Method Article

Budowa mikromacierzy tkankowych na bazie kleju do badań nad nowotworami i chorobami

DOI:

10.3791/68424

⸱

August 1st, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Laboratory, The Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 2Department of Anesthesiology, The Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 3Department of Pathology, The Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University, 4Department of Pediatrics, The Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital of Nanjing Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje tanią produkcję i efektywną metodę walidacji konstrukcji TMA na bazie kleju, zapewniając wygodną platformę diagnostyki patologicznej do badań nad nowotworami i chorobami.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia mikromacierzy tkankowych (TMA) to wysokoprzepustowa platforma do jednoczesnego wykrywania i analizy wielu próbek tkanek, ułatwiająca efektywne badania biomarkerów nowotworów i chorób. Jednak konwencjonalne metody budowy TMA często napotykają ograniczenia, takie jak złożoność operacyjna, czasochłonne procedury i zmienna dokładność. Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano metodę budowy TMA opartą na kleju, oferując lepsze mocowanie rdzenia tkanki i zwiększoną stabilność strukturalną. Systematyczna walidacja obejmowała ocenę histologiczną (barwienie HE), profilowanie immunohistochemiczne docelowych białek oraz analizę hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH). Wyniki pokazały, że metoda oparta na kleju utrzymała doskonałą integralność plastrów, poprawiła stosunek sygnału do szumu i zapewniła stałą powtarzalność między partiami. Chociaż podejście to ogranicza się do obsługi ręcznej, stanowi niezawodną i ekonomiczną opcję dla produkcji TMA o umiarkowanej przepustowości. Metoda ta jest szczególnie przydatna w środowiskach badawczych, które cenią sobie elastyczność i różnorodność próbek, a nie automatyzację na dużą skalę, zwiększając użyteczność TMA w środowisku akademickim i diagnostycznym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tissue Microarray (TMA) to wysokoprzepustowa technika analizy próbek tkanek1,2,3. Uzyskuje się wiele rdzeni tkanek dawcy, a bloki parafiny dawcy są przenoszone do bloków tkanek biorcy w celu jednoczesnej różnicowej i porównawczej analizy molekularnej w teoretycznie tych samych warunkach wydajności2,4. Klasycznym sposobem skonstruowania mikromacierzy tkankowej (TMA) jest użycie dziurkacza do ekstrakcji rdzeni tkanek z próbki tkanki dawcy i ułożenia ich sekwencyjnie w bloku parafiny biorcy. Metoda ta jest odpowiednia dla dawczych bloków parafinowych o podobnej głębokości i pozwala na wydajną analizę wielu próbek na jednym wycinku, znacznie poprawiając efektywność badania i spójność danych5,6,7. Niemniej jednak metoda ta nadal ma pewne ograniczenia, w tym nieodpowiednie obchodzenie się z rdzeniem tkanki podczas procesu zatapiania, co może skutkować niespójnym barwieniem próbek w kolejnych analizach8.

Drugą metodą budowy TMA jest metoda taśmowa9,10. Ta metoda odwraca proces budowy poprzez odlewanie bloku wokół odwróconych pionowych rdzeni, które po zakończeniu są zlicowane z górną częścią TMA, niezależnie od długości rdzenia11,12. Metoda ta wymaga jednak zapewnienia odpowiedniego umieszczenia rdzenia tkankowego i skuteczności taśmy, a także ogranicza liczbę próbek, które można przetworzyć w porównaniu z tradycyjnymi technikami.

To badanie proponuje innowacyjną metodę budowy TMA za pomocą kleju, mającą na celu rozwiązanie problemów takich jak niewystarczająca stabilność rdzeni tkanek i skomplikowane operacje, które występują w tradycyjnych technikach13. Metoda ta wykorzystuje klej do precyzyjnego łączenia ze sobą wielu rdzeni tkanek i ma zalety prostej obsługi i dużej twardości próbki. W porównaniu z tradycyjnymi metodami cięcia lub taśmy, metoda klejenia może zwiększyć wskaźnik retencji rdzeni tkanek i obniżyć koszty. Metoda ta ma zastosowanie do badań klinicznych ze średnią wielkością próby i jest szczególnie przydatna w przypadku projektów badawczych, które wymagają elastycznego dostosowania planu eksperymentalnego. Należy jednak zauważyć, że zdolność przetwarzania tej metody nie spełnia wymagań ultra-wysokiej przepustowości9. Tymczasem w samym procesie aplikacji należy ustalić kompletny zestaw ustandaryzowanych norm operacyjnych i systemów kontroli jakości. Operatorzy muszą przechodzić systematyczne szkolenia i przechodzić profesjonalne oceny, aby zapewnić standaryzację operacji technicznych i powtarzalność wyników. Kompleksowa analiza wskazuje, że technologia ta osiąga dobrą równowagę między elastycznością operacyjną, opłacalnością i niezawodnością techniczną i jest szczególnie przydatna w scenariuszach badawczych, w których zasoby są ograniczone, ale nadal należy zagwarantować kontrolę jakości.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie bloki dawców zostały uzyskane z archiwalnych próbek patologicznych zebranych w latach 2016-2018 w Szpitalu Ludowym Huai'an nr 1 Uniwersytetu Medycznego w Nankinie. Próbki zostały pozbawione elementów identyfikujących przed użyciem i przetworzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami (komisja bioetyczna stowarzyszonego szpitala ludowego Huai'an nr 1 Uniwersytetu Medycznego w Nankinie, KY-2024-250-01).

1. Ocena i znakowanie tkanek dawcy

  1. Wybierz bloki tkanek o grubości ≥5 mm i powierzchni ≥15 mm × 15 mm. Zapewnij 2 mm margines bezpieczeństwa na krawędziach i wyklucz obszary wykazujące martwicę, krwotok lub zwapnienie, aby zachować integralność tkanki.
  2. Identyfikacja i oznakowanie obszaru docelowego
    1. Oceń skrawki zabarwione H&E za pomocą mikroskopu optycznego. Zlokalizuj obszar docelowy poprzez skanowanie o niskim poborze mocy, a następnie przełącz się na wysoką moc, aby potwierdzić cechy morfologiczne komórki. Zaznacz granice obszaru docelowego na slajdach.
    2. Odwzoruj współrzędne wybranego obszaru na powierzchnię bloku parafiny, aby zakończyć konwersję znakowania.

2. Ekstrakcja rdzenia tkankowego

  1. Przygotowanie do nakłucia i wstępna obróbka próbki
    1. Wybierz ręczny dziurkacz o średnicy 2 mm i potwierdź gładkość jego krawędzi tnącej oraz łatwość obsługi.
    2. Umieścić blok parafiny dawcy na zimnym podłożu w temperaturze 4 °C na 15 minut.
  2. Wyrównaj igłę pionowo z zaznaczonym punktem i wywieraj stały nacisk obrotowy, aby osiągnąć głębokość graniczną. Unikaj przechylania lub wibrowania podczas procesu7 (Rysunek 1A).
  3. Delikatnie obrócić igłę w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (≤2 obroty/s), aby ją wyjąć. Ostrożnie wysunąć rdzeń tkankowy z igły i przenieść go do pojedynczego dołka wstępnie schłodzonej 96-dołkowej płytki. Zapisz lokalizację rdzenia w każdej studni (Rysunek 1B).
    UWAGA: Jeśli spód rdzenia tkanki jest nierówny, wyrównaj go ostrzem. Po przycięciu ponownie sprawdź integralność.
  4. Wstępnie zapisz wszystkie numery dawców i odpowiadające im pozycje studzienki płytki ELISA (A1-H12) w formularzu rejestracyjnym. Podczas operacji należy ponownie sprawdzić, aby zapewnić ścisłą zgodność między numerami dawców a pozycjami studni.
  5. Natychmiast sprawdź rdzenie pod kątem integralności. Odrzuć rdzenie, które są złamane, wygięte lub wykazują odchylenia średnicy >0,1 mm.
    UWAGA: Upewnij się, że długość rdzenia jest spójna (współczynnik zmienności, CV ≤5%) i unikaj zadrapań powierzchni lub artefaktów ściskania.

3. Utrwalenie rdzenia tkankowego

  1. Użyj wodoodpornego markera, aby narysować siatkę bezpośrednio na powierzchni formy, zapewniając wyraźne i równomiernie rozmieszczone linie.
    1. Użyj standardowej formy z efektywną powierzchnią dna 3.0 cm × 2.5 cm i zarezerwuj pustą granicę 1.5 mm z każdej strony.
    2. Użyj wodoodpornego markera o grubości 0,5 mm z cienkim punktem, aby narysować dziewięć równo rozmieszczonych równoległych linii w poziomie i w pionie, tworząc siatkę pozycjonującą 9 × 9 (w sumie 81 punktów przecięcia).
      UWAGA: Przed rozpoczęciem wyczyść wnętrze formy wacikiem nasączonym ksylenem, aby usunąć resztki parafiny, które mogą powodować rozwarstwienie. Podczas procesu rysowania użyj stalowej linijki, aby zapewnić jednolitą grubość linii i wyraźnie rozróżnialne punkty przecięcia.
  2. Za pomocą pipety narysuj 5 μl kleju i delikatnie umieść go na środku wstępnie oznaczonego szkiełka, aby utworzyć pojedynczą kroplę. Natychmiast użyj cienkiej pęsety, aby pionowo podnieść rdzeń tkanki pod kątem 90° i powoli wciśnij go pionowo w kroplę kleju (Rysunek 1C).
  3. Włóż rdzenie do odpowiednich przecięć siatki na formie za pomocą pęsety. Delikatnie uciskaj przez 5 sekund, aby zapewnić bezpieczną przyczepność (Rysunek 1D).
  4. Jeśli rdzeń tkanki jest przemieszczony, należy go natychmiast dostroić i zresetować za pomocą drobnej pęsety, zanim klej zastygnie (w ciągu 30 sekund). Wyrzuć zestalone, niewspółosiowe rdzenie, aby zachować jakość preparatu, jednocześnie zachowując cenne próbki w jak największym stopniu.

4. Instalacja kasety i osadzanie parafiny

  1. Umieść kasetę z bibułą pionowo nad stalową formą, zapewniając kontakt z końcówkami rdzenia bez stosowania kompresji. Zabezpiecz kasetę za pomocą zacisków magnetycznych we wszystkich czterech rogach i uszczelnij szwy stopioną parafiną.
  2. Wlej stopioną parafinę pod kątem 45° zygzakiem, utrzymując natężenie przepływu 1 ml / s. Upewnij się, że poziom parafiny przekracza końcówki rdzenia o 2 mm (Rysunek 1E).
  3. Szybko schłodzić blok na zimnej płycie o temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby utworzyć sztywną warstwę nośną. Przenieś blok do środowiska o temperaturze 22 °C na 20 minut, aby zmniejszyć naprężenia wewnętrzne. Na koniec użyj opalarki o temperaturze 40 °C, aby delikatnie wygładzić powierzchnię i wyeliminować ślady skurczu.
  4. Lekko podgrzej parafinę, aby ją zmiękczyć, a następnie ostrożnie przetnij wzdłuż krawędzi kasety, aby poluzować blok. Delikatnie podnieś kasetę i usuń resztki parafiny, aby zapewnić integralność rdzeni tkanek (Rysunek 1F).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnym badaniu, wysokiej jakości mikromatryce tkankowe zostały skonstruowane przy użyciu metody klejenia. Aby zweryfikować skuteczność metody, przeprowadzono szereg eksperymentów, w tym barwienie H&E, immunohistochemiczne wykrywanie określonych białek oraz analizę fluorescencji hybrydyzacji in situ (FISH). Krytycznym elementem procesu budowy jest obecność kropek rdzenia tkankowego w oczekiwanych miejscach i odległościach od siebie, co jest oceniane za pomocą oględzin. Oględziny bloków TMA pokazują, że rdz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako innowacyjna metoda konstruowania mikromacierzy tkankowych (TMA), metoda klejowa wykazała znaczące zalety ze względu na łatwość procedur konstrukcyjnych i opłacalność. W porównaniu z tradycyjną metodą igiełkową, która opiera się na zaawansowanych narzędziach14,15, metoda klejenia umożliwia utrwalanie próbki poprzez klejenie, co można wykonać tylko przy użyciu podstawowych narzędzi, co znacznie obniża próg techniczny. W przeciwieństwie do tradycyjnej metody za...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękuję członkom zespołu za ich wsparcie i wkład w ten eksperyment.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestaw do wykrywania raka piersi HER2Anbiping2502001Zestaw do wykrywania raka piersi HER2 Przeciwciało
CDHR4Abcamab166914Przeciwciało CDHR4
Przeciwciało CDK1Abcamab265590Przeciwciało CDK1
Przeciwciało CRTAC1Abcamab254691Przeciwciało CRTAC1
DNASE1L3 przeciwciałoAbcamab203669Przeciwciała DNASE1L3
Maszyna do zatapianiaP.S.J MEDICALBM450AMaszyna do zatapiania
W pełni automatyczny odwadniacz tkanekLeica BiosystemsASP3005W pełni automatyczna suszarka do tkanek
Szkiełka mikroskopoweszklane Citotest250124A1Szkiełka mikroskopowe szklane
KlejTIZO200Klej
GPR146 przeciwciałoAbcamab117104Przeciwciało GPR146
Przeciwciało IGSF10Przeciwciało Abcamab197671Przeciwciało IGSF10
Przeciwciało ITIH1Abcamab233032ITIH1
Niskoprofilowe ostrza mikrotomuThermo Fisher3052835Niskoprofilowe ostrza do mikrotomów
MarkerDeliSK109Marker
MicrotomeLeica BiosystemsHistoCore BIOCUTMicrotome
Wosk parafinowySolarbioYA0012Wosk parafinowy
Przeciwciało SMAD9Przeciwciało Abcamab262940SMAD9
Przeciwciało TARBP1Abcamab115896Przeciwciało ZCCHC24 TARBP1
Przeciwciało Abcamab88756ZCCHC24
Przeciwciało

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bingle, L., Fonseca, F. P., Farthing, P. M. Constructing tissue microarrays: Protocols and methods considering potential advantages and disadvantages for downstream use. Oral Biol Mol Tech Appl. Seymour, G. J., Cullinan, M. P., Heng, N. C. K. , 429-438 (2017).
  2. Chung, L. K., et al. Tissue microarray analysis for epithelial membrane protein-2 as a novel biomarker for gliomas. Brain Tumor Pathol. 35 (1), 1-9 (2018).
  3. Torata, N., et al. Tissue tablet method: An efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray. Hum Pathol. 45 (1), 143-152 (2014).
  4. Koo, M., Squires, J. M., Ying, D., Huang, J. Making a tissue microarray. Biobank Methods Protocols. Yong, W. H. , 313-323 (2019).
  5. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
  6. Vogel, U. F., Bueltmann, B. D. Simple inexpensive, and precise paraffin tissue microarrays constructed with a conventional microcompound table and a drill grinder. Am J Clin Pathol. 126 (3), 342-348 (2006).
  7. Pires, A. R. C., Andreiuolo, F. M., de Souza, S. R. TMA for all: A new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagn Pathol. 1 (1), 14(2006).
  8. Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: An example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types. J Transl Med. 11 (1), 104(2013).
  9. Glinsmann-Gibson, B., et al. Recommendations for tissue microarray construction and quality assurance. Appl Immunohistochem Mol Morphol. 28 (4), 325-330 (2020).
  10. Chen, N., Zhou, Q. Constructing tissue microarrays without prefabricating recipient blocks: A novel approach. Am J Clin Pathol. 124 (1), 103-107 (2005).
  11. Pires, A. R. C., de Souza, S. R. Hypodermic needle without recipient paraffin block technique. Methods Mol Biol. 664, 53-61 (2010).
  12. Vogel, U. F., Bültmann, B. Application of a novel and low-cost technique to construct paraffin tissue microarrays out of paraffinised needle biopsy specimens from patients with breast cancer. J Clin Pathol. 63 (7), 640-643 (2010).
  13. Qin, P., Li, L., Zhao, L., Bian, P., Xiong, Z. Constructing high-density tissue microarrays with a novel method and a self-made tissue-arraying instrument. Pathol Res Pract. 245, 154430(2023).
  14. Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A next-generation tissue microarray (ngTMA) protocol for biomarker studies. J Vis Exp. (91), e51893(2014).
  15. Barrette, K., van den Oord, J. J., Garmyn, M. Tissue microarray. J Invest Dermatol. 134 (9), 1-4 (2014).
  16. Sexton, T., Kucera, G. L., Levine, E. A., Watabe, K., O'Neill, S. S. Optimization of tissue microarrays from banked human formalin-fixed paraffin embedded tissues in the cancer research setting. Biopreserv Biobank. 17 (5), 452-457 (2019).
  17. Harfouch, R. M., et al. Optimization of tissue microarray technique for breast cancer patients: A short communication. Ann Med Surg. 85 (10), 5299-5303 (2023).
  18. Choi, C. H., et al. Construction of high-density tissue microarrays at low cost by using self-made manual microarray kits and recipient paraffin blocks. Korean J Pathol. 46 (6), 562-568 (2012).
  19. Kim, K. H., et al. In-house manual construction of high-density and high-quality tissue microarrays by using homemade recipient agarose-paraffin blocks. Korean J Pathol. 47 (3), 238-244 (2013).
  20. Moncada, R., et al. Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas. Nat Biotechnol. 38 (3), 333-342 (2020).
  21. Bingham, V., et al. Topographic analysis of pancreatic cancer by TMA and digital spatial profiling reveals biological complexity with potential therapeutic implications. Sci Rep. 14 (1), 11361(2024).
  22. Casadonte, R., Longuespée, R., Kriegsmann, J., Kriegsmann, M. MALDI IMS and cancer tissue microarrays. Adv Cancer Res. 134, 173-200 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tissue MicroarrayGlue Based TMATumor ResearchDisease BiomarkersCore FixationHistological EvaluationHE StainingImmunohistochemistryFISH AnalysisSlice Integrity
Video Coming Soon

Related Articles