Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja deoksyrybonukleinowym w całym genomie z gatunków Mycobacterium za pomocą techniki bromku cetylotrymetylamoniowego

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68409

⸱

12 grudnia 2025

 , 
1DST/NRF Centre of Excellence for Biomedical Tuberculosis Research, South African Medical Research Council (SAMRC), Centre for Tuberculosis Research, Division of Molecular Biology and Human Genetics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje metodę CTAB polegającą na wydobyciu wysokiej jakości DNA z mykobakterii, pokonując wyzwania związane z ich twardymi, bogatymi w kwas grzybniczy ściany komórkowe. Proces obejmuje trawienie enzymatyczne, lizę komórek za pomocą CTAB oraz oczyszczanie DNA poprzez ekstrakcję organiczną i wytrącanie etanolem. Ta metoda wytwarza DNA odpowiednie do badań molekularnych i jest wiarygodna w badaniach mykobakterialnych.

Streszczenie

Efektywna i niezawodna ekstrakcja DNA to podstawowy etap biologii molekularnej, dostarczający wysokiej jakości materiał genetyczny do dalszych zastosowań, takich jak PCR, sekwencjonowanie i analizy genomowe. Jednak unikalny skład ścian komórkowych mykobakterii, bogaty w lipidy i kwasy grzybnicze, stanowi poważne wyzwanie dla efektywnej izolacji DNA. Metoda bromku cetylotrymetylamoniu (CTAB) jest szeroko stosowana ze względu na skuteczność w ekstrakcji DNA o wysokiej czystości z gatunków mykobakterii, w tym zarówno szczepów szybko jak i wolno rosnących. Technika ta polega na enzymatycznym rozbiciu komórek bakteryjnych za pomocą lizoenzymu i proteinazy K, a następnie lizie składników komórkowych za pomocą CTAB, który selektywnie wiąże się i tworzy kompleks z polisacharydami i białkami. Oczyszczanie i koncentracja DNA uzyskuje się poprzez ekstrakcję rozpuszczalnikami organicznymi oraz wytrącanie etanolem. Według naszych danych, protokół CTAB dostarcza dużych ilości DNA (200 - 1000 ng/μL) o wysokiej jakości i minimalnym zanieczyszczeniu, co udowodniono elektroforezą żelową i analizą NanoDrop. DNA wyodrębniane z różnych gatunków mykobakterii jest wysokiej czystości i nadaje się do różnych badań molekularnych. Badanie to demonstruje proceduralne kroki metody CTAB, podkreślając jej skuteczność w pokonywaniu unikalnych wyzwań związanych z ekstrakcją DNA mykobakterii.

Wprowadzenie

Ekstrakcja wysokiej jakości DNA to fundamentalny etap biologii molekularnej, niezbędny do dalszych zastosowań, takich jak PCR, sekwencjonowanie całego genomu i inne badania genomowe. W przypadku Mycobacterium, rodzaju obejmującego zarówno gatunki patogenne, takie jak Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), jak i niepatogenne gatunki środowiskowe, takie jak Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), ekstrakcja DNA może być trudna ze względu na ich grube, bogate w lipidy i hydrofobowe ściany komórkowe 1,2,3. Ta wytrzymała ściana komórkowa wymaga stosowania specjalistycznych metod lizy do rozbicia komórek i skutecznego uwalniania DNA genomowego.

Metoda bromku cetylotrymetylamoniowego (CTAB) okazała się skuteczna w izolowaniu wysokiej jakości DNA z różnych gatunków mykobakterii 4,5. CTAB, kationowy surfaktant, wiąże się z polisacharydami i innymi składnikami komórki, ułatwiając ich usunięcie podczas procesu ekstrakcji6. Nawet przy trudnych próbkach protokół oparty na CTAB zapewnia efektywną izolację nienaruszonego i czystego DNA, szczególnie w połączeniu z lizą enzymatyczną, obróbką cieplną oraz ekstrakcją rozpuszczalnikami organicznymi 7,8. Metoda CTAB odegrała kluczową rolę w efektywnej ekstrakcji DNA z gatunków mykobakterii, szczególnie w badaniach związanych z sekwencjonowaniem całego genomu, metagenomiką oraz diagnostyką molekularną, które wymagają czystego i wysokiej jakości materiału wejściowego DNA 9,10. W porównaniu z innymi technikami ekstrakcji DNA, takimi jak bead-beating czy komercyjne zestawy, przedstawiony tutaj protokół CTAB oferuje wyraźną przewagę w zachowaniu integralności DNA, co jest kluczowym czynnikiem dla długoodczytowego sekwencjonowania i zastosowań epigenetycznych. Chociaż wcześniejsze badania wykazały niższe wydajności DNA przy CTAB w porównaniu do metod zakłócania mechanicznego, podkreślają one również jego zdolność do minimalizowania ścinania DNA i utrzymania integralności DNA11,12. Aby zniwelować ograniczenia czystości i wydajności, obecny protokół został zoptymalizowany, skracając czas inkubacji i poprawiając spójność w różnych typach próbek. To udoskonalenie potwierdziły wyniki Oppermana i in., którzy wykazali, że DNA ekstrahowane przez CTAB z hodowli Mycobacterium avium ma wystarczające stężenie i jakość do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie rRNA 16S i testy liniowe, co dodatkowo wspiera zastosowanie protokołu CTAB jako wszechstronnego i skalowalnego narzędzia w badaniach mykobakterii, szczególnie w badaniach wymagających nienaruszonego DNA genomowego do zaawansowanych analiz molekularnych13. Dodatkowo, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) zazwyczaj wymaga 100-1000 ng wysokiej jakości DNAgenomowego 14, a w przypadku sekwencjonowania długiego odczytu, takiego jak sekwencjonowanie PacBio, wymaga ≥5 μg wysokiej jakości DNA15, dlatego gdy potrzebne są duże ilości wysokiej jakości i nienaruszonego DNA, CTAB pozostaje efektywną metodą16.

Ustanowienie efektywnych, spójnych i skutecznych metod ekstrakcji DNA z mikroorganizmów trudnych do rozlewu jest konieczne, aby zapewnić powtarzalność i wiarygodność we wszystkich laboratoriach, szczególnie w zakresie identyfikacji szczepów i badań epidemiologicznych 5,7. Protokół ten zawiera szczegóły dotyczące ekstrakcji DNA całego genomu z mykobakterii metodą CTAB. Obecny protokół ma na celu umożliwienie badaczom osiągania spójnych i wiarygodnych wyników w procesach pracy biologii molekularnej poprzez eliminowanie pułapek i pokonywanie wyzwań związanych z charakterystyczną ścianą komórkową mykobakterii17.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Reprezentatywne wyniki zostały opracowane za zgodą komisji etyki REC: BES: BES, Uniwersytet w Stellenbosch (BES-2024-22504). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie wsewininy posiewki mykobakterii

UWAGA: W zależności od badanego gatunku, ten etap musi być przeprowadzony w laboratorium poziomu 2 (BSL-2) lub poziomu 3 (BSL-3). Czas inkubacji i warunki hodowli zależą również od potrzeb wzrostu gatunku mykobakterialnego ze względu na ich specyficzne tempo wzrostu i cechy fizjologiczne.

  1. Przygotuj 5 mL lub 8 mL hodowli bakteryjnej odpowiednio w płynnym medium Middlebrook 7H9 lub MGIT, uzupełnionym OADC i inkubuj w temperaturze 37 °C przez wymagany okres, aby umożliwić wzrost bakterii. Wolno rosnące grzybniki potrzebują 10-14 dni, natomiast szybko rosnące około 2-5 dni.
    UWAGA: Zawiesina komórek mykobakterii może być przygotowana przez zeskrobanie pętli kolonii do sterylnej podwójnie destylowanej wody, jeśli hodowla początkowa pochodzi z płyt agarowych (np. agar Middlebrook 7H10).
  2. Wlej płynną kulturę do probówek po 15 mL.
  3. Zabij hodowlę cieplną w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę w inkubatorze.
  4. W przypadku Mycobacterium tuberculosis lub innych patogennych gatunków wymagających BSL-3, przenieś hodowle zabijane termicznie do laboratorium BSL-2.

2. Trawienie ściany komórkowej i ekstrakcja DNA

UWAGA: Po inaktywacji hodowli termicznej można bezpiecznie przeprowadzić następujące kroki w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2). Jeśli celem jest ekstrakcja do sekwencjonowania długiego odczytu lub alternatywnych zastosowań wymagających DNA o dużej masie cząsteczkowej, koniecznie stosuj końcówki pipety o szerokim przeciętnym przekształceniu, a na etapach wirów zastępuj wir inwersją lub mieszaniem pipet.

  1. Wiruj probówkę 15 mL w dawce 3220 x g przez 15-30 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usuń przezroczysty supernatant (upewnij się, że wszystkie materiały są usunięte).
  2. Dokładnie ponownie zawiesz pellet hodowli w 300 μL buforu Tris-EDTA (TE).
  3. Przelej ponownie zawiesinowany pellet do probówki 2 mL.
  4. Dodaj 100 μL lizozymu (10 mg/mL) i wymieszaj pipetowanie pipetowaniem w górę i w dół 5 razy, a następnie delikatnie stukaj w probówkę, aby zapewnić równomierną dyspersję.
  5. Inkubuj mieszankę w temperaturze 37 °C na rotacyjnym inkubatorze przez noc (~16 h; krótszy czas inkubacji może obniżyć efektywność lizy i w konsekwencji prowadzić do niskiej wydajności DNA).
  6. Następnego dnia przygotuj mieszankę 5 μL proteinazy K (10 mg/mL) oraz 70 μL 10% SDS. Na przykład, jeśli jest pięć próbek, przygotuj 350 μL 10% SDS i 25 μL Proteinazy K. Wymieszaj przez odwrócenie probówki, aby zapobiec powstawaniu piany.
  7. Dodaj 75 μL tej mieszaniny do każdej próbki.
  8. Mieszaj przez stukanie i inkubuj w temperaturze 65 °C przez 10 minut w inkubatorze lub bloku grzewczym, z mieszaniem przerywanym przez inwersję.
  9. Dodaj 100 μL 5 M NaCl.
  10. Dodaj 100 μL roztworu CTAB/NaCl w temperaturze 65 °C.
    UWAGA: Podgrzej roztwór CTAB/NaCl do 65 °C przed zapewnieniem dokładności pipetowania, biorąc pod uwagę lepkość substancji w RT.
  11. Mieszaj przez stukanie, aż roztwór stanie się mleczny.
  12. Inkubuj w temperaturze 65 °C przez 10 minut w inkubatorze lub bloku grzewczym, z przerywanym mieszaniem przez inwersję.
  13. Dodaj do każdej próbki równą objętość (~ 675 μL) roztworu chloroformu/alkoholu izoamylowego (24:1) i wymieszaj przez stuknięcie.
    UWAGA: Wykonaj ten krok w okapie wyparowym, ponieważ chloroform jest toksyczny w przypadku wdychania i wymaga ostrożnego obchodzenia.
  14. Wiruj próbki w temperaturze 12000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  15. Ostrożnie zasysaj 550-600 μL fazy wodnej (górnej) do sterylnych probarek 1,5 mL i odpowiednio je oznaczyć.
    UWAGA: Uważaj, aby nie ruszyć innych warstw. Jeśli któreś warstwy zostaną przypadkowo uszkodzone, ponownie wiruj rurkę.

3. Wytrącanie i elucia DNA

  1. Dodaj równą objętość (550-600 μL) lodowatego izopropanolu i wymieszaj przez odwrócenie rurek.
    UWAGA: Jeśli stężenie DNA jest wysokie, podczas mieszania może powstać biała wytrąca.
  2. Inkubuj rurki w temperaturze -20 °C przez 30 minut do 1 godziny.
    UWAGA: Dłuższe czasy inkubacji mogą zwiększyć wytrącenie DNA18 , ale mogą również prowadzić do współwydzielania soli. Dlatego inkubacja nocna może być przeprowadzona, jeśli spodziewane jest niskie stężenie DNA.
  3. Wiruj w najwyższej prędkości (~21130 x g) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby rozpylić nierozpuszczalne DNA.
    UWAGA: Upewnij się, że przednia strona rurek 1,5 jest skierowana do wewnątrz wirnika wirówki. Na tym etapie DNA wytrąca się na dnie i wzdłuż tyłu rurek. Jest to ważne, aby nie zakłócić potencjalnie niewidocznego pelletu w kolejnym etapie. Biały osad lub osad może być widoczny, jeśli stężenie DNA jest wysokie. Brak granulki nie oznacza nieudanej ekstrakcji; Kontynuuj pozostałe kroki.
  4. Aspiruj supernatant z przedniej strony rurki, nie naruszając granulatu DNA ani nie dekantując go szybko, jednocześnie dbając o to, aby granulek pozostał nieruszony.
    UWAGA: Lepiej aspirować supernatant, jeśli hodowla początkowa jest mała i spodziewane jest niskie stężenie DNA.
  5. Dodaj 1000 μl lodowatego etanolu o 75%.
  6. Mieszaj, odwracając rurki kilka razy.
  7. Wirówka w 12000 × g przez 30 minut (w tej samej orientacji co w kroku 3).
  8. Wsysaj lub przelewaj cały etanol, nie naruszając granulki.
    UWAGA: Kroki 5-8 można powtórzyć, jeśli przewiduje się wysoką ilość koprecipitacji soli.
  9. Pozwól tubkom wyschnąć na powietrzu w RT przez noc lub przez co najmniej 30 minut.
  10. Do każdej probówki dodaj 25-50 μL buforu TE (pH 8), aby ponownie zawiesować DNA.
    UWAGA: DNA może być ponownie zawieszone w wodzie buforowej Tris (10 mM, pH 8) lub w wodzie bez nukleazy, jeśli aplikacje w dalszej części rzeki są wrażliwe na EDTA.
  11. Pozwól, by pellet DNA ponownie zawiesił się przez noc w temperaturze 4 °C.
  12. Przechowuj w temperaturze 4 °C przez 2-3 dni przed przeprowadzeniem oceny jakości.
  13. Przechowuj w -80 °C przez dłuższy czas.

4. Ilościowa identyfikacja DNA i kontrola jakości

UWAGA: Kontrola jakości DNA jest zazwyczaj wykonywana za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i elektroforezy żelowej. System ilościfikacji oparty na fluorescencji może być również używany do ilościowego określenia wyodrębnionego DNA.

  1. Metoda spektrofotometru
    1. Zmierz stężenie DNA i określ jakość zgodnie z zaleceniami producenta.
      UWAGA: Próbka DNA powinna mieć stosunek 260/280 między 1,7 a 2,0. Wartość 1,8 jest zwykle uznawana za czystą dla DNA. Wartości poniżej tego zakresu wskazują na zanieczyszczenie białkiem pozostałym, guanidyną lub innymi odczynnikami, które silnie wchłaniają się na głębokości 280 nm lub w jej okolicy. Idealny jest stosunek 260/230 między 2,0-2,2. Jeśli stosunek jest niższy niż oczekiwano, może to wskazywać na obecność zanieczyszczeń wchłaniających się w 230 nm, takich jak EDTA, fenol i węglowodany. Sprawdź również wykresy absorpcji uzyskane dla próbki.
  2. Elektroforeza żelowa
    1. Wykonaj elektroforezę żelowąagarozową 19 , aby ocenić integralność DNA i ustalić, czy doszło do fragmentacji lub degradacji.
    2. Aby wizualizować DNA w systemie dokumentacji żelu UV, użyj żelu agarozowego o zawartości 1,0% zawierającego barwnik SYBR Safe. Uruchom żel na 80 V przez 45 minut.
      UWAGA: Celem jest posiadanie wyraźnych, wyraźnych, wysokomolekularnych pasów powyżej najwyższego pasma drabiny DNA. Za każdym razem używaj nowego bufora 1× TAE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół ekstrakcji DNA metodą CTAB (Rysunek 1) został oceniony na różnych gatunkach grzybników, takich jak M. tuberculosis, M. abscessus i M. chelonea. Ekstrakcjonowano DNA i porównywano pod kątem wydajności, czystości i integralności wyodrębnionego DNA w różnych próbkach.

Stężenie DNA różniło się w poszczególnych gatunkach grzybniczych, w niektórych przypadkach wahając się od 190 do 600 ng/μL do >1000 ng/μL, co wskazuje, że CTAB wydoby...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Reprezentatywne wyniki pokazują użyteczność metody CTAB w ekstrakcji DNA z gatunków mykobakterii oraz w rozwiązywaniu wyzwań związanych z ekstrakcją DNA z tych organizmów. Mykobakterie są dobrze znane ze swoich złożonych i bogatych w lipidy ścian komórkowych2. Obecne wyniki podkreślają kilka kluczowych aspektów, które przyczyniają się do sukcesu tej techniki, ponieważ dostarcza ona nienaruszone DNA o wysokim stężeniu, wysokiej jakości, które powinno być odpowiednie do dalszych zastosowań, takich j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy wyrażają szczere podziękowania zespołowi genomiki gruźlicy: Nabili Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa oraz Robowi M Warrenowi za ich wkład w rozwój i optymalizację tego protokołu oraz za nieocenione wsparcie podczas całego badania. Prace te oraz zaangażowane osoby były wspierane grantami i finansowaniem od South African Medical Research Council (SAMRC), National Research Foundation (NRF) oraz Uniwersytetu w Stellenbosch (SU). Fundatorzy nie mieli żadnej roli w projektowaniu badania, zbieraniu danych, analizie ani przygotowaniu manuskryptów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Końcówki pipety 1 mLKażdy dostawca
10 & mikro; Końcówki pipety LKażdy dostawca
10% siarczan sodu dodecylowy (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)71736-100 ML
Rurki polipropylenowe o pojemności 15 mLKażdy dostawca
Probówki 2 ml i probówki 1,5 mlKażdy dostawca
200 & mikro; I pipete końcówkiKażdy dostawca
2-PROPANOL, BIOREAGENT, DLA MOLEKULARNEGO PASMA IMerck (Sigma-Aldrich)I9516-1L Przechowywać w -20 i stopniach; C
37 stopni; Inkubator CKażdy dostawca
5 M NaClMerck (Sigma-Aldrich)S6546 - 100 ML
65 stopni; Inkubator CKażdy dostawca
Żel agarozowyMerck (Sigma-Aldrich)
System dokumentacji żelu UV Bio-Rad,BioRad
Wirówka (do probówek 15 ml lub 50 ml) oraz mikrofuge (do probówek 2 ml)Każdy dostawca
CHLOROFORM DO ANALIZY EMPARTA® ACSMerck (Sigma-Aldrich)1070242500
Alkohol chloroformowy/izoamylowy (24:1)W okapu wymieszaj 384 ml chloroformu i 16 ml alkoholu izoamylowego
Rozwiązanie CTAB/NaClMerck (Sigma-Aldrich)52370-100 GRozpuszcz 4,1 g NaCl w 80 ml wody destylowanej. Podczas mieszania dodaj 10 g CTAB. Roztwór cieplny w 65 stopniach; Inkubator C. Reguluj objętość do 100 ml z wodą destylowaną. Przechowuj w temperaturze pokojowej do 6 miesięcy.
Drabinka DNA 1 KbThermo Fisher Scientific
ALKOHOL ETYLOWY, CZYSTY, 200 PROOF, DO MOL&Merck (Sigma-Aldrich)E7023-500MLWymieszaj 75 ml etanolu absolutnego i 25 ml wody destylowanej
Lizozym (10 mg/ml)Merck (Sigma-Aldrich)10837059001Rekonstytuacja liofilizowanego lizozymu (doprowadzony do temperatury pokojowej) za pomocą wody destylowanej do 10 mg/ml
Middlebrook 7H9 mediaMerck (Sigma-Aldrich)M0178Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi przygotowania płynnego medium
MIDDLEBROOK OADC WZBOGACANIE 6 x 100 ml F BD212240
Medium wskaźnika wzrostu mykobakterii (MGIT)BD245122
System NanoDropThermo Fisher Scientific
Pipeta P10Każdy dostawca
Pipeta P1000Każdy dostawca
Pipeta P200Każdy dostawca
Proteinaza K, recomb, PCR grd 2x250mg Merck (Sigma-Aldrich)3115801001Rekonfunduj fiolkę liofilizowanej proteinazy K w wodzie destylowanej do 10 mg/ml. Zamrażaj aliquoty w probówkach o pojemności 2 ml przy -20 i stopniach; C
SYBR-safeThermo Fisher Scientific
pH buforowe Tris/EDTA (TE) 8,0Merck (Sigma-Aldrich)8890-OP lub 382499997
WirKażdy dostawca

Bibliografia

  1. FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
  2. Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the mycobacterial envelope. Microbiol Spectr. 7 (4), 7.4.1(2019).
  3. Wayne, L. G., Sohaskey, C. D. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol. 55 (1), 139-163 (2001).
  4. Mohammadi, S., et al. Optimal DNA isolation method for detection of non-tuberculous mycobacteria by polymerase chain reaction. Adv Biomed Res. 6 (1), 133(2017).
  5. Van Soolingen, D., et al. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: Evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 29 (11), 2578-2586 (1991).
  6. Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr Protoc Mol Biol. 56 (1), 2.4.1-2.4.5 (2001).
  7. Van Embden, J. D., et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol. 31 (2), 406-409 (1993).
  8. Wang, W. -F., et al. Genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates and construction of a Beijing lineage reference genome. Genome Biol Evol. 12 (2), 3890-3905 (2020).
  9. Epperson, L. E., Strong, M. A scalable, efficient, and safe method to prepare high quality DNA from mycobacteria and other challenging cells. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. 19, 100150(2020).
  10. Warren, R., et al. Safe Mycobacterium tuberculosis DNA extraction method that does not compromise integrity. J Clin Microbiol. 44 (1), 254-256 (2006).
  11. Amaro, A., Duarte, E., Amado, A., Ferronha, H., Botelho, A. Comparison of three DNA extraction methods for Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium subsp. avium. Lett Appl Microbiol. 47 (1), 8-11 (2008).
  12. Arslan, N., Demiray-Gurbuz, E., Ozkutuk, N., Esen, N., Özkütük, A. A. Comparison of four different DNA isolation methods from MGIT culture for long-read whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis. Jundishapur J Microbiol. 17 (9), e148070(2024).
  13. Opperman, C. J., et al. Mycobacterium avium DNA extraction: Implications for NTM identification and amplicon sequencing. South Afr J Infect Dis. 40 (1), 5(2025).
  14. Froenicke, L. Illumina and Aviti sample and library requirements. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/illumina-aviti-sample-and-library-requirements (2015).
  15. Froenicke, L. PacBio Revio and Sequel II library prep & sequencing. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/pacbio-revio-and-sequel-ii-library-prep-sequencing (2016).
  16. Dippenaar, A., et al. Droplet-based whole genome amplification for sequencing minute amounts of purified Mycobacterium tuberculosis DNA. Sci Rep. 14, 9931(2024).
  17. Doig, C. The efficacy of the heat-killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
  18. Li, Y., et al. A systematic investigation of key factors of nucleic acid precipitation toward optimized DNA/RNA isolation. Biotechniques. 68 (4), 191-199 (2020).
  19. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2012).
  20. Van Soolingen, D., Hermans, P. W., De Haas, P. E., Van Embden, J. D. Insertion element IS1081-associated restriction fragment length polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex species: A reliable tool for recognizing Mycobacterium bovis BCG. J Clin Microbiol. 30 (7), 1772-1777 (1992).
  21. Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
  22. Dippenaar, A., et al. Exploring the potential of Oxford Nanopore Technologies sequencing for Mycobacterium tuberculosis sequencing: An assessment of R10 flowcells and V14 chemistry. PLOS ONE. 19 (6), e0303938(2024).
  23. Chang, A., et al. Metagenomic DNA sequencing to quantify Mycobacterium tuberculosis DNA and diagnose tuberculosis. Sci Rep. 12, 16972(2022).
  24. Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: The next culture-independent game changer. Front Microbiol. 8, 1069(2017).
  25. Marshall, J. E., et al. Methods of isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from environmental samples: A scoping review. Tuberculosis. 138, 102291(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakcja DNAmetoda CTABDNA ca ego genomulizy cian kom rkowychproteinaza Ktraktowanie lizozymemekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymielektroforeza w elu agarozowymbufor Tris EDTA
Ekstrakcja deoksyrybonukleinowym w całym genomie z gatunków Mycobacterium za pomocą techniki bromku cetylotrymetylamoniowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.