System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

Rozwój tkanek embrionalnych jest kontrolowany przez komórki znajdujące się w "centrach organizacyjnych", które sygnalizują odległym komórkom w tkance, kontrolując ich decyzje o proliferacji (tj. wzroście i podziale) lub przyjmowaniu określonych^losów1. W tej nieautonomicznej sygnalizacji komórkowej pośredniczą ligandy wytwarzane przez organizujące się komórki centralne, które tworzą gradienty stężeń w tkankach i wywołują reakcje zależne od stężenia. W wielu przypadkach ligandy te są dostarczane lub odbierane przez długie filopodia sygnalizacyjne oparte na aktynie, zwane cytonemami, które łączą komórki wysyłające i odbierające sygnały w tkankach ^2,3. Po raz pierwszy odkryte w dysku imaginalnym skrzydła Drosophila⁴, cytonemy zostały również zidentyfikowane u ssaków i innych kręgowców 5,6,7,8,9. Lepsze zrozumienie roli cytonemów w sygnalizacji nieautonomicznej komórki, na wczesnym etapie, ma kluczowe znaczenie dla rozszyfrowania, w jaki sposób komórki komunikują się, aby zorganizować się w tkanki i jak te linie komunikacyjne są modyfikowane w różnych stanach patologicznych, w tym w wadach rozwojowych i raku.

Cytonemy mogą rozciągać się od komórek źródłowych, aby dostarczyć ligandy do komórek docelowych lub od komórek docelowych, aby otrzymać ligandy w pobliżu ich źródeł ^2,3. Cytonemy nawiązują bliskie kontakty ze swoimi celami, gdzie, jak się uważa, tworzą struktury podobne do synaps, w których może zachodzić transfer ligandów ^3,10,11. Ten kontakt może wystąpić między końcówkami cytonemów źródłowych i docelowych lub między cytonemami a ciałami komórkowymi³. Chociaż nie zostało to dokładnie scharakteryzowane, adhezja komórek poprzez cząsteczki adhezyjne lub poprzez interakcje receptor-ligand jest w niektórych przypadkach potrzebna do prawidłowej aktywacji dalszych zdarzeń sygnalizacyjnych 12,13,14, co czyni ją ważnym aspektem biologii cytonemu.

W kilku badaniach zastosowano technikę "rekonstytucji GFP u partnerów synaptycznych" (GRASP) do analizy kontaktów z cytonemami. Metoda ta została opracowana w celu identyfikacji i mapowania partnerów synaptycznych w złożonych układach nerwowych¹⁵. Opiera się na ekspresji dwóch komplementarnych fragmentów rozszczepionego GFP (spGFP1-10 i spGFP11), z których każdy jest połączony z regionem zewnątrzkomórkowym domeny transbłonowej (np. CD4), w różnych populacjach komórek. Jeśli błony plazmatyczne komórek w tych dwóch populacjach wejdą w bezpośredni kontakt, spowoduje to zbliżenie się komplementarnych domen spGFP, co prowadzi do odtworzenia fluorescencji GFP. Podejście to zastosowano u Drosophila w celu zidentyfikowania istnienia kontaktów cytonemu między komórkami w krążku skrzydła oraz między dyskiem skrzydła a innymi ściśle przylegającymi tkankami 12,16,17,18,19,20,21.

W pracy opisano zastosowanie GRASP do charakterystyki kontaktów między dwiema morfologicznie odrębnymi warstwami nabłonkowymi dysku imaginalnego skrzydła Drosophila, dyskiem właściwym (DP) i błoną okołopodniową (PerM). Te warstwy nabłonkowe tworzą worek otaczający centralne światło, z pseudowarstwowymi kolumnowymi komórkami DP znajdującymi się po jednej stronie i płaskonabłonkowymi komórkami PerM po drugiej, obie z błonami wierzchołkowymi skierowanymi do wewnątrz w kierunku światła (ryc. 1A). Istnieją pewne dowody na sygnalizację przezlumenalną między dwiema warstwami 22,23,24,25, a ostatnio udokumentowaliśmy sygnalizację z DP w celu kontrolowania proliferacji komórek PerM, w której pośredniczą cytonemy wierzchołkowe w DP²¹. Protokół ten polega na wykorzystaniu systemów ekspresji transgenów GAL4 / UAS i LexA / LexAop do ekspresji komplementarnych fragmentów spGFP połączonych z CD4 na błonach komórek DP i PerM. Wykorzystuje odtworzoną fluorescencję GFP do odczytu kontaktu błonowego między dwiema populacjami komórek.

Sterownik nubbin-GAL4 służy do ekspresji CD4-spGFP1-10 w szczególności w obszarze kieszeni skrzydłowej DP (rysunek 1A). Sterownik PerM-LexA²¹ służy do ekspresji CD4-spGFP11 w specyficznym dla PerM (rysunek 1A). Te dwa systemy ekspresji są od siebie niezależne, umożliwiając jednoczesną i specyficzną ekspresję różnych transgenów w DP i PerM (ryc. 1B, C).

Podstawowy schemat genetyczny polega na krzyżowaniu much w celu wytworzenia larw o genotypie nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. Jako kontrolę negatywną pomijamy transgen LexAop-CD4-spGFP11 . Inne transgeny (np. kodujące białka, dwuniciowy RNA) mogą być dowolnie wyrażane w warstwie DP (pod kontrolą sekwencji UAS ) lub w PerM (pod kontrolą operatora LexA).

Jest to protokół obrazowania na żywo, którego nie można przerwać. Przygotowanie materiału szacuje się na ~10 min. Sekcje nie powinny być wykonywane jednorazowo dłużej niż 20 minut przed obrazowaniem. Obrazowanie trwa ~30 min i nie powinno trwać dłużej niż ~1 h. W przypadku wielu warunków lub dużej liczby próbek, procedura musi być przeprowadzana w wielu rundach, aby zapewnić najlepsze wyniki.

1. Przygotowanie materiału

1. Przed sekcją wyczyść pęsetę, 9-dołkową szklaną płytkę punktową (lub inny pojemnik odpowiedni do zbierania i czyszczenia larw) oraz pokrytą silikonem szalkę Petriego wielokrotnego użytku pokrytą silikonem używaną do sekcji z 70% etanolem.
2. Przygotuj szkiełka mikroskopowe, wykonując płukanie 70% etanolem, a następnie przyklejając przekładkę obrazową do wysuszonego szkiełka. Wytnij nożyczkami poszczególne studzienki z 8-dołkowego paska i przetnij na pół (ryc. 2A). Usuń podkład ochronny z jednej strony każdej połówki i przyklej przekładki do suwaka, lekko rozstawione od siebie, aby stworzyć osłoniętą przestrzeń pośrodku, w której zostaną umieszczone dyski (Rysunek 2B).
   UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że upraszcza to montaż próbki, ponieważ dokładna objętość medium przenoszonego na szkiełko jest mniej krytyczna. Każdy niewielki nadmiar objętości po prostu wypłynie przez szczelinę po nakryciu. Ponieważ obrazujemy tylko przez stosunkowo krótki czas (zazwyczaj ~1 h), nie doświadczyliśmy żadnych problemów ze średnim suszeniem.
3. Rozmrozić pożywkę do obrazowania na żywo (nieuzupełnioną pożywkę Schneider's Drosophila Medium przechowywaną w zamrożonych 10 ml porcji) i przechowywać w łatwo dostępnym pojemniku na lód.
4. W probówce do mikrowirówek o pojemności 2 ml wymieszaj 1,5 ml pożywki z 20 μl 200 μg/ml Hoechst 33342 (stężenie końcowe 2,7 μg/ml). Trzymaj probówkę na lodzie.
   UWAGA: Ta specyficzna forma barwnika Hoechst jest stosowana, ponieważ jest wysoce przepuszczalna przez błonę. UWAGA: Podczas obchodzenia się z Hoechst 33342 należy używać rękawic. Narzędzia należy umyć po użyciu.

2. Rozwarstwienie tarczy skrzydła i przygotowanie ślizgu

1. Po krzyżowaniu genetycznym i hodowli w temperaturze 25°C należy pobrać z probówki wędrujące larwy w trzecim stadium rozwojowym i umyć je w zimnym podłożu do obrazowania na żywo w 9-dołkowej szklanej płytce punktowej.
   UWAGA: Cytonemy są bardzo delikatne. W kolejnych krokach należy zachować ostrożność, aby manipulować tkankami wokół dysków, starając się unikać bezpośredniego kontaktu między dyskami a narzędziami preparacyjnymi. Przygotowujemy trzy lub cztery larwy na raz, ponieważ uszkodzenie kilku krążków jest nieuniknione, a może to stać się zauważalne dopiero na etapie obrazowania.
2. Pod mikroskopem preparacyjnym przenieś larwy do kropli żywego podłoża obrazowego na pokrytej silikonem szalce Petriego i rozpocznij sekcję za pomocą dwóch kleszczy preparacyjnych. Aby to zrobić, najpierw przytrzymaj głowę i przednią część ciała stabilnie, ściskając larwy jedną parą kleszczy na około jednej trzeciej długości ciała (od przedniej). Używając drugiej pary kleszczy, uszczypnij ciało tuż za pierwszymi kleszczami. Następnie odciągnij tylną część larw, aby odizolować przednią "połowę".
3. Odwróć przednią połowę, zabezpieczając ją jedną parą pęset po obu stronach odciętego końca i przepychając głowę drugą parą (jak odwrócenie skarpety na lewą stronę), aby odsłonić wewnętrzne struktury, w tym wyimaginowane krążki, tchawicę, gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita.
4. Ostrożnie usuń gruczoły ślinowe, ciało tłuszczowe i jelita, uważając, aby nie naruszyć bocznych pni tchawicy, które powinny pokrywać i chronić krążki skrzydeł.
5. Za pomocą kleszczyków ostrożnie przenieś oczyszczone przednie połówki z dołączonymi krążkami skrzydełkowymi do kropli czystego podłoża do obrazowania na żywo za pomocą Hoechst, umieszczonego między przekładkami na przygotowanym szkiełku (ryc. 2C). Odizoluj krążki skrzydeł od reszty tkanek, delikatnie tępo odcinając je od drobnych gałęzi tchawicy, które łączą się z dyskiem, używając jednego ostrza kleszczy preparacyjnych lub cienkiego drutu wolframowego przymocowanego do uchwytu igły preparującej. Resztę tuszy należy wyrzucić.
6. Ustaw tarcze za pomocą jednego ostrza kleszczy preparacyjnych lub igły preparacyjnej z drutu wolframowego. Ze względu na ich spłaszczony kształt przypominający łzę, dyski skrzydeł będą opadać z DP lub PerM skierowanym do góry. W przypadku tego protokołu zorientuj wszystkie dyski stroną PerM do góry.
7. Dostosuj objętość podłoża, aby całkowicie wypełnić studzienkę, do poziomu nieco powyżej poziomu przekładki obrazowania, dodając lub usuwając pożywkę w razie potrzeby. Usuń podkład ochronny z górnej strony każdej połówki przekładki obrazowania, a następnie ostrożnie opuść szkiełko nakrywkowe na próbkę. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe w miejscu, w którym styka się z przekładkami obrazowymi (np. zaokrąglonym końcem kleszczy preparacyjnych), aby upewnić się, że szkiełko nakrywkowe przylega do przekładki.
   UWAGA: Poziom medium powinien znajdować się nieco powyżej wysokości przekładki, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza, ale nie na tyle wysoko, aby generować znaczny przepływ, gdy szkiełko nakrywkowe jest opuszczone.

3. Obrazowanie

1. Obrazowanie próbek w temperaturze pokojowej za pomocą mikroskopu konfokalnego (laser argonowo-jonowy o długości fali 488 nm dla GFP, laser UV o długości fali 350 nm dla Hoechst) wyposażony w soczewkę zanurzeniową olejową 40x/1,30 NA i oprogramowanie do mikroskopii. Uzyskuj stosy obrazów o rozmiarze kroku 1 μm, które rozciągają się od nieco powyżej najwyższego poziomu PerM (gdzie fluorescencja Hoechsta maleje) do podstawowej strony DP, co zwykle daje ponad 100 obrazów na stos. Pobieraj powtarzające się stosy obrazów, aby generować filmy poklatkowe.
   UWAGA: Obrazujemy slajd nie dłużej niż ~1-2 h.
2. W przypadku ustawień oprogramowania mikroskopu należy rejestrować obrazy za pomocą kodowania 8-bitowego, uśredniania linii 2, wzmocnienia detektora zwykle od 650 do 750 oraz oddzielnych ścieżek kanałów, aby zmniejszyć wyciek sygnału. Używaj identycznych ustawień lasera i detektora dla wszystkich warunków, określonych z góry przez wcześniejsze wykonanie testów dla każdego stanu.
   UWAGA: Przy 40-krotnym powiększeniu nasze obrazy mają rozdzielczość 5,0386 pikseli na μm (rozmiar piksela: 0,1985 x 0,1985 μm²). W naszej konfiguracji optymalne ustawienia mikroskopu konfokalnego obejmowały najwyższą możliwą intensywność lasera (bez uszkadzania tkanki), aby uchwycić jak najwięcej sygnału, a jednocześnie zapewnić niewielkie lub zerowe nasycenie; oraz najniższy możliwy poziom hałasu oceniany na podstawie kontroli ujemnych, osiągnięty poprzez zmniejszenie przesunięcia detektora i prędkości akwizycji (w razie potrzeby). Zazwyczaj używamy mniej niż 5% mocy lasera i maksymalnej prędkości głowicy skanującej ("9" w ustawieniach oprogramowania Zen). Pozyskanie pojedynczego stosu obrazów zajmuje zwykle ~1 min 45 s, a zdjęcia są wykonywane co 2-3 minuty w celu analiz poklatkowych.

4. Analiza obrazu

1. Wyświetlaj stosy przy użyciu funkcji projekcji o maksymalnej intensywności w pakiecie oprogramowania ImageJ (kliknij na obraz | Stosy | Z wybierz z menu Maksymalna intensywność ).
2. Na obrazach MIP określ obszar kieszeni skrzydła na podstawie wzoru składania tarczy skrzydła (przy użyciu kanału Hoechsta) przy użyciu wyboru wielokąta. Użyj tego samego wyboru na kanale GFP z funkcją Clear Outside ( kliknij Edytuj | Wyczyść na zewnątrz), aby ustawić wartość każdego piksela zewnętrznego na 0.
3. Na obrazach MIP użyj kanału Hoechst, aby wyczyścić obrazy GFP, w szczególności usuwając wszelkie artefakty, które pojawiają się w obu kanałach, ustawiając odpowiednią wartość piksela na 0 (kliknij Wybór wielokąta, a następnie Edytuj | wyczyść).
4. Na oczyszczonych obrazach MIP użyj funkcji Histogram (kliknij Analizuj | Histogram | Lista), aby uzyskać i skopiować listę wszystkich wartości pikseli do tabeli w arkuszu kalkulacyjnym.
5. Ustalić wartość progową na podstawie analizy sygnału tła w kontrolach ujemnych (a następnie zweryfikować w innych próbkach; zob. dyskusję).
6. Obliczyć procentowy udział powierzchni dodatniej według GFP, korzystając z następującego wzoru:
   %Powierzchnia dodatnia według GFP = × 100
7. Znormalizuj dane na końcu, dzieląc każdą wartość przez średnią warunku odniesienia (który jest ustawiony na 1).
   UWAGA: Prawidłowy piksel = piksel o wartości ≥ 1, skutecznie ignorując usunięty piksel, którego wartość została ustawiona na 0. Wartości pikseli równe 0 nie występują naturalnie.
8. Aby określić, gdzie w dyskach lokalizuje się odtworzony sygnał GFP, użyj reslices XZ stosów obrazów, aby spojrzeć na oś apikopodstawną nabłonka dysku. Wykonuj ponowne cięcie na Fidżi bez interpolacji i zwiększ wysokość obrazu na osi Z za pomocą funkcji Skala z interpolacją dwuliniową, aby poprawić widoczność.

Aby przetestować przydatność procedury GRASP do pomiaru kontaktów między komórkami DP i PerM, zbadaliśmy krążki skrzydeł o czterech różnych genotypach: krążki kontroli negatywnej typu dzikiego (genotyp: w1118), które będą wyświetlać tylko poziomy autofluorescencji tła w kanale GFP; krążki wykazujące ekspresję CD4-spGFP1-10 w warstwie DP, ale pozbawione transgenu CD4-spGFP11, które będą pokazywać poziom fluorescencji wytwarzanej przez sam GFP1-10 (który spodziewaliśmy się, że będzie nieistotny, ponieważ GFP1-10 nie powinien fluoryzować26); dyski, w których CD4-spGFP1-10 i CD4-spGFP11 są wyrażone odpowiednio w DP i PerM (rysunek 3A), co ujawni "normalny" poziom kontaktu DP-PerM; oraz krążki, które oprócz CD4-spGFP1-10 i CD4-spGFP11 wykazują również ekspresję kinazy białkowej Ser/Thr Slik w komórkach DP pod kontrolą UAS . Ekspresja Slik w komórkach DP napędza nieautonomiczną proliferację komórek PerM27. Napędza również tworzenie cytonemów wierzchołkowych w komórkach DP, które przechodzą przez światło dysku i wydają się stykać z komórkami PerM, często stabilnie21. W związku z tym spodziewaliśmy się, że ekspresja Slik zwiększy komplementację GFP w tej eksperymentalnej konfiguracji.

Obrazowanie na poziomie PerM w dyskach typu dzikiego ujawniło zwykłe ułożenie tych komórek, których płaskonabłonkowa morfologia i niska szybkość proliferacji skutkują rozrzuconym wyglądem jąder (wizualizowane przez barwienie Hoechsta, ryc. 3B). Wykryto minimalną ilość autofluorescencji, głównie w postaci ziarnistych plamek o niskiej intensywności, które miały tendencję do skupiania się w kierunku środka torebki skrzydłowej (ryc. 3B). Dyski wyrażające tylko CD4-spGFP1-10 w DP wyglądały bardzo podobnie, a fluorescencja wydawała się mieć podobną intensywność (ryc. 3C). Użyliśmy poziomu intensywności autofluorescencji w dyskach kontroli negatywnej, aby ustawić próg dla sygnałów w eksperymencie, przy czym mniej niż ~0,2% intensywności pikseli w większości obrazów kontroli negatywnej przekraczało ten próg. Kwantyfikacja względnej powierzchni obszaru torebki skrzydłowej na każdym obrazie, który miał wartości pikseli powyżej tego progu, potwierdziła, że poziom fluorescencji był nie do odróżnienia od tła w dyskach wyrażających tylko CD4-spGFP1-10 (Figura 3F).

W dyskach wyrażających CD4-spGFP1-10 w torbie skrzydłowej i CD4-spGFP11 w PerM, zaobserwowaliśmy pojawienie się większej liczby jaśniejszych plam fluorescencji GFP (ryc. 3D). W reslice'ach XZ stosów obrazów płyt, te jaśniejsze punkty są zlokalizowane w świetle dysku, gdzie spodziewamy się komplementacji GFP21. Kwantyfikacja wykazała, że względna powierzchnia obszaru torebki skrzydłowej na każdym obrazie, na którym wartości pikseli przekraczały próg, była na ogół większa niż 0,5%, czyli poziom znacznie wyższy niż w kontrolach ujemnych (Rysunek 3F). Wynik ten sugeruje, że zwykle istnieje niski poziom kontaktu między komórkami DP i PerM podczas rozwoju dysku.

Ekspresja Slik w warstwie DP spowodowała dramatyczne zmiany w wyglądzie PerM. W obszarze leżącym nad torebką skrzydłową, w której ulegał ekspresji Slik, nastąpił ogromny wzrost liczby jąder komórek PerM, co odzwierciedla silną stymulację proliferacji komórek (ryc. 3E). Stwierdzono również powszechne pojawienie się fluorescencji GFP o wysokiej intensywności, która pasowała do lokalizacji zwiększonej proliferacji komórek PerM (Figura 3E, F). Sugeruje to, że cytonemy wierzchołkowe powstałe w odpowiedzi na Slik nawiązują bliskie kontakty z komórkami w PerM, co jest zgodne z odpowiedzią proliferacyjną tych komórek. Chociaż z tych wyników jasno wynika, że Slik sprzyja kontaktom błona-błona DP-PerM, nie możemy wykluczyć, że inne mechanizmy, takie jak wydzielane lub zrzucane pęcherzyki błonowe DP, mogą przyczyniać się do tego efektu.

Ryc. 1: Organizacja dysku imaginalnego skrzydła Drosophila . (A) Schemat skrzydłowego dysku imaginalnego. Obraz po lewej stronie to widok en face (XY), po prawej to przekrój YZ. DP jest w kolorze niebieskim, z obszarem kieszeni skrzydłowej zacieniowanym na ciemnoniebiesko. PerM jest reprezentowany przez czarną przerywaną linię w widoku XZ. DP i PerM zawierają centralny prześwit. (B) MAX Z projekcja konfokalnego stosu obrazów dysku skrzydła, w którym mirystoilowany TdTomato (czerwony) był wyrażany w całej torbie skrzydłowej pod kontrolą sterownika nubbin-GAL4 , a jądrowy GFP (GFPnls, zielony) był wyrażany w PerM pod kontrolą sterownika PerM-LexA . Podziałka liniowa = 20 μm. (C) Przekrój XZ stosu obrazów dysku jak w B, pokazujący nienakładanie się domen wyrażeń nubbin-GAL4 i PerM-LexA . Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Montaż próbek za pomocą przekładek do obrazowania na żywo. Zdjęcia przedstawiające (A) cięcie 8-dołkowych przekładek do obrazowania, (B) umiejscowienie i mocowanie przekładek na szklanym szkiełku mikroskopowym oraz (C) umiejscowienie kropli pożywki do obrazowania na żywo w przestrzeni osłoniętej przez przekładki do obrazowania, w której zamontowane są dyski. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kwantyfikacja kontaktów błonowych między populacjami komórek DP i PerM w dysku skrzydła. (A) Schemat konfiguracji eksperymentalnej, z ekspresją CD4-spGFP1-10 sterowaną przez GAL4 w DP i ekspresją CD4-spGFP11 sterowaną przez LexA w PerM. Kontakt między dwiema warstwami nabłonka w poprzek światła powoduje komplementację fluorescencji GFP. (B-E) Obrazy konfokalne pokazujące połączone kanały żywych dysków skrzydeł wyrażających (B) brak części spGFP (w1118), (C) CD4-spGFP1-10 w samej warstwie DP, (D) razem z CD4-spGFP11 w PerM, lub (E) zarówno z CD4-spGFP11 w PerM, jak i Slik w DP. Obrazy są projekcjami MAX Z, z Hoechstem w kolorze białym i kanałem GFP w kolorze zielonym na górnych obrazach. Podziałka = 20 μm. (F) Wykres przedstawiający względną powierzchnię fluorescencji GFP powyżej intensywności progowej na krążek dla każdego warunku (średnia ± odchylenie standardowe). Dane znormalizowano do stanu CD4-spGFP1-10 + CD4-spGFP11 (wartość wyjściowa). Wartości p obliczono przy użyciu niesparowanego jednoczynnikowego porównania ANOVA firmy Welch z wielokrotnym porównaniem Dunnett T3. Skróty: DP = tarcza właściwa; PerM = błona okołopodialna. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Rambaud et al.21. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.