Method Article

Transmisyjna mikroskopia elektronowa jako technika wizualizacji do analizy okołodobowej plastyczności synaptycznej w korze mięśniowej myszy

DOI:

10.3791/68385

⸱

August 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany protokół opisuje zastosowanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) do ilościowego określania zmian okołodobowych w korze myszy, koncentrując się głównie na liczbie synaps i morfologii kolców dendrytycznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie okołodobowej plastyczności synaptycznej wymaga trzymania myszy w różnych warunkach oświetleniowych (cykl światła/ciemności, LD 12:12 i stała ciemność, DD), zapewnienia dostępu do kół do jazdy i poświęcenia ich w czterech określonych punktach czasowych w ciągu 24 godzin - na początku i w środku dnia/subiektywnego dnia oraz na początku i w środku nocy/subiektywnej nocy. Mózgi są następnie odpowiednio mocowane do transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Kora beczkowa, ze swoją precyzyjną organizacją somatotopową, stanowi idealny model do takiej analizy. Aby uzyskać wymagany obszar mózgu, mózgi są nacinane stycznie za pomocą wibratomu, a następnie sekcje zawierające korę beczkowatą są wybierane i zatapiane w żywicy Polybed. Z przygotowanych bloków zawierających wybrane beczki wycinane są kolejne ultracienkie sekcje. Gęstość synaptyczną, pobudzającą i hamującą, analizuje się na podstawie mikrofotografii elektronowych przy użyciu metody dyssektora stereologicznego. Dodatkowo obrazy TEM są wykorzystywane do rekonstrukcji 3D kolców dendrytycznych. Zmiany w kształcie kolców dendrytycznych wskazują na przebudowę neuronów w ciągu dnia. Liczba synaps pobudzających osiąga szczyt podczas snu (w ciągu dnia) u myszy, podczas gdy synapsy hamujące osiągają szczyt w fazie aktywności (w środku nocy).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rytmy okołodobowe są generowane przez zegary okołodobowe w prawie wszystkich procesach zachodzących w organizmie. U zwierząt i ludzi wykryto je na poziomie molekularnym, komórkowym i całego organizmu, a także w ich zachowaniu. System okołodobowy organizmu składa się z głównego zegara okołodobowego (rozrusznika serca) i zegarów obwodowych. Wszystkie zegary okołodobowe generują oscylacje okołodobowe poprzez cykliczną ekspresję genów zegara, które są kontrolowane przez ich białka. Mechanizm molekularny zegara generuje rytmy okołodobowe z okresem ~1 dnia (dłuższym lub krótszym niż 24 godziny), ale w warunkach dzień/noc okres rytmów endogennych jest zsynchronizowany z 24 godzinami. W fizjologii układu nerwowego bezkręgowców i kręgowców wykryto wiele rytmów okołodobowych; Jednak niektóre badania wykazały, że są one również obecne w plastyczności synaptycznej i neuronalnej, czyli zmianach w liczbie i strukturze synaps i dendrytów 1,2,3,4.

Kora somatosensoryczna myszy stanowi doskonałe miejsce do badania plastyczności synaptycznej w ciągu dnia ze względu na dobrze zdefiniowaną organizację i bezpośrednie powiązanie z aktywnością lokomotoryczną zwierząt 5,6,7,8,9. W warstwie IV kory somatosensorycznej znajdują się wyraźne struktury nerwowe (beczki), które są bardzo zauważalne nawet w niezabarwionym mózgu10,11. Ich ułożenie odzwierciedla morfologię i organizację wąsów na pysku zwierzęcia, umożliwiając precyzyjne odwzorowanie bodźców sensorycznych. Duże beczki są zorganizowane w pięciu regularnych rzędach, z których każdy zawiera od czterech do siedmiu beczek. Rzędy beczek, które odpowiadają dużym wąsom, są oznaczone wielkimi literami od A do E i reprezentują wąsy ułożone od okolicy oczu w dół wzdłuż pyska. Każda beczka składa się z dwóch głównych obszarów: zagłębienia, środkowej części wypełnionej neuropilem oraz ściany zwanej bokiem, która jest zdominowana przez ciała komórek gwiaździstych. Beczki są oddzielone od siebie obszarami o mniejszej gęstości komórek, zwanymi przegrodami. Każda beczka odbiera impulsy z określonego wąsa znajdującego się po przeciwnej stronie pyska zwierzęcia10,12.

Podział na konkretne beczki, ustawione w regularnych rzędach, pozwala na szybką i łatwą identyfikację wybranego obszaru 10,13. Wybór beczek z rzędu B do analizy zmian okołodobowych opiera się na badaniach plastyczności zależnej od aktywności 14,15,16,17. Rząd B charakteryzuje się dobrze zdefiniowanymi granicami somatotopowymi i zawiera tylko cztery wyraźne duże beczki, co upraszcza jego lokalizację w próbkach. Ze względu na swoje centralne położenie, aktywność neuronalna rzędu B jest skorelowana z naturalnymi zachowaniami myszy, takimi jak eksploracja środowiska i aktywność lokomotoryczna. Do liczenia synaps na kolcach i trzonach dendrytycznych ważne jest, aby wybrać środkowe części beczek, w których ciała komórkowe są rzadkie 12,15,18.

Immunohistochemia w połączeniu z obrazowaniem w mikroskopii konfokalnej jest techniką, która odegrała kluczową rolę w wyjaśnieniu kluczowych mechanizmów plastyczności synaptycznej u myszy. Podczas gdy zastosowanie mikroskopii konfokalnej zapewnia obrazy o wysokiej rozdzielczości ze zmniejszoną fluorescencją tła i poprawą klarowności struktury komórkowej, cierpi z powodu fotobielenia i wymaga skomplikowanego przygotowania próbki, co może zmienić stan tkanek biologicznych. Poleganie na markerach fluorescencyjnych może ograniczyć rodzaje białek, które mogą być badane jednocześnie, ze względu na ich nakładanie się. Konfokalna mikroskopia immunofluorescencyjna zapewnia środki do znakowania określonych białek, ich poziomów ekspresji i lokalizacji związanych z aktywnością synaptyczną za pomocą przeciwciał do wykrywania docelowych antygenów w ustalonych odcinkach tkanki. Chociaż metoda ta oferuje specyficzność i elastyczność w badaniu różnych białek zaangażowanych w neuroprzekaźnictwo, jest ograniczona przez niezdolność do dostarczania danych w czasie rzeczywistym na temat procesów dynamicznych ze względu na związany z tym etap fiksacji. Niespójność w wiązaniu przeciwciał może również skutkować niewiarygodnymi wynikami 19,20,21.

Zastosowanie mikroskopii elektronowej zamiast metod immunofluorescencyjnych z mikroskopią świetlną pozwala na uzyskanie znacznie wyższej rozdzielczości i większej precyzji zarówno w doborze lokalizacji, jak i rozróżnieniu struktur neuronalnych. Sekcje mikroskopii elektronowej z transmisją szeregową (TEM) pomagają uwidocznić strukturę synaptyczną na poziomie ultrastrukturalnym i mają tę zaletę, że są wykorzystywane do badania tworzenia lub eliminacji synaps. TEM umożliwia naukowcom analizę właściwości fizycznych synaps oraz zmian w gęstości i strukturze, które nazywa się plastycznością synaps. Chociaż przygotowanie próbki i obrazowanie są pracochłonne, TEM zapewnia bardziej szczegółowe zrozumienie zmian, które zachodzą podczas uczenia się, tworzenia pamięci i przetwarzania informacji sensorycznych, a także w ciągu dnia, roku i wieku zwierząt.

Nasza metoda ma na celu zbadanie dobowej dynamiki gęstości synaptycznej i morfologii przy użyciu podejścia opartego na co najmniej czterech punktach czasowych w połączeniu z metodą dyssektora stereologicznego opartą na seryjnych obrazach TEM. Metoda dysektora stereologicznego pozwala na wiarygodne oszacowanie liczby synaps nawet przy użyciu tylko kilku ultracienkich odcinków szeregowych 22,23,24,25,26. Dobrze zdefiniowana organizacja somatotopowa kory beczkowatej zapewnia precyzyjną anatomiczną selekcję miejsc badania, natomiast szeregowy TEM pozwala na różnicowanie typów synaps (pobudzających i hamujących) oraz ich lokalizacji (na kolcach i trzonach dendrytycznych). Metoda ta stanowi cenne narzędzie dla naukowców badających neuroplastyczność dobową i okołodobową, umożliwiając zbadanie, w jaki sposób czynniki środowiskowe i wewnętrzne wpływają na dynamikę synaptyczną. Poszczególne składowe naszej metody umożliwiają jej zastosowanie do analizy zmian neuroplastyczności w znacznie szerszym zakresie badań, niekoniecznie ograniczających się do zmian okołodobowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury doświadczalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez odpowiednią instytucjonalną komisję etyczną i przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych, a także z przepisami krajowymi. Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie zwierząt i zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt.

1. Przygotowanie tkanek mózgowych

  1. Składaj ofiary myszom w czterech różnych punktach czasowych co 6 godzin w cyklu 24-godzinnym, zarówno w warunkach światła/ciemności (LD 12:12), jak i stałej ciemności (DD) (ryc. 1). W warunkach LD 12:12 należy odnieść się do czasu Zeitgeber (ZT), gdzie ZT0 odpowiada początkowi fazy światła, a ZT12 początkowi fazy ciemnej. W ciągłej ciemności należy odnieść się do czasu okołodobowego (CT), gdzie CT0 oznacza początek subiektywnego dnia, a CT12 oznacza początek subiektywnej nocy.
    UWAGA: Punkty czasowe to ZT0/CT0 (początek dnia, dzień subiektywny), ZT6/CT6 (środek dnia, dzień subiektywny), ZT12/CT12 (początek nocy, noc subiektywna) i ZT18/CT18 (środek nocy, subiektywna noc).
  2. Perfuzję i naprawę mózgów myszy za pomocą 2,5% aldehydu glutarowego i 2% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4).
  3. Usunąć każdy mózg z czaszki i pozostawić go w roztworze utrwalającym (2,5% aldehydu glutarowego i 2% paraformaldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym, pH 7,4) przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
  4. Aby przygotować mózg do sekcji, odetnij móżdżek i podziel mózg na dwie półkule (ryc. 2A,B).
  5. Wybierz jedną półkulę (prawą lub lewą) i ustaw ją tak, aby sekcje były przycięte stycznie do kory beczki. Zamontuj wybraną półkulę na uchwycie wibratomu i mocno ją przyklej (Rysunek 2C).
  6. Ciąć odcinki o grubości 60 μm (prędkość sekcji wibratomu: 7,10 i częstotliwość: 5,00) (rysunek 2D), a następnie przenieść skrawki do mieszaniny 0,1 M buforu fosforanowego i roztworu utrwalającego (stosunek 1:5).
  7. Zbadaj skrawki pod mikroskopem świetlnym z 4-krotnym powiększeniem i zbierz tylko te z widoczną korą pola beczkowatego do następnego kroku (ryc. 2E). Użyj wklęsłego suwaka, aby upewnić się, że sekcja pozostaje stale w cieczy.

2. Fiksacja i sekcja mózgu

  1. Za pomocą pędzla delikatnie przenieś chusteczki do małej szklanej szalki Petriego. Następnie płucz sekcje mózgu w 0,1 M buforze kakodylowym (BC, pH 7,4) przez 3 x 5 minut.
  2. Utrwalić skrawki w 1% tetratlenku osmu (OsO4) w 0,1 M BC za pomocą 1,5% żelazocyjanku potasu i pozostawić w temperaturze +4 °C na 1 godzinę.
    UWAGA: Roztwór OsO4 należy przygotować bezpośrednio przed użyciem, ponieważ OsO4 jest niestabilny, a jego aktywność zmniejsza się z czasem.
  3. Skrawki postfix w 1% OsO4 w roztworze 0,1 M BC przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Wszystkie te czynności należy wykonywać w rękawicach ochronnych i pod wyciągiem z dobrze działającą wentylacją, ponieważ OsO4 jest bardzo toksyczny.
    Odpady należy przechowywać w osobnej butelce ze szczelną nakrętką. Nie pozwól, aby produkt dostał się do kanalizacji.
  4. Po utrwaleniu płukać sekcje w wodzie destylowanej przez 2 x 5 min.
  5. W kolejnym kroku inkubuj skrawki mózgu przez 40 minut w roztworze 70% etanolu zawierającego 1% octanu uranylu. Po wymieszaniu należy użyć strzykawki z filtrem (25 mm) i powoli wlać 2 ml roztworu do każdej szalki Petriego z chusteczkami.
  6. Odwodnić tkanki w rosnących stężeniach alkoholu: 70%, 80% i 90% etanolu po 5 min oraz 100% etanolu po 3 x 5 min.
    UWAGA: Możliwe jest pozostawienie tkanek w 70% etanolu na noc w temperaturze +4 °C.
  7. Umyj chusteczki w tlenku propylenu 2 x 10 min.
    UWAGA: Tlenek propylenu jest silnie substancją chemiczną; Używaj go ostrożnie podczas noszenia rękawic ochronnych i pracy pod wyciągiem. Użycie szklanego pojemnika (szklanej szalki Petriego) ma kluczowe znaczenie dla tego etapu.
    Tlenek propylenu jest niezwykle łatwopalną cieczą i parą. Odpady należy przechowywać w oddzielnym, szczelnie zamkniętym szklanym pojemniku. Nie pozwól, aby produkt dostał się do kanalizacji; istnieje ryzyko wybuchu.
  8. Zastąp tlenek propylenu mieszaniną żywicy Polybed i tlenku propylenu (w stosunku 1:1). Wlej co najmniej 2 ml roztworu do każdej szalki Petriego z kawałkami, przykryj pokrywką i inkubuj przez 40 minut.
  9. Na koniec osadź sekcje mózgu w mieszaninie żywicy Polybed i tlenku propylenu (stosunek 3:1). Użyć co najmniej 2 ml mieszanki na szalkę Petriego, przykryć i pozostawić na 1,5 godziny.
    UWAGA: Upewnij się, że chusteczki są całkowicie zanurzone i upewnij się, że nie unoszą się nad płynem.
  10. Pokrój folię Aclar na kawałki pasujące do wielkości szkiełka podstawowego. Za pomocą plastikowej pipety nałóż niewielką ilość żywicy na folię Aclar i przenieś skrawki mózgu z szalki Petriego na żywicę za pomocą pędzla. Umieścić każdą sekcję między dwiema foliami Aclar i inkubować przez 48 godzin w piecu o temperaturze 65 °C w celu polimeryzacji.

3. Obrazowanie i cięcie kory beczkowej

  1. Sfotografuj wycinki mózgu przy 2-krotnym powiększeniu obiektywu za pomocą mikroskopu świetlnego (ryc. 2F).
  2. Zbierz wszystkie obrazy i zaimportuj je do programu graficznego.
    1. Aby otworzyć obrazy, kliknij Plik |Otwórz i zaznacz obrazy za pomocą punktu menu Shift |Otwarty. Obrazy otworzą się w osobnych oknach.
    2. Rozpocznij układanie obrazów od kory mózgowej (najmniejszego elementu) i kontynuuj, aż wszystkie sekcje zostaną prawidłowo wyrównane.
    3. Kliknij prawym przyciskiem myszy Warstwa 1 |Zduplikuj warstwę na każdym obrazie. W oknie dialogowym wprowadź numer obrazu jako nazwę, wybierz jeden obraz jako plik docelowy i kliknij przycisk OK. Powtórz te kroki dla wszystkich obrazów, duplikując je do tego samego pliku docelowego.
    4. Wyrównaj obrazy, aby zrekonstruować pole beczki, zapewniając odpowiednią kolejność anatomiczną. Użyj narzędzia Przesuń , aby ręcznie ustawić położenie każdej warstwy, a następnie kliknij polecenie Edycja |Przekształcanie |Narzędzie Obróć lub Odwróć , aby w razie potrzeby dostosować orientację. Aby dostosować wyrównanie, użyj punktu menu Edycja | Przekształcanie | Zniekształcaj i przesuwaj rogi obrazu, aby niezależnie dopasować je do struktur anatomicznych. Aby ułatwić wyrównanie, ustaw tryb mieszania górnej warstwy na Nakładka w panelu Warstwy .
    5. Porównaj anatomiczne punkty orientacyjne, takie jak kontury lufy i naczynia krwionośne, aby zapewnić prawidłowe ustawienie. Aby zapisać stos, kliknij Plik |Zapisz jako, nazwij plik i wybierz jego format (PSD lub TIFF); następnie kliknij przycisk OK.
  3. Przejrzyj kolejno wiele sekcji zawierających pole beczki, identyfikując widoczne beczki w każdej sekcji.
  4. Ręcznie obrysuj każdą widoczną lufę na dodatkowej wspólnej warstwie, zapewniając rekonstrukcję całego pola lufy. Aby utworzyć dodatkową warstwę, kliknij pozycję Warstwa |Nowość |Warstwa, nazwij warstwę i kliknij przycisk OK. Wybierz narzędzie Pędzel z paska narzędzi i na nowej warstwie ręcznie narysuj każdą widoczną beczkę.
    1. Aby uzyskać większą precyzję, użyj zoomu i dostosuj rozmiar pędzla zgodnie z potrzebami. Aby powiększyć lub pomniejszyć obraz, użyj narzędzia Lupka lub naciśnij Ctrl + "+" / Ctrl + "-". Aby zmienić rozmiar pędzla, kliknij prawym przyciskiem myszy płótno, gdy narzędzie Pędzel jest aktywne i przesuń suwak Rozmiar .
  5. Zidentyfikuj wybraną lufę na podstawie tej rekonstrukcji.
  6. Znajdź wybraną beczkę pod mikroskopem świetlnym na podstawie wzoru pola lufy (pięć rzędów, każdy z czterema do siedmiu lufami) i układu naczyń krwionośnych, które wskazują jej położenie w polu beczki.
  7. W każdej sekcji z widoczną korą beczki zidentyfikuj wybraną lufę pod mikroskopem stereoskopowym i wytnij ją wraz z sąsiednią za pomocą żyletki.
  8. Usuń mały kawałek z sekcji, przyklej go do bloku żywicy i odłóż do wyschnięcia. Później odetnij nadmiar żywicy otaczającej tkankę.
    UWAGA: Upewnij się, że kawałek chusteczki jest umieszczony płasko na powierzchni żywicy.
  9. Za pomocą ultramikrotomu i noża diamentowego wyciąć ultracienkie kolejne odcinki (3-6 odcinków o grubości 65 nm) (Rysunek 3A) i zebrać na pokrytych formvarem, jednoszczelinowych siatkach niklowych (2 x 0,75 mm).
  10. Po wyschnięciu próbki należy kontrastować z 2% octanem uranylu przez 3 minuty i 0,03% cytrynianem ołowiu przez 1,5 minuty.
    UWAGA: Dla kontrastu, ważne jest, aby umyć kratki kilka razy i pozostawić je do całkowitego wyschnięcia po każdym kroku. Używaj strzykawek z filtrami do octanu uranylu i cytrynianu ołowiu.
  11. Wykonuj kolejne zdjęcia z zagłębienia wybranej lufy (na przykład B2) pod TEM (napięcie przyspieszające 80 kV przy powiększeniach 4K lub 8K, w zależności od obszaru i objętości wymaganej do analizy.
    UWAGA: Zwykle analizuje się co najmniej całkowitą objętość 100μm3 na zwierzę.

4. Analiza obrazu

UWAGA: Tworzenie i wyrównywanie stosów obrazów TEM można wykonać w ten sam sposób zarówno za pomocą darmowego oprogramowania (takiego jak GIMP), jak i komercyjnego (np. Photoshop). Rekonstrukcje również mogą być wykonywane w ten sam sposób za pomocą zarówno komercyjnego oprogramowania (np. 3D Studio Max), jak i całkowicie darmowych programów, takich jak Blender.

  1. Aby oszacować gęstość synaps, należy umieścić w stosie co najmniej trzy obrazy TEM w oprogramowaniu graficznym (Rysunek 6). Im większa liczba obrazów seryjnych, tym większa dokładność obliczeń.
    1. Aby otworzyć obrazy, kliknij Plik |Otwórz i zaznacz obrazy za pomocą punktu menu Shift |Otwarty; Obrazy otworzą się w osobnych oknach.
    2. Dla każdego obrazu kliknij prawym przyciskiem myszy Warstwa 1 |Zduplikowana warstwa. W oknie dialogowym wprowadź numer obrazu jako nazwę, wybierz jeden obraz jako miejsce docelowe i kliknij przycisk OK. Powtórz te same kroki dla wszystkich obrazów i zduplikuj je w tym samym miejscu docelowym.
    3. Aby zapisać stos, kliknij Plik |Zapisz jako, nazwij plik, wybierz jego format (PSD lub TIFF) i kliknij przycisk OK.
  2. Aby wyrównać obrazy TEM, zaznacz górną warstwę obrazu i ustaw tryb mieszania na Nakładka w panelu Warstwy . Korzystanie z punktu menu Edycja |Przekształcanie |Obróć lub narzędzie Przerzuć , aby dostosować orientację obrazu. Użyj narzędzia Przesuń , aby wyrównać struktury.
    1. Aby uzyskać bardziej precyzyjne dopasowania, użyj punktu menu Edycja |Przekształcanie | Zniekształcanie w celu niezależnego przesuwania rogów obrazu. Aby zwiększyć precyzję, przytrzymaj Ctrl i przeciągnij poszczególne punkty narożne. Wykorzystaj zmiany wielkości i kształtu mitochondriów i aksonalnych osłonek mielinowych między kolejnymi obrazami TEM, aby zweryfikować prawidłową sekwencję obrazów.
  3. Użyj metody dyssektorowej do liczenia synaps.
    1. Dodaj warstwę do stosu obrazów EM, klikając Warstwa |Nowość |Warstwa |Dobrze. Upewnij się, że nowa warstwa jest przezroczysta (bez wypełnienia tła).
    2. Aby zdefiniować obszar analizy, kliknij punkt menu Warstwa |Nowość |Warstwa |Dobrze; następnie wybierz narzędzie Prostokąt , przejdź do Warstwa |Styl warstwy |Obrysuj, ustaw kolor obrysu, grubość (rozmiar) i położenie (zalecane wewnątrz), kliknij przycisk OK i narysuj prostokąt. Wybierz opcję Wypełnij: 0%. Zaznacz wszystkie synapsy obecne na obrazach TEM, które nie przecinają dwóch sąsiednich wybranych krawędzi prostokąta (np. prawej i dolnej lub górnej i lewej).
    3. Dodaj nową warstwę do adnotacji, klikając opcję Warstwa |Nowość |Warstwa |Dobrze. Użyj narzędzia Pędzel , aby oznaczyć synapsy na nowej warstwie. Użyj narzędzia Lupka i narzędzia Rączka do precyzyjnego oznaczania.
    4. Wybierz jeden kolor, aby oznaczyć synapsy pobudzające, a inny dla synaps hamujących. Aby zmienić kolor, kliknij pole koloru pierwszego planu na pasku narzędzi, wybierz kolor w oknie Próbnik kolorów i kliknij przycisk OK.
  4. Jeśli obrazy TEM zawierają duże struktury (np. mielinizowane włókna nerwowe, duże dendryty lub części ciała komórki), użyj siatki z wieloma kwadratami. Pozwala to na wykluczenie wszelkich kwadratów, które są w całości zajęte przez duże konstrukcje.
    1. Dodaj nową warstwę przezroczystą, klikając opcję Warstwa |Nowość |Warstwa |Dobrze. Włącz widok siatki , klikając Widok |Pokaż |Siatka i włącz przyciąganie do siatki, klikając pozycję Widok |Przyciągaj do |Siatka.
    2. Ustaw odstępy siatki, klikając Edytuj |Preferencje |Linie pomocnicze, siatka i plasterki. Wybierz narzędzie Linia , ustaw tryb na Kształt lub Piksele, ustaw grubość linii (np. 1 px) i narysuj pionowe i poziome linie wzdłuż widocznej siatki, aby pokryć cały obszar obrazu.
  5. Zdefiniuj sekcje "górną" i "dolną" dla każdego stosu obrazów. Policz tylko synapsy, które są nieobecne na ostatnim obrazie, ale są obecne na poprzednich obrazach. Pozwala to na dokładną identyfikację synaps bez przeszacowywania ich liczby.
  6. Użyj skali na obrazie i oblicz objętość próbki (stos obrazów TEM). Zmierz obszar, w którym zliczane są synapsy i pomnóż przez liczbę obrazów TEM w stosie i grubość ultracienkich odcinków.
  7. Podziel liczbę synaps przez objętość, aby określić gęstość synaps na jednostkę objętości.
  8. Użyj wszystkich obrazów TEM zawierających kolce dendrytyczne (zwykle 10-12 kolejnych mikrofotografii elektronowych), aby zrekonstruować kolce dendrytyczne i tworzące się w nim synapsy.
    1. Otwórz stos obrazów w oprogramowaniu graficznym. Wybierz narzędzie Kadrowanie , zaznacz obszar zawierający grzbiet dendrytyczny w stosie i naciśnij Enter. Wybrany obszar zostanie przycięty we wszystkich widocznych warstwach. Uwidocznij tylko jedną warstwę na raz, ukryj inne warstwy za pomocą ikony oka w panelu Warstwy .
    2. Zapisz każdy przycięty obraz osobno, klikając Plik |Zapisz jako, nazwij plik, wybierz format (zalecany JPG) i kliknij przycisk OK. Powtórz te czynności dla każdej warstwy w stosie.
      UWAGA: Przed przeniesieniem obrazów do oprogramowania do rekonstrukcji 3D najlepiej jest najpierw oznaczyć kolorami elementy, które są rekonstruowane.
    3. Dodaj nową warstwę do adnotacji, klikając Warstwa | Nowość |Warstwa | Dobrze.
    4. Ustaw krycie warstwy na 30-50% w panelu Warstwy .
    5. Wybierz narzędzie Pędzel , wybierz inny kolor dla każdej struktury (np. grzbiet dendrytyczny, synapsa) i zaznacz elementy. Pracuj tylko na nowej warstwie, aby zachować oryginalny obraz. Po zakończeniu scal warstwę adnotacji z obrazem, kliknij prawym przyciskiem myszy górną warstwę i scal w dół. Powtórz te kroki dla każdego obrazu TEM zawierającego przekrój poprzeczny grzbietu dendrytycznego.
  9. Przenieś obrazy TEM z widocznymi przekrojami grzbietu dendrytycznego do oprogramowania do rekonstrukcji 3D. Aby usunąć domyślny obiekt Cube, kliknij go prawym przyciskiem myszy i usuń. Aby wyrównać perspektywę rzutni przed przesłaniem obrazów, kliknij przycisk Z na metauchwytu nawigacyjnym lub naciśnij numeryczny 7. Aby przesłać obrazy, kliknij Dodaj |Obraz |Odniesienie, wybierz pierwszy obraz i kliknij go dwukrotnie, aby potwierdzić. Powtórz te czynności dla każdego obrazu, upewniając się, że perspektywa rzutni pozostaje spójna przez cały czas.1
    UWAGA: Aby obrócić widok, przytrzymaj środkowy przycisk myszy i poruszaj myszą lub użyj metauchwytu nawigacyjnego. Aby przesunąć widok, przytrzymaj Shift + środkowy przycisk myszy, przesuń mysz lub użyj polecenia Przesuń widok.
  10. Ułóż obrazy TEM w odpowiedniej odległości, biorąc pod uwagę grubość ultracienkich odcinków (Rysunek 4A). Aby ustawić ostatni obraz TEM wzdłuż osi Z, kliknij obraz, kliknij Właściwości obiektu (prawy pasek boczny) i wprowadź wartość w polu Lokalizacja Z. Obrazy mogą być teraz rozmieszczone między pierwszym a ostatnim obrazem. Aby je rozpowszechnić, zaznacz wszystkie obrazy, naciśnij N , aby otworzyć N-panel, i kliknij kartę Edytuj (w N-panelu) | Odległość Z.
    UWAGA: Przed dokonaniem jakichkolwiek zmian wyrównaj perspektywę rzutni i kliknij przycisk Z na metauchwytu nawigacji lub naciśnij numeryczny 7.
    Aby można było rozmieszczać obrazy, musi być włączone narzędzie Rozmieść . Aby go aktywować, przejdź do punktu menu Edycja | Preferencje | Pobierz rozszerzenia, wyszukaj "Dystrybuuj" i kliknij Zainstaluj. Po włączeniu narzędzie Dystrybucja pozostaje aktywne między sesjami i nie trzeba go ponownie aktywować, o ile używana jest ta sama wersja programu.
  11. Ręcznie obrysuj kształt grzbietu dendrytycznego na każdym obrazie, używając pojedynczej krzywej na obraz TEM (Rysunek 4B,C).
    1. Upewnij się, że widoczny jest tylko pierwszy obraz TEM. W kolekcji scen ukryj wszystkie inne obiekty za pomocą ikony oka . Aby utworzyć krzywą bazową dla konturu, kliknij przycisk Dodaj |Krzywa |Okrąg. Przesuń obiekt BézierCircle, przytrzymaj G, przesuń przycisk myszy i kliknij, aby zaakceptować zmiany.
    2. Aby dopasować rozmiar profilu grzbietu dendrytycznego, przeskaluj obiekt, przytrzymaj S, przesuń mysz i kliknij. Wejdź na zakładkę Modelowanie z zaznaczonym obiektem BézierCircle. Ponownie wyrównaj perspektywę rzutni i kliknij przycisk Z na metauchwytu nawigacji lub naciśnij Numpad 7.
    3. Aby dostosować kształt krzywej, zaznacz punkt kontrolny, przytrzymaj G, przesuń mysz i kliknij.
    4. Aby dostosować kierunek i siłę uchwytów, wybierz punkt uchwytu, naciśnij G , aby przesunąć lub S , aby przeskalować, i kliknij, aby potwierdzić. Powtórz te czynności dla każdego punktu.
    5. Aby dodać nowy punkt kontrolny, zaznacz dwa istniejące punkty kontrolne, przytrzymaj Shift i kliknij każdy punkt, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Podziel. Gdy krzywa wystarczająco odpowiada granicy profilu grzbietu dendrytycznego, wejdź w zakładkę Układ , kliknij prawym przyciskiem myszy na obiekcie BézierCircle i Zduplikuj obiekt, a następnie kliknij bez poruszania myszą. Utwórz taką samą liczbę kopii BézierCircle, jaką jest obrazów TEM używanych do rekonstrukcji. Wyrównaj je z ułożonymi obrazami TEM za pomocą narzędzia Rozmieść , jak w kroku 4.10.
    6. Dostosuj każdą krzywą BézierCircle na karcie Modelowanie , aby dopasować ją do profilu grzbietu dendrytycznego na każdym obrazie. Upewnij się, że w danym momencie widoczny jest tylko aktualnie edytowany obiekt BézierCircle i odpowiadający mu obraz TEM.
      UWAGA: Wszystkie operacje kliknięcia prawym przyciskiem myszy wymagane dla niektórych kroków muszą być wykonywane w granicach sceny. Kolejne krzywe muszą odpowiadać granicom kolejnych odcinków grzbietu dendrytycznego i zawierać taką samą liczbę punktów kontrolnych.
  12. Połącz sąsiednie linie za pomocą funkcji rekonstrukcji 3D, aby utworzyć ciągłą powierzchnię i utworzyć ostateczny kształt 3D (Rysunek 4D).
    1. Upewnij się, że widoczne są tylko obiekty BézierCircle. W kolekcji scen ukryj wszystkie inne obiekty za pomocą ikony oka na pasku bocznym.
    2. Aby utworzyć obiekt grzbietu dendrytycznego, przejdź do zakładki Układ , zaznacz wszystkie obiekty BézierCircle, kliknij prawym przyciskiem myszy i kliknij Połącz. Przekształć połączony obiekt w siatkę, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając polecenie Konwertuj na |Siatka.
    3. Aby połączyć krawędzie łączonego obiektu, należy wejść w zakładkę Modelowanie , nacisnąć 2 aby przejść do trybu Wybór krawędzi |Wybierz punkt menu |Wszystko |kliknij prawym przyciskiem myszy |Mostek krawędzi pętli.
    4. Aby wypełnić lukę w górnej części obiektu, odznacz wszystko, klikając obok obiektu, przytrzymaj Alt i kliknij jedną sekcję krawędzi górnej półki, kliknij prawym przyciskiem myszy, wybierz Wyciągnij krawędzie, przeciągnij w górę na osi Z, naciśnij S i przesuń mysz, aby zmniejszyć nową pętlę krawędzi, kliknij, aby zaakceptować zmianę. Podczas gdy nowa pętla krawędzi jest nadal wybrana, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Nowa powierzchnia z krawędzi. Wypełnij dolną szczelinę tą samą metodą.
    5. Aby wygładzić obiekt, wejdź na kartę Układ , kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję Wygładzanie cienia. Aby jeszcze bardziej wygładzić kształt, przejdź do Modyfikatory (prawy pasek boczny) |Dodaj modyfikator |Generuj |Powierzchnia podziału podziałowego. Ustaw poziomy Rzutnia i Renderowania na tę samą wartość (zalecana 1).
  13. Powtórz kroki 4.11-4.12 dla rekonstrukcji synaps (ryc. 4E,F).
  14. Przypisz kolor do każdej struktury i użyj funkcji renderowania, aby przygotować ostateczny obraz (Rysunek 4G,H). Przejdź do menu Cieniowanie rzutni i wybierz opcję Renderowane, aby wyświetlić podgląd zmian w materiale. Wybierz obiekt, który chcesz pokolorować, i kliknij Materiał (prawy pasek boczny) |Nowość |dostosuj kolor bazowy.
    1. Aby poprawić wygląd materiału, dostosuj suwaki Chropowatość lub Metaliczny zgodnie z potrzebami. Użyj tej metody, aby przypisać odrębny kolor do każdej struktury.
    2. Aby dostosować oświetlenie sceny, kliknij obiekt Światło, przytrzymaj G i przesuń mysz, aby zmienić jego położenie. Aby zmienić intensywność światła, przejdź do Dane (prawy pasek boczny) i dostosuj wartość Moc .
    3. Aby ustawić kamerę, ustaw rzutnię tak, aby była skierowana w stronę zrekonstruowanego grzbietu, tak jak powinien wyglądać na końcowym obrazie, naciśnij Ctrl + Alt + Numpad 0. Wybierz widoczną ramkę kamery, przytrzymaj G i przesuń mysz, aby w razie potrzeby zmienić jej położenie.
    4. Aby przygotować się do renderowania, przejdź do Wyjście (prawy pasek boczny), zmień wartości rozdzielczości X i Y , aby dopasować je do żądanego obrazu. Aby poprawić jakość obrazu, przejdź do Renderuj (prawy pasek boczny) |Renderuj, dostosuj wartość Samples do zakresu od 120 do 250. Aby uzyskać przezroczyste tło, przejdź do Renderuj |Filmy |zaznacz opcję Przezroczysty. Aby wyrenderować obraz, naciśnij F12 lub przejdź do opcji Renderuj (górne menu) |Renderuj obraz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby prawidłowo zastosować naszą metodę do analizy okołodobowych zmian synaptycznych, należy zacząć od wybrania co najmniej czterech punktów czasowych w równych odstępach czasu, po dwa punkty na każdą fazę aktywności zwierząt (co 6 godzin). W wyznaczonych punktach czasowych zwierzęta są składane w ofierze, a ich mózgi są zbierane. Takie podejście pozwala na identyfikację dziennych lub okołodobowych wzorców plastyczności synaptycznej i łączy je ze zmianami w aktywności lokomotorycznej zwierząt (ryc. 1<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy przedstawiono metodologię zastosowaną do badania plastyczności okołodobowej synaps oraz rekonstrukcji kolców dendrytycznych w korze beczkowatej myszy. Aby zapewnić wiarygodne wyniki, badanie plastyczności okołodobowej powinno obejmować co najmniej cztery punkty czasowe. Nasze badania wykazały, że dane z dwóch punktów czasowych – jednego w fazie odpoczynku (dzień) i jednego w fazie aktywności (noc) – dostarczyły informacji na temat dziennych różnic między fazami aktywności zwierząt w warunkach LD 12:12....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca jest finansowana z grantów Narodowego Centrum Nauki, NCN OPUS20 nr UMO-2020/39/B/NZ7/03366 dla EP oraz Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego, nr N41/DBS/001129 dla MJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Folia AclarAgar naukowyAGL4458
Oprogramowanie Blender Wersja: v. 2.91.2
Kwas kakodylowy, sól sodowa trójwodzianNauki polilogiczne01131-100
Zjeżdżalnia wklęsłaMenzel powiedział:9.161 151
Nóż diamentowy Diatom15-AmerykańskiKąt noża: Ultra 45°  
Aparat cyfrowy Nikon DXM 1200 F
Wodorofosforan di-sodowy dwunastowodnyPOCH799280115
Żywica do zatapianiaNauki polilogiczne08792-1Formuła Luft 
EtanolPol-AuraPA-11-0004
Oprogramowanie GIMPWersja: V 3.0.4
Cytrynian ołowiuTAAB (Biblioteka TAAB)L018
Mikroskopia świetlna Nikon Optymacyjna
Tetrtlenek osmu Nauki polilogiczneNumer katalogowy: 0223C-10krystaliczny (99.95%)
Pędzel
Oprogramowanie Photoshopwersja: CS5
Żelazocyjanek potasuSigmaaldrichZobacz materiał P8131 powiedział:
Tlenek propylenu Sigmaaldrich82320Puriss. p.a., ≥ 99,5% (GC)
Siatki z pojedynczymi szczelinamiAgar naukowyAGG25252 x 0,75 mm lub 2 x 1 mm
Chlorek sodu Chempur powiedział:117941206
Diwodorofosforan sodu dwuwodnyChempur powiedział:117991808
Mikroskop stereoskopowyPZO
Filtr strzykawkowy Firma BiosensBS25PES045
TEM JoelJEM-2100 powiedział:
UltramikrotomKsięga LeicaUC7 (wersja angielska)
Octan uranyluLachema (Księga)
WibratomizmKsięga LeicaVT1000 S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jasinska, M., Pyza, E. Circadian plasticity of mammalian inhibitory interneurons. Neural Plast. 2017, 1-12 (2017).
  2. Krzeptowski, W., Hess, G., Pyza, E. Circadian plasticity in the brain of insects and rodents. Front Neural Circuits. 12, 32(2018).
  3. Mansilla, A., et al. Molecular mechanisms that change synapse number. J Neurogenet. 32 (3), 155-170 (2018).
  4. Frank, M. G. Renormalizing synapses in sleep: the clock is ticking. Biochem Pharmacol. 191, 114533(2021).
  5. Jasinska, M., et al. Daily rhythm of synapse turnover in mouse somatosensory cortex. Acta Neurobiol Exp. 74 (1), 104-110 (2014).
  6. Jasinska, M., et al. Circadian rhythmicity of synapses in mouse somatosensory cortex. Eur J Neurosci. 42 (8), 2585-2594 (2015).
  7. Jasinska, M., et al. Circadian clock regulates the shape and content of dendritic spines in mouse barrel cortex. PLOS ONE. 14 (11), e0225394(2019).
  8. Jasinska, M., et al. Circadian changes of dendritic spine geometry in mouse barrel cortex. Front Neurosci. 14, 578881(2020).
  9. Jasinska, M., et al. Light-modulated circadian synaptic plasticity in the somatosensory cortex: link to locomotor activity. Int J Mol Sci. 25 (23), 12870(2024).
  10. Woolsey, T. A., Vander Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
  11. Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the Sml-face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
  12. Armstrong-James, M., Fox, K. Spatiotemporal convergence and divergence in the rat SI barrel cortex. J Comp Neurol. 263 (2), 265-281 (1987).
  13. Barrel cortex. Fox, K. , Cambridge University Press. (2008).
  14. Jasinska, M., et al. Rapid, learning-induced inhibitory synaptogenesis in murine barrel field. J Neurosci. 30 (3), 1176-1184 (2010).
  15. Knott, G. W., Quairiaux, C., Genoud, C., Welker, E. Formation of dendritic spines with GABAergic synapses induced by whisker stimulation in adult mice. Neuron. 34 (2), 265-273 (2002).
  16. Jasinska, M., et al. Effect of associative learning on memory spine formation in mouse barrel cortex. Neural Plast. 2016, 1-11 (2015).
  17. Jasinska, M., et al. Fear learning increases the number of polyribosomes associated with excitatory and inhibitory synapses in the barrel cortex. PLOS ONE. 8 (2), e54301(2013).
  18. White, E. L. Ultrastructure and synaptic contacts in barrels of mouse SI cortex. Brain Res. 105 (2), 229-251 (1976).
  19. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing whole-brain activity and development at the single-cell level using light-sheet microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
  20. Serrano, M. E., Kim, E., Petrinovic, M. M., Turkheimer, F., Cash, D. Imaging synaptic density: the next holy grail of neuroscience. Front Neurosci. 16, 796129(2022).
  21. Woelfle, S., et al. CLARITY increases sensitivity and specificity of fluorescence immunostaining in long-term archived human brain tissue. BMC Biol. 21 (1), 113(2023).
  22. Weibel, E. R. Stereological methods. Vol. 1: practical methods for biological morphometry. , Academic Press. London. (1979).
  23. Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134 (2), 127-136 (1984).
  24. Gundersen, H. J. G. Stereology of arbitrary particles. J Microsc. 143 (1), 3-45 (1986).
  25. Fiala, J. C., Harris, K. M. Cylindrical diameters method for calibrating section thickness in serial electron microscopy. J Microsc. 202 (3), 468-472 (2001).
  26. Napper, R. M. A. Total number is important: using the disector method in design-based stereology to understand the structure of the rodent brain. Front Neuroanat. 12, 16(2018).
  27. Perez-Cruz, C., Simon, M., Czéh, B., Flügge, G., Fuchs, E. Hemispheric differences in basilar dendrites and spines of pyramidal neurons in the rat prelimbic cortex: activity- and stress-induced changes. Eur J Neurosci. 29 (4), 738-747 (2009).
  28. Kasthuri, N., et al. Saturated reconstruction of a volume of neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  29. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nat Methods. 9 (12), 1198-1201 (2012).
  30. Videnovic, A., Zee, P. C. Consequences of circadian disruption on neurologic health. Sleep Med Clin. 10 (4), 469-480 (2015).
  31. Logan, R. W., McClung, C. A. Rhythms of life: circadian disruption and brain disorders across the lifespan. Nat Rev Neurosci. 20 (1), 49-65 (2018).
  32. Nassan, M., Videnovic, A. Circadian rhythms in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurol. 18 (1), 7-24 (2021).
  33. Shen, Y., et al. Circadian disruption and sleep disorders in neurodegeneration. Transl Neurodegener. 12 (1), 8(2023).
  34. Dufort-Gervais, J., Mongrain, V., Brouillette, J. Bidirectional relationships between sleep and amyloid-beta in the hippocampus. Neurobiol Learn Mem. 160, 108-117 (2019).
  35. Adler, P., et al. Aging disrupts the circadian patterns of protein expression in the murine hippocampus. Front Aging Neurosci. 11, 368(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transmission Electron MicroscopyCircadian Synaptic PlasticityBarrel CortexMouse BrainSynaptic DensityDendritic Spine ReconstructionExcitatory SynapsesInhibitory SynapsesStereological Dissector MethodTangential Brain Sectioning

Related Articles