Method Article

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

DOI:

10.3791/68420

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, San Francisco, 2Jules Stein Eye Institute, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej to makrofagi ośrodkowego układu nerwowego (OUN), które reagują na infekcje tkankowe i urazy. Oprócz roli w stanie zapalnym, mikroglej odgrywa rolę rozwojową w udoskonalaniu obwodów poprzez przycinanie synaptyczne. Jednak mechanizmy przycinania synaptycznego w neurozapaleniu i neurodegeneracji pozostają nieznane. W tym protokole używamy modelu explantowego siatkówki myszy do badania dynamiki mikrogleju ex vivo. Aby zbadać ruchliwość mikrogleju i ich interakcje z białkami postsynaptycznymi, oznaczamy synapsy AAV-PSD95-RFP oraz nagrywamy filmy poklatkowe ruchomych mikrogleju współlokalizowanych z białkami postsynaptycznymi za pomocą mikroskopii konfokalnej z obracającym się dyskiem. Następnie tworzymy rekonstrukcje powierzchniowe i punktowe mikrogleju oraz PSD95 za pomocą oprogramowania do analizy obrazów. Dane takie jak długość przemieszczenia mikrogleju, szybkość procesu oraz kontakt z punktami postsynaptycznymi mogą być następnie wyodrębniane z tych powierzchni, aby zrozumieć zachowanie mikrogleju zarówno w stanach homeostatycznych, jak i po uszkodzeniu neuronów. Protokół ten może być przydatny do badania roli mikrogleju w przycinaniu synaptycznym w chorobach neurodegeneracyjnych siatkówki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcja obwodu i homeostaza opierają się na silnie regulowanym wyładowaniu synaps oraz innych unikalnych interakcjach między różnymi typami komórek1. Mikroglej pełni rolę rezydujących makrofagów ośrodkowego układu nerwowego (OUN), to populacja nieneuronalna w siatkówce, która odgrywa unikalną rolę w przycinaniu synaptycznym. Podczas rozwoju OUN mikroglej przycina niefunkcjonalne lub słabe synapsy, aby udoskonalić obwody nerwowe2. Mikroglej w rozwijającym się mózgu obserwuje swoje otoczenie i jest przygotowany do roli neuroprotekcyjnej w krytycznych okresach3. W rozwoju układu wzrokowego mikroglej jest kluczowym regulatorem rozwoju neuronów korowych i interneuronów, a także wykazuje zmiany morfologiczne podczas krytycznych okresów przebudowywania synaptyki4. Podobnie w rozwijającej się siatkówce mikroglej oczyszcza komórki apoptotyczne, tworząc miejsce dla nowych połączeń synaptycznych, co potwierdzono wzrostem poziomu homeostatycznego markeru P2Ry12 podczas tych procesów oczyszczania5. Jednak najnowsze odkrycia wskazują, że mikroglej może nie odgrywać ostatecznej roli w udoskonalaniu obwodów nerwowych w rozwijającym się układzie wzrokowym6, podkreślając kontrowersje dotyczące roli mikrogleju w rozwoju obwodów wzrokowych.

W kontekstach urazów mikroglej zmienia morfologię w stan aktywny i może pełnić rolę neurodegeneracyjną. Na przykład mikroglej w modelach choroby Alzheimera wykazał zwiększone zajatynie blaszek amyloid-beta7 oraz markerów synaptycznych, takich jak SPH i PSD958. W neurodegeneracji siatkówki wiele grup badawczych stwierdziło mikroglej z pochłaniającym materiałem synaptycznym, ale brak wyraźnych dowodów na aktywne pochłonięcie nienaruszonych synaps 9,10,11,12,13. Na przykład He i in. stwierdzili, że liczba mikrogleju wzrasta i zwiększa objętość pochłoniętego materiału synaptycznego w modelu retinitis pigmentosa9, ale nie jest jasne, czy doszło do fagocytozy nienaruszonych synaps, czy do usuwania zanieczyszczeń. Dodatkowo, tradycyjne klasyfikacje mikroglejów — takie jak "spoczynkowy vs. aktywowany" czy "M1 vs. M2" — są zbyt uproszczone i coraz mniej dokładne w świetle współczesnych wniosków. Mikroglej występuje w gradiencie stanów, a nie w kategoriachdyskretnych 12. Dlatego Paolicelli i in. wezwali do przesunięcia się od przestarzałych klasyfikacji binarnych na bardziej zniuansowaną, rygorystycznie zdefiniowaną nomenklaturę stanów mikroglejowych, aby lepiej zrozumieć i zdefiniować morfologię oraz aktywność mikrogleju12. Dlatego strategie oceny funkcji mikrogleju ex vivo i in vivo zwiększą zdolność tej dziedziny do rozpoznawania stanów i aktywności mikrogleju zarówno w kontekście rozwoju, jak i choroby.

Chociaż istnieją strategie badania funkcji mikrogleju zarówno ex vivo, jak i in vivo, obrazowanie na żywo ex vivo przynosi kilka korzyści. Po pierwsze, przejrzystość rogówki lub rozwój zaćmy nie utrudniają obrazowania siatkówki, umożliwiając wyraźną wizualizację drobnych procesów i punktów synaptycznych. Ponadto obrazowanie in vivo wymaga więcej umiejętności technicznych przy przygotowaniu, co sprawia, że przygotowania ex vivo są o wyższej przepustowości, co skutkuje większą liczbą zdjęć zwierząt na eksperyment. Pomimo teoretycznych korzyści, jakie może umożliwić obrazowanie in vivo, do rejestrowania ruchliwości mikrogleju potrzebna jest wysoka moc laserowa (100-230 μW) do obrazowania podłużnego14,15. Jednak obrazowanie mikrogleju ex vivo z niższą mocą lasera i odpowiednim medium obrazowym może zapewnić taką samą jakość obrazowania jak in vivo przy odpowiednim przygotowaniu, choć tkanka nie jest już na swoim miejscu.

Wykazano, że mikroglej zwiększa liczebność, złożoność i ruch procesów po przejściowym ciśnieniu wewnątrzgałkowym (IOP) napoziomie 10. W tkance usztywnionej mikroglejoza skutkuje zwiększoną kolokalizacją z białkami synaptycznymi10. Wcześniejsze badania wykazały również wczesną utratę synaps i degenerację dendrytów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w modelu nadciśnienia oczu indukowanego laserem u myszy (LIOH) oraz innych modelach neurodegeneracyjnych 10,16,17,18,19,20. Jednak nadal nie wiadomo, czy odgrywają aktywną rolę w przycinaniu synaps, czy raczej bardziej pasywną w usuwaniu zaniedbań komórkowych, w tym rozłożonych synaps. Ponieważ rozkład synaps jest wczesnym znakiem rozpoznawczym neurodegeneracji, zrozumienie dynamiki mikrogleju i jego roli w rozkładaniu synaps jest kluczowe 8,10. Tutaj wykorzystujemy obrazowanie na żywo, aby zrozumieć dynamikę mikrogleju i ich interakcję z pobudzającym białkiem gęstości postsynaptycznej-95 (PSD95) na dendrytach RGC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęta były trzymane na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco, pod cyklami świetlnymi 12 godzin światła i 12 godzin ciemności, podawano im wodę i standardową dietę ad libitum, chyba że zaznaczono inaczej. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco. Zobacz Tabelę materiałów dotyczących materiałów i instrumentów używanych w tym protokole. Przegląd procedury eksperymentalnej, od iniekcji wewnątrzskvitrealnej po obrazowanie i analizę, przedstawiono na Rysunku 1.

1. Produkcja i efektywność wirusów AAV-PSD95-TagRFP

  1. Skonstruuj AAV-PSD95-tagRFP, biorąc sekwencję PSD-95pTagRFP (Addgene plasmid #52671; RRID:Addgene_52671) i włożenie go poniżej promotora CMV w AAV-CMV-GFP po usunięciu GFP (plazmid Addgene #67634; RRID: Addgene_67634).
  2. Przygotuj wirusa przy użyciu potrójnie transfekowanego HEK293T, oczyszczonego PEG/chloroformem i skoncentrowanego do miana10,12 ip/mL (opisanego w Negrini i in.).21.
    UWAGA: Ta metoda produkcji wirusa zazwyczaj generuje niższy miar niż ultrawirowanie, ale w tych eksperymentach pożądane jest posiadanie rzadko zakażonych komórek21. Wersja kapsyd/serotyp użyta w tych eksperymentach to 7m8, (Addgene plasmid # 64839; RRID: Addgene_64839).
    1. Sprawdź wydajność AAV przed przystąpieniem do pełnego protokołu obrazowania.
      UWAGA: Czytelnicy wdrażający ten protokół powinni dążyć do rzadkiego oznaczania RGC, ponieważ celem jest identyfikacja i izolacja pojedynczych dendrytów RGC.
  3. Zweryfikować pomyślną transfekcję, a następnie naprawić siatkówkę w 2% PFA w 1x ACSF. W przypadku białek synaptycznych sprawdź sygnał pod mikroskopem konfokalnym na 63x, aby potwierdzić wyraźną rozdzielczość znakowania fluorescencyjnego.
    UWAGA: Niższe stężenie wiązania pomaga zachować znakowanie białek synaptycznych. Jeśli stosowany AAV nie dotyczy składników synaptycznych, czytnicy mogą wybrać 4% PFA.

2. Hodowla myszy i iniekcje AAV-PSD95-TagRFP wewnątrzszkliste

  1. Krzyżowanie samców i samic myszy albinosów CD-1 (szczep 022) z B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J (szczep 005582), aby uzyskać myszy albinosów CD-1 z mikroglejem ekspresującym EGFP. Poczekaj co najmniej cztery pokolenia krzyżowania wstecznego, aby użyć heterozygotycznych myszy samca i samicy Cx3cr1 w eksperymentach. Utrzymuj i odświeżaj szczep po 10 pokoleniach z powrotem na tło CD-1, aby zapobiec dryfowi genetycznemu.
  2. Znieczulanie zwierząt (P30-P60) za pomocą znieczulenia izofluranowego przez komorę indukcyjną z użyciem 3-5% znieczulenia w tlenie i przepływem 1 L/min tlenu. Umieść zwierzę pod stereomikroskopem, jednocześnie dbając o ciągłe podawanie izofluranu przez stożek nosa. Aby potwierdzić, że zwierzę jest znieczulone, uszczypnij palec co najmniej 3 razy, żeby się upewnić.
  3. Przed wstrzyknięciem AAV dodaj kroplę 0,5% proparakainy. Wstrzyknąć 2 μL AAV-PSD95-RFP powoli dożytrawnie do obu oczu w miejscu nadskroniowym, używając strzykawki o pojemności 26 G 10 μL. Powoli wyjmij igłę, aby zapobiec cofaniu się AAV przez miejsce wkłucia. Po wstrzyknięciu nałóż maść antybiotykową na oczy.
  4. UWAGA: Igła nie powinna przechodzić dalej niż do połowy obwodu komory szklistej. W ten sposób siatkówka i soczewka mogą zostać uszkodzone wraz z końcówką igły, co prowadzi do przenikliwości lub nawet nieudanej transfekcji. Rozwój zaćmy lub krwotok wskazuje na błędną technikę iniekcji.
  5. Po wstrzyknięciu potwierdzi, że zwierzęta są czujne, zanim odłożysz je do pierwotnych klatek i pokoi mieszkalnych. Jeśli zwierzę odczuwa ból po wstrzyknięciu, podaj buprenorfinę dootrzewnowową. Poczekaj 3 tygodnie na ekspresję AAV. Jeśli stosuje się model indukowalny do podniesienia ciśnienia wewnątrzgałkowego (lub wykonania innych manipulacji), należy odczekać 3 tygodnie przed wywołaniem podwyższonego ciśnienia wewnątrzgałkowego w jednym oku, używając oka przeciwległego lub oczu naiwnego zwierzęcia jako kontrolę.

3. Eutanazja i płaskie montaże siatkówki

  1. Przygotuj świeży, 1x roztwór sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF, pH 7,4) w 1x PBS zawierający następujące składniki w mM: 119 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 MgCl2,6H 2O, 2,5 CaCl 2,2H2O, 1 NaHPO4, 11 glukozy i 20 HEPES.
  2. Utlen roztworu należy przez co najmniej 15 minut przed zastosowaniem go do ostrej sekcji. Podłącz rurkę do butli z tlenem i załóż korek z otworem na środku, aby zapobiec ucieczce gazu.
  3. Uśpić mysz co najmniej 1 mL znieczulenia izofluranowego w małej komorze indukcyjnej, a następnie wykonać zwichnięcie szyjki macicy. Przed enukleacją oznacz stronę nosową rogówki, aby można było śledzić lokalizację siatkówki w trakcie eksperymentu.
    1. Aby zainfundować oczy wstrzyknięte mikrokulkami lub laserem, wykonaj ograniczoną orzewnicę spojówkową i umieść nożyczki za okiem, aby rozcinać oko u podstawy nerwu wzrokowego. Dzięki temu delikatne oko pozostaje nienaruszone.
  4. Za pomocą mikroskopu sekcyjnego nakłuj mały otwór igłą 23 G lub 25 G w rogówce, co pozwala natlenionym ACSF przeniknąć oko. Włóż nożyczki do tego otworu, aby zrobić fiducijarne cięcie na końcu nosa.
  5. Odetnij resztę rogówki i tęczówki w miejscu limbusu.
  6. Usuń tęczówkę i obiektyw. Jeśli siatkówka przykleja się do soczewki, oddziel ją kleszczemi.
  7. Oddziel siatkówkę od twardówki, delikatnie rozcinając ją kleszcze między RPE a siatkówką nerwową.
  8. Umieść siatkówkę po stronie niesiateczkowej papieru membranowego z estrów mieszanych celulozowych (MCE), aby uzyskać wyraźną wizualizację i obrazowanie.
  9. Wykonuj małe, relaksujące cięcia w siatkówce w pozostałych trzech kwadrantach, z najdłuższym nacięciem w siatkówce nosowej, aby śledzić lokalizację siatkówki.
    UWAGA: Siatkówka powinna wyglądać jak czterolistna koniczyna.
  10. Przenieś siatkówkę z papieru filtrującego na laboratoryjną chusteczkę. Użyj jednej kropli ACSF, aby zwilżyć siatkówkę, a następnie chusteczką wysusz papier filtracyjny. Powtarzaj przez co najmniej 8-10 kropli krwi, aby siatkówka przylegała do papieru filtracyjnego.
  11. Umieść siatkówkę w komorze natleniającyej, jednocześnie rozcinając przeciwległe oko.
  12. Gdy będzie gotowy do zdjęcia, wysusz papier filtracyjny zgodnie z krokiem 3.10 i odwróć siatkówkę na talerzkę Matek Petriego. Obciąż siatkówkę metalowymi koralikami lub pierścionem. Dodaj 3-5 kropli ACSF.
    UWAGA: Małe metalowe kulki, takie jak te z metalowej kąpieli koralików lub pierścienia, mają wystarczający rozmiar i wagę, by zapobiec dryfowi bez zaburzania integralności siatkówki.
  13. Wykonaj pierścień, używając stalowego drutu i rozciągniętych nylonowych sznurków, sklejając i dodając ciężarek, aby uzyskać pierścień z napiętymi, równoległymi strunami.
    1. Owiń drut wokół cylindra o średnicy 1/2 cala i mocno naciągnij szczypcami. Odetnij każdy pierścień od cylindra i spłaszcz między imadłom.
    2. Przeszlifuj pierścień na jednej stronie, aby uzyskać szorstką, płaską stronę. Naciągnij nylonowe sznurki nad otworem butelki o średnicy 1-2 cala i trzymaj je na miejscu za pomocą gumek recepturki.
    3. Umieść pierścień na nylonowych sznurkach i ostrożnie przyklej go do nylonowych sznurków, nakładając niewielkie ilości kleju wzdłuż wewnętrznego obwodu pierścienia. Następnie połóż na pierścieniu lekki ciężarek, na przykład monetę lub cienki metalowy drut, aby utrzymać pierścień na miejscu.
    4. Po wysuszeniu odetnij nylonowe struny z zewnętrznej krawędzi pierścienia precyzyjnymi nożyczkami. W efekcie powstają stałe, równoległe struny napinające średnicę pierścienia.
    5. Jeśli gęstość nylonowych strun w obrębie pierścienia jest zbyt wysoka, przetnij pojedyncze sznurki za pomocą mikrosekcjonujących nożyczek sprężynowych dostosowanych do potrzeb eksperymentu.
      UWAGA: Proces sekcji i montażu powinien zająć tylko ~5 minut. Im szybciej tkanka zostanie umieszczona w zrównoważonych warunkach fizjologicznych ex vivo, tym zdrowsza jest tkanka.

4. Obrotowe dyskowe konfokalne pozyskiwanie

UWAGA: Włącz komorę nawilżającą na 5%CO2 i uruchom ją przez co najmniej godzinę przed obrazowaniem. Pozwolenie systemowi i próbce na osiągnięcie równowagi termicznej pomoże zmniejszyć dryf.

  1. Zacznij skanować okular na 10x, aby skupić się na mikrogleju. Podczas skanowania tkanki w poszukiwaniu obszarów do obrazowania należy używać kanału mikrogleju jako odniesienia i skupiać się wyłącznie na mikrogleju z jasnymi synaptycznymi punktami współlokalizowanymi (w promieniach 10-20 μm). Ponieważ znakowanie AAV nie jest jednorodne w całej tkance, skanuj obszary, w których mikroglej i punkty znajdują się współlokalizowane w tej samej płaszczyźnie. Gdy obszar spełniający te kryteria zostanie znaleziony, przełącz na 60x, aby ustawić ostrość, a następnie przełączyć się w tryb aparatu, klikając przycisk aparatu .
    1. Korzystając z oprogramowania systemu obrazowania, kliknij prawym przyciskiem myszy na ekran, aby znaleźć nawigację xy. Pojawi się ekran podglądowy, który może zeskanować tkankę, tworząc ramkę 3 x 3, 5 x 5 lub niestandardowy rozmiar, aby wykryć optymalne obszary. Użyj klatki 3 x 3 lub 5 x 5 oraz ekranu z jednym kanałem referencyjnym, aby zapobiec ciągłemu wybielaniu zdjęć.
      UWAGA: Do tego protokołu użyliśmy kanału mikroglejowego.
  2. Natychmiast zobrazuj zamontowaną siatkówkę za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem 60x (NA 1,49).
  3. Aby zobaczyć próbkę, kliknij prawym przyciskiem myszy na ekran, wybierz Live i kliknij przycisk auto-adjustment , aby system mógł dostosować widok na podstawie aktualnych LUT-ów. Aby dostosować ustawienia lasera, najpierw wybierz każdy kanał osobno i dostosuj moc oraz ekspozycję lasera w razie potrzeby. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na fluorofor, aby przypisać ustawienia do Microscope i zapisać własne ustawienia, ponieważ oprogramowanie nie zapisuje ich po przełączeniu na inny kanał.
    1. Przełącz na następny kanał i dostosuj w razie potrzeby. Kliknij prawym przyciskiem myszy na fluorofor, aby zapisać ustawienia. Jeśli pobierasz wiele kanałów w tej samej klatce, wprowadź te same wartości użyte po podglądzie każdego kanału osobno. Kliknij prawym przyciskiem myszy na fluorofor, aby zapisać ustawienia.
    2. Aby uzyskać dostęp do wielu kanałów, wybierz interesujące kanały w zakładce Lambda . Do obrazowania na żywo połącz wszystkie kanały w jeden kanał, aby szybko uchwycić drobny ruch z interesującej komórki, umożliwiając jednoczesne pozyskiwanie każdego kanału, a nie osobno, co może powodować opóźnienie w timelapse w zależności od prędkości komórki.
  4. Zrób zakup timelapse na wybrany czas.
    1. W zakładce czasu w lewym dolnym rogu wpisz 5-10 minutowy poklatkowy czas z odstępem 20 sekund.
    2. W zakładce ustawień akwizycji po prawej stronie ustaw rozdzielczość obrazu na 608 x 832 z rozmiarem piksela 0,12 μm.
    3. Zbieraj obrazy w zakresie 10–20 μm, wykonując krok 0,3 μm , aby zapewnić akceptowalną rozdzielczość drobnych mikroglejów i synaptycznych punktów wzdłuż osi z. Aby zapewnić skuteczne śledzenie komórek, utrzymuj odstęp czasu między klatkami na poziomie 20–30 s.
      UWAGA: Ze względu na kruchość tkanki ex vivo, zaleca się najpierw obrazowanie siatkówki eksperymentalnej i nie dłużej niż godzinę. Ma to na celu unormowanie stanu przeciwległego oka kontrolnego, które powinno znajdować się w komorze natlenionej podczas obrazowania pierwszej siatkówki.
  5. Użyj tego protokołu do obrazowania bardziej powierzchownych warstw siatkówki. Dzięki uzyskaniu poklatków czasowych większych niż 20 μm, trudniej jest uchwycić drobne ruchy procesu w odstępach 20 sekund. Dlatego mikroglej obrazowy mieści się w stosie 20 μm.

5. Śledzenie, analiza i eksport danych

  1. Renderowanie powierzchniowe dla mikrogleju
    1. Przekonwertuj plik timelapse na format IMS za pomocą programu do konwerowania plików. Wprowadź następujące rozmiary wokseli na podstawie właściwości obrazu uzyskanych w kroku 4.2: x = 0,1272423 mikron, y = 0,1272423 mikron, z = 0,3 mikron.
    2. Po uruchomieniu oprogramowanie analityczne rozpocznie się w Arenie. Kliknij folder Obserwuj, aby otworzyć wcześniej przekonwertowany plik. Upewnij się, że obraz jest w widoku 3D.
    3. Aby wykryć całe pojedyncze mikroglej, kliknij ikonę niebieskiej powierzchni w pasku Obiektów . Wybierz ostatnie trzy opcje w ustawieniach algorytmu : Śledzenie powierzchni (w czasie), Klasyfikacja powierzchni oraz Statystyki obiekt-obiekt. Kliknij niebieski przycisk odtwarzania , aby przejść do następnego kroku.
      1. W przypadku wielu mikroglejów wybierz segment tylko Obszar Zainteresowania (ROI), aby zapewnić istnienie pojedynczych mikroglejów w jednym obiekcie powierzchniowym. Ustaw parametry x, y i z odpowiednio, aby tylko powierzchnia pojedynczego mikrogleju była interesująca.
    4. Wybierz kanał, dla którego zostanie utworzony rendering powierzchni. Jeśli chcesz, wybierz Gładki, aby wygładzić tworzenie powierzchni i użyj proporcji 1:1 - 1,25 do rozmiaru woksela obrazu. Na przykład, jeśli obraz ma rozmiar woksela 0,12 x 0,12 x 0,3 μm, ustaw szczegóły powierzchni na 0,15 - 0,16 μm. W trybie progowym wybierz segmentację uczenia maszynowego , aby nauczyć oprogramowanie wykrywania interesujących komórek.
      UWAGA: Następny krok polega na przekazywaniu danych treningowych do Imaris AI poprzez segmentację uczenia maszynowego.
    5. W sekcji Dane treningowe obserwuj dwa narzędzia pędzla: Tło (do wykrywania tła) oraz Pierwszy plan (do wykrywania prawdziwego sygnału próbki). Rysuj pociągnięcia pędzla, wybierając wybrany pędzel i używając przycisków Shift + Lewy przycisk. Upewnij się, że w ustawieniach wybrano wyświetlenie interpolacji. Wybierz Train i Predict, aby wprowadzić dane treningowe z wykonanych pociągnięci pędzla.
      UWAGA: Podawanie więcej niż sześciu pociągnięć powoduje dłuższy czas przetwarzania przez AI i niedokładne przechwytywanie komórki.
      1. Użyj żółtego wskaźnika pośrodku, aby przesuwać się po stosie z. Narysuj wiele pociągnięć pędzla na płaszczyznach x, y i z, a także w kilku (nie wszystkich) ramach czasowych timelapse. Wykonaj 3-5 krótkich pociągnięć pędzla na wpis, ponieważ AI najlepiej uczy się na podstawie małych fragmentów informacji naraz. Dostosowuj ten krok iteracyjnie przy każdym wpisie, aż uzyskamy dokładną powierzchnię komórki.
      2. Wybierz żółty prostokąt , aby przełączać się między wyświetlaczem treningowym a faktyczną powierzchnią utworzoną jako ostateczny kontrol. Sprawdź też w czasie poklatkowym, czy powierzchnia dokładnie odzwierciedla komórkę.
    6. Gdy uzyskasz dokładne odwzorowanie powierzchni, przejdź do kolejnego kroku. Odznacz podzielone obiekty.
    7. Dostosuj liczbę wokseli w histogramie. Przesuń próg tak, aby usuwał małe obiekty niepołączone z główną powierzchnią.
      UWAGA: Ten krok służy do usunięcia wszelkich niepożądanych powierzchni powstałych w wyniku szumów tła. Celem jest usunięcie wszelkich powierzchni niepołączonych z głównym ciałem komórki zainteresowania.
    8. Następnie edytuj powierzchnię w razie potrzeby. Ręcznie usuwaj wszelkie obiekty, które nie są częścią głównej powierzchni lub krawędzi ciętych, używając narzędzia nożycowego w razie potrzeby.
    9. Jeśli chcesz, ustaw próg dozwolonych luk, które nadal mogą być powiązane z obiektem. Wybierz algorytm śledzenia dla ruchomej komórki.
      UWAGA: Ruch autoregresyjny jest najczęściej używanym narzędziem do śledzenia komórek, ponieważ monitoruje ciągły ruch przez cały czas poklatkowy.
      1. Maksymalna odległość i maksymalny rozmiar przerwy to liczby zdefiniowane przez użytkownika, które wyznaczają istotne punkty, od których powierzchnia może odchylać się od niej. Ustaw maksymalną odległość przerwy 0,96 μm oraz maksymalną odległość 3 (ustawienia domyślne).
    10. Podobnie jak obiekty powierzchniowe były filtrowane w kroku 5.1.7, filtrowanie ścieżek niezwiązanych z główną powierzchnią. To również jest korygowane za pomocą histogramu. Określ, gdzie ustawić próg, sprawdzając, kiedy małe ścieżki punktowe, które trwają nie dłużej niż pięć ramek czasowych, są usuwane z regulacji filtrów.
    11. Następnie ustaw klasyfikacje, jeśli chcesz. Na przykład kategoryzuj długość przemieszczenia od 0 do 1 μm do 1+ μm , aby określić niewielki ruch procesu lub znacząco duże przemieszczenie procesu lub komórki.
    12. Na koniec umieść odpowiednie etykiety na niektórych zdarzeniach, korzystając z klasyfikacji z poprzedniego kroku.
      UWAGA: Ten krok najlepiej wykorzystać po wygenerowaniu plam dla sygnału postsynaptycznego.
  2. Klasyfikacja punktowa dla PSD95
    1. Aby wykryć całe pojedyncze mikroglej, kliknij ikonę niebieskiej powierzchni w pasku Obiektów . Wybierz ostatnie trzy opcje w ustawieniach algorytmu : Śledzenie powierzchni (w czasie), Klasyfikacja powierzchni oraz Statystyki obiekt-obiekt. Kliknij niebieski przycisk odtwarzania , aby przejść do następnego kroku.
    2. Wybierz kanał źródłowy dla markera synaptycznego. Wyłącz slicer i inne kanały, aby zobaczyć tylko PSD95. Użyj przycisku ctrl oraz narzędzia do wyboru wskaźnika , aby oszacować średnicę xy punktu.
      1. Wybierz kilka jasnych punktów, które utrzymują się przez cały timelapse (rozmiar od 0,6 μm do 1,2 μm).
      2. Wyłącz odejmowanie tła. Jeśli obraz wymaga odejmowania tła, użyj narzędzia do odejmowania tła w sekcji Przetwarzanie obrazu przed przetworzeniem timelapse.
    3. Następnie dodaj filtr na podstawie jakości punktu. Przeciągnij histogram, aby wszystkie punkty PSD95 były dokładnie zarejestrowane przez cały timelapse.
      UWAGA: Jakość zależy od intensywności środka punktu9. Ten filtr najdokładniej rejestruje rzeczywisty sygnał PSD95 w porównaniu do liczby filtrów wokselowych lub średnic.
    4. Następnie usuń wszelkie plamy generowane przez szumy, korzystając z kroku edycji. Przełącz kursor sześcianu lub kursor koła, aby usunąć pojedyncze lub wiele miejsc, które pojawiają się tylko przez 1-2 ramki czasowe z powodu szumów.
    5. Jeśli chcesz, ustaw próg dozwolonych luk, które nadal mogą być powiązane z obiektem. Wybierz odpowiedni algorytm śledzenia dla markera synaptycznego.
      1. Maksymalna odległość i maksymalna odległość to liczby zdefiniowane przez użytkownika, które wyznaczają istotne punkty, od których plamy mogą odbiegać. Ustaw maksymalną odległość przerwy 14,6 μm oraz maksymalną odległość 3 ( domyślne ustawienia).
    6. Podobnie jak obiekty punktowe były filtrowane w kroku 5.2.3, ścieżki filtrowania nie są powiązane z wyraźnymi punktami. To również jest korygowane za pomocą histogramu. Aby określić, gdzie ustawić próg, sprawdź, kiedy usuwane są małe tory obiektów.
    7. Ustaw klasyfikacje, jeśli chcesz. Na przykład rozróżni punkty pochłonięte, kontaktowane lub niekontaktowane, używając klasyfikacji Najkrótszej odległości do powierzchni. Ułożone jako każda punkta < 0 μm wewnątrz powierzchni, kontakt między 0 a 0,5 μm od powierzchni lub niekontaktowany jako 0,5+ μm od powierzchni.
    8. Na koniec umieść odpowiednie etykiety na niektórych zdarzeniach, korzystając z klasyfikacji z poprzedniego kroku.
  3. Gdy powierzchnie i plamy dokładnie oddadzą interesujące mikrogleje i punkty, wyeksportuj wszystkie statystyki z każdego obiektu w zakładce statystyk . Upewnij się, że szczegółowe statystyki są wyodrębnione, obejmujące długość wyporu, prędkość oraz klasyfikację zdarzeń kontaktowych.
    1. Wiele statystyk, takich jak powierzchnia, objętość, długość przemieszczenia i prędkość, pochodzi z Imaris. Eksportować długość i prędkość przemieszczeń powierzchni, aby zdefiniować dynamikę mikrogleju w eksperymencie.
      1. Zdefiniuj długość przemieszczenia jako odległość między początkową a końcową pozycją powierzchni, mierzoną w μm22.
      2. Zdefiniuj prędkość jako chwilową prędkość powierzchni z jednego przedziału czasowego na drugi, mierzoną w μm/s22.
        UWAGA: Zdarzenia kontaktowe to zjawisko opisane przez autorów jako nienaruszone punkty postsynaptyczne, dzielące odległość 0 μm między pojedynczymi mikroglejami przez co najmniej pięć spójnych ram czasowych w ramach timelapse.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej z siatkówki myszy CX3CR1-GFP zostały zobrazowane za pomocą opisanego protokołu. Myszy miały wartość od P30 do P60 w momencie podania AAV-PSD95-RFP, a co najmniej 21 dni umożliwiało ekspresję AAV. Reprezentatywne obrazy mikrogleju oraz ich interakcji z PSD95 puncta przed i po analizie przedstawiono na Rysunku 2. Aby wywołać aktywację mikrogleju, zastosowaliśmy model nadciśnienia oczu indukowanego laserem myszy (LIOH), który tymczasowo podnosi ciśnien...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten umożliwia wizualizację i śledzenie interakcji poszczególnych mikroglejów z miejscami postsynaptycznymi wzdłuż dendrytów RGC. W chorobie neurodegeneracyjnej, takiej jak jaskra, mikroglej współlokalizuje się z synapsami w wewnętrznej warstwie pleksiformowej (IPL) siatkówki. Rola mikrogleju w rozkładzie synaps nie jest dobrze poznana. Jednak mikroglej potencjalnie przyczynia się do tego poprzez kilka potencjalnych mechanizmów, w tym aberracyjne pochłanianie synaps, pasywne usuwanie zanieczyszczeń z komórek apop...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PSD-95pTagRFP był prezentem od Johannesa Hella (Addgene plasmid #52671; RRID: Addgene_52671), natomiast wersja kapsydowa, 7m8, była prezentem od Johna Flannery'ego i Davida Schaffera (plazmid Addgene #64839; RRID: Addgene_64839). Chcielibyśmy podziękować Aparnie Lakkaraju za umożliwienie nam korzystania z wirującego mikroskopu dysku w ich laboratorium oraz Nilsie La Cunza za wskazówki w zakresie obrazowania na żywo. Chcielibyśmy również podziękować Felice Dunn, Annice Balraj i Luca Della Santina za pomocne dyskusje i uwagi dotyczące tego rękopisu. Dziękujemy Suling Wang za pomoc w analizie danych dotyczących Imaris. Prace te zostały sfinansowane przez NIH-NEI EY028148 i EY034973 dla Y.O., nagrodę ARVO Davida L. Epsteina dla Y.O. oraz NIH-NEI EY034973-S1 dla C.F.. Badania te były również częściowo wspierane przez wspólne zasoby NUT UCSF Vision Core EY002162/EY037668 NIH-NEI P30 oraz nieograniczony grant od Research to Prevent Blindness z Nowego Jorku. Rysunek 1 został stworzony na biorender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Igła 25 gaugeAlcon8065420920
26s Gauge 10 & micro; Strzykawka LHamilton701RNWG
7m8Addgene64839http://n2t.net/addgene:64839
Wielofunkcyjny drut ze stali nierdzewnej 304 Bend-and-StayStanford Advanced MaterialsSS3368Drut stalowy do produkcji pierścieni
Chlorek wapnia HeksahydratSigma-AldrichC5080-500G
Mikroskop sekcjonującyAmscopeDo sekcji i montowania siatkówki
Nożyce do sekcjiFST15024-10
D-(+)-glukozaSigma-AldrichG7528-250G
KleszczeDumont11252-21
HEPESSigma-AldrichH3375-500G
Imaris 10.0.2Instrumenty OksfordzkieOprogramowanie analityczne
Konwerter plików ImarisInstrumenty Oksfordzkie
Loctite Super Glue Ultra Gel ControlLoctite1363589Klej do robienia pierścieni
Chlorek magnezu – heksahydratSigma-AldrichM9272-100G
Papier filtrujący membranę MCE (13 mm)MilliporeHABG013000,45 μ m Rozmiar porów
Komora mikrośrodowiskowaTokai HitSTXG-TIZBX-SET
Odwrócony mikroskop Nikon Eclipse Ti2-ENikon
Elementy NISNikon
Neomycyna i polimyksyna B sulfae oraz maść okulowa z bacitracyną cynkową, USPBausch + Lomb24208-780-55
Pędzel rozmiar 00Amazon
Prism 8.0GraphPad
USP roztwór chlorowodorku proparakainy, 0,5%Sandoz61314-0016-01
Szalka Petriego pokryta powłoką PDL (35 mm)MatekP35GC-1.5-14-CNr 1.5 Slip
PSD95_pTagRFPAddgene52671http://n2t.net/addgene:52671
Chlorek potasuSigma-AldrichP9333-500G
Chlorek soduSigma-AldrichS7653-1KG
Monozasadowy fosforan soduSigma-AldrichS9638-25G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, Y. K., Hengen, K. B., Turrigiano, G. G., Gjorgjieva, J. Homeostatic mechanisms regulate distinct aspects of cortical circuit dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (39), 24514-24525 (2020).
  2. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  3. Rosin, J. M., et al. Embryonic microglia interact with hypothalamic radial glia during development and upregulate the TAM receptors MERTK and AXL following an insult. Cell Rep. 34 (1), 108587(2021).
  4. Wang, X., Li, K., Guo, L., Liu, X., Guo, Y., Zhang, W. The influence of changes in microglia development on the plasticity of the developing visual cortex circuit in juvenile mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (4), 45(2025).
  5. Blume, Z. I., Lambert, J. M., Lovel, A. G., Mitchell, D. M. Microglia in the developing retina couple phagocytosis with the progression of apoptosis via P2RY12 signaling. Dev Dyn. 249 (6), 723-740 (2020).
  6. Brown, T. C., et al. Microglia are dispensable for experience-dependent refinement of mouse visual circuitry. Nat Neurosci. 27 (8), 1462-1467 (2024).
  7. Huang, Y., et al. Microglia use TAM receptors to detect and engulf amyloid β plaques. Nat Immunol. 22 (5), 586-594 (2021).
  8. Ding, X., et al. Loss of microglial SIRPα promotes synaptic pruning in preclinical models of neurodegeneration. Nat Commun. 12 (1), 2030(2021).
  9. He, J., et al. Microglia mediate synaptic material clearance at the early stage of rats with retinitis pigmentosa. Front Immunol. 10, 912(2019).
  10. Yu, A., Fang, C., Tan, L. X., Lakkaraju, A., Della Santina, L., Ou, Y. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).
  11. Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: a field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  13. Yu, Z., Gutu, A., Kim, N., O'Shea, E. K. Synapse weakening-induced caspase-3 activity confers specificity to microglia-mediated synapse elimination. bioRxiv. , (2024).
  14. Miller, E. B., Zhang, P., Ching, K., Pugh, E. N., Burns, M. E. In vivo imaging reveals transient microglia recruitment and functional recovery of photoreceptor signaling after injury. Proc Natl Acad Sci USA. 116 (33), 16603-16612 (2019).
  15. Wahl, D. J., Ng, R., Ju, M. J., Jian, Y., Sarunic, M. V. Sensorless adaptive optics multimodal en-face small animal retinal imaging. Biomed Opt Express. 10 (1), 252(2019).
  16. Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective vulnerability of specific retinal ganglion cell types and synapses after transient ocular hypertension. J Neurosci. 36 (35), 9240-9252 (2016).
  17. Della Santina, L., et al. Disassembly and rewiring of a mature converging excitatory circuit following injury. Cell Rep. 36 (5), 109463(2021).
  18. Ramírez, A. I., et al. Microglial changes in the early aging stage in a healthy retina and an experimental glaucoma model. Prog Brain Res. 256, 125-149 (2020).
  19. de Hoz, R., et al. Bilateral early activation of retinal microglial cells in a mouse model of unilateral laser-induced experimental ocular hypertension. Exp Eye Res. 171, 12-29 (2018).
  20. Soliño, M., Yu, A., Della Santina, L., Ou, Y. Large-scale survey of excitatory synapses reveals sublamina-specific and asymmetric synapse disassembly in a neurodegenerative circuit. iScience. 26 (8), 107262(2023).
  21. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction. Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).
  22. Imaris reference manual. , https://lims.gzzoc.com/files/instrument/20240722/2024072212391299299_ImarisManual.pdf (2024).
  23. Joseph, A., Power, D., Schallek, J. Imaging the dynamics of individual processes of microglia in the living retina in vivo. Biomed Opt Express. 12 (10), 6157(2021).
  24. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  25. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microglia DynamicsSynaptic PruningRetinal ExplantSpinning Disk MicroscopyMicroglia MotilityPSD95 LabelingTime Lapse ImagingSynapse InteractionNeuroinflammationSurface Rendering

Related Articles