zwojowe, komórki dwubiegunowe i fotoreceptory), osiągając gęstość komórkową i zagęszczenie, a tym samym są nieprzezroczyste. Jak wyjaśniono we wprowadzeniu, oczyszczenie optyczne uzyskuje się, gdy RI jest dopasowane do całego obiektu, który ma być obrazowany. W związku z tym media immersyjne używane do obrazowania będą miały drastyczny wpływ na osiągniętą przezroczystość. Tabela 2 zawiera szczegółowe informacje na temat RI mediów zanurzeniowych i testowanych roztworów czyszczących.

RozwiązanieWspółczynnik załamania światła
Media zanurzeniowePowietrze1
Woda1.33
Glicerol1.45
Olej1.51
Rozwiązania w zakresie rozliczeńFruktoza/glicerol1.468
Inicjatywa obywatelska1.558
FluoClear BABB1.56

Tabela 2: Współczynnik załamania światła (RI) ośrodków immersyjnych najczęściej stosowanych w mikroskopii świetlnej oraz metodologie oczyszczania optycznego testowane pod kątem oczyszczania organoidów siatkówki. Skrót: RI = współczynnik załamania światła.

Porównując uzyskane obrazy konfokalne (ryc. 1, prawy panel), leczenie fruktozą/glicerolem spowodowało najmniejszą poprawę przezroczystości, ograniczając wizualizację warstw siatkówki i uniemożliwiając wizualizację rdzenia organoidu. W ramach projektu ECi osiągnięto lepszą przezroczystość, co pozwoliło na wizualizację warstw siatkówki, ale nadal ograniczało to wizualizację rdzenia organoidu siatkówki ze względu na rozpraszanie światła, które utrudniało wykrywanie fluorescencji w wewnętrznych częściach próbki. FluoClear BABB zapewnił największą poprawę przezroczystości, umożliwiając wyraźną wizualizację zarówno rdzenia, jak i kory organoidu siatkówki w wyższej rozdzielczości przy podobnej intensywności fluorescencji.

Warto wspomnieć, że zarówno protokoły ECi, jak i FluoClear BABB spowodowały znaczny skurcz próbki, co ilustrują odpowiednie obrazy jasnego pola każdego oczyszczonego organoidu siatkówki (ryc. 1, lewy panel). Skurcz próbki jest spowodowany poprzednimi etapami odwadniania, które usuwają wodę, i to jest powód, dla którego protokół fruktozy/glicerolu nie zmniejsza próbki. To kurczenie się stanowi jednak wyjątkową okazję do głębszej eksploracji. Chociaż kompresuje ogólny rozmiar organoidu i potencjalnie zaniża odległości wewnętrzne, zwiększa również zwartość. Ta izotropowa zwartość, stosunkowo jednolita we wszystkich kierunkach, pozwala nam wykorzystać obiektywy o dużym powiększeniu i doskonałej zdolności rozdzielczej (ze względu na ich większą NA), które w przeciwnym razie obrazowałyby tylko najbardziej zewnętrzną warstwę komórek ze względu na ich krótsze odległości robocze (WD). Na przykład obiektyw powietrzny 10x NA 0.4 oferuje WD 2.53 mm, podczas gdy obiektyw olejowy 63x NA 1.4 o znacznie lepszej rozdzielczości ma WD tylko 0.14 mm. Wykorzystując bardziej kompaktowe organoidy oczyszczone przez BABB, możemy skutecznie przezwyciężyć to ograniczenie i uzyskać obrazowanie w wysokiej rozdzielczości głębszych struktur, takich jak warstwa komórek zwojowych znajdująca się we wnętrzu organoidu (ryc. 2).

figure-results-2
Rycina 2: Rekonstrukcje 3D organoidu siatkówki (200 DIV) oczyszczone za pomocą FluoClear BABB zobrazowane za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego. Mikroskop został wyposażony w (A) obiektyw powietrzny 10x NA 0,4 i (B) obiektyw olejowy 63x NA 1,5. Oczyszczanie i obrazowanie pozwalają na wizualizację całego organoidu, a jednocześnie obraz z drobnymi szczegółami niektórych obszarów zainteresowania. DRAQ5 (jądra), opsyna B+GR (czopki) i TUJ1 (neurony). Skróty: DIV = dni in vitro; BABB = alkohol benzylowy/benzoesan benzylu; NA = apertura numeryczna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podsumowując, naszym wyborem do oczyszczania był FluoClear BABB, ponieważ oferował on doskonałą wizualizację całego organoidu siatkówki z wysoką rozdzielczością i stosunkiem sygnału do szumu. Co ważne, skurcz wywołany przez BABB, zagęszczanie organoidu izotropowo. Ta kompaktowość pozwoliła nam wykorzystać cele o dużym powiększeniu do szczegółowej eksploracji głębszych struktur. Wreszcie, kompatybilność BABB z obiektywami immersyjnymi z olejkiem zapewniła minimalne rozpraszanie światła i wysokiej jakości obrazowanie w różnych powiększeniach.

Identyfikacja i czasoprzestrzenne rozmieszczenie komórek siatkówki w organoidach w okresie dojrzewania

Postępując zgodnie z opisaną tutaj metodologią i stosując obrazowanie całościowe na organoidach znakowanych immunologicznie specyficznymi przeciwciałami wyszczególnionymi w Tabeli 1, zbadaliśmy, w jaki sposób neurosiatkówka jest kształtowana z organoidów w różnych punktach dojrzewania, od wczesnych etapów rozwoju (40 DIV) do bardziej dojrzałych stadiów (do 250 DIV), wykazując dobrze zdefiniowaną strukturę 3D. Takie podejście pozwoliło nam zobrazować powstawanie i organizację różnych składników siatkówki opisanych w tym rozdziale.

PrzeciwciałoSpecyficznośćCeleLokalizacja w: Retina[ ]końcowy (rozcieńczenie)Gospodarz#RRDI
Ochrona przed GFPDobra praktyka rolnaDobra praktyka rolnaKomórki GCaMP6s-dodatnie10 μg/ml (1:1 000)ChAB_300798
Kanał CHX10Homeobox brzuszno-przyśrodkowy podwzgórza 2 (Vsx2)Czynnik transkrypcyjnyNeuroblasty i komórki dwubiegunowe10 μg/ml (1:2)MsAB_10842442
Opsin BOpsin niebieskiZewnętrzny segment niebieskich stożkówNiebieskie stożki10 μg/ml (1:100)RbAB_177457
Opsin RGOpsin zielony i czerwonyZewnętrzny segment zielonych i czerwonych stożkówZielone i czerwone stożki10 μg/ml (1:100)ChAB_11213279
ODKOPRZYJPowrót do zdrowiaBiałko wiążące wapńFotoreceptory10 μg/ml (1:100)RbAB_2253622
RHO (RET-P1)RodopsynaZewnętrzny segment prętówPręty63 μg/ml (1:100)MsAB_260838
TUJ1 powiedział:Beta-tubulina klasy III specyficzna dla neuronówIzoforma tubuliny Beta-IIINeuronów50 μg/ml (1:200)MsAB_2315514

Tabela 1: Przeciwciała pierwszorzędowe badane w organoidach siatkówki z różnych etapów dojrzewania. Skróty: Kurczak = Ch; Mysz = Ms; Królik = Rb.

Znakowanie immunologiczne za pomocą różnych markerów pozwoliło na identyfikację komórek zgodnych z tą warstwową strukturą. TUJ1 to specyficzna dla neuronu beta-tubulina klasy III (Tabela 1), zwykle stosowana w pokrojonych próbkach do znakowania komórek zwojowych siatkówki (RGC)15 ze względu na jej obfitość. TUJ1 jest obecny we wszystkich neuronach siatkówki16 i od wczesnych stadiów różnicowania neuronalnego17. Ekspresję TUJ1 stwierdzono na wszystkich etapach dojrzewania w korze organoidu, co pozwoliło na śledzenie organizacji komórek siatkówki w warstwach. Na rysunku 3 możemy zaobserwować, że we wczesnych stadiach rozwoju (40 DIV) TUJ1 jest równomiernie rozmieszczony w pojedynczej, cienkiej i jednolitej warstwie. Od 90 DIV obszar wierzchołkowy organoidu staje się gęstszy i bardziej zwarty, ponieważ wypełnia się znacznie większą liczbą komórek, które gromadzą się w obszarze wierzchołkowym. Przy 170 DIV organoid siatkówki uzyskał warstwową strukturę siatkówki 3D z dyskretną warstwą wierzchołkową. Przy 200 DIV widzimy, że głębiej w organoidzie znajdują się inne ciała komórkowe rozciągające długie projekcje, które są znacznie mniej liczne. Wreszcie, przy 250 DIV, struktura w trzech warstwach jądrowych jest oczywista, odpowiadająca: (1) zewnętrznej warstwie jądrowej (ONL) zgodnej z dojrzałymi fotoreceptorami, (2) wewnętrznej warstwie jądrowej (INL) zamieszkałej głównie przez komórki dwubiegunowe i (3) warstwie komórek zwojowych (GCL) utworzonej przez RGC, jak pokazano na rysunku 3 (u dołu po prawej).

figure-results-3
Rycina 3: Organizacja neuronów po dojrzewaniu organoidów siatkówki w strukturze warstwowej. Projekcje stosu Z obrazów konfokalnych organoidów siatkówki oczyszczonych z FluoClear BABB barwionych TUJ1. W 40 DIV nie powstają żadne struktury warstwowe. Od 170 DIV neurosiatkówka rozwarstwia się na warstwy. Oznaczone są warstwy jądrowe siatkówki: ONL, INL i GCL (żółte groty strzałek). Podziałka = 25 μm (po lewej) i 10 μm (po prawej). Skróty: BABB = alkohol benzylowy/benzoesan benzylu; DIV = dni in vitro; ONL = zewnętrzna warstwa jądrowa, INL = wewnętrzna warstwa jądrowa; GCL = warstwa komórek zwojowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dzięki tej metodologii możemy również raportować składanie wiązek aksonów. Jak widać w powiększonych obszarach (ryc. 4), zaobserwowaliśmy wiązki włókien rozciągające się od wewnętrznego jądra organoidu w kierunku obwodu, wystające w kierunku obszarów, które są daleko od siebie oddalone (do 1 mm). Co ciekawe, powstawanie tych włókien zachodziło na różnych etapach dojrzewania. W miarę wzrostu organoidu włókna gęstnieją, stają się bardziej złożone i zbierają więcej projekcji komórkowych (Ryc. 4 [250 DIV] i Dodatkowe wideo S1). RGC są pierwszymi komórkami, które różnicują się podczas rozwoju siatkówki, a zatem mogą organizować swoje projekcje od bardzo wczesnych etapów rozwoju. RGC mogą inicjować ekspansję neurytów jeszcze przed ustaleniem swojej ostatecznej pozycji w organoidzie Nasze odkrycia są zgodne z poprzednimi raportami18 , które pokazują tworzenie się struktury przypominającej nerw wzrokowy w kokulturach organoidów siatkówki i mózgu.

figure-results-4
Rycina 4: Składanie projekcji neuronalnych na różnych etapach dojrzewania. Włókna rozciągają się od wewnętrznych płaszczyzn organoidu siatkówki w kierunku obwodu. Powstawanie tych włókien zachodziło na różnych etapach dojrzewania, od 40 DIV do najstarszego badanego punktu dojrzewania (250 DIV). Podziałka = 25 μm (górny rząd) i 100 μm (dolny rząd). Skróty: DIV = dni in vitro. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W miejscu wierzchołkowym organoidów siatkówki niektóre fotoreceptory dojrzewają do pręcików, które zawierają rodopsynę w zewnętrznych segmentach do wykrywania widzenia monochromatycznego w warunkach słabego oświetlenia, podczas gdy inne dojrzewają do czopków, które wyrażają niebieskie, zielone i czerwone opsyny i są odpowiedzialne za kolor i wysoką ostrość widzenia w jasnych warunkach oświetleniowych. Rycina 5 (u góry) ilustruje populację fotoreceptorów czopków w organoidzie siatkówki, które wyrażały niebieskie i/lub zielono-czerwone opsyny (OPSIN B i GR, tabela 1). Komórki te wykazują wydłużoną morfologię z różnymi opsynami rozmieszczonymi w całym ciele komórki, z wyłączeniem jądra. Warto zauważyć, że zewnętrzna końcówka tych komórek wydaje się jaśniejsza, potencjalnie przypominając zewnętrzny segment fotoreceptora zawierającego dyski. Aby uwidocznić zarówno niebieskie, jak i zielone/czerwone czopki przy użyciu pojedynczego kanału do wykrywania fluorescencji, drugorzędowe przeciwciała przeciwko niebieskiej opsynie (OPSIN B, królik) i zielono-czerwonej opsyny (OPSIN GR, kurczak) oznaczono tym samym fluoroforem, optymalizując wykorzystanie kanałów i usprawniając proces obrazowania, unikając jednocześnie nakładania się widma. Podzbiór komórek fotoreceptorowych na rycinie 5 (na dole) wykazywał ekspresję rodopsyny (RHO, tabela 1 i dodatkowe wideo S2), wskazując jednoznacznie na ich tożsamość jako pręcików. Te pręciki mają wcześniej opisaną wydłużoną morfologię, z jądrem umieszczonym centralnie i bogatym w opsynę ciałem komórki zorientowanym na obrzeża organoidu.

figure-results-5
Rycina 5: Organoidy siatkówki z późniejszych etapów rozwoju. Góra: dojrzałe czopki, dół: pręciki. Projekcja Z obrazów konfokalnych organoidów siatkówki oczyszczonych z FluoClear BB wybarwionych TUJ1 (neurony), DRAQ5 (jądra), opsyn-B+GR (czopki) i RHO (pręciki). Rysunki schematyczne są pokazane w celach informacyjnych. Podziałka = 100 μm (po lewej) i 10 μm (po prawej). Skróty: DIV = dni in vitro; BABB = alkohol benzylowy/benzoesan benzylu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Komórki dwubiegunowe i ich rozkład czasoprzestrzenny zidentyfikowano, śledząc ekspresję Chx10 (znaną również jako Vsx2) przez 250 DIV dojrzewania (Figura 6). Chx10 (Tabela 1) jest czynnikiem transkrypcyjnym krytycznym dla proliferacji komórek progenitorowych i determinacji komórek dwubiegunowych w rozwijającej się siatkówce19,20. Jako gen homeoboksowy ulega ekspresji we wczesnych stadiach rozwoju w neuroblastach, a w dojrzałej siatkówce znajduje się wyłącznie w komórkach dwubiegunowych. Rysunek 6 przedstawia rozmieszczenie komórek Chx10-dodatnich w rozwijającym się organoidzie. Początkowo obserwuje się liczne komórki Chx10-dodatnie rozciągające się od obwodu neuroretifretalnego w kierunku środka. W miarę dojrzewania organoidu komórki te stają się mniej liczne i przenoszą się do INL, gdzie znajdują się komórki dwubiegunowe.

figure-results-6
Rysunek 6: Ekspresja Chx10 w ciągu 250 DIV dojrzewania. Obrazy konfokalne z projekcją Z organoidu siatkówki oczyszczonego z FluoClear BB wybarwionego DRAQ5 (jądra) i Chx10 (neuroblasty i dojrzałe komórki dwubiegunowe). Podziałka = 100 μm. Skróty: DIV = dni in vitro; BABB = alkohol benzylowy/benzoesan benzylu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Na koniec wykazujemy, że endogenny GFP z markerów wapnia GCaMP jest zachowany po oczyszczeniu za pomocą tej metodologii. Na rycinie 7 możemy zaobserwować neurosiatkówkę 70 organoidów siatkówki DIV zakażonych Ad5-CMV-GCaMP6 i znakowanych immunologicznie anty-GFP (Tabela 1) w celu zwiększenia fluorescencji po długotrwałym utrwaleniu.

figure-results-7
Rycina 7: Endogenny GCaMP zachowany w metodzie oczyszczania FluoClear BABB. Organoid siatkówki o średnicy 70 DIV zakażony Ad5-CMV-GCaMP6 znakowany immunologicznie anty-GFP (komórki eksprymujące GCaMP), Chx10 (neuroblasty i komórki dwubiegunowe we wczesnym stadium) i DRAQ5 (jądra). Podziałka = 100 μm (po lewej) i 25 μm (po prawej). Skróty: BABB = alkohol benzylowy/benzoesan benzylu; DIV = dni in vitro. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Film uzupełniający S1: Rekonstrukcja 3D organoidu siatkówki przedstawiająca zbiór projekcji neuronalnych. Projekcja Z obrazów konfokalnych organoidów siatkówki oczyszczonych przez FluoClear BB przy 250 DIV wybarwionych TUJ1 (neurony) reprezentowane na fioletowo i DRAQ5 (jądra) na żółto. Skróty: BABB = alkohol benzylowy/benzoesan benzylu; DIV = dni in vitro. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film uzupełniający S2: Rekonstrukcja 3D pręcików ustawionych na powierzchni organoidu siatkówki w późnych stadiach rozwoju (200 DIV). Projekcja Z obrazów konfokalnych organoidów siatkówki oczyszczonych z FluoClear BB przy 200 DIV barwionych RECOV (fotoreceptory) reprezentowane na zielono i RHO (pręciki) na fioletowo. Skróty: DIV = dni in vitro; BABB = alkohol benzylowy/benzoesan benzylu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół ułatwia badanie czasoprzestrzennego rozmieszczenia komórek tworzących organoid siatkówki na różnych etapach dojrzewania, zachowując jego naturalną architekturę 3D, co jest kluczowym aspektem dla zrozumienia tych modeli w kontekście przyszłej medycyny spersonalizowanej. Zapewnia szczegółowy wgląd w architekturę siatkówki na poziomie odrębnych warstw i poszczególnych typów komórek, umożliwiając wizualizację struktur subkomórkowych przy zachowaniu globalnego kontekstu 3D.

Alternatywą dla obrazowania całościowego jest obróbka końcowa próbki w celu wykonania obrazowania na konwencjonalnych przekrojach (parafinowych lub krioprezerwowanych). Podczas gdy sekcje dostarczają cennych informacji na temat lokalizacji białek i struktur, dane te są ograniczone do jednej płaszczyzny, co ogranicza zrozumienie przestrzennych połączeń komórkowych. W rezultacie, cechy takie jak proporcja czopków i pręcików lub tworzenie wiązek aksonalnych w określonych regionach mogą nie być dokładnie odwzorowane, co komplikuje interpretację w trzech wymiarach. Organoidy siatkówki są wysoce niejednorodne, z różnymi regionami potencjalnie zawierającymi różne typy komórek i/lub wykazującymi różny stopień złożoności i zróżnicowania. Obrazowanie całościowe rozwiązuje ten problem, ponieważ umożliwia globalną analizę gradientów niejednorodności bez polegania na wyborze podzbioru sekcji, które mogą nie reprezentować całej próbki.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszami świetlnymi (LSFM)21,22,23 może być stosowana jako alternatywa dla laserowo-skaningowej mikroskopii konfokalnej. W LSFM próbka jest oświetlana cienką warstwą światła o grubości kilku mikronów, a cała fluorescencja generowana z oświetlonego przekroju optycznego jest wykrywana za pomocą kamery. LSFM to technika detekcji oparta na szerokim polu, która stanowi wysoce wydajną strategię szybkiej wizualizacji dużych objętości (próbek w skali do centymetra) przy minimalnym efekcie fotowybielania i fototoksyczności. Jednak organoidy mogą wykazywać znaczną aberrację sferyczną, ponieważ światło przechodzące przez zakrzywione powierzchnie jest załamywane w różny sposób w zależności od kąta padania. W tych eksperymentach zniekształcenie to powodowało utratę ostrości, co prowadziło do rozmycia i pogorszenia rozdzielczości głębszych struktur. Do obrazowania naszych organoidów siatkówki (o średnicy około 1 mm) najskuteczniejszym podejściem okazała się laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna.

Protokół ten jest dostosowany do naszych wymagań eksperymentalnych. Może być używany jako przewodnik dla naukowców zapuszczających się w obrazowanie całościowe optycznie oczyszczonych organoidów siatkówki i powinien być dostosowany, jeśli te się różnią. W tej sekcji szczegółowo opisano krytyczne kroki, modyfikacje i ograniczenia metodologii.

Kluczowym krokiem jest podjęcie decyzji w sprawie protokołu rozliczeniowego. Należy wziąć pod uwagę wiele kryteriów. Po pierwsze, należy wziąć pod uwagę typologię próby. Oczyszczanie kości to nie to samo, co oczyszczanie tkanki mózgowej, tak jak oczyszczanie organoidów siatkówki różni się od oczyszczania organoidów żołądka, ponieważ każdy z nich wymaga odrębnego podejścia. Aby zobrazować oczyszczone organoidy innego typu, konieczne jest przejrzenie literatury w celu zidentyfikowania protokołów, które zostały zoptymalizowane specjalnie dla interesującej próbki. Fruktoza/glicerol to szybka i nietoksyczna metoda oczyszczania, która, jak udowodniono, jest przydatna do usuwania organoidów pochodzących z różnych tkanek (organoidy ludzkich dróg oddechowych, okrężnicy, nerek, wątroby i piersi oraz organoidy gruczołów sutkowych myszy)12 , ale nie była odpowiednia do zwiększania przezroczystości ludzkich organoidów siatkówki. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, żadne badanie nie donosi o zastosowaniu fruktozy/glicerolu w tkance nerwowej/organoidzie. Dlatego dochodzimy do wniosku, że ta metoda oczyszczania nie jest odpowiednia do oczyszczania tkanek nerwowych. Dalsze badania są uzasadnione w celu wyjaśnienia przyczyn leżących u podstaw tej niezgodności.

Innym krytycznym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest wymagane pole widzenia, ponieważ ma ono bezpośredni wpływ na strategię obrazowania i wybór komponentów optycznych. Duże pola widzenia są zwykle osiągane przy użyciu obiektywów o małym powiększeniu, które często są przeznaczone do użytku bez mediów zanurzeniowych (np. powietrze, RI = 1,00). Obiektywy te doświadczają większego niedopasowania RI podczas obrazowania próbek oczyszczonych przez BB (RI = 1,56), co prowadzi do przesunięć w ostrości głębokości, które należy skorygować podczas przetwarzania końcowego. W przeciwieństwie do tego, obiektywy immersyjne z olejem (RI = 1,51) wykazują mniejsze niedopasowanie RI do roztworów czyszczących, takich jak BABB (RI = 1,56) i dlatego nie wymagają ponownej kalibracji.

Proste metody zanurzeniowe zwykle nie zapewniają wysokiej przezroczystości i nie nadają się do uzyskiwania wysokiej jakości obrazów próbek z całego montażu. Protokoły oczyszczania tkanek wpływają na skuteczne rozwiązanie poprzez pęcznienie lub kurczenie się próbek. W zależności od celu eksperymentu, korzystne może być zarówno obrzęk, jak i kurczenie się. Protokoły, które rozszerzają próbkę, mogą zwiększyć rozdzielczość drobnych szczegółów w tym samym układzie optycznym, który wcześniej nie był w stanie pokazać tych samych szczegółów. Skurcz może być pożądany w celu wizualizacji dużych próbek, które w przeciwnym razie nie zmieściłyby się w komorze na próbki lub nie dostosowałyby się do obiektywnych odległości roboczych. Ponieważ jednak skurcz ściska próbkę i może zniekształcać odległości wewnętrzne, technika ta nie nadaje się do oceny wymiarowej ani precyzyjnego pomiaru odległości międzykomórkowych.

Innym ważnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest kompatybilność z białkami fluorescencyjnymi. W większości protokoły oparte na rozpuszczalnikach organicznych wygaszają białka fluorescencyjne, ponieważ wymagają wysokich temperatur lub degradują białka fluorescencyjne podczas zatapiania w roztworach pasujących do RI. Na szczęście większość metod jest kompatybilna z technikami znakowania immunologicznego. Jednak zgodność każdego epitopu powinna być potwierdzona eksperymentalnie.

Co więcej, przenikanie dużych cząsteczek IgG przez tkankę może być utrudnione, co zmniejsza skuteczność barwienia i ogranicza wizualizację docelowej struktury do powierzchni próbki. Barwienie całych próbek przeciwciałami może zająć kilka dni (a nawet tygodni), w zależności od wielkości i charakteru próbki, co znacznie wydłuża czas trwania protokołu.

Wreszcie, kompatybilność z przyrządem optycznym jest obowiązkowa. Większość metod opartych na rozpuszczalnikach organicznych (z wyjątkiem ECi) jest bardzo korozyjna i nie jest chemicznie kompatybilna z dostępnymi na rynku komorami na próbki i obiektywami zanurzeniowymi. Co więcej, niektóre rozwiązania odśnieżające mają RI który nie odpowiada zakresowi wymaganemu przez dostępne obiektywy (zwykle woda).

Jest kilka kroków w protokole, które wymagają szczególnej uwagi. FluoClear BABB, jako hydrofobowa metoda oczyszczania, wymaga wcześniejszego etapu odwodnienia. pH odgrywa ważną rolę w zachowaniu fluorescencji białek endogennych, takich jak GFP. Następnie ważne jest, aby upewnić się, że roztwory alkoholu mają odpowiednio dostosowane pH. Odwodnienie jest kluczem do całkowitego oczyszczenia. Optymalne wyniki uzyskuje się poprzez inkubację próbek z rosnącym gradientem roztworów alkoholu.

Wielkość próbki odgrywa ważną rolę w umożliwieniu przeciwciałom osiągnięcia określonych celów. Przeciwciała mogą nie przenikać jednorodnie i zostać zatrzymane na zewnątrz próbki. W takim przypadku należy rozważyć zmianę detergentu na inny rodzaj detergentu (Tween-20 lub Saponina), zwiększając stężenie i czas inkubacji detergentu i przeciwciał. Jeśli te dostosowania są niewystarczające, alternatywne strategie mogą poprawić przenikanie przeciwciał. W przypadku znakowania immunologicznego dużych próbek (w skali centymetrowej) naukowcy odkryli, że SDS może ułatwić głębszą penetrację przeciwciał24. SDS indukuje częściową utratę trzeciorzędowej struktury przeciwciał, skutecznie linearyzując białko i umożliwiając mu głębsze wnikanie w tkankę. Następnie wypłukanie SDS przywraca przeciwciałom właściwości wiązania antygenu, umożliwiając bardziej równomierne barwienie grubszych tkanek i zmniejszając powszechnie obserwowany gradient silniejszego znakowania na powierzchni próbki.

Przygotowanie własnych fluorescencyjnych przeciwciał drugorzędowych ma kilka zalet, ponieważ zapewnia większą elastyczność w projektowaniu znakowania immunologicznego, umożliwiając wybór specyficznej kombinacji przeciwciał fluoroforowo-drugorzędowych, zwiększając liczbę kolorów, które można zastosować w tej samej próbce. Dodatkowo stosunek fluoroforu do przeciwciał można dostosować, dzięki czemu są one na ogół jaśniejsze. Należy jednak wziąć pod uwagę pewne aspekty. Przeciwciała drugorzędowe wytwarzane na zamówienie są na ogół mniej stabilne niż te dostępne na rynku i powinny być używane świeże. Większość z nich zachowuje powinowactwo do ligandów przez 3-6 miesięcy w temperaturze 4 °C, ale stabilność musi zostać określona eksperymentalnie, ponieważ niektóre kombinacje mogą ulegać szybszej degradacji. Co więcej, niektóre pary przeciwciało-fluorofor mogą zmieniać powinowactwo przeciwciała do jego epitopu, powodując częściowe lub całkowite niespecyficzne znakowanie. Aby zapewnić wiarygodność, zaleca się najpierw przetestowanie specjalnie wykonanych przeciwciał drugorzędowych przy użyciu kontroli, takich jak komórki w hodowli, przed zastosowaniem ich do próbek eksperymentalnych.

Ten zoptymalizowany protokół integruje oczyszczanie optyczne z immunoznakowaniem, aby ułatwić obrazowanie konfokalne organoidów siatkówki z całym wierzchowaniem. Zachowuje integralność strukturalną i umożliwia identyfikację kluczowych typów komórek siatkówki w organoidzie. W ten sposób protokół zapewnia naukowcom potężne narzędzie do badania dojrzewania organoidów siatkówki i organizacji przestrzennej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni Angelowi Sandovalowi, Ericowi Calatayudowi, Gustavo Castro-Olverze, Marcie Martin i Alinie Hirschmann (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) za ich wsparcie techniczne. Podmiotami finansującymi, które wsparły te prace, są: Fundació CELLEX; Fundació Mir-Puig; Program Ministerio de Economía y Competitividad - Severo Ochoa dla centrów doskonałości w dziedzinie badań i rozwoju (CEX2019-000910-S, [MCIN/AEI/10.13039/501100011033]); Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades - Agencia Estatal de Investigación (PID2021-122807OB-C31 i PID21-122807OB-C32); Instituto de Salud Carlos III (PI22/01747); Fundación La ONCE; Generalitat de Catalunya w ramach programu CERCA; Laserlab-Europe (EU-H2020 GA nr 871124); oraz Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Obiektyw 10x NA0.40 DRYKsięga LeicaHC PL APO CS2-
Obiektyw 63x NA1.40 OILKsięga LeicaHC PL APO CS2-
przeciwciało anty-GFPKsięga Abcamab13970 powiedział:-
Alkohol benzylowy (BA)Sigma Aldrich13162-
Benzoesan benzylu (BB)Sigma AldrichW213802-
Szalka Petriego ze szkła dolnegoMatTek powiedział:P35G-1.5-14-C-
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichA7030 (wersja angielska)-
Przeciwciało Chx10Sta Cruz BiotechSC-365519-
Kolumny filtracyjne żelowe Cytiva Illustra Nap-5, Sephadex G-25Sigma Aldrich17-0853-02-
DAPI (interfejs DAPI)Sigma AldrichZobacz materiał D9542-
DMSOSigma AldrichZobacz materiał D8418-
DRAQ5 powiedział:Rybak termiczny62251-
Barwnik (kwas karboksylowy, ester sukcynimidylowy)Invitrogen lub Abberior--
ImageJ/Fidżi NIH  Wersja 1.50i-
Odwrócony konfokalny laserowy mikroskop skaningowyMikrosystemy LeicaTCS SP8 STED 3X-FALCON-
Oprogramowanie do obróbki 3D LAS XMikrosystemy Leica--
mQ H2O--Ultraczysta woda z systemu oczyszczania wody Synergy
NaHCO3Acros Organics424270010-
Nieznakowane drugorzędowe IgGJackson Immunoresearch--
Niebieskie przeciwciało opsynyMilipore   AB5407 -
Przeciwciało opsyny RGMiliporyAB5745 -
Paraformaldehyd (PFA) 4%Termo naukowy J199943-K2-
Rozwiązanie PBSGibco (firma Gibco)18912-014-
Sondy do znakowania falloidynyRybak termiczny--
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco 10010023-
Przeciwciało RECOVMiliporyAB5585-I -
Przeciwciało RHO (RET-P1)Sigma AldrichO4886 -
Cytrynian sodu trójzasadowy dwuwodny Sigma AldrichZobacz materiał C8532-
Tryton X-100Sigma AldrichZobacz materiał T8787 TGL-
Przeciwciało TUJ1Covance MMS-435P -

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, Y. J., Jo, D. H. Retinal organoids from induced pluripotent stem cells of patients with inherited retinal diseases: A systematic review. Stem Cell Rev Rep. 21 (1), 167-197 (2025).
  2. Onyak, J. R., Vergara, M. N., Renna, J. M. Retinal organoid light responsivity: Current status and future opportunities. Trans Res. 250, 98-111 (2022).
  3. O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), dev189746(2020).
  4. Wahle, P., et al. Multimodal spatiotemporal phenotyping of human retinal organoid development. Nat Biotechnol. 41 (12), 1765-1775 (2023).
  5. Isla-Magrané, H., Veiga, A., García-Arumí, J., Duarri, A. Multiocular organoids from human induced pluripotent stem cells displayed retinal, corneal, and retinal pigment epithelium lineages. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 581(2021).
  6. Isla-Magrané, H., Zufiaurre-Seijo, M., García-Arumí, J., Duarri, A. All-trans retinoic acid modulates pigmentation, neuroretinal maturation, and corneal transparency in human multiocular organoids. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 376(2022).
  7. Avilov, S. V. Navigating across multi-dimensional space of tissue clearing parameters. Methods Appl Fluoresc. 9 (2), 022001(2021).
  8. Brenna, C., et al. Optical tissue clearing associated with 3D imaging: application in preclinical and clinical studies. Histochem Cell Biol. 157 (5), 497(2022).
  9. Bálint, Š, Verdeny Vilanova, I., Sandoval Álvarez, Á, Lakadamyali, M. Correlative live-cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (9), 3375-3380 (2013).
  10. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).
  11. Klingberg, A., et al. Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy. J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).
  12. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  13. Wang, Y., Zhang, D. -H., Zhang, J. -Y., Chen, N., Zhi, G. -Y. High-yield synthesis of bioactive ethyl cinnamate by enzymatic esterification of cinnamic acid. Food Chem. 190, 629-633 (2016).
  14. Schellinger, A. P., Carr, P. W. Solubility of buffers in aqueous-organic eluents for reversed-phase liquid chromatography. LCGC North America. 22 (6), 544(2004).
  15. Jiang, S. -M., et al. β-III-Tubulin: A reliable marker for retinal ganglion cell labeling in experimental models of glaucoma. Int J Ophthalmol. 8 (4), 643-652 (2015).
  16. Guo, J., Walss‐Bass, C., Ludueña, R. F. The β isotypes of tubulin in neuronal differentiation. Cytoskeleton. 67 (7), 431-441 (2010).
  17. Lee, S., et al. TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue. Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 453-459 (2005).
  18. Fernando, M., et al. Differentiation of brain and retinal organoids from confluent cultures of pluripotent stem cells connected by nerve-like axonal projections of optic origin. Stem Cell Rep. 17 (6), 1476-1492 (2022).
  19. Belecky-Adams, T., et al. Pax-6, Prox 1, and Chx10 homeobox gene expression correlates with phenotypic fate of retinal precursor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 38 (7), 1293-1303 (1997).
  20. Rowan, S., Cepko, C. L. Genetic analysis of the homeodomain transcription factor Chx10 in the retina using a novel multifunctional BAC transgenic mouse reporter. Dev Biol. 271 (2), 388-402 (2004).
  21. Andilla, J., et al. Imaging tissue-mimic with light sheet microscopy: A comparative guideline. Sci Rep. 7, 44939(2017).
  22. Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: A tutorial. Adv Opt Photonics. 10, 111(2018).
  23. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  24. Darche, M., et al. Light sheet fluorescence microscopy of cleared human eyes. Commun Biol. 6 (1), 1025(2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy siatk wkiobrazowanie ca ych preparat wutwardzanie optycznemikroskopia konfokalnaimmunoznakowaniewizualizacja kom rek 3Dludzkie pluripotencjalne kom rki macierzystetypy kom rek siatk wkiutwardzanie metod BABBmorfologia fotoreceptor w

Powiązane artykuły