Artykuł metodologiczny

Ex vivo Analiza jednocząsteczkowa składania receptora 2 Ryanodine w tkance sercowej i neuronalnej

DOI:

10.3791/68408

⸱

15 lipca 2025

 , 
1Department of Chemistry, University of Kentucky

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia metodę obrazowania pojedynczych cząsteczek opartą na pęcherzykach, która zachowuje natywną organizację receptorów, umożliwiając precyzyjną kwantyfikację stechiometrii i szerokie zastosowania w badaniach nad budowaniem, funkcjonowaniem i chorobami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie montażu receptorów jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw ich funkcji i regulacji w procesach fizjologicznych. Podczas gdy tradycyjne badania pojedynczych cząsteczek in vitro opierają się na izolowaniu białek z heterologicznych systemów ekspresji, często nie udaje im się uchwycić fizjologicznej złożoności in vivo związanej z organizacją i składaniem białek powierzchniowych komórek. Protokół ten wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM) do badania cząsteczek receptora Ryanodine 2 (RyR2) znakowanych GFP zamkniętych w pęcherzykach w nanoskali. Pęcherzyki te, generowane z narządów szybko pobranych od zwierzęcia, skutecznie zapewniają obraz stanu składania receptora w momencie ekstrakcji, umożliwiając szczegółową analizę stechiometrii podjednostek i organizacji receptora w odpowiedzi na zmiany w środowisku fizjologicznym zwierzęcia. Podejście to wykorzystuje TIRFM i krokową analizę fotowybielania, aby zapewnić odczyt stechiometrii receptorów. Obrazowanie receptorów na poziomie pojedynczej cząsteczki ułatwia wykrycie niejednorodności w obrębie populacji receptorów złożonych w żywym zwierzęciu i umożliwia monitorowanie zmian składania związanych ze stanami chorobowymi. W rezultacie, metoda ta stanowi potężne narzędzie do określania rozmieszczenia zespołów receptorów i ich korelacji ze zmianami w ich środowisku fizjologicznym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptory błonowe odgrywają kluczową rolę w procesach fizjologicznych zachodzących w organizmie człowieka1. Podstawową funkcją jest pośredniczenie w komunikacji między komórkami poprzez przekazywanie bodźców zewnątrzkomórkowych w celu zainicjowania wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych. Ze względu na ich fundamentalną rolę w sygnalizacji, prawie 70% istniejących terapii jest ukierunkowanych na receptory błonowe2. Często są to struktury oligomeryczne złożone z wielu podjednostek połączonych w formy heteromeryczne z wieloma stechiometriami3,4. Zrozumienie, w jaki sposób receptory organizują się w funkcjonalne kompleksy, ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia ich roli w zdrowiu i chorobie5,6. Tradycyjne metody biochemiczne, takie jak immunoprecypitacja i western blot, zapewniają uśrednione pomiary zespołowe, które ukrywają heterogeniczność w subpopulacjach receptorów7. Natomiast techniki jednocząsteczkowe pozwalają na bezpośrednią obserwację poszczególnych receptorów, umożliwiając ilościowe określenie niejednorodności w populacjach receptorów8,9,10. Techniki jednocząsteczkowe stały się standardem w ilościowym określaniu składania receptorów błonowych, stechiometrii i oligomeryzacji11,12. Podejście to jest szeroko stosowane do wielu fizjologicznie istotnych receptorów błonowych przy użyciu izolowanych białek lub warunków hodowli komórkowej. Badania pojedynczych cząsteczek opierają się przede wszystkim na systemach ekspresji in vitro, w których białka mogą być izolowane ze środowiska komórkowego. Jednak złożoność żywego systemu nie jest w pełni odzwierciedlona w tego typu heterologicznych systemach ekspresji.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowaliśmy podejście, które izoluje i obrazuje receptory błonowe w fizjologicznie odpowiednim stanie, rejestrując je w nanopęcherzykach pochodzących bezpośrednio z tkanek serca i neuronów. Metoda ta skutecznie zachowuje stan składania się receptora w momencie tworzenia pęcherzyków, umożliwiając bezpośrednią wizualizację stechiometrii podjednostki receptora, która jest kluczowym wskaźnikiem odpowiedzi receptora w różnych środowiskach fizjologicznych. Takie podejście pozwala nam zbadać stechiometryczny zespół receptorów błonowych, który występuje w złożonym środowisku biologicznym u żywych zwierząt, bez konieczności heterologicznej ekspresji lub rekonstytucji. Stosując mikroskopię fluorescencyjną całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM), uzyskujemy obrazowanie w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki receptorów otoczonych pęcherzykami i ekstrahujemy ślady fotowybielania w celu określenia składu podjednostek.

TIRFM doskonale nadaje się do obrazowania pojedynczych cząsteczek białek błonowych, ponieważ selektywnie wzbudza fluorofory w odległości ~150 nm od powierzchni szkła, redukując fluorescencję tła od cząsteczek w roztworze3,10. To uwięzienie znacznie zwiększa stosunek sygnału do szumu, umożliwiając dokładne wykrywanie poszczególnych kompleksów receptorów błonowych. Analizując krokowe fotowybielanie fluorescencyjnie znakowanych receptorów, możemy bezpośrednio określić stechiometrię podjednostek i ocenić potencjalną heterogeniczność w populacjach receptorów12. Jest to szczególnie istotne w przypadku receptora Ryanodine 2 (RyR2), dużego wewnątrzkomórkowego kanału uwalniania Ca²⁺, który odgrywa kluczową rolę w sprzężeniu pobudzenie-skurcz w sercu, gdzie gromadzi się tylko jako homo-tetramer, oraz w funkcji synaptycznej w mózgu, gdzie jego montaż nie został ustalony1,13,14. Biorąc pod uwagę obecność wielu izoform RyR w tkankach neuronalnych, nie jest jasne, czy RyR2 tworzy czysto homomeryczne kompleksy tetramerów w mózgu, składające się z czterech identycznych podjednostek, tak jak ma to miejsce w sercu, czy też heteromeryczne zespoły z RyR1 lub RyR3 występują in vivo15,16,17,18.

Poprzez izolowanie pęcherzyków z określonych obszarów serca i mózgu, metoda ta umożliwia badanie potencjalnych różnic w organizacji RyR2 specyficznych dla danej tkanki. Wykorzystujemy właściwości RyR2 w tkance serca, gdzie może tworzyć tylko homotetramery, aby zapewnić statystycznie solidną podstawę do stechiometrii podjednostek jednocząsteczkowych ex vivo, a znany zespół tetramerów służy jako kontrola do badania nieznanych zespołów w innych narządach. Zdolność do obrazowania receptorów w ich naturalnym stanie przy jednoczesnym zachowaniu ich fizjologicznych interakcji zapewnia solidne ramy do badania składania receptorów w różnych narządach i w różnych warunkach fizjologicznych. Protokół ten opisuje przebieg procesu izolacji, unieruchomienia i obrazowania pojedynczej cząsteczki RyR2 znakowanego GFP, co pozwala na precyzyjne scharakteryzowanie stechiometrii receptora. Technika ta nie tylko pogłębia naszą wiedzę na temat organizacji RyR2 w tkankach serca i neuronów, ale także oferuje szersze zastosowania do badania składania i regulacji receptorów w różnych kontekstach fizjologicznych i patologicznych19,20,21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki

  1. Perfuzja przezsercowa i ekstrakcja narządów
    1. Znieczulij mysz za pomocą CO₂ do momentu ustania oddychania.
    2. Ustaw mysz w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz kończyny.
    3. Wykonaj nacięcie w linii środkowej wzdłuż brzucha i rozciągnij się na boki w kierunku klatki piersiowej, aby odsłonić klatkę piersiową.
    4. Ostrożnie włóż igłę do lewej komory i przetnij prawy przedsionek, aby umożliwić drenaż perfuzyjny.
    5. W celu przygotowania pęcherzyków należy perfować zimnym 1x PBS, aż układ krążenia zostanie oczyszczony z krwi.
    6. W przypadku kriosekcji, po perfuzji PBS, kontynuuj perfuzję z 4% paraformaldehydem (PFA) w celu utrwalenia tkanek.
    7. Ostrożnie wyjmij serce i natychmiast umieść je na lodzie.
    8. Za pomocą cienkich nożyczek ostrożnie przetnij wzdłuż linii środkowej skóry głowy i oderwij skórę, aby odsłonić czaszkę.
    9. Wykonaj nacięcie u podstawy czaszki w pobliżu otworu wielkiego.
    10. Za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie podważ czaszkę wzdłuż podłużnej szczeliny, usuwając fragmenty kości, aby odsłonić mózg.
    11. Delikatnie podnieś mózg za pomocą zakrzywionych kleszczy, przecinając nerwy czaszkowe, aby w pełni wydobyć go w stanie nienaruszonym.
    12. W przypadku stosowania do kriosekcji, po utrwaleniu mózgu w 4% PFA w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
    13. Jeśli jest używany do przygotowania pęcherzyków, natychmiast umieść mózg na lodzie bez fiksacji w celu dalszej obróbki.
  2. Kriosekcja
    1. Usuń mózg lub serce z 4% PFA i osusz go.
    2. Osadź cały narząd w związku OCT w krioformie.
    3. Zamrozić osadzoną tkankę, umieszczając formę w zamrażarce o temperaturze -80 °C do całkowitego zestalenia.
    4. Przed podziałem na sekcje należy wyrównać temperaturę komory kriostatu i głowicy próbki do -20 °C.
    5. Przenieść zamrożony blok OCT z zamrażarki o temperaturze -80 °C do komory kriostatu i pozostawić do zrównoważenia przez 10 minut.
    6. Oczyść uchwyt próbki 70% etanolem, wysusz go i nałóż cienką warstwę OCT jako klej.
    7. Przymocuj zamrożony blok OCT do uchwytu, upewniając się o prawidłowej orientacji.
    8. Włóż uchwyt do uchwytu na próbkę kriostatu i wyreguluj położenie ostrza.
    9. Odetnij nadmiar OCT, aż powierzchnia tkanki zostanie odsłonięta.
    10. Tkankę należy podzielić na sekcje o grubości 10 μm, pobierając skrawki na szkiełka podstawowe.
    11. Po wysuszeniu skrawków na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, nałożyć na nie podłoże montażowe i umieścić szkiełko nakrywkowe w celu uszczelnienia próbki.
    12. Poczekaj, aż nośnik montażowy zastygnie przed umieszczeniem szkiełek w temperaturze 4 °C w celu obrazowania.
  3. Przygotowanie pęcherzyków
    1. Przygotowanie pęcherzyków serca
      1. Pobrać serce po perfuzji przezsercowej za pomocą 1x PBS i umieścić je na lodzie.
      2. Za pomocą sterylnego skalpela wyciąć około 30 mg mięśnia komorowego z dna serca.
      3. Przenieść tkankę do probówki wirówkowej zawierającej 4-5 ml 10 mM NaHCO₃ z 5 mM NaN₃ w celu utrzymania integralności pęcherzyków.
      4. Homogenizować tkankę za pomocą homogenizatora, aż do pełnej lizy.
      5. Odwirować homogenat o stężeniu 10 000 × g przez 20 minut w celu usunięcia dużych zanieczyszczeń i zebrania supernatantu.
      6. Przeprowadzić ultrawirowanie przy 37 000 × g przez 65 minut, następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3-4 ml 20 mM buforu tris-maleinianu (pH 6,8) z 0,6 M KCl.
      7. Powtórz ultrawirowanie przy 37 000 × g przez kolejne 65 minut, aby usunąć rozpuszczoną aktomiozynę.
      8. Zawiesić końcowy osad w 0,5 ml 20 mM buforu tris-maleinianu (pH 6,8) z 50 mM KCl w celu uzyskania roztworu pęcherzyków serca i przechowywać go w temperaturze -80 °C.
    2. Przygotowanie pęcherzyków mózgowych
      1. Pobrać mózg po perfuzji przezsercowej za pomocą 1x PBS i umieścić go na lodzie.
      2. Pokrój mózg na odcinki o grubości 1 mm za pomocą 1 mm matrycy koronalnej mózgu myszy.
      3. Zidentyfikuj trzecią i czwartą sekcję z opuszki węchowej i dokładnie przeanalizuj: 1) najbardziej zewnętrzną warstwę korową z obu półkul; 2) hipokamp, znajdujący się w centralnej części sekcji.
      4. Od tylnego końca odizoluj móżdżek, wykonując poprzeczne nacięcie u jego podstawy.
      5. Połącz te same obszary mózgu od pięciu myszy, aby zapewnić odpowiednią wydajność pęcherzyków.
      6. Natychmiast homogenizować tkankę za pomocą homogenizatora Dounce w 2 ml zimnego buforu homogenizacyjnego (0,32 M sacharozy, 10 mM HEPES, 2 mM EDTA, inhibitor proteazy, pH 7,4).
      7. Dodać 3 ml dodatkowego buforu homogenizacyjnego i odwirować w temperaturze 200 × g przez 15 minut w celu usunięcia dużych fragmentów tkanki.
      8. Zebrać supernatant i odwirować w temperaturze 1 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia frakcji jądrowej.
      9. Następnie odwirować supernatant w temperaturze 10 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia mitochondriów.
      10. Otrzymany supernatant należy odwirować ultra w stężeniu 100 000 × g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w celu osadzenia pęcherzyków.
      11. Zawiesić ostateczną osadę pęcherzyka w 1x PBS, aby uzyskać roztwór pęcherzyków mózgowych i przechowywać go w temperaturze -80 °C.
  4. Charakterystyka nanopęcherzyków za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA)
    1. Zmontuj celę detekcyjną zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Włącz instrument i uruchom kompatybilne oprogramowanie.
    3. Załaduj strzykawkę o pojemności 1 ml wodą dejonizowaną (DI) i ręcznie przepłucz rurkę systemu, aż tło zostanie oczyszczone z zanieczyszczeń.
    4. Przygotować próbkę nanopęcherzyków, rozcieńczając ją w 1x PBS.
    5. Załaduj ~1 ml rozcieńczonej próbki nanopęcherzyków do czystej strzykawki o pojemności 1 ml, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
    6. Ręcznie wstrzyknąć próbkę do komórki detekcyjnej i dostosować ostrość, aż pęcherzyki będą wyraźnie widoczne.
    7. Przymocuj strzykawkę do pompy strzykawkowej i ustaw natężenie przepływu na 200 μl/s w panelu sprzętowym.
    8. W panelu SOP ustaw czas pomiaru na 60 s, liczbę cykli na 5 i potwierdź, że kontrola temperatury jest włączona i ustawiona na 25 °C. Zapisz ustawienia jako nową procedurę SOP, klikając przycisk Zapisz procedurę SOP i nadając plikowi odpowiednią nazwę (np. "nanovesicle_standard.sop").
    9. W panelu Przechwytywanie skonfiguruj ustawienia instrumentu, wybierając poziom kamery 13 i początkowy próg wykrywania 3.
    10. Kliknij przycisk Uruchom i wybierz wcześniej zapisaną procedurę SOP. Oprogramowanie automatycznie przeprowadzi pomiar zgodnie z ustawieniami.
    11. Po zakończeniu kliknij Analizuj, aby przetworzyć każdy film. Dostosuj próg wykrywania, aby upewnić się, że wszystkie cząstki są wyraźnie widoczne, a po zakończeniu analizy wsadowej kliknij przycisk Zakończ. Eksportuj wynik, klikając Eksportuj dane | Wszystkie pomiary i zapisz jako plik CSV do późniejszego wykorzystania.
    12. Po zakończeniu eksperymentu przepłucz system ~ 2 ml wody DI, aż nie pozostaną żadne resztki pęcherzyków.
    13. Wtrzyknij powietrze przez rurkę, aby usunąć pozostały płyn, upewniając się, że system jest suchy do następnego użycia.

2. Obrazowanie

  1. Obrazowanie konfokalne kriosekcji tkanek
    1. Włącz laserowy skaningowy mikroskop konfokalny i otwórz połączone oprogramowanie.
    2. Wybierz odpowiedni obiektyw (20x powietrze lub 60x olej) i załaduj przygotowane szkiełko kriosekcyjne na stolik mikroskopu.
    3. Skonfiguruj ustawienia lasera pod kątem wzbudzenia GFP za pomocą linii laserowej 488 nm z filtrem emisyjnym 535/70 nm.
    4. Zoptymalizuj parametry obrazowania, w tym rozmiar otworu (28,9 μm), intensywność lasera (17%) i wzmocnienie detektora (15,3), aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu przy jednoczesnej minimalizacji fotowybielania.
    5. W razie potrzeby uzyskaj stos Z, ustawiając górną i dolną płaszczyznę ogniskowej oraz definiując odpowiedni rozmiar kroku (0,275 μm).
    6. Włącz automatyczne łączenie obrazów z 15% nakładaniem się obrazów podczas uzyskiwania obrazów o dużym obszarze.
    7. Dostosuj rozdzielczość obrazu i w razie potrzeby zastosuj uśrednianie klatek, aby zredukować szumy tła.
    8. Przechwytuj obrazy i zapisuj je w formacie ".nd2" do dalszej analizy.
  2. Obrazowanie z pełnym wewnętrznym odbiciem fluorescencyjnym (TIRF)
    1. Unieruchomienie pęcherzyków za pomocą metody biokompatybilnej kotwicy do membrany (BAM)22
      1. Oczyścić naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm, zanurzając je w 5 M NaOH przez 1 godzinę w temperaturze 45 °C, a następnie trzykrotnie dokładnie płukając wodą DI.
      2. Sonikować naczynia w 0,1 M HCl przez kolejną 1 godzinę w temperaturze 45 °C, a następnie trzy dodatkowe płukania wodą DI.
      3. Oczyszczoną powierzchnię szkła należy potraktować 2% 3-aminopropylotrietoksysilanem (APTES) w etanolu przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu wprowadzenia aminowych grup funkcyjnych.
      4. Opłucz naczynie 3x wodą DI i etanolem, aby usunąć nadmiar APTES i pozostaw do wyschnięcia.
      5. Inkubować naczynie ze 100 μM Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS (Sunbright OE-020CS) w 1x PBS przez 10 min.
      6. Umyj naczynie PBS, aby usunąć nieprzereagowany odczynnik
        7. .
      7. Wprowadzić pęcherzyki o pożądanym stężeniu i inkubować przez 15 minut, aby umożliwić związanie pęcherzyków.
      8. Delikatnie spłucz naczynie PBS, aby usunąć niezwiązane pęcherzyki, upewniając się, że unieruchomione pęcherzyki pozostają przyczepione.
    2. Konfiguracja i akwizycja obrazowania TIRF
      1. Włącz odwrócony mikroskop fluorescencyjny, źródło lasera 488 nm i kamerę EMCCD.
      2. Uruchom oprogramowanie Metamorph i CellSens, aby zainicjować kontrolę obrazowania.
      3. Wyczyść obiektyw zanurzeniowy 60x w oleju (1.49 NA APO) metanolem, aby usunąć kurz i resztki oleju.
      4. Nałóż niewielką kroplę olejku immersyjnego o współczynniku załamania światła (RI) na soczewkę obiektywu.
      5. Umieść przygotowane naczynie pęcherzykowe na stoliku mikroskopu, upewniając się, że jest wyśrodkowane w celu optymalnego wyrównania.
      6. Dostosuj ostrość wiązki laserowej, centrując wiązkę wzbudzenia na środku tylnej apertury obiektywu w trybie epifluorescencji.
      7. Użyj silnika krokowego, aby wyregulować kąt padania lasera, aż do osiągnięcia kąta krytycznego, zapewniając całkowite wewnętrzne odbicie na powierzchni szkła.
      8. Zidentyfikuj płaszczyznę ogniskowej, skanując przez oś Z, rozróżniając: 1) pierwszą płaszczyznę ostrości, odpowiadającą powierzchni szklanego dna; 2) druga płaszczyzna ogniskowania, odpowiadająca powierzchni unieruchomionej przez pęcherzyk.
      9. Gdy pęcherzyki są już ostre, zastosuj autofokus w CellSens, aby zablokować pozycję obiektywu w tej płaszczyźnie, zapobiegając dryfowaniu podczas obrazowania.
      10. Tymczasowo wyłącz laser i przesuń stolik mikroskopu na nowe pole widzenia, które nie było jeszcze wystawione na działanie światła wzbudzającego.
      11. Rozpocznij nagrywanie, jednocześnie włączając laser, zapewniając uchwycenie pełnego procesu fotowybielania bez wcześniejszej ekspozycji.
      12. Uzyskuj obrazy o następujących parametrach: Czas ekspozycji: 100 ms na klatkę, Tryb akwizycji: 900 ciągłych klatek na pole widzenia, Ustawienie wzmocnienia: 1,400.
      13. Powtórz ten proces dla wielu pól widoku, aby zapewnić wystarczające gromadzenie danych.
      14. Zapisz stosy obrazów w formacie TIFF do dalszej obróbki.

3. Przetwarzanie obrazu i analiza danych

  1. Konfokalne przetwarzanie obrazu
    1. Otwórz uzyskane obrazy konfokalne w połączonym oprogramowaniu.
    2. Dostosuj ustawienia tabeli przeglądowej (LUT), aby zoptymalizować jasność i kontrast.
    3. Zastosuj te same dopasowania LUT jednolicie na wszystkich obrazach, aby zachować spójność wizualną.
  2. Przetwarzanie wideo TIRF i analiza intensywności fluorescencji
    1. Przetwarzanie wideo do wizualizacji
      1. Otwórz pobrane stosy obrazów TIRF (format TIFF) w ImageJ w celu wizualizacji.
      2. Dostosuj jasność i kontrast, aby zwiększyć klarowność sygnału, zapewniając, że fluorescencyjne pęcherzyki są łatwe do odróżnienia od tła.
      3. Eksportuj dostosowane obrazy do prezentacji lub dalszej analizy jakościowej.
    2. Analiza etapu fotowybielania
      1. Wyodrębnianie śladów czasowych
        1. Otwórz skrypt MATLAB (zobacz Plik uzupełniający 1) o nazwie "getTimeTraces.m" i uruchom go. W graficznym interfejsie użytkownika (GUI) kliknij przycisk Załaduj film i wybierz plik .tiff obrazowania TIRF, aby zaimportować stos filmów z pęcherzykami.
        2. Kliknij przycisk Znajdź szczyty, aby automatycznie zidentyfikować sygnały fluorescencji pojedynczej cząsteczki. Regiony sygnału zostaną oznaczone okręgami w oknie podglądu.
        3. Kliknij przycisk Wypełnij dane. Spowoduje to wyeksportowanie śladu intensywności czasowej dla każdego miejsca do pliku .xlsx w celu dalszej analizy.
      2. Ręczne liczenie kroków
        1. Uruchom skrypt "simpleGraph.m" (patrz Plik uzupełniający 1), aby uruchomić GUI, kliknij Załaduj pliki danych i wybierz plik .xlsx wygenerowany w kroku 3.2.2.1.3.
        2. Sprawdź etapy wybielania każdego śladu czasu wyświetlanego w lewym panelu. Należy upewnić się, że do analizy akceptowane są tylko ślady spełniające następujące kryteria: 1) ślad czasowy zawiera co najmniej jeden odrębny etap bielenia. 2) Czas trwania jednego kroku wynosi co najmniej 1 s. 3) Różnica intensywności między poziomami kroków wynosi co najmniej 3x odchylenie standardowe intensywności po wybielaniu.
        3. Po prawej stronie znajdź pole Krok # i użyj przycisków + lub -, aby wprowadzić liczbę etapów fotowybielania dla każdej śladu.
        4. Po zakończeniu każdego wpisu kliknij przycisk Dalej, aby przejść do następującego śladu. Po przetworzeniu wszystkich śladów oprogramowanie automatycznie wygeneruje i zapisze plik .txt rejestrujący liczbę kroków każdej ścieżki.
      3. Podsumowanie liczby kroków
        1. Uruchom skrypt "CombinedFiles.m" (patrz Plik uzupełniający 1), aby otworzyć GUI.
        2. Wpisz żądaną nazwę danych wyjściowych podsumowania w polu tekstowym.
        3. Kliknij opcję Połącz wiele wyników simpleGraph w jeden plik. W przeglądarce plików wybierz co najmniej jeden żądany plik .txt wygenerowany w kroku 3.2.2.2.3. Skrypt automatycznie skompiluje wszystkie dane dotyczące liczby kroków i wygeneruje połączony plik .xlsx podsumowujący częstotliwość śledzenia 1-etapowego, 2-etapowego,...
          4. .

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby potwierdzić stosowalność tej metody, najpierw zweryfikowaliśmy ekspresję i lokalizację GFP-RyR2 poprzez konfokalne obrazowanie kriosekcji tkanki sercowej i neuronalnej (Rysunek 1). Sygnał fluorescencyjny w tkance serca wykazywał poprzeczny prążkowany wzór zgodny z oczekiwaną lokalizacją RyR2 w kardiomiocytach, ale wykazywał wysoką intensywność w niektórych regionach mózgu, a mianowicie w korze, hipokampie i móżdżku, co wskazuje na ekspresję specyficzną dl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniu tym ustanowiono szczegółowy i powtarzalny protokół enkapsulacji ex vivo i obrazowania pojedynczych cząsteczek receptorów błonowych przy użyciu RyR2 znakowanego GFP jako systemu modelowego. Protokół znacznie rozwija obecne metody, umożliwiając analizę stechiometryczną kompleksów receptorowych bezpośrednio z tkanki natywnej, zachowując fizjologiczny kontekst białek błonowych. W porównaniu z tradycyjnymi systemami ekspresji in vitro, podejście to minimalizuje artefakty wprowadzone przez nadekspresję lub s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować rdzeniowi mikroskopii UKY Light oraz Centrum Bioelektroniki i Nanomedycyny za korzystanie z ich urządzeń. Wsparcia dla tych prac udzielił NIH (GM138837 i GM138882). Rysunek 2 (https://BioRender.com/s69w811) i Rysunek 3 (https://BioRender.com/y54b47) zostały stworzone w BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Talerz 35 mm | Nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe | Średnica szkła 14 mmMattekP35G-1.5-14-C
Andwin Scientific  Tissue-Tek Cryomold Molds/AdapteryFisher ScientificNC9542860
APTESMillipore Sigma440140-100ML(3-aminopropylo)trietoksysilan
Bio-Gen PRO200 Homogenizator laboratoryjnyPro Scientific1204B59
cellSENSOlympus Scientific Solutionsnie dotyczy
kamery EMCCDAndorn/aiXon Ultra 897
Etanol absolutny ≥ 100% (v/v) USP dla biologii molekularnej (200 dowodów)VWR71006-012
Leica CM1860Leican/akriostat
MetaMorph Zaawansowaneurządzenia molekularnen/a
Nanosight NS300 (z oprogramowaniem Nanosight NTA)Malvern Panalyticaln/a
Nikon AXR Odwrócony mikroskop konfokalnyNikonn/a
Olympus IX83 Zmotoryzowany mikroskop fluorescencyjny z autofokusemOlympusn/aTIRFM
Paraformaldehyd 4% w PBS gotowy do użycia odczynnik utrwalającyVWR76221-378
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 20x, ultra czysty VWR97062-950
Wodorotlenek sodu, kulki, klasa odczynnikaVWR97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +NOF America Corporationn/aOleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakuraM71484
VectaMount AQ Wodne mediumdo montażu Vector LaboratoriesH-5501-60

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taur, Y., Frishman, W. H. The cardiac ryanodine receptor (RyR2) and its role in heart disease. Card Rev. 13 (3), 142-146 (2005).
  2. Lundstrom, K. Structural genomics and drug discovery. J Cell Mol Med. 11 (2), 224-238 (2007).
  3. Levitz, J., et al. Mechanism of assembly and cooperativity of homomeric and heteromeric metabotropic glutamate receptors. Neuron. 92 (1), 143-159 (2016).
  4. Fox-Loe, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. Organelle-specific single-molecule imaging of α4β2 nicotinic receptors reveals the effect of nicotine on receptor assembly and cell-surface trafficking. J Bio Chem. 292 (51), 21159-21169 (2017).
  5. Degani-Katzav, N., Gortler, R., Gorodetzki, L., Paas, Y. Subunit stoichiometry and arrangement in a heteromeric glutamate-gated chloride channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E644-E653 (2016).
  6. Aryal, S. P., Fu, X., Masud, A. A., Neupane, K. R., Richards, C. I. Single-molecule studies of membrane receptors from brain region specific nanovesicles. Bio-protocol. 11 (10), e4018(2021).
  7. Schneeweis, L. A., et al. Comparison of ensemble and single molecule methods for particle characterization and binding analysis of a pegylated single-domain antibody. J Pharm Sci. 104 (12), 4015-4024 (2015).
  8. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. J Gen Phys. 141 (6), 737-746 (2013).
  9. Lee, J., Lee, T. H. Single-molecule investigations on histone h2a-h2b dynamics in the nucleosome. Biochem. 56 (7), 977-985 (2017).
  10. Aggarwal, V., Ha, T. Single-molecule pull-down (SiMPull) for new-age biochemistry: methodology and biochemical applications of single-molecule pull-down (SiMPull) for probing biomolecular interactions in crude cell extracts. Bioessays. 36 (11), 1109-1119 (2014).
  11. Sungkaworn, T., et al. Single-molecule imaging reveals receptor-g protein interactions at cell surface hot spots. Nature. 550 (7677), 543-547 (2017).
  12. Fu, X., et al. Brain region specific single-molecule fluorescence imaging. Anal Chem. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  13. Anderson, K., et al. Structural and functional characterization of the purified cardiac ryanodine receptor-Ca2+ release channel complex. J Bio Chem. 264 (2), 1329-1335 (1989).
  14. Waddell, H. M. M., Mereacre, V., Alvarado, F. J., Munro, M. L. Clustering properties of the cardiac ryanodine receptor in health and heart failure. J Mol Cell Card. 185, 38-49 (2023).
  15. Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor ryr2. Science. 354 (6310), aah5324(2016).
  16. Xiao, B., et al. Isoform-dependent formation of heteromeric Ca2+ release channels (ryanodine receptors). J Bio Chem. 277 (44), 41778-41785 (2002).
  17. Xu, L., Wang, Y., Yamaguchi, N., Pasek, D. A., Meissner, G. Single channel properties of heterotetrameric mutant ryr1 ion channels linked to core myopathies. J Biol Chem. 283 (10), 6321-6329 (2008).
  18. Chagovetz, A. A., Klatt Shaw, D., Ritchie, E., Hoshijima, K., Grunwald, D. J. Interactions among ryanodine receptor isotypes contribute to muscle fiber type development and function. Dis Model Mech. 13 (2), dmm038844(2019).
  19. Yao, J., et al. Limiting RyR2 open time prevents Alzheimer's disease-related neuronal hyperactivity and memory loss but not β-amyloid accumulation. Cell Rep. 32 (12), 108169(2020).
  20. Hiess, F., et al. Subcellular localization of hippocampal ryanodine receptor 2 and its role in neuronal excitability and memory. Comm Biol. 5 (1), 183(2022).
  21. Clowsley, A. H., et al. Analysis of RyR2 distribution in HEK293 cells and mouse cardiac myocytes using 3D MINIFLUX microscopy. bioRxiv. , (2023).
  22. Kato, K., et al. Immobilized culture of nonadherent cells on an oleyl poly(ethylene glycol) ether-modified surface. Biotech. 35 (5), 1014-1021 (2003).
  23. Yin, Q., Aryal, S. P., Song, Y., Fu, X., Richards, C. I. Quantitative single-molecule analysis of ryanodine receptor 2 subunit assembly in cardiac and neuronal tissues. Anal Chem. 96 (41), 16298-16306 (2024).
  24. Moonschi, F. H., et al. Cell-derived vesicles for single-molecule imaging of membrane proteins. Angew Chem Int Ed. 54 (2), 481-484 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ca kowite wewn trzne odbicietkanka sercamonta receptor wstopniowe fotoblakni cieznakowanie GFPp cherzyki w skali nanometrycznejstechiometria receptor w
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły