Method Article

System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

DOI:

10.3791/68411

⸱

August 22nd, 2025

 , 
1Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM), 2Programmes de biologie moléculaire, Université de Montréal, 3Département de Médecine, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół pomiaru kontaktów między komórkami w sąsiednich warstwach nabłonka w żywych dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila przy użyciu podejścia opartego na rekonstytucji GFP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzrost i wzorzec tkanki embrionalnej są w dużej mierze kontrolowane przez sygnały wymieniane lokalnie między populacjami komórek w samych tkankach. Cytonemy to rodzaj filopodiów sygnałowych zidentyfikowanych po raz pierwszy u Drosophila, które łączą się i pośredniczą w wymianie między komórkami wytwarzającymi i odbierającymi sygnał. W rozwijającym się krążku imaginalnym skrzydła Drosophila cytonemy biorą udział w wymianie sygnałów między różnymi populacjami komórek w nabłonku dysku właściwego (DP), który utworzy dorosłe skrzydło, a także między komórkami DP a komórkami w sąsiednich tkankach związanych z dyskiem. Cytonemy łączą synapsy z komórkami docelowymi, tworząc intymne kontakty błonowe.

W tym miejscu przedstawiamy protokół ilościowego określania kontaktu za pośrednictwem cytonemu między komórkami DP a komórkami sąsiedniego nabłonka błony okołopodalnej (PerM), który jest oddzielony od komórek DP światłem dysku, przy użyciu podejścia do rekonstytucji GFP w żywych dyskach skrzydeł. Korzystając z systemów GAL4-UAS i LexA-LexAop, komplementarne fragmenty rozszczepionego GFP (spGFP1-10, spGFP11), z których każdy jest połączony z domeną transbłonową CD4, ulegają ekspresji po obu stronach światła dysku. Obrazowanie odtworzonej fluorescencji GFP w preparatach żywych skrzydeł za pomocą mikroskopii konfokalnej jest następnie wykorzystywane do generowania stosów obrazów, z których można zlokalizować i określić ilościowo odtworzoną fluorescencję GFP. Za pomocą tego systemu możliwa jest jednoczesna ekspresja transgenów kodujących białka lub interferencje RNA w komórkach wytwarzających cytonemy lub docelowych, aby ocenić ich wpływ na kontakty komórkowe DP-PerM. System ten, łatwo adaptujący się do innych tkanek, umożliwia w ten sposób identyfikację czynników ważnych dla tworzenia lub funkcjonowania cytonemu.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój tkanek embrionalnych jest kontrolowany przez komórki znajdujące się w "centrach organizacyjnych", które sygnalizują odległym komórkom w tkance, kontrolując ich decyzje o proliferacji (tj. wzroście i podziale) lub przyjmowaniu określonychlosów1. W tej nieautonomicznej sygnalizacji komórkowej pośredniczą ligandy wytwarzane przez organizujące się komórki centralne, które tworzą gradienty stężeń w tkankach i wywołują reakcje zależne od stężenia. W wielu przypadkach ligandy te są dostarczane lub odbierane przez długie filopodia sygnalizacyjne oparte na aktynie, zwane cytonemami, które łączą komórki wysyłające i odbierające sygnały w tkankach<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sterownik nubbin-GAL4 służy do ekspresji CD4-spGFP1-10 w szczególności w obszarze kieszeni skrzydłowej DP (rysunek 1A). Sterownik PerM-LexA21 służy do ekspresji CD4-spGFP11 w specyficznym dla PerM (rysunek 1A). Te dwa systemy ekspresji są od siebie niezależne, umożliwiając jednoczesną i specyficzną ekspresję różnych transgenów w DP i PerM (ryc. 1B, C).

Podstawowy schemat genetyczny polega na krzyżowaniu much w celu wytworzenia larw o genotypie nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby przetestować przydatność procedury GRASP do pomiaru kontaktów między komórkami DP i PerM, zbadaliśmy krążki skrzydeł o czterech różnych genotypach: krążki kontroli negatywnej typu dzikiego (genotyp: w1118), które będą wyświetlać tylko poziomy autofluorescencji tła w kanale GFP; krążki wykazujące ekspresję CD4-spGFP1-10 w warstwie DP, ale pozbawione transgenu CD4-spGFP11, które będą pokazywać poziom fluorescencji wytwarzanej przez sam GFP1-10 (który spodziewaliśmy się, że będzie nieistotny, poniewa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytonemy odgrywają ważną rolę w dystrybucji ligandów, kontrolując wzrost i organizację rozwijających się tkanek. Wymiana sygnału odbywa się tam, gdzie końcówki cytonemu nawiązują intymny kontakt błonowy ze swoimi celami. W tym protokole opisujemy prostą metodę analizy kontaktów za pośrednictwem cytonemu między warstwami nabłonka w tarczy skrzydła przy użyciu techniki GRASP.

Przedstawiona tutaj technika wymaga co najmniej czterech komponentów - sterownika GAL4, sterownika LexA i dwóch transgenó.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta została wsparta grantem CIHR (PJT-162109) dla D.H. M.J. otrzymał stypendium doktoranckie od Fundacji Institut de Recherches Cliniques de Montréal oraz od Programu Biologii Molekularnej Uniwersytetu w Montrealu. Autorzy bardzo cenią sobie pomoc, jaką przyniosła im platforma IRCM Microscopy and Imaging (Mikroskopia i Obrazowanie).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Mikroskop sekcyjny Discovery V12Zeissmikroskop preparacyjny
Kleszcze Dumont #55, Wskazówki biologiczneNarzędzia naukowe11255-20kleszcze preparacyjne
EP-Slik (slik20358)BDSC (Biblioteka BDSC)Panneton i wsp. 2015 szczep muchy do odciągania Slik
FIDŻISchindelin J. i in. (2012) Oprogramowanie do analizy obrazu
Hoechst 33342 ThermoFisher NaukowyH3570 Obrazowanie na żywo barwienia jądrowego 
LexAop-CD4-spGFP11  BDSC (Biblioteka BDSC)93018Szczep muchy
Mikroskop konfokalny LSM 700 Zeissmikroskop konfokalny
nub-GAL4Centrum Hodowli Drosophila w Bloomington (BDSC)86108Szczep muchy
PerM-LexARambaud, Joseph i wsp., 2025Szczep muchy
PYREX 9-wgłębieniowa szklana płyta punktowaSprzedajNauki przyrodnicze Corning7220-85do zbierania i mycia larw
Schneider's Drosophila MediumThermoFisher Naukowy21720024Nośnik do obrazowania na żywo
Dystanse obrazowe SecureSeal, 8-dołkowe, grubość 0,12 mm Grace Bio-Labs654008Dystansowy
Zestaw elastomerów silikonowych SYLGARD 184Sylgard powiedział:3097358-1004do wykonywania płyt sekcyjnych
UAS-CD4-spGFP1-10  BDSC (Biblioteka BDSC)93017Szczep muchy
ZenZeissOprogramowanie do akwizycji

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development. Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).
  2. Kornberg, T. B. Cytonemes and the dispersion of morphogens. Wiley Interdiscip....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cytoneme Mediated ContactDrosophila Wing DiscGFP ComplementationLive ImagingConfocal MicroscopySplit GFP SystemCell Cell ContactPeripodial MembraneTissue Growth SignalingProtein Expression

Related Articles