Artykuł metodologiczny

Przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji i analizy powierzchni liści i apoplastycznego RNA przy użyciu rozet Arabidopsis

DOI:

10.3791/68406

⸱

8 sierpnia 2025

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Indiana University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy prostą, ale wysoce powtarzalną metodę izolowania zewnątrzkomórkowego RNA z powierzchni liści i apoplastu roślin Arabidopsis.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powierzchnia liści roślin i przestrzeń międzykomórkowa w liściach (apoplast) służą jako kluczowe interfejsy wymiany molekularnej między roślinami a oddziałującymi z nimi drobnoustrojami. W poprzednich pracach wykazaliśmy obecność różnorodnych gatunków RNA w apoplaście rozet Arabidopsis. Niedawno nasze odkrycia ujawniły, że rośliny Arabidopsis również aktywnie wydzielają RNA na powierzchni liści. Aby to zbadać, opracowaliśmy wysoce powtarzalną metodę zbierania zarówno płynu do mycia powierzchni liści (LSW), jak i apoplastycznego płynu myjącego (AWF) z tego samego zestawu roślin Arabidopsis. Dodatkowo zbadaliśmy nieinwazyjną technikę polegającą na wymazie z powierzchni liścia (LSS), która umożliwiła nam pobranie RNA poprzez delikatne przetarcie powierzchni liścia sterylnymi patyczkami z bawełnianą końcówką. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego, przefiltrowaliśmy frakcje LSW, AWF i LSS przed wyizolowaniem zewnątrzkomórkowego RNA (exRNA). Po przeanalizowaniu oczyszczonego exRNA za pomocą elektroforezy żelowej denaturacji RNA, zaobserwowaliśmy różnorodny szereg długich i małych gatunków RNA w próbkach LSW, LSS i AWF RNA. Dalsza kwantyfikacja i analiza porównawcza między próbkami exRNA a warunkami eksperymentalnymi przeprowadzono przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ. Protokół ten zapewnia wydajne, opłacalne podejście do izolowania i analizowania niewielkich ilości exRNA z liści roślin. Te preparaty RNA można dalej scharakteryzować za pomocą sekwencjonowania i innych analiz molekularnych, oferując wgląd w dynamiczne role exRNA w interakcjach roślina-mikroorganizm.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liście są kolonizowane przez różne drobnoustroje, w tym bakterie, grzyby, lęgniowce i protisty, które mogą pomóc chronić rośliny przed biotycznymi i abiotycznymi stresorami, ostatecznie promując wzrost i rozwój roślin 1,2,3,4. Liść rośliny ma dwa główne przedziały, w których znajdują się oddziałujące na siebie drobnoustroje: epifityczne (powierzchnia liścia) i endofityczne (apoplast)2. Powierzchnia liścia jest chroniona hydrofobową warstwą naskórka, która zapobiega utracie wody i zawiera składniki takie jak wosk i kutyna. Górna (adaksjalna) powierzchnia liścia często zawiera wyspecjalizowane komórki naskórka przypominające włosy, zwane włoskami, zwane trichomami, które chronią przed światłem UV, regulują temperaturę i służą jako środki odstraszające roślinożerność. W przeciwieństwie do tego, apoplast ułatwia wymianę gazu i wody do fotosyntezy i zapewnia wilgotne środowisko sprzyjające kolonizacji mikrobiologicznej5. Pomimo tych różnic oba przedziały liści faworyzują niektóre drobnoustroje, przy czym epifityczne sieci mikrobiologiczne są bardziej złożone pod względem różnorodności w porównaniu z endofitycznymi sieciami mikrobiologicznymi5. Sposób, w jaki skład tych społeczności mikrobiologicznych jest regulowany w każdym kompartmencie zewnątrzkomórkowym, pozostaje słabo poznany. Spekulujemy, że struktura społeczności drobnoustrojów może być częściowo determinowana przez zewnątrzkomórkowy RNA (exRNA) wydzielany przez roślinę żywicielską.

W naszym ostatnim badaniu opisaliśmy obecność różnych gatunków RNA na powierzchni liści, które różnią się od RNA w apoplastach lub lizatach komórkowych6. Podczas gdy większość badań nad exRNA w roślinach koncentrowała się na małych niekodujących RNA, takich jak mikroRNA (miRNA) i małe interferujące RNA (siRNA), mniej uwagi poświęcono innym gatunkom RNA, takim jak fragmenty pochodzące z rRNA i tRNA, które mogą potencjalnie regulować procesy komórkowe niezależnie od komplementarności sekwencji, szczególnie u gatunków pozbawionych mechanizmów interferencji RNA 7,8. Rozdział 9.

Opisana przez nas metoda umożliwia sekwencyjną izolację RNA zarówno z płukania powierzchni liści (LSW), jak i z apoplastycznego płynu myjącego (AWF) przy użyciu tego samego zestawu roślin Arabidopsis. Dodatkowo opisujemy nieinwazyjną technikę ortogonalną polegającą na wymazie z powierzchni liścia (LSS), która umożliwia pobranie RNA poprzez delikatne przetarcie spryskanej powierzchni liścia sterylnymi patyczkami z bawełnianą końcówką6. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego, przed wyizolowaniem zewnątrzkomórkowego RNA filtrujemy zarówno frakcję LSW, jak i AWF. Aby ocenić ilość i rozkład wielkości próbek exRNA, opisano protokół wykorzystujący elektroforezę w żelu poliakrylamidowym połączoną z analizą obrazu za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania ImageJ. Protokół ten zapewnia wydajne i opłacalne podejście do izolowania i analizowania niewielkich ilości exRNA. Te preparaty RNA można dalej scharakteryzować za pomocą sekwencjonowania i analiz molekularnych, oferując wgląd w dynamiczne role zewnątrzkomórkowego RNA w interakcjach roślina-drobnoustroje.

Opisany poniżej protokół różni się od wcześniej opisanego protokołu izolowania RNA z pęcherzyków zewnątrzkomórkowych roślin10. Obecny protokół nie wymaga żadnych etapów ultrawirowania i umożliwia izolację RNA z całkowitego zewnątrzkomórkowego płynu płuczkowego, a nie tylko z pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Co najważniejsze, zapewnia dwie ortogonalne metody izolowania RNA z powierzchni liścia. O ile nam wiadomo, izolacja RNA z powierzchni liści nie została opisana przed naszą niedawną publikacją6.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie buforu i sterylizacja

  1. Przygotować bufor do izolacji pęcherzyków (VIB) składający się z 20 mM kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES), pH 6,0, 2 mM CaCl2 i 0,01 M NaCl w 1 l wody destylowanej.
    UWAGA: Dokonano niewielkich korekt stężenia NaCl w VIB z 0,1 M do 0,01 M, aby naśladować stężenie jonów apoplastu liści.
  2. Autoklawować VIB przez 20 minut w temperaturze 121 °C, cykl cieczowy. Alternatywnie, przefiltruj i wysterylizuj VIB za pomocą filtra próżniowego 0,45 μm.
    UWAGA: Ten krok ma na celu upewnienie się, że bufor jest sterylny, ponieważ każde zanieczyszczenie mikrobiologiczne może prowadzić do wywołania roślin, a co za tym idzie, zmienności wyników. Bufor ten może być przechowywany w temperaturze pokojowej (bez otwierania pokrywy po sterylizacji) w celu krótkotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C w przypadku długotrwałego przechowywania.

2. Materiał roślinny i warunki wzrostu

  1. Wysiewaj nasiona Arabidopsis thaliana Col-0 typu dzikiego (WT) w 4-calowych okrągłych plastikowych doniczkach zawierających standardową mieszankę doniczkową. Po wysianiu namocz nasiona biologicznym fungicydem (600 mg/l), przykryj je przezroczystą plastikową kopułą i trzymaj w temperaturze 4 °C w ciemności przez 3 dni, aby wywołać synchroniczne kiełkowanie.
  2. Przenieś doniczki z nasionami do komory wzrostu dnia krótkotrwałego o kontrolowanej temperaturze, ustawionej na 24 °C w świetle 9 godzin, w ciemnym fotoperiodze przez 9 godzin, z gęstością strumienia fotonów fotosyntetycznych 150 μmol·m−2·s−1 na poziomie rośliny (50:50 mieszanka 3500 i 32-watowych żarówek fluorescencyjnych o widmie 3,500 i 5,000 K).
  3. Po około 10 dniach przenieś pojedyncze sadzonki do 36-komorowych wkładów tacowych zawierających mieszankę doniczkową i przykryj przezroczystą plastikową kopułą na 1-2 tygodnie.
    UWAGA: Typowy eksperyment wymaga ~12-24 zdrowych roślin dla każdego genotypu/zabiegu. Zauważono, że rośliny w wieku 6-7 tygodni dają optymalną ilość RNA LSW i AWF przy najmniejszym ryzyku zanieczyszczenia komórek.
  4. W zależności od użytej mieszanki doniczkowej podlewaj rośliny co 10-15 dni, aby uniknąć suszy lub stresu powodziowego.

3. Pobieranie RNA na powierzchni liścia

  1. Metoda oparta na wirowaniu (mycie powierzchni liści; LSW)
    1. Do każdej repliki użyj 6-7-tygodniowych roślin Arabidopsis.
    2. Dodać Silwet-L77 (odtąd nazywany środkiem zwilżającym) do sterylnego VIB w końcowym stężeniu 0,001% (1 μL w 100 ml VIB) przed rozpoczęciem izolacji LSW.
      UWAGA: Silwet-L77 jest środkiem zwilżającym, który zmniejsza napięcie powierzchniowe i umożliwia buforowi pokrycie powierzchni liści.
    3. Przenieś 100 ml VIB do butelki z rozpylaczem o pojemności 500 ml.
    4. Ostrożnie oderwij rozety Arabidopsis od ich korzeni za pomocą cienkich nożyczek.
    5. Usuń nadmiar ziemi z ogonka liściowego za pomocą miękkiej szczotki.
    6. Umieść rozety na płaskiej tacy, powierzchnią osiową skierowaną do góry.
    7. Spryskaj powierzchnię abaxialną środkiem zwilżającym VIB + za pomocą pięciu pompek butelki z rozpylaczem.
    8. Ostrożnie odwróć rozety i spryskaj powierzchnię adaksjalną pięciokrotnie środkiem zwilżającym VIB+.
    9. Aby odzyskać LSW, ostrożnie umieść spryskane rozety w bezigłowych strzykawkach o pojemności 60 ml z otworami na dole (maksymalnie dwie 6-tygodniowe rozety mogą zmieścić się w jednej strzykawce) umieszczonych w butelkach wirówkowych o pojemności 250 ml. Owinąć strzykawkę parafilmem wokół szyi, aby zawiesić końcówkę strzykawki nad dnem butelki (patrz rysunek 1 w celach informacyjnych).
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat przygotowania strzykawek 60 ml z otworami znajdują się w poprzednio opublikowanym protokole11.
    10. Odwirować załadowane butelki o masie 100 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C (wirnik JA-14).
    11. Przefiltrować LSW przez filtr strzykawkowy 0,22 μm i zebrać filtrat w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml umieszczonej na lodzie.
      UWAGA: Zazwyczaj 12 roślin daje około 30 ml LSW na końcu przy użyciu tego protokołu. Jest to jednak tylko szacunek oparty na liczbie oprysków wykonanych na każdym etapie. Objętość ta jest zwykle mniejsza niż objętość rozpylona, ponieważ część rozpylonego buforu jest tracona podczas przenoszenia.
  2. Metoda wymazu z powierzchni liści (LSS)
    1. Spryskaj oderwane rozety środkiem zwilżającym VIB +, jak opisano w poprzednim rozdziale (kroki 3.1.1-3.1.7).
    2. Aby odzyskać LSS, przetrzyj powierzchnię przyosiową i adoksjalną za pomocą sterylnych patyczków z bawełnianą końcówką i dociśnij nasączone końcówki do wewnętrznej ścianki probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, aby wycisnąć płyn.
      UWAGA: Próbki LSS adaksjalne i abaksjalne można zbierać w oddzielnych probówkach w zależności od konfiguracji eksperymentalnej i oczekiwanego wyniku.
    3. Przefiltrować próbki LSS przez filtr strzykawkowy 0,22 μm do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml umieszczonej na lodzie.
      UWAGA: W zależności od liczby pobranych wymazów z roślin, w jednym eksperymencie można zebrać różne objętości LSS.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Narzędzia używane do mycia powierzchni liści i izolacji apoplastycznego płynu myjącego. (A) Aby zebrać LSW i AWF, dwie całe rozety Arabidopsis thaliana umieszcza się w strzykawce o pojemności 60 ml z ośmioma dodatkowymi otworami, które są topione na końcu strzykawki za pomocą podgrzewanych kleszczy, aby utworzyć kanały, przez które przepływa płyn. (B) Ta bezigłowa strzykawka jest następnie owijana parafilmem w okolicy szyi, jak pokazano. (C) Ten etap pozwala na zmieszczenie strzykawki w butelce wirówkowej o pojemności 250 ml bez dotykania dna butelki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Zbieranie apoplastycznego płynu myjącego (AWF)

  1. Umieść ten sam zestaw roślin, które są używane do izolacji LSW lub LSS, w zlewce i delikatnie spłucz je dwukrotnie wodą destylowaną.
  2. Infiltrować próżniowo rozety za pomocą VIB przez 20 s w następujący sposób:
    UWAGA: Chociaż proces infiltracji próżniowej jest dobrze opisany w poprzednio opublikowanym protokole11, został on tutaj odtworzony, aby uczynić obecny protokół jasnym.
    1. Ostrożnie umieść rozety w ekspresie do kawy French Press z 300-500 ml VIB. Umieść pokrywkę na prasie francuskiej i delikatnie opuść tłok, aż rośliny zostaną całkowicie zanurzone.
    2. Umieść prasę francuską z roślinami i buforem w komorze próżniowej. Zastosuj próżnię przez 20 sekund za pomocą pompy próżniowej. Bufor powinien po prostu zacząć wrzeć.
    3. Zwolnij próżnię i wyjmij prasę francuską z komory próżniowej, zdejmij pokrywę i wlej VIB do osobnej plastikowej zlewki o pojemności 500 ml. Usuń rozety z prasy francuskiej.
      UWAGA: VIB może być ponownie użyty wiele razy tego samego dnia dla jednego genotypu, ale po użyciu do infiltracji próżniowej VIB nie powinien być przechowywany do użycia w innym dniu.
    4. Usuń nadmiar VIB z roślin, delikatnie potrząsając, a następnie przesuwając liście po ręczniku papierowym.
  3. Nadmiar bufora usunąć z powierzchni liści poprzez delikatne osuszenie bibułą.
  4. Aby zebrać apoplastyczny płyn płuczący (AWF), należy umieścić rozety w strzykawkach bezigłowych o pojemności 60 ml umieszczonych w butelkach wirówkowych o pojemności 250 ml zgodnie z opisem dla zbioru LSW i odwirować w temperaturze 4 °C przez 30 minut przy 600 × g z powolnym przyspieszeniem.
  5. Przefiltrować połączony AWF przez filtr strzykawkowy 0,22 μm i zebrać filtrat w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml umieszczonej na lodzie.
    UWAGA: Zazwyczaj 12 roślin daje około 6 ml AWF na końcu przy użyciu tego protokołu. Przefiltrowane LSW, AWF i LSS mogą być używane natychmiast lub przechowywane w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
  6. Zanotować świeżą masę (FW) roślin użytych do każdej kontrpróby po izolacji AWF. Następnie użyj tego odczytu, aby znormalizować ilość RNA w każdej próbce (ryc. 2).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schematyczne ilustracje protokołu i metody wymazu z powierzchni liścia. (A) Schematyczne ilustracje protokołu krokowego izolacji płukania powierzchni liści i apoplastycznego płynu myjącego za pomocą rozet Arabidopsis. (B) Schematyczna ilustracja metody wymazu z powierzchni liścia (LSS) do izolowania RNA z powierzchni liścia. Rysunki zaczerpnięte z rys. S1 i rys. S4 Borniego i in., 2025r. 6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Wytrącanie RNA

  1. Wytrącić RNA, mieszając wymaganą objętość AWF, LSW lub LSS z 0,1 objętością 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 1,0 objętością zimnego izopropanolu w 15 ml probówce wirówkowej.
  2. Dodać glikogen (zapas 20 mg/ml) do końcowego stężenia 20 μg/ml.
    UWAGA: Upewnij się, że probówki wirówkowe używane do wytrącania RNA mogą być odwirowywane z dużą prędkością 13 000 × g. Pęknięcie probówek na tym etapie może prowadzić do utraty próbek RNA.
  3. Inkubować mieszaninę w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc.
  4. Odwirować probówki o masie 13 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C (wirnik JA-25,50).
  5. Umyj granulkę dwukrotnie lodowatym 70% EtOH i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu nie dłużej niż 10 minut.
  6. Ponownie zawiesić granulki w 100 μl ultraczystej wody wolnej od DNaz/RNaz lub VIB i przenieść RNA do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Po tym etapie wytrącone RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 2 tygodni.

6. Izolacja RNA na bazie TRIzolu

  1. Dodaj 1 ml odczynnika TRIzol do każdej probówki i wymieszaj, potrząsając na rotatorze.
    UWAGA: Do obchodzenia się z TRIzolem należy używać go w dygestorium, nosić rękawice i okulary ochronne.
  2. Umieść rurki na rotatorze stołowym na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Dodać 200 μl chloroformu do każdej probówki, a następnie wykonać krótki, ale energiczny etap wirowania.
    UWAGA: Do obchodzenia się z chloroformem należy go używać w dygestorium, nosić rękawice i okulary ochronne.
  4. Pozostawić probówki w temperaturze pokojowej na około 3 minuty, a następnie odwirować w temperaturze 13 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Przenieść fazę wodną do znakowanych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i dodać 10 μg glikogenu wolnego od RNaz i jedną objętość zimnego izopropanolu.
    UWAGA: W przypadku wytwarzanych odpadów niebezpiecznych biologicznie (takich jak odpady fenolowe) rozpuszczalniki organiczne należy zbierać w wyznaczonych pojemnikach na odpady zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
  6. Inkubować probówki nie dłużej niż 1 godzinę w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Wytrącanie RNA przez ponad 1 godzinę na tym etapie zmniejsza skuteczność izolacji RNA i prowadzi do bardzo niskiego stężenia RNA.
  7. Aby uzyskać granulowanie RNA, należy odwirować probówki o masie 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Umyj granulki RNA dwukrotnie za pomocą lodowatego 70% EtOH i pozwól im wyschnąć na powietrzu przed ponownym zamieszaniem w 10-20 μl ultraczystej wody wolnej od DNaz / RNaz.
  9. Zawieszony RNA należy przechowywać odpowiednio w temperaturze -20 °C lub -80 °C w celu krótko- lub długoterminowego przechowywania.

7. Usuwanie zanieczyszczeń fenolem lub guanidyną

  1. Aby usunąć zanieczyszczenie fenolem lub guanidyną z próbek RNA, należy wykonać jedno lub dwa seryjne wytrącanie z 96% EtOH i octanem amonu.
  2. Dodać 1 μg glikogenu do 10 μl próbek RNA i wymieszać z 0,5 objętości 7,5 M octanu amonu przed dodaniem 2,5 objętości 96-100% EtOH.
    UWAGA: Na tym etapie końcowe stężenie EtOH powinno wynosić 70-75% w całej objętości.
  3. Inkubować mieszaninę w temperaturze -80 °C przez 30 minut i odwirowywać w temperaturze 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Przemyć osad RNA dwukrotnie 70% EtOH i ponownie zawiesić w 10 μl ultraczystej wody wolnej od DNaz/RNaz.

8. Elektroforeza w żelu RNA do oznaczania ilościowego i porównania

  1. Przygotuj mini żel (7,2 cm x 8,6 cm x 0,75 mm) zawierający 10% lub 15% poliakrylamidu i 7 M mocznika w 1x Kwas Tris-Borowy EDTA (TBE, pH 8,4) przy użyciu 40% roztworu akrylamidu/bis, 37,5:1. Alternatywnie, komercyjny miniżel denaturujący (15% żel TBE-Mocznik) może być użyty do przeprowadzenia próbek RNA.
  2. Wymieszać próbki RNA (1:1) z 2x denaturującym buforem ładującym (95% formamidu, 10 mM EDTA, 0,02% SDS, 0,02% błękitu bromofenolowego i 0,01% cyjanolu ksylenowego), denaturować w temperaturze 65 °C przez 5 minut i natychmiast umieścić na lodzie.
  3. Roztwory RNA należy rozpuścić w buforze o mocy 0,5 raza TBE przy napięciu atmosferycznym 220 V przez około 1 godzinę i 15 minut.
  4. W przypadku wzorców rozmiaru należy użyć mieszanki 1:1 markerów drabinkowych ssRNA niskiego zakresu i 14-30 nt ssRNA.
  5. Zabarwić żel 1x złotym barwnikiem żelowym z kwasem nukleinowym SYBR w 0,5x TBE przez 10 minut, przemyć dwukrotnie wodą destylowaną i zobrazować za pomocą systemu obrazowania (ryc. 3).
  6. Aby określić ilościowo RNA rozpuszczony na każdym pasie, należy użyć metody analizy żelu opisanej w dokumentacji ImageJ pod nagłówkiem "Analiza żelu": https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
  7. Ponieważ 100 ng / μL CL RNA jest ładowane za każdym razem, aby porównać wzór prążkowania między próbkami CL i exRNA, oszacuj stężenie próbek exRNA w stosunku do CL RNA (ryc. 4).

figure-protocol-3
Ryc. 3: Liście roślin są pokryte różnorodnym RNA. 100 ng RNA z lizatu komórek liści (CL) i 2 μl RNA wyizolowanego z AWF i LSW oddzielono na 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym i wybarwiono barwnikiem kwasem nukleinowym SYBR Gold w celu wizualizacji i porównania wzorów prążków RNA. Wzorce wielkości RNA są pokazane na skrajnym lewym pasie. Pomiary densytometryczne uzyskane za pomocą analizy żelowej ImageJ są wskazane na dole każdego pasa i wskazują ilość RNA w stosunku do RNA w całkowitym pasie lizatu komórek liścia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Wielokrotna ekstrakcja RNA LSW. LSW po raz pierwszy wyizolowano przy użyciu VIB bez Silwet L-77 lub różnych stężeń Silwet L-77 (0,001% lub 0,01%). Wielokrotna izolacja LSW przy użyciu tego samego zestawu roślin Arabidopsis może być zastosowana do wzbogacenia RNA LSW przy użyciu VIB + Silwet L-77 (0,001%). L1, L2 i L3 oznaczają próbki RNA wyizolowane za pomocą LSW zebrane przez trzy kolejne rundy wirowania po oprysku tego samego zestawu roślin. Zwiększenie stężenia środka zwilżającego z 0,001% do 0,01% nie poprawiło izolacji RNA LSW. Pomiary densytometryczne uzyskane za pomocą analizy żelowej ImageJ są wskazane na dole każdego pasa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

9. Alternatywna metoda ilościowego oznaczania RNA metodą opartą na płytkach do mikromiareczkowania

  1. Przygotuj wzorcowe roztwory RNA przy użyciu CL RNA w ultraczystej wodzie wolnej od RNaz / DNaz. Określić odpowiedni zakres stężeń dla wzorców w oparciu o przewidywane stężenie próbek. Stosować następujące stężenia RNA: 0, 6,75, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/μl i przygotować wystarczającą objętość każdego wzorca, aby umożliwić przeprowadzenie dwóch kontrprób technicznych.
  2. Przygotować 1,5x SYBR Gold barwnik żelowy z kwasem nukleinowym w 500 mM Tris HCl pH = 8.
    UWAGA: SYBR Gold jest zależny od pH i ma optymalną czułość barwienia w zakresie pH = 7,0 do 8,0.
  3. Konfiguracja mikropłytek:
    1. Dodać 99 μl dH2O do każdego dołka.
    2. Dodaj 1 μl RNA do każdej studzienki. Użyj 1 μl zarówno dla próbek RNA, jak i wzorców RNA.
    3. Dodaj 50 μl 1,5x SYBR Gold do każdego dołka.
  4. Ustaw parametry czytnika mikropłytek w następujący sposób:
    Wstrząs -liniowy lub orbitalny: 0:03 (MM:SS)
    Odczyt - Punkt końcowy fluorescencji z długością fali wzbudzenia ustawioną na 496 nm i długością fali emisji ustawioną na 540 nm.
  5. Zbuduj linię kalibracyjną, korzystając z wartości wzorców. Korzystając z równania linii kalibracyjnej, oblicz stężenia RNA w próbkach.
    UWAGA: Alternatywne barwniki mogą być stosowane do ilościowego oznaczania RNA w próbkach izolowanych za pomocą trizolu. Podobne wyniki uzyskano z odczynnikiem do oznaczania ilościowego RNA Ribo488. Firma dostarcza szczegółową instrukcję dla tego barwnika. Krótko rozcieńczyć barwnik 1000x (1 do 1000) za pomocą 200 mM Tris pH = 8. Następnie, aby dokonać pomiarów, dodać 99 μl autoklawizowanego dH2O do każdej studzienki + 1 μl RNA (próbki lub wzorca) + 100 μl rozcieńczenia Ribo488, inkubować 5 minut i określić ilościowo fluorescencję za pomocą czytnika płytek przy użyciu wzbudzenia 480 nm i emisji 520 nm. Standardowe krzywe uzyskane przy użyciu dwóch barwników RNA pokazano na rysunku 5.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Krzywe standardowe uzyskane przy użyciu metody kwantyfikacji RNA opartej na płytkach mikromiareczkowych. Dwa różne barwniki RNA, SYBR Gold (po lewej) i Ribo488 (po prawej) dają spójne wyniki z dwiema kontrpróbami technicznymi na próbkę. Każda metoda może być użyta do przeprowadzenia kwantyfikacji RNA. Jednak krzywą wzorcową należy uzyskać za każdym razem, gdy konieczne jest ilościowe oznaczenie RNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczny przegląd opisanego powyżej protokołu krokowego izolowania płukania powierzchni liści (LSW) i apoplastycznych frakcji płuczących (AWF) z roślin Arabidopsis przedstawiono na rysunku 2A. Metoda ta pozwala na ekstrakcję zarówno LSW, jak i AWF z zaledwie trzech do sześciu roślin na replikę, przy jednoczesnym konsekwentnym uzyskiwaniu równoważnych ilości RNA z obu frakcji. Do pomiaru stężenia RNA w lizatach komórkowych wykorzystujemy spektrofotometrię NanoDrop. Jednak w przypadku próbek RNA pochodzących z LSW, LSS i AWF polegamy na densytometrycznej kwantyfikacji żeli poliakrylamidowych barwionych złotem SYBR. Ten etap kwantyfikacji jest konieczny, ponieważ frakcje zewnątrzkomórkowe zawierają nieznane zanieczyszczenie - prawdopodobnie polisacharydy - które czasami mogą się oczyszczać i zakłócać metody kwantyfikacji RNA oparte na absorbancji, prowadząc do przeszacowania stężenia RNA. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, planujemy wykorzystać w naszych przyszłych pracach metody oczyszczania RNA nieoparte na fenolach.

Analiza żelu denaturacyjnego RNA ujawniła obecność szerokiego zakresu gatunków RNA w LSW i AWF, w tym zarówno długich, jak i małych RNA (Figura 3). Warto zauważyć, że równoważne ilości RNA udało się wyizolować zarówno z powierzchni liści, jak i frakcji apoplastycznej, przy czym ilości RNA zostały znormalizowane na świeżą masę rośliny (FW). Co zaskakujące, profile wielkości RNA frakcji LSW i AWF znacznie różniły się od siebie oraz od profilu RNA całkowitego lizatu komórkowego (CL). Różnice te sugerują, że frakcje exRNA nie są zanieczyszczone komórkowym RNA. Spośród tych trzech frakcji, apoplastyczny RNA (AWF) wykazywał największą różnorodność w rozkładzie wielkości, co sugeruje, że apoplastyczny RNA jest bardziej zdegradowany niż RNA na powierzchni liści.

Do dalszych badań nad obecnością RNA na powierzchni liści rzodkiewnika użyliśmy wacików bawełnianych. Metoda ta pozwoliła nam na selektywne i sekwencyjne pobranie RNA z powierzchni liścia adaksjalnego (górnego) i abaksjalnego (dolnego)6. Analizy te wykazały, że obie powierzchnie liści zawierały podobne ilości RNA. Co więcej, zdolność do zbierania RNA po prostu poprzez absorpcję buforu z powierzchni liścia bez konieczności wirowania dodatkowo potwierdza wniosek, że RNA rzeczywiście znajduje się na powierzchni liścia, a nie jest ekstrahowany przez aparaty szparkowe podczas wirowania.

Jedną z podstawowych zmian, która pozwoliła nam wyodrębnić dużą ilość RNA na powierzchni liści, było dodanie środka zwilżającego. Odzyskaliśmy prawie dwa razy więcej RNA po dodaniu środka zwilżającego (o bardzo niskim stężeniu 0,001%) do VIB. Ta różnica w stężeniu RNA uzyskanego z Silwet L-77 i bez niego wskazuje, że zastosowanie środka zwilżającego poprawia rozpuszczanie RNA na powierzchni liścia. Jednak zwiększenie stężenia środka zwilżającego z 0,001% do 0,01% nie poprawiło izolacji RNA LSW (ryc. 4). Warto zauważyć, że powtórzenie izolacji RNA LSW z tych samych liści dało dodatkowe RNA (około 63% odzysku uzyskanego z pierwszego mycia), co sugeruje, że liście stale wydzielają RNA na powierzchnię, przy czym prawie dwie trzecie z niego jest zastępowane w ciągu około 30 minut wymaganych do przetworzenia liści. Aby zwiększyć całkowitą wydajność RNA LSW, gdy materiał roślinny jest ograniczony, możliwe jest mycie tych samych liści wiele razy z rzędu. Nie zalecamy jednak więcej niż trzech prań, ponieważ związane z tym obchodzenie się może prowadzić do skumulowanego uszkodzenia materiału liści, co można ocenić na podstawie zielonego zabarwienia płynu myjącego. W tych eksperymentach stężenie RNA oszacowano za pomocą analizy densytometrycznej na bazie żelu RNA. Jednak opisana powyżej metoda kwantyfikacji RNA na płytkach mikromiareczkowych może być stosowana do dokładnej kwantyfikacji RNA podczas oceny wielu próbek jednocześnie (ryc. 5).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten szczegółowo opisuje, jak wyizolować płyn do mycia powierzchni liści (LSW), wymaz z powierzchni liści (LSS) i apoplastyczny płyn do mycia (AWF) ze zdrowych rozet Arabidopsis, a następnie ekstrakcję RNA. Krytyczne etapy obejmują przygotowanie i sterylizację VIB przed wykonaniem eksperymentu, uprawę roślin w kontrolowanych warunkach oraz użycie Silwet-L77 w celu zapewnienia prawidłowego pokrycia powierzchni liścia przez VIB. Procedury te powinny dać równe ilości RNA zarówno z LSW, jak i AWF, znormalizowane przez świeżą masę liści. Odzyskiwanie RNA z tych frakcji zewnątrzkomórkowych wymaga ostrożnego obchodzenia się, zwłaszcza w odniesieniu do granulek RNA po etapach wytrącania.

Chociaż powyższy protokół został zoptymalizowany pod kątem liści Arabidopsis, z powodzeniem stosowaliśmy go również na innych gatunkach roślin z niewielkimi modyfikacjami. Ekstrakcję RNA z powierzchni liścia można zoptymalizować, wdrażając dwie podstawowe regulacje: po pierwsze, przeprowadzając wiele rund izolacji LSW, a po drugie, zwiększając stężenie środka zwilżającego. Gatunki roślin, które mają bardzo hydrofobową powierzchnię liści, takie jak ryż12,13, mogą wymagać wyższych stężeń środka zwilżającego.

Dodatkowo opisaliśmy nieinwazyjną metodę pobierania RNA z powierzchni liści za pomocą wacików z bawełnianą końcówką. Dzięki tej metodzie izolacji RNA powierzchni liścia zapewniamy, że probówka zbiorcza jest umieszczona w pojemniku na lód. Biorąc pod uwagę, że RNA na powierzchni liścia jest wydzielane i gromadzi się w temperaturze pokojowej, zakładamy, że pozostanie stabilne nawet podczas procesu zbierania. Porównaliśmy również wzorce prążkowania LSW i LSS RNA i nie wykazują one dużej różnicy pod względem degradacji.

Powyższy protokół wykorzystuje odczynnik TRIzol do oczyszczania RNA z LSW, LSS lub AWF. Ten odczynnik wykorzystuje fenol do usuwania białek. Odkryliśmy jednak, że oczyszczanie oparte na trizolu nie usuwa polisacharydów, takich jak pektyny, które są obfite w LSW i AWF6. Takie cząsteczki oczyszczające mogą powodować problemy z kwantyfikacją RNA za pomocą spektrofotometrii lub fluorometrii. Dlatego polegamy na analizie densytometrii na bazie żelu RNA w celu oceny stężeń exRNA. Obecnie badamy metody oczyszczania oparte na kolumnach, które powinny zapewnić lepsze oddzielenie RNA od polisacharydów. Jednak metody te często ograniczają odzyskiwanie małych RNA, ponieważ błona krzemionkowa jest zoptymalizowana do wiązania cząsteczek RNA większych niż ~200 nukleotydów. Małe RNA mogą przechodzić przez błonę podczas wiązania lub zostać utracone na etapach płukania. Dlatego do tej pory polegaliśmy tylko na metodzie opartej na trizolu w celu bardziej kompleksowego odzyskiwania wszystkich rozmiarów RNA, w tym małych RNA, chociaż wymaga to ostrożnego obchodzenia się i separacji faz.

Dodatkowo, przeprowadzając analizę żelu RNA, nie widzimy fragmentów mniejszych niż 80 nt dla wszystkich próbek komórkowego RNA w porównaniu z RNA AWF i LSW, głównie ze względu na niską liczebność w stosunku do dużych ilości rRNA i tRNA. Obecność mniejszych prążków w AWF i LSW wynika z degradacji obfitych rRNA i tRNA, która zachodzi naturalnie po wydzielaniu RNA w przedziale zewnątrzkomórkowym roślin i nie jest artefaktem wprowadzanym podczas zbierania i obchodzenia się z roślinami, co potwierdza sekwencjonowanie i analiza northern blot6.

Nasza metoda izolacji powierzchni liści jest wszechstronnym narzędziem o znacznym potencjale dla szerokiego zakresu zastosowań badawczych. Powinno to umożliwić izolację biomolekuł z powierzchni liści, takich jak RNA, białka i inne metabolity, które mogą mieć kluczowe znaczenie dla zrozumienia interakcji między roślinami a drobnoustrojami. Jeśli pożądana jest identyfikacja drobnoustrojów obecnych w AWF i LSW, można to osiągnąć, eliminując filtrację przez filtr 0,22 μm.

Rośliny wchodzą w interakcje z szeroką gamą drobnoustrojów, w tym bakteriami, grzybami i wirusami, które tworzą złożone społeczności na ich powierzchni1. Te zbiorowiska mikrobiologiczne mogą mieć głęboki wpływ na wzrost roślin, odporność na choroby i pobieranie składników odżywczych 2,3,4. Izolując i analizując mycie powierzchni liści przy użyciu tej metody, naukowcy mogą wyizolować exRNA, metabolity drobnoustrojów, zidentyfikować społeczności drobnoustrojów obecne na powierzchni liści i zbadać, w jaki sposób te społeczności są regulowane na poziomie molekularnym.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta została wsparta dwoma grantami z Narodowej Fundacji Nauki Stanów Zjednoczonych,

IOS-2243531 i IOS-2141969 do RW

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
14-30 nt marker drabinkowy ssRNATakara3416
Probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 mlFirma VWR20170-038
Strzykawka bezigłowa 10 mlBD303347
15 ml probówek sokołaFirma VWR89039-668
15% Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 10 dołków/12 dołków, 30 &mikro; L/20 i mikro; LBio-Rad4566053 / 4566055
Wkłady do tac 36-komorowychPrawdziwy rynek liści
40% roztwór akrylamidu i bis-akrylamidu, 37,5:1Bio-Rad1610148
4-calowe okrągłe doniczkiPrawdziwy rynek liści
50 ml probówek FalconFirma VWR89039-656
Strzykawka bezigłowa 50 mlBD309653
96-dołkowa płytka z czarnym dnemGrenier655090
Acrodisc 0.22 μ M Filtr strzykawkowyPall4192
Acrodisc 0,45 μ M Filtr strzykawkowyPall4454
Nadsiarczan amonu (APS) Sigma-AldrichA3678 (wersja angielska)
Chlorek wapnia Sigma-AldrichZobacz materiał C1016
Chloroform (bez RNaz)Macron Chemikalia wysokowartościoweMK444110
Przezroczyste kopułki z tworzywa sztucznegoHummert Międzynarodowy11 3348Do przykrycia roślin i utrzymania wilgotności można użyć dowolnej plastikowej kopuły
Sztyft z bawełnianą końcówką klasy medycznejUline powiedział:S-21102
Etanol (bez rnazy)Decon Laboratories, Inc.2716GEA (od GEA)
Ekspres do kawy French Press, 24 uncjeŚnieżny szczytZobacz materiał CS-111
Taca do uprawy bez otworów 10 x 20Prawdziwy rynek liści
Wiaderko na lód Schuett-Biotech, Spongex3-680 052
IzopropanolThermo Scientific149320050
Wirnik JA-14 o stałym kącie nachyleniaBeckmana Coultera; Modelu: JA-14339247
Chusteczki KimwipesKCWW, Kimberly-Clark34120
Niski zakres ssRNA laderNEBN0364S
Hydrat MESSigma-AldrichZobacz materiał M8250
Czytnik mikropłytekBioTek  Synergia H1
Miracle-Gro (Cudowne Gro)Miracle-Gro (Cudowne Gro)24-8-16Jest to uniwersalny pokarm roślinny. W zależności od źródła gleby używanego do uprawy roślin, aplikację można dostosować.
Butelka Nalgene centifuge 250 ml (bez nakrętki)Nalgene powiedział:3120
Ręczniki papierowe
ParaFilm  Folia laboratoryjna MParafilmS-25929 (wersja angielska)
Zlewka plastikowa (500 ml)Uline powiedział:S-21658
Glikogen wolny od RNaz (20 mg/ml)Thermo ScientificCzynnik R0561
RootShield Plus WP Biologiczny środek grzybobójczyBioWorks (Prace biologiczne)68539-9
Nożyczki
Silwet L-77Laboratoria fitotechniczneNumer katalogowy S7777 powiedział:Można użyć dowolnej marki Silwet L-77. Jednak z biegiem czasu Silwet traci swoją skuteczność. Idealnie jest wymieniać go raz w roku.
Chlorek soduSigma-AldrichZobacz materiał S7653
Miękka nylonowa szczotka do malowania włosówNAM. Zaopatrzenie w sztukęNr 6
Butelka z rozpylaczemUline powiedział:S-7272Można użyć dowolnej butelki z rozpylaczem, ale ustawienia spryskiwacza powinny być pod prysznicem.
Sungro Profesjonalna mieszanka do uprawySungro powiedział:
Mieszanka rozmnożeniowa SungroSungro powiedział:
SYBR Gold Barwnik żelowy z kwasem nukleinowym (10 000x koncentrat w DMSO)Thermo ScientificZobacz materiał S11494
TEMEDThermo Scientific17919
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596026
Ultraczysta woda wolna od Dnazy/RnazyInvitrogen10977015
MocznikSigma-AldrichU5378 powiedział:
Komora próżniowa, 0,20 stopy sześciennejSP Scienceware - Bel-Art Products - H-B InstrumentF42031-0000
Pompa próżniowa, 3,5 CFMIdealne produkty próżnioweP101532
WagaEscali powiedział:WBB480535To tylko przykład. Można użyć dowolnej wagi.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vorholt, J. A. Microbial life in the phyllosphere. Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).
  2. Ritpitakphong, U., Falquet, L., Vimoltust, A., Berger, A., M'etraux, J., L'Haridon, F. The microbiome of the leaf surface of Arabidopsis protects against a fungal pathogen. New Phytol. 210 (3), 1033-1043 (2016).
  3. Chaudhry, V., Runge, P., Sengupta, P., Doehlemann, G., Parker, J. E., Kemen, E. Shaping the leaf microbiota: plant-microbe-microbe interactions. J Exp Bot. 72 (1), 36-56 (2021).
  4. Vacher, C., Hampe, A., Port'e, A. J., Sauer, U., Compant, S., Morris, C. E. The phyllosphere: microbial jungle at the plant-climate interface. Ann Rev Ecol Evol Syst. 47, 1-24 (2016).
  5. Mahmoudi, M., Almario, J., Lutap, K., Nieselt, K., Kemen, E. Microbial communities living inside plant leaves or on the leaf surface are differently shaped by environmental cues. ISME Commun. 4 (1), ycae103(2024).
  6. Borniego, M. L., et al. Diverse plant RNAs coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  7. Ren, B., Wang, X., Duan, J., Ma, J. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation. Science. 365 (6456), 919-922 (2019).
  8. Chery, M., Drouard, L. Plant tRNA functions beyond their major role in translation. J Exp Bot. 74 (7), 2352-2363 (2022).
  9. Panstruga, R., Spanu, P. Transfer RNA and ribosomal RNA fragments-Emerging players in plant-microbe interactions. New Phytol. 241 (2), 567-577 (2024).
  10. Baldrich, P., Rutter, B. D., Karimi, H. Z., Podicheti, R., Meyers, B. C., Innes, R. W. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "Tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  11. Rutter, B. D., Rutter, K. L., Innes, R. W. Isolation and quantification of plant extracellular vesicles. Bio Protoc. 7 (17), e2533(2017).
  12. Zhang, Z., et al. OsHSD1, a hydroxysteroid dehydrogenase, is involved in cuticle formation and lipid homeostasis in rice. Plant Sci. 249, 35-45 (2016).
  13. Zhou, L., Ni, E., Yang, J., Zhou, H., Liang, H., Li, J., Jiang, D., Wang, Z., Liu, Z., Zhuang, C. Rice OsGL1-6 is involved in leaf cuticular wax accumulation and drought resistance. PLoS One. 8 (5), e65139(2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Leaf Surface RNAApoplastic RNAArabidopsis RosettesExtracellular RNARNA IsolationLeaf Surface WashApoplastic Wash FluidRNA Gel ElectrophoresisImageJ AnalysisPlant Microbe Interactions

Powiązane artykuły