Method Article

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

DOI:

10.3791/68427

⸱

October 3rd, 2025

 ,  ,  , 
1Azrieli Research Center of CHU Sainte-Justine, 2Pediatric Department, Faculty of Medicine, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroglej, rezydujące w mózgu komórki odpornościowe, wykazują profile transkrypcyjne specyficzne dla regionu i kontekstu podczas rozwoju i choroby. Protokół ten przedstawia dwie uzupełniające się metody badania populacji mikrogleju w tkance móżdżku myszy: cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki.

Jako pierwsza zastosowana metoda, protokół oparty na cytometrii przepływowej jest zoptymalizowany pod kątem mózgów we wczesnym okresie poporodowym, zapewniając solidną izolację komórek i spójność w warunkach eksperymentalnych. Rozpoczyna się od dysocjacji tkanek za pomocą trawienia enzymatycznego, a następnie usuwania mieliny poprzez wirowanie w gradiacji gęstości Percoll w celu uzyskania wysokiej jakości zawiesiny komórek nerwowych oraz strategii bramkowania opartej na ekspresji CD45 i CD11b. Barwienie żywe/martwe zapewnia żywotność komórek, a przeciwciała sprzężone z fluorochromem są wykorzystywane do profilowania ekspresji wybranych markerów powierzchniowych na mikrogleju. Kontrole kompensacyjne są wykonywane przy użyciu kulek lateksowych ze zwalidowanymi strategiami bramkowania przy użyciu kontroli fluorescencji minus jeden (FMO).

Druga metoda polega na sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki przy użyciu 10X Genomics, zgodnie z tymi samymi etapami izolacji, które umożliwiają profilowanie transkryptomiczne mikrogleju w różnych warunkach. Klastry mikrogleju identyfikuje się za pomocą analizy ekspresji genów, a analizę różnicową ekspresji przeprowadza się między grupami eksperymentalnymi. Losowy klasyfikator lasu jest stosowany wyłącznie do rozróżniania próbek męskich i żeńskich podczas multipleksowania.

Razem, te powtarzalne i adaptowalne protokoły zapewniają solidne ramy do badania różnorodności mikrogleju w móżdżku podczas wczesnego rozwoju mózgu i jego potencjalnych zmian w wyniku eksperymentalnych perturbacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wczesny okres poporodowy jest krytyczną fazą rozwoju mózgu, charakteryzującą się złożonymi procesami komórkowymi i molekularnymi, które stanowią podstawę funkcji poznawczych, emocjonalnych i behawioralnych1. Jednak okres ten jest również naznaczony podatnością, ponieważ zakłócenia mogą zmienić trajektorie neurorozwojowe i prowadzić do długotrwałych zaburzeń neurologicznych lub psychiatrycznych. Mikroglej, rezydujące w mózgu komórki odpornościowe, odgrywają kluczową rolę w kształtowaniu rozwijającego się mózgu poprzez przycinanie synaptyczne, fagocytozę, nadzór immunologiczny i reakcje na zniewagi środowiskowe 2,3. Komórki te wykazują niezwykłą plastyczność, przyjmując profile transkrypcyjne, które różnią się w zależności od regionu mózgu, etapu rozwoju i kontekstu patologicznego 4,5.

Dokładna analiza aktywacji mikrogleju w rozwijającym się mózgu wymaga solidnych i powtarzalnych metodologii zdolnych do analizy ich dynamicznych fenotypów w kontekście niedojrzałych tkanek mózgowych. Cytometria przepływowa stanowi niezawodne rozwiązanie, umożliwiające wysokoprzepustową charakterystykę populacji komórkowych i ekspresję markerów6. Jednak jego zastosowanie w badaniu mikrogleju z mózgów wczesnych postnatalnych jest technicznie trudne ze względu na delikatną naturę tkanki i potrzebę skutecznych protokołów izolacji i wzbogacania komórek 7,8.

Przedstawiony tutaj protokół łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) w celu wyizolowania i scharakteryzowania mikrogleju z wczesnych postnatalnych mózgów myszy, ze szczególnym uwzględnieniem móżdżku od 3. dnia po urodzeniu (P3) do 30. dnia po urodzeniu (P30)9, regionu i etapu rozwoju, dla którego szczegółowe odniesienia metodologiczne pozostają ograniczone.

Ten przepływ pracy obejmuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie w gradionym gradieniu gęstości w celu usunięcia zanieczyszczeń i wzbogacenia komórek oraz barwienie immunologiczne przy użyciu panelu markerów zewnątrzkomórkowych i wewnątrzkomórkowych. Aby scharakteryzować różnorodność mikrogleju, stosuje się szereg markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych10,11. Zamiast przypisywać stałe znaczniki (zapalne lub naprawcze), protokół definiuje subpopulacje w oparciu o dyskretne profile ekspresji markerów. Na przykład mikroglej z ekspresją CD80, CD86 i iNOS, CD206 i Arg1, CD86 i CD64 lub CD163 i CD206 są identyfikowane i analizowane jako molekularnie odrębne podzbiory. Markery te odzwierciedlają różne aktywowane stany mikrogleju10,11 i są prezentowane jako profile ekspresji.

Ta wieloparametryczna strategia bramkowania umożliwia precyzyjną identyfikację podzbiorów mikrogleju w oparciu o ekspresję markerów powierzchniowych, oferując usprawnione ramy do analizy heterogeniczności immunologicznej podczas poporodowego rozwoju mózgu. Aby rozszerzyć profilowanie fenotypowe i odkryć różnorodność transkrypcyjną, sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki przeprowadza się po izolacji komórki. Badanie to ustanawia spójny i skalowalny przepływ pracy w celu pogłębienia wiedzy na temat procesów neurorozwojowych i długoterminowego wpływu aktywacji mikrogleju. Integrując zoptymalizowaną cytometrię przepływową i sekwencję scRNA w ramach opartych na rozwoju i regionie, protokół ten służy jako potężne narzędzie do badania biologii mikrogleju we wczesnym okresie życia i jej znaczenia dla wyników neurorozwojowych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez komisję etyczną Centrum Badawczego CHU Sainte-Justine i są zgodne z wytycznymi i zasadami Centrum Badawczego Ste-Justine oraz Uniwersytetu w Montrealu (Montreal, Quebec, Kanada).

1. Izolacja komórek od mózgu

  1. Po zabiegach znieczulenia/eutanazji należy szybko usunąć cały mózg z jamy czaszki i umieścić go w probówce o pojemności 15 ml zawierającej pożywkę do hodowli komórek mikrogleju (patrz tabela materiałów). Trzymaj probówkę na lodzie. W razie potrzeby powtórz tę samą procedurę dla dodatkowych myszy.
    Wszystkie myszy użyte w tym badaniu pochodziły z wewnętrznych kolonii hodowlanych w laboratorium dr Tremblay'a. Eksperymentalne myszy zostały wygenerowane przez skrzyżowanie myszy B6.129-Cx3Cr1 CreERT2-EYFP / WT z myszami B6-Rosa26iDTR / WT, oba pierwotnie pochodzące z Jackson Laboratories. Ta strategia hodowlana dała potomstwo heterozygotyczne pod względem allelu IDTR, umożliwiając warunkowe zubożenie komórek eksprymujących Cx3Cr1 (głównie mikrogleju) przez indukowany tamoksyfenem system Cre-loxP. Przed pobraniem tkanek myszy znieczulono poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (150 μg/g) i ksylazyny (10 μg/g). Eutanazja została przeprowadzona przez ścięcie głowy w głębokiej narkozy, zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich wykorzystywania.
  2. Albo zachowaj cały mózg, albo przystąp do sekcji określonych regionów, jeśli jest to pożądane. Przeprowadzić sekcję na małej szalce Petriego zawierającej pożywkę do hodowli komórek mikrogleju (patrz tabela materiałów) na lodzie, aby utrzymać żywotność komórek.
    UWAGA: Ten protokół został zwalidowany dla całego mózgu i móżdżku od P1 do P30.
  3. Usuń pożywkę do hodowli komórek mikrogleju i drobno przetnij tkankę mózgową za pomocą skalpela na szalce Petriego.
  4. W celu trawienia enzymatycznego przenieść homogenizowaną tkankę do probówek o pojemności 5 ml. Dodać 2 ml HBSS (1x) uzupełnionego 2 mg/ml kolagenazy D i 14 μg/ml DNazy I (patrz Tabela 1). Uszczelnij nakrętki probówek parafilmem. Inkubować probówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 minut, potrząsając probówką co 5 minut. Aby zatrzymać trawienie, umieść rurki na lodzie.
  5. Przepuść homogenat przez metalowy filtr siatkowy o wielkości 140 μm (patrz tabela materiałów), aby usunąć duże zanieczyszczenia. Użyj szklanego tłuczka, aby oddzielić komórki.
  6. Kilkakrotnie przemyć filtr pożywką do hodowli komórek mikrogleju (3 ml na pranie).
  7. Zebrać filtrat za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieść go do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować roztwór o stężeniu 500 g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Odrzucić supernatant, ostrożnie odwracając probówkę. Ponownie zawiesić pellet, delikatnie zeskrobując go na stojaku.
  9. Dodać 10 ml 37% roztworu pożywki koloidalnej na bazie krzemionki (patrz Tabela 1) w celu usunięcia mieliny i zanieczyszczeń. Odwirować roztwór o sile 500 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy minimalnej sile hamowania.
  10. Odessać warstwę mieliny w górnej części roztworu za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
    UWAGA: Ciągłe zasysanie zapobiega ponownemu mieszaniu się mieliny z roztworem.
  11. Przemyć komórki, dodając 10 ml HBSS (1x) i odwirować w temperaturze 500 × g przez 7 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad, delikatnie zeskrobując go stojakiem, a następnie dodać 10 ml buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencyjnie (FACS) (patrz Tabela 1). Odwirować roztwór o sile 500 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  13. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić ostateczną osadówkę i zachować komórki. Wyizolowane komórki są teraz gotowe do barwienia cytometrią przepływową lub sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek.
  14. W przypadku izolacji sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki należy policzyć komórki pod mikroskopem przy użyciu stabilnych odczynników fluorescencyjnych (patrz Tabela materiałów) w celu odróżnienia żywych i martwych komórek jądrzastych wraz z błękitem trypanowym (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że ogniwa są w doskonałym stanie, z żywotnością do 90% i osiągają stężenie 1000 komórek/μl). Kolejne kroki opisano w punkcie 9.1.
    UWAGA: Utrzymuj probówki na lodzie przez cały czas trwania protokołu. Wszystkie etapy wirowania muszą być przeprowadzane w temperaturze 4 °C z maksymalnym hamulcem, z wyjątkiem etapu Percoll, gdzie określony jest minimalny hamulec. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wykonaj cały protokół tego samego dnia. W przypadku protokołu sekwencyjnego RNA pojedynczej komórki przefiltruj wszystkie roztwory używane do izolacji, w kroku 1.11 użyj HBSS (1x) do drugiego płukania, a w kroku 1.12 zachowaj 70-100 μl roztworu komórkowego.

2. Protokół barwienia zewnątrzkomórkowego cytometrii przepływowej

  1. Przenieś wszystkie komórki do 96-dołkowej płytki ze stożkowym dnem (patrz tabela materiałów). Odwirować płytkę przy 500 g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Szybko odwróć płytkę, aby usunąć supernatant jednym ruchem.
  3. Zawiesić osad komórkowy w 25 μl roztworu blokującego (patrz Tabela 1). Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
  4. Aby przygotować zewnątrzkomórkową mieszaninę do barwienia przeciwciał (patrz Tabela 2), należy odwirować zapasy przeciwciał o masie 10 000 × g w celu usunięcia potencjalnych agregatów. Nie naruszając osadu, ostrożnie odessać żądaną objętość z supernatantu, aby przygotować mieszankę barwiącą i dostosować objętość do 25 μl za pomocą buforu FACS.
  5. Do każdej studzienki dodać 25 μl mieszanki przeciwciał zewnątrzkomórkowych. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Przed zastosowaniem eksperymentalnym wszystkie przeciwciała miareczkowano na zawiesinach jednokomórkowych móżdżku (lub mózgu) w celu określenia optymalnego stężenia roboczego. Miareczkowanie przeprowadzono przez seryjne rozcieńczenia w celu wygenerowania krzywej nasycenia, a do etapu sygnału wybrano rozcieńczenie odpowiadające plateu sygnału z minimalnym tłem.
  6. Nie mieszając, dodać 150 μl buforu FACS do studzienek. Odwirować płytkę o masie 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odwrócić płytkę, aby usunąć supernatant jednym ruchem.
  7. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu FACS. Odwirować płytkę o stężeniu 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odwrócić płytkę w celu usunięcia supernatantu jednym ruchem. Powtórz pranie jeszcze raz, używając 200 μl buforu FACS w tych samych warunkach.

3. Barwienie wewnątrzkomórkowe

  1. Ponownie zawiesić komórki w 100 μl buforu saponinowo-paraformaldehydowego (PFA) (patrz Tabela 1) w celu utrwalenia i przepuszczalności komórek. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
  2. Nie mieszając, dodać 100 μl buforu saponin (patrz Tabela 1). Odwirować płytkę o stężeniu 500 × g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odwrócić płytkę w celu usunięcia supernatantu jednym ruchem.
  3. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu saponinowego. Przygotować kontrole kompensacji, dodając 20 μl kulek (patrz tabela materiałów) do 11 pustych studzienek. Odwirować płytkę o stężeniu 500 × g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odwrócić płytkę w celu usunięcia supernatantu jednym ruchem.
  4. Aby przygotować wewnątrzkomórkową mieszaninę do barwienia przeciwciał (patrz Tabela 3), należy odwirować zapasy przeciwciał o masie 10 000 × g w celu usunięcia potencjalnych agregatów. Nie naruszając osadu, ostrożnie odessać żądaną objętość z supernatantu, aby przygotować mieszankę barwiącą i dostosować objętość do 50 μl za pomocą buforu saponinowego.
  5. Zawiesić osad w 50 μl wewnątrzkomórkowej mieszaniny przeciwciał (patrz Tabela 3). Dodać 1 μl każdego przeciwciała do studzienek perełkowych. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Bez mieszania dodać 150 μl buforu saponin do każdej studzienki próbki komórki i dodać 100 μl buforu FACS do każdej studzienki zawierającej kontrole kompensacyjne w celu przepłukania kulek. Odwirować płytkę o stężeniu 500 × g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odwrócić płytkę w celu usunięcia supernatantu jednym ruchem.
  7. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu saponin i ponownie zawiesić kontrole kompensacyjne w 200 μl buforu FACS. Odwirować płytkę o masie 500 × g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Odwrócić płytkę, aby usunąć supernatant jednym ruchem. Powtórzyć płukanie jeszcze raz, używając 200 μl buforu saponin w tych samych warunkach.
  8. Zawiesić ogniwa i kontrolki kompensacyjne w 200 μl buforu FACS. Przenieść zawiesinę do probówki FACS i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu uzyskania cytometrii przepływowej.
    UWAGA: Upewnij się, że wszystkie kroki z odczynnikami wrażliwymi na światło są wykonywane w minimalnych warunkach oświetleniowych. Jedna studzienka koralikowa nie zawiera przeciwciała, co odpowiada niebarwionej probówce z kulkami.

4. Akwizycja cytometrii przepływowej

  1. Włącz cytometr przepływowy, a następnie komputer.
  2. Otwórz oprogramowanie cytometru przepływowego i zainicjuj uruchamianie fluidyki, wybierając opcję Uruchom na karcie cytometru.
  3. Utwórz nowy folder eksperymentu, klikając Nowy folder i przypisując nazwę. Następnie kliknij przycisk Nowy eksperyment , aby nadać eksperymentowi nazwę i wybierz opcję Nowa probówka , aby dodać próbkę i probówkę z próbką.

5. Skonfiguruj kontrolę wynagrodzeń

  1. Przygotuj pojedynczo barwione koraliki kompensacyjne dla każdego fluorochromu użytego w panelu, wraz z niebarwioną kontrolą.
  2. Załaduj rurki kompensacyjne na cytometr. Ustaw napięcie rozproszenia przewodzenia (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC) na około 250.
  3. Dostosuj napięcia dla każdego kanału fluorescencyjnego tak, aby populacja ujemna znajdowała się w pierwszej dekadzie osi.
  4. Zdobądź co najmniej 5 000 zdarzeń na tubę.
  5. Użyj macierzy kompensacji, aby dostosować się do nakładania się widma, aż wszystkie dodatnie piki zostaną wyraźnie oddzielone od populacji ujemnej i wyśrodkowane powyżej 104 na odpowiedniej osi.
    UWAGA: Kontrole kompensacji muszą być wykonywane dla każdego eksperymentu, ponieważ ustawienia cytometru lub wydajność fluorochromu mogą znacząco wpłynąć na nakładanie się widma. Chociaż kontrole kompensacji opartej na komórkach są zalecane w niektórych zastosowaniach tkanki mózgowej, w tym protokole zastosowano kulki wychwytujące przeciwciała ze względu na mniejszą liczbę mikrogleju możliwego do uzyskania z móżdżku myszy P3, co ogranicza wykonalność kompensacji opartej na komórkach. Fluorescencja przeciwciał została początkowo zwalidowana na komórkach pochodzących z mózgu i stwierdzono, że jest porównywalna z sygnałami opartymi na kulkach. Uwzględnij niebarwioną zawiesinę komórek pochodzących z mózgu podczas początkowej optymalizacji panelu, aby ocenić autofluorescencję tkanek i ustalić wyjściowe poziomy sygnału. Ta kontrola jest niezbędna do prawidłowego ustawienia ujemnych populacji w każdym kanale fluorescencyjnym.

6. Przygotowanie i pozyskanie kontroli FMO

  1. Dla każdego kluczowego markera należy przygotować kontrolę fluorescencji minus jeden (FMO), która obejmuje wszystkie przeciwciała z wyjątkiem tego, które jest badane.
  2. Uruchom kontrolki FMO przy użyciu tych samych ustawień akwizycji, co w pełni wybarwione próbki.
  3. Wykresy FMO służą do definiowania progów bramkowania dla niskich lub nakładających się na siebie populacji oraz do odróżniania prawdziwych dodatnich wyników od szumu tła.
    UWAGA: Kontrole FMO powinny być wykonywane podczas początkowej optymalizacji panelu w celu zdefiniowania dokładnych i niezawodnych granic bramkowania, szczególnie w tkankach o wysokiej autofluorescencji, takich jak mózg. Jeśli panel barwienia, ustawienia przyrządu lub warunki eksperymentalne są modyfikowane, kontrole FMO muszą zostać powtórzone. W przypadku kolejnych eksperymentów wykorzystujących te same zwalidowane ustawienia panelu i cytometru, wcześniej zdefiniowane progi bramkowania mogą być ponownie wykorzystane w celu zapewnienia spójności między kontrpróbami biologicznymi.

7. Przygotuj i zdobądź kontrole Isotype

  1. Wybarwić próbkę kontrolną przeciwciałami kontrolnymi izotypu dopasowanymi pod względem fluorochromu i stężenia do przeciwciał testowych.
  2. Zbieraj dane przy użyciu tych samych ustawień cytometru.
  3. Kontrole izotypowe należy stosować tylko do oceny potencjalnego nieswoistego wiązania, szczególnie w przypadku markerów wewnątrzkomórkowych lub słabo scharakteryzowanych przeciwciał. Nie należy używać kontrolek izotypowych do bramkowania, ponieważ nie odzwierciedlają one takiej samej kinetyki wiązania jak określone przeciwciała.
    UWAGA: Kontrole izotypów nie nadają się do bramkowania i nie powinny być używane do definiowania populacji. Ich stosowanie jest opcjonalne i powinno być zarezerwowane do walidacji swoistości przeciwciał w wybranych przypadkach.

8. Strategia bramkowania cytometrii przepływowej

  1. Utwórz następujące wykresy kropkowe dla bramkowania sekwencyjnego:
    FSC-A vs. SSC-A w celu wykluczenia zanieczyszczeń
    FSC-A vs. FSC-H, aby wybrać podkoszulki.
    FSC-A kontra Amcyan (barwnik żywotności) do bramkowania żywych komórek.
  2. Zidentyfikuj mikroglej jako CD11b+CD45+ za pomocą CD11b (FITC) vs CD45 (AF700).
    UWAGA: Ze względu na etap rozwojowy (P3-P15), kontekst zapalny i trawienie enzymatyczne, TMEM119 i P2RY12 nie były wiarygodne w wyraźnym oddzielaniu mikrogleju od innych populacji szpiku za pomocą cytometrii przepływowej. Strategia bramkowania CD11b+CD45+ , wcześniej zwalidowana w mózgu po urodzeniu, została zatem wykorzystana do identyfikacji populacji mikrogleju przy jednoczesnej minimalizacji zanieczyszczenia. W warunkach kontrolnych typowa wydajność waha się od 30 000 do 200 000 komórek mikrogleju na cały mózg od P3 do P15. W przypadku eksperymentów skupiających się w szczególności na móżdżku, średnia wydajność wynosi około 5000 komórek mikrogleju na mózg.
  3. Użyj kontrolek FMO, aby zdefiniować progi bramkowania dla znaczników aktywacji.
  4. Identyfikacja subpopulacji mikrogleju na podstawie ekspresji markerów związanych z odpornością:
    CD80+ (Super Jasny 436)
    CD86+ (PE)
    iNOS+ (PE-eFluor 610)
  5. Dalsze charakteryzowanie podzbiorów mikrogleju za pomocą kombinacji ekspresji markerów:
    CD206+ (APC), następnie Arg1+ (PE-Cy7)
    CD86+ (PE), a następnie CD64+ (PerCP-eFluor 710)
    CD163+ (Super Bright 600)następnie CD206+ (APC)
    UWAGA: Kombinacje markerów służą do opisu niejednorodności molekularnej w populacji mikrogleju. Podzbiory te są raportowane na podstawie samej ekspresji markerów i nie przypisuje się im określonych ról funkcjonalnych, zgodnie z obecnymi normami uznającymi plastyczność mikrogleju i fenotypy zależne od kontekstu.
  6. Załaduj próbkę eksperymentalną. Ustaw FSC na 300 i SSC na 200. Użyj niskiego natężenia przepływu i zarejestruj żądaną liczbę zdarzeń.
  7. Po akwizycji umyj cytometr i wyeksportuj dane jako . Pliki FSC do analizy.
  8. Analizuj dane za pomocą oprogramowania cytometru przepływowego.

9. Próbka sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

  1. Korzystając z tego samego protokołu izolacji komórek, który opisano dla cytometrii przepływowej (patrz krok 1.14), ponownie zawiesić zdysocjowane komórki w buforze FACS. Używaj buforu FACS w probówkach zbiorczych i wszystkich kolejnych krokach obsługi, aby utrzymać stabilność komórek.
  2. Nie należy wykonywać sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS), jeśli celem jest wychwycenie wszystkich typów komórek z obszaru mózgu. Jeśli jednak eksperyment wymaga wzbogacenia w kierunku mikrogleju, przed sekwencjonowaniem należy uwzględnić etap sortowania FACS.
  3. Natychmiast oceń żywotność komórek za pomocą stabilnych w stanie laboratoryjnym barwników fluorescencyjnych i błękitu trypanowego (patrz tabela materiałów). Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru (patrz tabela materiałów).
  4. Sprawdź, czy zawiesina komórek wykazuje żywotność co najmniej 90% i dostosuj do końcowego stężenia około 1,000 komórek/μl przed przystąpieniem do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.
  5. Przechowuj wszystkie próbki na lodzie i przetwarzaj je natychmiast po dysocjacji, aby zminimalizować stres komórkowy i zmiany transkrypcyjne.
  6. Próbki należy multipleksować parami zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Jeden samiec i jedna samica z tej samej grupy eksperymentalnej zostali połączeni w celu zmniejszenia kosztów eksperymentu.
  7. Przygotuj biblioteki scRNAseq (patrz Spis materiałów) i postępuj zgodnie z zalecanymi wskazówkami producenta.
    UWAGA: Przygotowanie biblioteki zostało wykonane przez Platformę Genomiczną Instytutu Badań nad Immunologią i Rakiem (IRIC) na Uniwersytecie w Montrealu.
  8. Sekwencjonowanie bibliotek scRNA-seq za pomocą systemu sekwencjonowania do średniej głębokości 3200 mln odczytów na linię.
    UWAGA: Sekwencjonowanie przeprowadzono w Genome Quebec w Montrealu.

10. Analiza sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki

  1. Wykonaj analizę liczby unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI) przy użyciu oprogramowania Cell Ranger (v8.0.0) firmy 10X Genomics z genomem referencyjnym myszy GRCm39 2024-A. Użyj pakietu Seurat R (wersja 5.1) do analizy podrzędnej.
  2. Przeprowadź kontrolę jakości, wykluczając komórki, w których mitochondrialne RNA przekracza na przykład 30% całkowitego RNA (ryc. 1A) lub bardziej rygorystyczny próg wybrany do usuwania komórek z potencjalnym stresem. Odfiltruj komórki o niskiej jakości z log10GenesPerUMI większym niż 0,75 (Figura 1B), liczbą unikalnych cech ("nUMI") poniżej 500 i liczbą genów wykrytych na komórkę ("nGene") większą niż 300 (Figura 1C). Następnie usuń kropelki za pomocą pakietu "scDblFinder" w R. Z wykresem korelacji nUMI i nGene pokazującym progi, efekt filtrowania powinien być teraz widoczny (Rysunek 1D).
  3. Łagodzenie skutków wsadowych poprzez identyfikację 2 000 wysoce zmiennych genów na próbkę za pomocą funkcji SelectIntegrationFeatures firmy Seurat.
  4. Integruj zestawy danych za pomocą kanonicznej analizy korelacji (CCA) i przeprowadzaj analizę głównych składowych (PCA) w celu redukcji wymiarów. Użyj funkcji RunPCA z 50 głównymi komponentami (PC), skalując dane i regresjonując niechciane źródła zmienności (np. zawartość mitochondriów). Oceń liczbę zatrzymanych komputerów na podstawie wykresu łokcia i analizy JackStraw.
  5. Wizualizacja klastrów za pomocą algorytmu UMAP (Uniform Multifold approximation and Projection) za pośrednictwem funkcji Seurat RunUMAP . Zidentyfikuj profile ekspresji genów specyficzne dla klastra za pomocą funkcji FindAllMarkers . Opisuj klastry na podstawie sygnatur transkrypcyjnych, porównując zidentyfikowane geny markerów z wyselekcjonowanymi zasobami pojedynczych komórek, takimi jak PanglaoDB i CellMarker (Figura 2). Typy komórek, w tym mikroglej, są wnioskowane na podstawie tych profili transkryptomicznych, a nie z predefiniowanych markerów powierzchniowych.

11. Separacja komórek ze względu na płeć

  1. Zidentyfikuj komórki męskie i żeńskie na podstawie ekspresji genów specyficznych dla płci: czterech specyficznych dla kobiet (Xist, Tsix, Usp9x, Eif2s3x) i trzech specyficznych dla mężczyzn (Eif2s3y, Uty, Ddx3y).
  2. Klasyfikuj populacje męskie i żeńskie, filtrując komórki wykazujące ekspresję znormalizowanej liczby UMI > 1 dla dowolnego z tych genów przy użyciu funkcji podzbioru Seurata.
  3. Generuj obiekty Seurat, tworząc oddzielnie podzbiory komórek męskich i żeńskich. Przechowuj i analizuj te obiekty niezależnie w celu dalszych porównań.
  4. Walidacja klasyfikacji poprzez wizualizację ekspresji genów specyficznej dla płci przy użyciu funkcji FeaturePlot i VlnPlot , zapewniając wyraźną separację między populacjami komórek męskich i żeńskich.
    UWAGA: Kroki 12.1 i 12.2 należy wykonywać tylko wtedy, gdy próbka została zmultipleksowana przez zmieszanie jednego samca i jednej samicy.

12. Klasyfikacja mikrogleju w oparciu o model statystyczny

  1. Zbuduj pięć modeli statystycznych w języku R (las losowy, regresja logistyczna, naiwny algorytm Bayesa, maszyna wektorów nośnych, drzewo decyzyjne) przy użyciu zestawu treningowego ~1,000 komórek ze znanymi etykietami grup.
  2. Oceń wydajność modelu za pomocą 10-krotnej walidacji krzyżowej i krzywych charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) (rysunek 3). Zidentyfikuj kluczowe geny przyczyniające się do klasyfikacji za pomocą funkcji FindAllMarkers w Seurat.
  3. Wybierz model o najwyższym obszarze pod krzywą ROC (AUC). Losowy model lasu został wybrany na podstawie jego lepszego wyniku AUC.
  4. Zastosuj wybrany model do niesklasyfikowanych komórek przy użyciu funkcji przewidywania z pakietu RandomForest R. Scal przewidywane klasyfikacje z wcześniej oznaczonymi adnotacjami zestawami danych w Seurat przy użyciu scalania.
  5. Walidacja klasyfikacji poprzez wizualizację ekspresji genów markerów za pomocą FeaturePlot i VlnPlot. Aby zapewnić spójność przewidywanych tożsamości komórek, należy ocenić wzbogacenia zestawu genów markerowych nakładających się na siebie przed i po dodaniu sklasyfikowanych komórek za pomocą odpowiedniego testu statystycznego (np. dokładnego testu Fishera).

13. Analiza różnicowej ekspresji genów mikrogleju

  1. Wykonaj różnicową analizę ekspresji genów (DEG) między dwiema określonymi grupami zainteresowania przy użyciu funkcji Seurat "FindMarkers", gdzie ident.1 reprezentuje grupę zainteresowania, a ident.2 reprezentuje grupę odniesienia.
    UWAGA: Dane wyjściowe zawierają listę genów, które są różnie wyrażane w ident.1 w stosunku do ident.2. W tym kontekście, gen regulowany w górę to te, które mają wyższą ekspresję w ident.1 w porównaniu do ident.2, podczas gdy geny o obniżonej regulacji wykazują niższą ekspresję w ident.1. Ich porównania są wykorzystywane do generowania wykresów wulkanów i interpretacji zmian transkrypcyjnych specyficznych dla danego stanu.
  2. Zidentyfikuj geny o zróżnicowanej ekspresji (DEC) ze skorygowaną wartością P≤ 0,05. Do porównań między dwiema określonymi grupami należy użyć funkcji FindAllMarkers z następującymi kryteriami: geny wyrażane w co najmniej 10% komórek (min.pct = 0,1) i próg log2-krotnej zmiany wynoszący 0,25 (logfc.threshold=0,25). W przypadku porównań wielogrupowych we wszystkich mikrogleju należy użyć funkcji FindAllMarkers z tymi samymi parametrami. Uważa się, że geny o skorygowanej wartości P ≤ 0,05 mają znacznie zróżnicowaną ekspresję. Aby zobrazować wzorce wyrażeń DEG, wygeneruj wykres wulkanu przy użyciu wbudowanej funkcji w pakiecie EnhancedVolcano (Rysunek 4) .
  3. Porównaj wyniki cytometrii przepływowej, najpierw badając markery cytometryczne używane do znalezienia mikrogleju, w szczególności CD45+ i CD11b+, które odpowiadają genom PtprciItgam. Potwierdź ekspresję genów za pomocą funkcji FeaturePlot w Seurat.
  4. Oceń markery powszechnie związane z różnymi stanami mikrogleju, w tym CD80iNOS2, a także Mrc1,Arg1,Fcgr1 i CD163. Użyj funkcji Seurat FeaturePlot i DotPlot, aby zwizualizować ich wyrażenie w klastrach komórek.
  5. Wygeneruj wykres punktowy przy użyciu funkcji DotPlot w Seurat, aby podsumować wyrażenia znaczników i zweryfikować klasyfikację populacji.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten skutecznie wykorzystuje cytometrię przepływową do scharakteryzowania populacji komórek mikrogleju w próbkach mózgu myszy, w oparciu o ekspresję wybranych markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych. Poniższe sekcje szczegółowo opisują wyniki uzyskane z kluczowych etapów przepływu pracy, podkreślając rozmieszczenie i niejednorodność podzbiorów mikrogleju w odpowiedzi na warunki eksperymentalne.

Walidacja strategii kompensacji i bramkowania
Kulki kompensacyjne wykorzystano do kalibracji sygnałów fluorescencyjnych i skorygowania nakładania się widmowego między fluorochromami. Populacje dodatnie i ujemne dla każdego fluorochromu zostały wyraźnie oddzielone, co umożliwiło dokładne wygenerowanie matrycy kompensacyjnej. Progi bramkowania zostały początkowo zweryfikowane przy użyciu kontroli Fluorescence Minus One (FMO) podczas optymalizacji panelu, aby odróżnić prawdziwy sygnał od tła, szczególnie w przypadku słabych lub nakładających się znaczników. Progi te zostały następnie ponownie wykorzystane w eksperymentach przy użyciu tych samych ustawień panelu barwienia i cytometru, aby zapewnić spójność. Włączono kontrole izotypu w celu monitorowania potencjalnego niespecyficznego wiązania, szczególnie w przypadku markerów wewnątrzkomórkowych, ale nie były one wykorzystywane do podejmowania decyzji o bramkowaniu.

Identyfikacja komórek mikrogleju
Strategia bramkowania komórek żywych/martwych (Amcyjan) skutecznie wykluczyła martwe komórki. Strategia bramkowania skutecznie izolowała populacje komórek mikrogleju w oparciu o ekspresję CD45 (AF700) i CD11b (FITC). Parametry rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC) zostały zoptymalizowane (FSC = 300, SSC = 200) w celu wyśrodkowania populacji mikrogleju na wykresie kropkowym (ryc. 5).

Fenotypowanie komórek mikrogleju
Analiza wykresu punktowego umożliwiła identyfikację subpopulacji mikrogleju w oparciu o zróżnicowaną ekspresję markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych. Korzystając ze specyficznych strategii bramkowania w oprogramowaniu FlowJo, zidentyfikowano podzbiór komórek mikrogleju wyrażających CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) i iNOS (PE-eFluor 610) (Figura 6A). Podwójne bramkowanie wykorzystano również do zdefiniowania podzbiorów wyrażających CD206 (APC) i Arg1 (PE-Cy7) (patrz rysunek 6B). Dodatkowe populacje charakteryzowały się koekspresją CD86 (PE) i CD64 (PerCP-eFluor 710), a także CD163 (Super Bright 600) i CD206 (APC) (Figura 6C, D). Te profile fenotypowe odzwierciedlają zdefiniowaną markerami heterogeniczność w populacji mikrogleju i pokazują zdolność tego protokołu do rozróżniania wielu podzbiorów odrębnych transkrypcyjnie i immunologicznie bez wnioskowania o ustalonych stanach funkcjonalnych.

Analiza pojedynczych komórek mikrogleju
Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) wykorzystano do wizualizacji heterogeniczności komórkowej i identyfikacji klastrów komórek mikrogleju wśród innych typów komórek mózgowych. Każda kropka reprezentuje pojedynczą komórkę, a klaster jest oznaczony kolorem na podstawie podobieństwa transkrypcji (rysunek 2).

Przeprowadzono analizę różnicowej ekspresji w klastrze mikrogleju w celu zidentyfikowania genów modulowanych w warunkach eksperymentalnych. Geny o skorygowanej wartości P ≤ 0,05 uznano za wyrażone w różny sposób.

Wygenerowano wykres wulkanu, aby zobrazować te geny o zróżnicowanej ekspresji komórek mikrogleju, podkreślając te z dużą zmianą krotności i istotnością statystyczną (ryc. 4).

Aby porównać wyniki tych pojedynczych komórek z danymi cytometrii przepływowej, zbadano ekspresję markerów mikrogleju CD45 i CD11b (Ptprc i Itgam). UMAP pokazuje ich ekspresję w różnych populacjach komórek (ryc. 7).

Na koniec oceniono ekspresję wybranych markerów związanych z odpornością w celu scharakteryzowania heterogeniczności transkrypcji wśród komórek mikrogleju. Wykres skrzypcowy przedstawia ekspresję genów, takich jak CD80 i NOS-, a także Mrc1, Arg1, Fcgr1 i CD163 na poziomie pojedynczej komórki (ryc. 8). Te wzorce ekspresji markerów pozwalają na porównanie z profilowaniem opartym na cytometrii przepływowej i podkreślają różnorodność molekularną podzbiorów mikrogleju w warunkach eksperymentalnych.

figure-results-1
Rysunek 1: Kontrola jakości danych transkryptomicznych z pojedynczej komórki. (A) Dystrybucja zawartości mitochondrialnego RNA w komórkach. Komórki z >30% mitochondrialnym RNA zostały wykluczone w celu usunięcia potencjalnie zestresowanych lub umierających komórek. (B) Komórki o log10GenesPerUMI > 0,75 zostały odfiltrowane, aby zapewnić stały stosunek genów do UMI i zredukować szum z bibliotek o niskiej złożoności. (C) Komórki z mniej niż 500 wykrytymi transkryptami (nUMI) lub więcej niż 300 wykrytymi genami (nGENE) zostały również wykluczone w celu wyeliminowania komórek o niskiej jakości lub wielu komórek. (D) Wykres korelacji NUMI w stosunku do nGene ilustrujący wpływ progów filtrowania. Wykryte dublety zostały usunięte. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Wizualizacja UMAP transkryptomów jednokomórkowych. Wykres UMAP przedstawiający rozmieszczenie pojedynczych komórek na podstawie profili transkryptomicznych uzyskanych od dwóch pojedynczych zwierząt. Każda kropka reprezentuje jedną komórkę oznaczoną kolorem według tożsamości klastra. Klaster komórek mikrogleju jest identyfikowany wśród innych populacji komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Krzywa ROC klasyfikatora lasu losowego oceniana za pomocą walidacji krzyżowej. Krzywa charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) ilustrująca wydajność modelu Random Forest używanego do odróżniania mikrogleju od innych typów komórek mózgowych na podstawie profili ekspresji genów. Model został przeszkolony na zestawie ~1000 komórek ze znanymi etykietami i oceniony przy użyciu 10-krotnej walidacji krzyżowej. Spośród pięciu testowanych modeli statystycznych (las losowy, regresja logistyczna, naiwny algorytm Bayesa, maszyna wektorów nośnych i drzewo decyzyjne) model lasu losowego osiągnął najwyższą wydajność klasyfikacji. Pole pod krzywą (AUC) odzwierciedla dokładność modelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Różnicowa analiza ekspresji genów w komórkach mikrogleju. Wykres wulkaniczny reprezentujący log2-krotną zmianę w funkcji skorygowanej wartości P dla genów różnie wyrażanych w mikrogleju między dwiema grupami eksperymentalnymi (kontrola vs. uszkodzenie mózgu móżdżku). Gen o podwyższonej regulacji jest bardziej ekspresjonowany w grupie zainteresowania (ident.1), a geny o obniżonej regulacji wykazują zmniejszoną ekspresję w porównaniu z grupą referencyjną (ident.2). Znakowane są kluczowe geny o istotnej zróżnicowanej ekspresji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Strategia bramkowania do identyfikacji mikrogleju za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Strategia bramkowania zastosowana do komórek móżdżku od myszy kontrolnej po urodzeniu 3 dnia (P3). (B) Podkoszulki zostały wybrane tak, aby wykluczyć dublety. (C) Żywe komórki zidentyfikowano za pomocą barwnika żywotności; zdarzenia o niskim FSC-A zostały wykluczone w celu usunięcia zanieczyszczeń i zapewnienia analizy nienaruszonych komórek. (D) Mikroglej zidentyfikowano jako CD45 + i CD11b + z dwiema odrębnymi populacjami: CD45o niskiej zawartości CD11bdla spoczynkowego mikrogleju i CD45int -CD11bwysoki dla aktywowanego mikrogleju. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Charakterystyka profili ekspresji markerów mikrogleju za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Sekwencyjne bramkowanie komórek CD45 + CD11b + w oparciu o ekspresję CD80, CD86 i iNOS. (B) Identyfikacja podzbioru wyrażającego CD206, po którym następuje bramkowanie na podstawie wyrażenia Arg1. (C) Identyfikacja podzbioru wyrażającego CD86, a następnie bramkowanie oparte na ekspresji CD64. (D) Identyfikacja podzbioru eksprymującego CD163, a następnie bramkowanie na podstawie ekspresji CD206. Te strategie bramkowania ilustrują fenotypową heterogeniczność populacji mikrogleju w oparciu o powierzchniową i wewnątrzkomórkową ekspresję markerów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rycina 7: Potwierdzenie tożsamości mikrogleju za pomocą ekspresji Itgam i Ptprc w danych sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. UMAP wyświetla krajobraz transkrypcyjny komórek móżdżku w P15, z ekspresją genów Itgam i Ptprc nałożoną na klastry. Koekspresja tych kanonicznych markerów szpikowych wspiera identyfikację populacji mikrogleju i jest zgodna z markerami stosowanymi w cytometrii przepływowej, zapewniając walidację krzyżową między analizami transkryptomicznymi i na poziomie białka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Profile ekspresji wybranych genów związanych z odpornością w komórkach mikrogleju zidentyfikowanych za pomocą sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Wykresy skrzypcowe pokazują rozkład ekspresji genów CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 i CD163 w poszczególnych komórkach mikrogleju. Markery te są powszechnie związane z procesami związanymi z układem odpornościowym i ilustrują niejednorodność transkrypcji obserwowaną w populacji mikrogleju. Przedstawiono dane dotyczące zarówno stanu kontrolnego, jak i uszkodzenia mózgu móżdżku (CBI). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Skład roztworów stosowanych do izolacji i barwienia komórek nerwowych. Poniższa tabela zawiera szczegółowy skład roztworów wymaganych do izolacji i barwienia komórek, w tym ich odpowiednie stężenia i składniki. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Stężenia mieszaniny przeciwciał do barwienia zewnątrzkomórkowego. Poniższa tabela zawiera szczegółowe informacje na temat stężeń przeciwciał i żywego/martwego roztworu stosowanego do barwienia zewnątrzkomórkowego, określając wymagane objętości i rozcieńczenia dla każdego przeciwciała w mieszaninie barwiącej dla jednej próbki. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Stężenia mieszaniny przeciwciał do barwienia wewnątrzkomórkowego. Poniższa tabela zawiera szczegółowe informacje na temat stężeń przeciwciał stosowanych do barwienia wewnątrzkomórkowego, określając wymagane objętości i rozcieńczenia dla każdego przeciwciała w mieszaninie barwiącej dla jednej próbki. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to przedstawia szczegółowy i zoptymalizowany protokół, który łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) w celu izolacji i charakterystyki komórek mikrogleju podczas wczesnego rozwoju mózgu po urodzeniu. Chociaż cytometria przepływowa pozostaje opłacalną i dostępną techniką, jej integracja z transkryptomiką pojedynczych komórek zapewnia uzupełniające informacje poprzez powiązanie ekspresji markerów na poziomie białka z profilami transkrypcyjnymi na poziomie genu. Protokół odnosi się do wyzwań technicznych specyficznych dla niedojrzałej tkanki mózgowej, w tym skutecznej dysocjacji, usuwania zanieczyszczeń i mieliny oraz zoptymalizowanych strategii barwienia immunologicznego, aby zapewnić odtwarzalność i wiarygodność w analizie populacji mikrogleju w kluczowych punktach czasowych rozwoju.

Cytometria przepływowa została wykorzystana do identyfikacji podzbiorów mikrogleju na podstawie ekspresji wybranych markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych. Zamiast wnioskować o stanach funkcjonalnych, podzbiory rozróżniano na podstawie ich profili ekspresji markerów, takich jak CD80+/CD86+/iNOS+ ; CD206+/ARG1+ ; Fenotypy CD86+/CD64+ lub CD163+/CD206+ . Te zdefiniowane markerami populacje odzwierciedlają heterogeniczność molekularną w obrębie przedziału mikrogleju i zapewniają praktyczne podejście do wysokoprzepustowej charakterystyki. Chociaż te klasyfikacje oparte na markerach powierzchniowych mogą nie oddawać pełnej złożoności różnorodności mikrogleju, pozostają pouczające, zwłaszcza w kontekstach, w których wielowymiarowe narzędzia molekularne mogą nie być dostępne. Celowo unikano klasyfikacji binarnych, takich jak paradygmat M1/M2, ze względu na widmowy, zależny od kontekstu charakter fenotypów mikrogleju, jak opisano w najnowszej literaturze12.

Obserwacje te są zgodne z wcześniejszymi badaniami podkreślającymi rolę mikrogleju zarówno w prawidłowym dojrzewaniu mózgu, jak i w odpowiedzi na bodźce środowiskowe lub patologiczne13,14. Zdolność do różnicowania heterogeniczności mikrogleju dostarcza cennych informacji na temat tego, w jaki sposób polaryzacja komórek mikrogleju może przyczyniać się do zaburzeń neurorozwojowych15,16.

Chociaż sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki oferuje wyższą rozdzielczość i umożliwia identyfikację odrębnych transkrypcyjnie subpopulacji komórek mikrogleju, jego koszt i złożoność analityczna ograniczają jego dostępność. W obecnym zestawie danych zebranym w 15. dniu po urodzeniu po urazie okołoporodowym szczyt odpowiedzi zapalnej jest w dużej mierze ustąpiony, co skutkuje niską liczbą aktywowanego mikrogleju. W związku z tym techniki redukcji wymiarowości, takie jak UMAP, nie pozwoliły na odzyskanie dobrze oddzielonych podklastrów mikrogleju, a analiza transkrypcyjna na poziomie klastra nie została uwzględniona w tym manuskrypcie protokołu.

Istotną innowacją tego protokołu jest jego optymalizacja pod kątem izolowania i charakteryzowania komórek mikrogleju z móżdżku we wczesnych stadiach postnatalnych (P3 do P30). Ten region i kontekst specyficzny dla wieku stanowią wyraźne wyzwania, w tym niską wydajność komórek, zawartość mieliny i zwiększoną kruchość tkanek. Aby rozwiązać te problemy, protokół łączy dostosowany przebieg dysocjacji, skuteczne usuwanie zanieczyszczeń i mieliny oraz starannie dostrojone warunki barwienia immunologicznego odpowiednie dla tkanki móżdżku o małej objętości. Pomimo coraz powszechniejszego uznawania mikrogleju móżdżku za funkcjonalnie i transkrypcyjnie odrębny od tych w innych obszarach mózgu, szczegółowe protokoły ich izolacji i analizy pozostają ograniczone. Obecna metoda oferuje niezawodny i dostępny przebieg pracy, szczególnie dostosowany do badań rozwojowych mikrogleju móżdżku.

Głównym celem tego manuskryptu jest zapewnienie powtarzalnych i elastycznych ram metodologicznych, a nie przedstawienie konkretnych odkryć biologicznych. Przepływ pracy nadaje się do adaptacji do innych etapów rozwojowych lub modeli eksperymentalnych, w których transkrypcyjnie odmienne stany mikrogleju mogą być bardziej widoczne. W takich kontekstach cytometria przepływowa pozostaje cennym narzędziem, zwłaszcza gdy jest zintegrowana z testami uzupełniającymi.

Jedną z kluczowych zalet tego protokołu jest jego zdolność adaptacji na różnych etapach rozwoju, od 3. dnia po urodzeniu (P3) do 30. dnia po urodzeniu (P30). Pozwala to na podłużną analizę fenotypu mikrogleju w miarę postępu dojrzewania mózgu. Połączone zastosowanie cytometrii przepływowej i sekwencjonowania scRNA umożliwia badanie nie tylko markerów powierzchniowych, ale także wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych i czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w komórki mikrogleju.

Niemniej jednak trawienie enzymatyczne może wpływać na ekspresję niektórych markerów powierzchniowych, co wymaga starannej optymalizacji warunków trawienia dla określonych celów eksperymentalnych 17,18. Ponadto ani cytometria przepływowa, ani sekwencjonowanie pojedynczych komórek nie dostarczają danych na poziomie populacji, które mogą nie uchwycić w pełni przestrzennych i funkcjonalnych niuansów interakcji komórek mikrogleju w ich natywnym środowisku. Włączenie technik przestrzennych pojedynczych komórek może pomóc w rozwiązaniu tego problemu poprzez zachowanie kontekstu przestrzennego komórek mikrogleju. Przyszłe badania łączące ten protokół z technikami obrazowania, takimi jak immunohistochemia, obrazowanie in vivo, western blot lub transkryptomika przestrzenna pojedynczej komórki, mogą dostarczyć uzupełniających informacji na temat dynamiki komórek mikrogleju.

Metoda ta otwiera nowe możliwości badania, w jaki sposób urazy we wczesnym okresie życia, takie jak stan zapalny, niedotlenienie lub stresory środowiskowe, wpływają na fenotypy komórek mikrogleju i przyczyniają się do długoterminowych wyników neurorozwojowych. Umożliwiając precyzyjną i wiarygodną charakterystykę stanów aktywacji komórek mikrogleju, ułatwia identyfikację celów terapeutycznych w celu modulowania odpowiedzi mikrogleju we wczesnym okresie życia, mając na celu zapobieganie zaburzeniom neurorozwojowym lub ich łagodzenie.

Podsumowując, protokół ten oferuje solidne i dostępne ramy do badania różnorodności komórek mikrogleju we wczesnym rozwoju mózgu. Połączenie cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki pozwala na elastyczne zastosowanie na różnych etapach rozwoju i modelach eksperymentalnych, ułatwiając głębszą eksplorację biologii mikrogleju zarówno w kontekście fizjologicznym, jak i patologicznym.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczyli, że nie występuje konflikt interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (487354) oraz Fonds de Recherche du Québec (333845).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
140 i mikro; M Filtr z siatki metalowej Sigma-AldrichZobacz materiał S3895 powiedział:
Probówka 15 mlSarstedt powiedział:62.554.205
Probówka 5 mlSarstedt powiedział:55.526.006
Płytka 96-dołkowa ze stożkowym dnem Sarstedt powiedział:82.1583.001
Arginaza 1 - Sprzężony Pecy7 - Klon : A1exF5Thermo Fisher Naukowy25-3697-82
Odczynniki fluorescencyjne stabilne laboratoryjnieInvitrogenNumer referencyjny A49905
CD11b - Sprzężony Fitc - Klon : M1/70BD Pharmingen553310
CD163 - Sprzężony SB600 - Klon : TNKUPJThermo Fisher Naukowy63-1631-82
CD206 - Sprzężony APC - Klon : C068C2Legenda biologiczna141708
CD45 - Sprzężony A700 - Klon : 30-F11BD Pharmingen560510
CD64 - Sprzężenie  PerCP-eF710 - Klon : X54-5/7.1Thermo Fisher Naukowy46-0641-82
CD80 - Sprzężony SB436 - Klon : 16-10A1Thermo Fisher Naukowy62-0801-82
CD86 - Sprzężony Pe - Klon : GL-1Legenda biologiczna105008
Kolagenaza DSigma– Aldrich11088866001
DNaza ISigma– Aldrich10104159001
Surowica płodowa bydlęca (FBS)Sigma– Aldrich Zobacz materiał F1051
HBSS (zbilansowany roztwór soli Hanka) 10xBioprodukty żubra 311506CL
HemocytometrVWR Polska82030-470
HEPESYBioprodukty żubra 330.050.EL
iNOS - Sprzężony PE- eF610 - Klon : CXNFTThermo Fisher Naukowy61-5920-82
KclThermo Fisher NaukowyZobacz materiał BP366-500
KH2PO4Thermo Fisher NaukowyZobacz materiał BP362-500
Żywy/martwy amcyjanThermo Fisher NaukowyL34957
Pożywki do hodowli komórek mikroglejuTechnologie życioweA12475-01
Na2HPO4Thermo Fisher NaukowyZobacz materiał BP332-500
Zawartość NaClThermo Fisher NaukowyZobacz materiał BP358-212
ParaformaldehydSigma– Aldrich Zobacz materiał P6148
Szczur anty mysz CD16/CD32BD Nauki Biologiczne 553142
SaponinaSigma– Aldrich Zobacz materiał S7900
Biblioteki scRNAseq10X Genomika1000121
Podłoże koloidalne na bazie krzemionkiThermo Fisher Naukowy45001747
Azydek soduThermo Fisher NaukowyZobacz materiał BP922I-500
Błękit trypanowyGibco (firma Gibco)1525006

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Berardi, N., Sale, A., Maffei, L. Brain structural and functional development: Genetics and experience. Dev Med Child Neurol. 57 (Suppl 2), 4-9 (2015).
  2. Tremblay, M. E. Microglial functional alteration and increased diversity in the challenged brain: Insights into novel targets for intervention. Brain Behav Immun Health. 16, 100301(2021).
  3. Salter, M. W., Beggs, S. Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS. Cell. 158 (1), 15-24 (2014).
  4. Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (Pt 5), 1138-1159 (2015).
  5. Nayak, D., Roth, T. L., Mcgavern, D. B. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
  6. Mehl, L. C., Manjally, A. V., Bouadi, O., Gibson, E. M., Tay, T. L. Microglia in brain development and regeneration. Development. 149 (8), dev200425(2022).
  7. Mastenbroek, L. J. M., Kooistra, S. M., Eggen, B. J. L., Prins, J. R. The role of microglia in early neurodevelopment and the effects of maternal immune activation. Semin Immunopathol. 46 (1-2), 1(2024).
  8. Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Front Immunol. 9, 1014(2018).
  9. Srakocic, S., et al. Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation. Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).
  10. Akhmetzyanova, E. R., Rizvanov, A. A., Mukhamedshina, Y. O. Current methods for the microglia isolation: Overview and comparative analysis of approaches. Cell Tissue Res. 395 (2), 147-158 (2024).
  11. Walker, D. G., Lue, L. F. Immune phenotypes of microglia in human neurodegenerative disease: Challenges to detecting microglial polarization in human brains. Alzheimers Res Ther. 7 (1), 56(2015).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  13. Hammond, T. R., et al. Single-cell RNA sequencing of microglia throughout the mouse lifespan and in the injured brain reveals complex cell-state changes. Immunity. 50 (1), 253-271.e6 (2019).
  14. Bernier, L. P., York, E. M., Macvicar, B. A. Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function. Trends Neurosci. 43 (11), 854-869 (2020).
  15. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).
  16. Gosselin, D., et al. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).
  17. Chometon, T. Q., et al. A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).
  18. Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplant. 28 (5), 638-644 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometrySingle Cell AnalysisMicroglia ActivationPostnatal Brain DevelopmentMouse CerebellumCell IsolationRNA SequencingTissue DissociationSurface Marker ProfilingDifferential Expression

Related Articles