Artykuł metodologiczny

Pomiar cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (ELISA)

DOI:

10.3791/68432

⸱

3 lipca 2025

 ,  ,  , 
1Molecular Biology and Genetics Section, Molecular Medicine Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten mierzy stężenia cyklicznego monofosforanu guanozyny (cGMP) w tkankach stałych za pomocą konkurencyjnego testu immunoenzymatycznego (ELISA). Protokół opisuje, w jaki sposób przetwarzać tkankę stałą, przeprowadzać konkurencyjny test ELISA, przeliczać absorbancję na stężenia cGMP w pikomolach na mililitr i obliczać końcowe stężenia jako nanomole cGMP na gram tkanki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym szlakiem, który wytwarza cykliczny monofosforan guanozyny (cGMP), jest szlak tlenku azotu (NO)-cGMP. W tym szlaku NO stymuluje aktywność katalityczną rozpuszczalnej cyklazy guanylowej (sGC), która przekształca trifosforan guanozyny w cGMP. NO jest interesujący, ponieważ u ssaków działa jako główny środek rozszerzający naczynia krwionośne, inhibitor agregacji płytek krwi, mediator funkcji immunologicznej, neuroprzekaźnik i poprawia wytrzymałość podczas aktywności fizycznej, a także pełni inne funkcje fizjologiczne. Pomiar obfitości NO w różnych tkankach może pomóc w wyjaśnieniu jego funkcji. Jednak NO nie może być mierzony bezpośrednio ze względu na jego krótszy niż sekundowy okres półtrwania. Zazwyczaj metabolity NO, azotany i azotyny, są mierzone w celu oszacowania obfitości NO. Dzieje się tak, ponieważ cząsteczki te mogą być przekształcane in vivo w reakcjach redoks. Mniej powszechna metoda szacowania obfitości NO wymaga pomiaru stężenia cGMP, cząsteczki sygnałowej za NO. Jednak pomiar cGMP w tkankach jest rzadko wykonywany, mimo że stwarza możliwość lepszego zrozumienia funkcji NO w narządach. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania protokołu do pomiaru stężeń cGMP w narządach i tkankach stałych. W tym protokole pobrane tkanki świni poddano homogenizacji, na przetworzonych próbkach przeprowadzono konkurencyjny test ELISA, a absorbancje przekształcono w nanomole cGMP na gram oryginalnej tkanki. Krótko mówiąc, protokół ten określa uproszczoną metodę pomiaru stężeń cGMP w tkankach stałych przy użyciu cyklicznego zestawu GMP ELISA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cykliczny monofosforan guanozyny (cGMP) jest cząsteczką sygnałową zdolną do wywoływania zmian fizjologicznych poprzez szlak tlenku azotu (NO)-cGMP. W szlaku NO-cGMP NO wiąże się z rozpuszczalną cyklazą guanyliową, enzymem cytozolowym, który przekształca trifosforan guanozyny w cGMP, zwiększając jego aktywność katalityczną 1,2. Późniejszy wzrost stężeń cGMP aktywuje szlaki sygnałowe, które sprzyjają rozszerzeniu naczyń krwionośnych3, prowadząc do obniżenia ciśnienia krwi 4,5, głównej reakcji fizjologicznej charakterystycznej dla obecności NO in vivo. Ponadto wiadomo, że NO wpływa na funkcjeodpornościowe6, poprawia wytrzymałośćpodczas aktywności fizycznej4 i zapobiega krzepnięciu krwi poprzez hamowanie agregacji płytek krwi7.

Bezpośredni pomiar NO jest utrudniony ze względu na jego krótszy niż sekundowy okres półtrwania in vivo8 w większości tkanek biologicznych. W związku z tym wyjaśnienie fizjologicznych skutków NO wymaga metody pomiaru jego obfitości ex vivo. W związku z tym w stosowanych metodach ilościowych unika się bezpośredniego pomiaru NO. Powszechną metodą szacowania stężeń NO w tkankach jest pomiar bardziej stabilnych metabolitów NO: azotynów i azotanów 4,5,9,10,11. Główną komplikacją stosowania stężeń azotynów i azotanów jako miar obfitości NO jest to, że oba metabolity służą również odpowiednio jako prekursor NO i cząsteczka magazynująca. Metabolity NO, zwłaszcza azotany, występują obficie w niektórych produktach spożywczych. W związku z tym zmiany w stężeniach cGMP, przy czym cGMP jest następcą NO, są przydatne do szacowania ilości aktywnego NO, a obfitość NO można określić bez ingerencji wcześniej obecnych azotynów i azotanów.

Wcześniejsze badania opierały się na pomiarze stężeń cGMP w osoczu12 i płytkach krwi13, ale rzadziej spotykany jest pomiar stężeń cGMP w tkankach stałych. Możliwość pomiaru stężeń cGMP w tkankach stałych pozwoliłaby na scharakteryzowanie aktywności NO w konkretnych narządach. Celem było zidentyfikowanie uproszczonej metody pomiaru cGMP w tkankach stałych za pomocą konkurencyjnego testu ELISA. Jedną z zalet korzystania z konkurencyjnego testu ELISA jest to, że wymaga on sprzętu powszechnie spotykanego w większości laboratoriów zainteresowanych NO, takiego jak czytnik mikropłytek często używany do innych celów. Dla porównania, niektóre inne metody pomiarowe wymagają sprzętu rzadko używanego podczas eksperymentów skoncentrowanych na NO, takiego jak mikroskopy14,15, licznik scyntylacyjny16 lub laser17. Oprócz dostępności, pomiar cGMP za pomocą konkurencyjnego testu ELISA jest czuły; Stężenia cGMP można wykryć z dokładnością do 0,1 pikomolu (pmol) cGMP/ml18. Z niewielkimi modyfikacjami w protokole18 zestawu cGMP ELISA (Tabela materiałów) ustalono metodę pomiaru cGMP w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego ELISA.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zabiegi na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem Molecular Medicine Branch Animal Study zatwierdzonym przez NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-23). Pobieranie tkanek przebiegało zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytutu Badawczego MedStar Health (numer protokołu: 2006001373 2020-017). W badaniu wykorzystano młode dorosłe świnie rasy Yorkshire (dwa samce i dwie samice) w wieku 3 miesięcy i o wadze od 30 do 35 kg. Rysunek 1 ilustruje schemat przedstawiający kroki protokołu zestawu cGMP ELISA. Odczynniki i sprzęt użyte w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schemat protokołu. Schemat ilustrujący kroki protokołu zestawu cGMP ELISA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie próbki tkanki

UWAGA: Tkanki przed pobraniem poddano perfuzji roztworem heparyny sodu, a następnie przechowywano w temperaturze -80 °C przed użyciem. Patrz Park et al.19 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat pobierania próbek tkanek.

  1. Przetwarzanie próbek tkanek
    1. Przed rozpoczęciem zabiegu schłodzić rozdrabniacz do tkanek, pęsetę i łyżkę na suchym lodzie przez 10 minut.
    2. Odważ nadmiar tkanki, ponieważ część może zostać utracona podczas sproszkowania (wydajność około 90%).
      UWAGA: Wcześniej nadmiar 170 mg przyniósł pomyślne wyniki. W razie potrzeby masę można zwiększyć lub zmniejszyć. Upewnij się, że masa tkankowa daje wystarczającą objętość próbki dla etapów acetylacji próbki tkankowej i rozcieńczania próbki tkankowej.
    3. Dodaj chusteczkę do rozdrabniacza na suchym lodzie.
    4. Błyskawicznie zamroź tkankę ciekłym azotem i pozwól, aby ciekły azot całkowicie odparował.
    5. Załóż pokrywę rozpylacza i uderz w nią młotkiem 15 razy.
      UWAGA: Jeśli zestaw rozdrabniacza nie jest dostępny lub nie można go użyć, próbkę należy pokroić na jak najmniejsze kawałki za pomocą nożyczek lub skalpela, gdy jest zamrożona lub przynajmniej schłodzona na lodzie. Ten etap zapewnia dobrą homogenizację i ma kluczowe znaczenie, szczególnie w przypadku twardszych tkanek.
    6. Wytaruj probówkę homogenizatora kulek i przenieś sproszkowaną tkankę do probówki za pomocą schłodzonej łyżki i pęsety.
    7. Zapisać masę tkanki dodanej do probówki homogenizatora kulkowego, aby później przeliczyć stężenia z molowości na mole na masę. Próbkę należy przechowywać na lodzie.
    8. Do probówki homogenizacyjnej dodać objętość w mikrolitrach 0,1 N kwasu solnego równą wielokrotności masy tkanki w miligramach .
      UWAGA: Odpowiednie rozcieńczenia powodują, że mierzone próbki spadają na krzywą wzorcową. Rozcieńczenia te znajdują się dla różnych typów tkanek metodą prób i błędów. W poprzednich eksperymentach stosunek rozcieńczenia 1:10 dla tkanki mięśni szkieletowych i stosunek rozcieńczenia 1:5 dla tkanki wątroby przyniósł pomyślne wyniki. Dla porównania, przy rozcieńczaniu 100 mg tkanki, stosunek rozcieńczenia 1:10 wymagałby 1,000 μl 0,1 N kwasu solnego, a stosunek rozcieńczenia 1:5 wymagałby 500 μl.
    9. Homogenizować próbki tkanek za pomocą homogenizatora w młynie perełkowym lub porównywalnej techniki.
      UWAGA: Od czasu do czasu schładzać próbkę podczas homogenizacji przy użyciu lodu. Jeśli homogenizator perełkowy nie jest dostępny, można zastąpić inne metody homogenizacji, które skutecznie rozbijają komórki i tworzą homogenat tkankowy, w tym homogenizator obrotowy lub homogenizator ultradźwiękowy.
    10. Wirować homogenaty przez 30 minut z prędkością 17 000 x g , utrzymując temperaturę próbki 4 °C.
      UWAGA: Niedostatecznie rozcieńczone homogenaty tkanki mięśni szkieletowych stają się nadmiernie lepkie i żelowate. Najlepiej widać to po odwirowaniu.
    11. Przenieść supernatant do probówki do mikrowirówki i odwirowywać supernatant przez 10 minut przy 17 000 x g , utrzymując temperaturę 4 °C.
    12. Przenieść podwielokrotność supernatantu do probówki do mikrowirówki i utrzymać próbkę na lodzie.
      UWAGA: Acetylacja 250 μL supernatantu dała pozytywne wyniki. Aby wstrzymać działanie protokołu, należy zamrozić próbki w temperaturze -80 °C i przechowywać je przez maksymalnie 48 godzin. Zaleca się, aby objętość supernatantu w procesie acetylacji była mierzona w dniu acetylacji.

2. Przygotowanie roztworu wzorcowego

UWAGA: Wzorce należy przygotować w dniu przygotowania mikropłytki ELISA.

  1. Przygotowanie buforu ELISA
    1. Dodaj rozmrożony 10x koncentrat buforowy ELISA do szklanej butelki zawierającej 90 ml ultraczystej wody.
      UWAGA: Należy uważać, aby wypłukać resztki 10x koncentratu buforowego ELISA przygotowanym buforem ELISA i umieścić bufor z powrotem w szklanej butelce. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 miesięcy.
  2. Standardowe przygotowanie zapasów
    1. Dodać 1 ml buforu ELISA do standardowej fiolki i wstrząsnąć do rozpuszczenia.
      UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 tygodni.
  3. Standardowe rozcieńczanie szeregowe
    1. Oznacz probówkę standardową B i dziewięć probówek od standardu od 0 do standardu 8.
    2. Dodać 9,9 ml buforu ELISA do probówki oznaczonej jako wzorzec B.
    3. Przenieść 100 μl standardowego wywaru (300 pmol/ml cGMP) do standardowej probówki B i dokładnie odwirować.
    4. Przenieść 1 000 μl roztworu z wzorcowej probówki B do standardowej probówki 1.
    5. Dodać 500 μl buforu ELISA do probówki oznaczonej wzorcem 0 i probówek oznaczonych wzorcem 2 do wzorca 8.
    6. Odwirować wzorzec 1, a następnie przenieść 500 μl roztworu z wzorca 1 do wzorca 2.
    7. Wykonać wir w standardzie 2, a następnie przenieść 500 μl roztworu z wzorca 2 do wzorca 3.
    8. Kontynuuj przenoszenie 500 μl ze wzorca n-1 do wzorca n, upewniając się, że wzorce są dokładnie wirowane po każdym dodaniu.
    9. Wyrzuć 500 μl roztworu z wzorca 8.
      UWAGA: Upewnij się, że wzory wirowe są określone w celu uzyskania optymalnej krzywej standardowej. Wzorce od 0 do 8 mają objętość 500 μl. Wzorce należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Wzorce należy stosować w dniu ich rozcieńczenia.

3. Acetylacja

UWAGA: Podczas reakcji acetylacji do grupy hydroksylowej 2' cząsteczki cGMP dodaje się grupę acetylową, która modyfikuje strukturę cGMP i prowadzi do wzrostu powinowactwa wiązania przeciwciał, zwiększając czułość testu ~10-krotnie. W próbkach zawierających ponad 1,0 pmol/ml cGMP pomiary można wykonywać bez acetylacji, a ten krok można pominąć. Potrzebę acetylacji należy określić doświadczalnie, na podstawie każdego przypadku z osobna.

  1. Preparat wodorotlenku potasu
    1. Dodaj 10 ml ultraczystej wody do butelki z wodorotlenkiem potasu, aby uzyskać 4 M roztwór.
      UWAGA: Nie zamykaj butelki, ponieważ wodorotlenek potasu się rozpuszcza. Przechowywać przez miesiące w temperaturze pokojowej.
  2. Acetylacja próbki tkanki
    1. Do podwielokrotności próbki o objętości 250 μl dodać 50 μl (5:1) 4 M wodorotlenku potasu i szybko po dodaniu dodać 12,5 μl (20:1) bezwodnika octowego.
    2. Wir przez 15 s.
    3. Dodać 12,5 μl 4 M wodorotlenku potasu do próbki i krótko przetrząsnąć.
    4. Opcjonalnie: Jeżeli próbki mięśni szkieletowych zestalają się po etapach acetylacji, należy je odwirować przy 17 000 x g przez 10 minut.
  3. Acetylacja wzorców
    1. Do probówki oznaczonej wzorcem 0 dodać 100 μl 4 M wodorotlenku potasu, a bezpośrednio 25 μl bezwodnika octowego.
    2. Wir standard przez 15 s.
    3. Dodać 25 μl 4 M wodorotlenku potasu do wzorca i krótko wirować.
    4. Powtórz te kroki dla pozostałych ponumerowanych standardów.
      UWAGA: Wiruj wszystkie próbki i wzorce przez ten sam czas, aby zapewnić spójne wyniki.

4. Rozcieńczenie próbki tkanki

  1. Dodać wstępnie określone proporcje buforu ELISA i podwielokrotność acetylowanej próbki do probówki mikrowirówkowej.
    UWAGA: Dla każdej próbki wymagane są dwa różne rozcieńczenia. Współczynniki rozcieńczenia, które powodują, że zmierzone stężenia cGMP spadają na krzywej standardowej, są znajdowane metodą prób i błędów. Rozcieńczenia muszą być oznaczone doświadczalnie dla każdego rodzaju tkanki, aby procent figure-protocol-2 ten mieścił się w przedziale od 20% do 80%. W poprzednich eksperymentach mierzących tkanki wątroby proporcje rozcieńczenia 1:2 i 1:3 przyniosły pomyślne wyniki z odpowiednimi wartościami procentowymi figure-protocol-3 . Proporcje te przyniosły również pomyślne wyniki dla mięśni szkieletowych. Jednak zmiany w tkance mięśni szkieletowych mogą wymagać bardziej rozcieńczonych próbek.
  2. Opcjonalnie: Jeśli po dodaniu próbki tkanki do bufora ELISA tworzy się osad, należy odwirować próbkę przez 10 minut przy 17 000 x g.

5. Przygotowanie mikropłytki ELISA

  1. Preparat znacznikowy acetylocholinoesterazy (AChE)
    1. Dodać 6 ml buforu ELISA do fiolki ze znacznikiem AChE i delikatnie wstrząsnąć do rozpuszczenia.
      UWAGA: Próbkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Nie wirować.
  2. Preparat przeciwsurowicy
    1. Dodać 6 ml buforu ELISA do fiolki z surowicą przeciw surowicy i delikatnie wstrząsnąć do rozpuszczenia.
      UWAGA: Przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 4 tygodnie. Nie wirować.
  3. Inkubacja próbki i próbki
    1. Wir standardowy 0.
    2. Do mikropłytki ELISA dodać 50 μl podwielokrotności wzorcowych studzienek od 0 do 5 (NSB i B0; Rysunek 2).
    3. Do dwóch studni (NSB; Rysunek 2) zawierających wzorzec 0, dodać 50 μl buforu ELISA.
    4. Za pomocą jednej końcówki pipety dodać 50 μl porcji wzorców od 1 do 8 do mikropłytki ELISA w dwóch egzemplarzach. Zacznij od najbardziej rozcieńczonego wzorca (wzorzec 8), a następnie przejdź do następnego najbardziej rozcieńczonego wzorca, aż wszystkie wzorce zostaną dodane.
      UWAGA: Odsysaj i dozuj każdy wzorzec kilka razy przed dodaniem go do studzienki. Wiruj standardy przed dodaniem ich do studzienek.
    5. Każdą próbkę należy zawirować przed dodaniem 50 μl podwielokrotności do studzienek w dwóch lub trzech egzemplarzach.
    6. Dodać 50 μl znacznika AChE do każdego NSB, B0, wzorca i dołka próbki (rysunek 2).
    7. Dodać 50 μl surowicy surowicy do każdego B0, wzorca i dołka próbki (ryc. 2).
    8. Przykryć mikropłytkę ELISA i inkubować w temperaturze 4 °C przez 18 godzin.
      UWAGA: Pamiętaj, aby wirować za każdym razem, gdy zostaniesz o to poproszony, aby uzyskać spójne wyniki.
  4. Przygotowanie buforu do płukania
    1. Do szklanej butelki dodaj 200 ml ultraczystej wody i 500 μl 400x koncentratu buforowego do mycia.
    2. Za pomocą strzykawki dodać 100 μl polisorbatu 20 do szklanej butelki.
    3. Delikatnie potrząśnij butelką, aby wymieszać.
      UWAGA: Bufor do płukania należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy. Podwój objętość ultraczystej wody, 400-krotny koncentrat buforu płuczącego i polisorbat 20, aby uzyskać pełną 96-dołkową mikropłytkę z próbkami.
    4. Przed użyciem przenieść bufor do płukania do butelki do mycia.
  5. Przygotowanie odczynnika Ellmana
    UWAGA: Przygotuj dzień opracowania mikropłytki ELISA.
    1. Do pojemnika zabezpieczonego przed światłem dodaj 20 ml ultraczystej wody.
    2. Użyj podwielokrotności ultraczystej wody, aby rozpuścić odczynnik Ellmana.
    3. Przenieść odczynnik Ellmana do pojemnika zabezpieczonego przed światłem.
    4. Użyj odczynnika Ellmana, aby przepłukać butelkę, w której się znalazł.
    5. Przenieść cały roztwór z powrotem do pojemnika zabezpieczonego przed światłem za pomocą pipety.
  6. Mycie mikropłytek ELISA
    1. Zawartość mikropłytki ELISA należy usunąć, odwracając ją. Upewnij się, że studzienki zostały opróżnione, stukając odwróconą mikropłytką ELISA w ręcznik papierowy.
    2. Napełnij studzienki buforem do płukania za pomocą butelki do mycia.
    3. Delikatnie mieszaj mikropłytkę ELISA przez 5 sekund, a następnie wylej bufor do płukania i strzepnij pozostały płyn na ręcznik papierowy.
    4. Napełnić mikropłytkę ELISA buforem do płukania, delikatnie mieszać mikropłytkę ELISA przez 30 s i wylać jej zawartość. Powtórz to cztery razy, stukając mikropłytką ELISA w ręcznik papierowy po każdym zrzucie, aby usunąć pozostały płyn.
      UWAGA: Zapobiegaj niedokładnym odczytom absorbancji, dokładnie myjąc mikropłytkę ELISA.
  7. Opracowywanie i odczytywanie mikropłytek ELISA
    1. Przenieś odczynnik Ellmana do zbiornika.
    2. Pracując szybko, użyj pipety wielokanałowej, aby podsycić 200 μl odczynnika Ellmana do ślepej próby, NSB, B0, TA, wzorca i dołka na próbkę.
    3. Dodać 5 μl znacznika AChE do dołka TA.
    4. Przykryj mikropłytkę ELISA parafilmem, umieść ją w pojemniku zabezpieczonym przed światłem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 60-90 minut z mieszaniem.
      UWAGA: Użyj studzienek B0 jako wskaźników odpowiedniego czasu inkubacji. Idealne studzienki B0 są widocznie żółte, ale nie ciemne.
    5. Usunąć film parafinowy i odczytać mikropłytkę ELISA przy gęstości optycznej 412 nm.
      UWAGA: Studzienki B0 o absorbancji między 0,3 AU a 1,0 AU, z odjętymi ślepymi próbami, wskazują, że mikropłytka ELISA jest odpowiednio rozwinięta.
    6. Fakultatywny: Jeśli mikropłytka ELISA jest słabo rozwinięta, należy wymienić warstwę parafinową i pozostawić ją do inkubacji w pojemniku zabezpieczonym przed światłem przez dodatkowy okres. Jeśli mikropłytka ELISA jest nadmiernie rozwinięta, zrzuć odczynnik Ellmana, przepłucz raz buforem do przemywania i ponownie wywołaj mikropłytkę ELISA za pomocą odczynnika Ellmana.

figure-protocol-4
Rysunek 2: Układ mikropłytek. Przykład układu mikropłytki dla konkurencyjnego testu ELISA. NSB wskazuje niespecyficzną studnię wiązania. B0 oznacza maksymalną wartość wiązania. TA dobrze wskazuje na całkowitą aktywność. Std. oznacza standardową studnię wraz z odpowiadającym jej numerem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Przeliczenie na stężenie

  1. Obliczenia znacznika powiązanego AChE
    1. Uśrednić absorbancję dwóch ślepych prób i odjąć średnią od absorbancji każdej studzienki.
      UWAGA: Do pozostałej części obliczeń należy użyć absorbancji odjętych od ślepej próby.
    2. Obliczyć średnie absorbancje studni NSB, B0 i studzienek ślepych.
    3. Aby obliczyć skorygowaną absorbancję B0 , należy użyć następującego równania:
      figure-protocol-5
      UWAGA: Corr. oznacza poprawiony, Abs. oznacza absorbancję, a Avg. oznacza średnią. Jeżeli średnia absorbancja studzienek ślepej próby (po odjęciu średniej ślepej próby) jest liczbą ujemną, do obliczeń należy użyć zera.
    4. Obliczyć stosunek dla każdego wzorca figure-protocol-6 i próbki, stosując następujące równanie:
      figure-protocol-7
    5. figure-protocol-8 Pomnóż stosunek każdej próbki przez 100, aby obliczyć procent figure-protocol-9 .
      UWAGA: Próbki mieszczą się w przedziale od 20% do 80% krzywej wzorcowej.
  2. Obliczenia krzywej standardowej
    1. Uśrednić figure-protocol-10 stosunek zduplikowanych studzienek każdego wzorca (od 1 do 8).
    2. Oblicz logit uśrednionego figure-protocol-11 współczynnika dla każdego wzorca, korzystając z następującego równania:
      figure-protocol-12
    3. Wykorzystując znane stężenia każdej normy (tabela 1) jako wartości X i logit figure-protocol-13 każdego wzorca jako wartości Y, obliczyć nachylenie i punkt przecięcia z osią Y.
    4. Obliczyć współczynnik oznaczalności, używając logarytmu10 znanych stężeń wzorca cGMP jako wartości X i logitufigure-protocol-14 każdego wzorca jako wartości Y.
      UWAGA: Sprawdź, czy współczynnik determinacji jest bliski 1.
  3. Obliczenia stężenia cGMP w pmol/ml
    1. Obliczyć logit figure-protocol-15 każdej próbki, stosując następujące równanie:
      figure-protocol-16
    2. Aby obliczyć stężenie cGMP w każdej próbce (w pikomolach cGMP na mililitr próbki), należy użyć następującego równania:
      figure-protocol-17
      UWAGA: DR oznacza współczynnik rozcieńczenia. Homogenatyczna suma suchej masy dla próbek wątroby rozcieńczonych kwasem solnym w stosunku 1:5 wynosi 6. Suma buforu DR dla próbek wątroby rozcieńczonych stosunkiem rozcieńczenia buforu ELISA w stosunku 1:2 wynosi 3. W związku z tym terminy pogrupowane w nawiasy są mnożone przez 18.
  4. Obliczanie stężenia cGMP w nmol/g
    1. Obliczyć nanomole cGMP na studzienkę za pomocą następującego równania:
      figure-protocol-18
    2. Obliczyć gramy tkanki w każdej acetylowanej próbce za pomocą następującego równania:
      figure-protocol-19
      UWAGA: "mg tkanki" oznacza masę tkanki dodanej do probówki homogenizacyjnej w miligramach . "objętość użytego HCl" jest to objętość 0,1 N kwasu solnego użytego do rozcieńczenia próbek do homogenizacji.
    3. Obliczyć liczbę gramów tkanki w każdej próbce rozcieńczonej buforem ELISA, stosując następujące równanie:
      figure-protocol-20
      UWAGA: »objętość próbki rozcieńczonej« oznacza objętość próbki rozcieńczonej buforem ELISA. "250 μl" oznacza objętość próbki acetylowanej. Wspomniane "odczynniki" to odczynniki do acetylacji 4 M KOH i bezwodnik octowy.
    4. Oblicz gramy tkanki na studzienkę za pomocą następującego równania:
      figure-protocol-21
      UWAGA: "objętość buforu" oznacza objętość buforu ELISA używaną do rozcieńczania próbek tkanek przed dodaniem próbek do studzienek.
    5. Podziel nanomole cGMP na studzienkę przez gramy tkanki na studzienkę, aby obliczyć stężenie cGMP w nmol/g.
Numer standardowyStężenia cGMP (pmol/ml)
Norma 13.0
Standardowy 21.5
Norma 30.75
Standardowy 40.375
Standardowy 50.1875
Standardowy 60.09375
Standardowy 70.046875
Standardowy 80.0234375

Tabela 1: Stężenia wzorcowe. Znane stężenia wzorców od 1 do 8.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Świnie domowe rasy Yorkshire leczone dietetycznym chlorkiem sodu (0,15 mmol/kg) lub 15azotanami znakowanymi azotem (0,15 mmol/kg) podawanymi raz dziennie przez pięć kolejnych dni jako bolus w karmie były perfundowane roztworem heparyny sodowej (0,9% chlorku sodu) przed pobraniem tkanek; Wszystkie szczegóły dotyczące kolekcji zostały wcześniej opublikowane19. Stężenia cGMP w mięśniach pośladkowych i wątrobie czterech świń domowych rasy Yorkshire zmierzono zgodnie z opisanym protokołem ELISA. Tkanki wątroby rozcieńczono w stosunku rozcieńczenia 1:5, a mięśnie pośladkowe w stosunku 1:10, z 0,1 N kwasem solnym (HCl) w celu wytrącenia białek. Homogenaty rozcieńczone HCl acetylowano, a następnie rozcieńczano buforem ELISA w stosunku rozcieńczenia 1:2 i 1:3 dla próbek wątroby i mięśni pośladkowych. Stężenia cGMP mierzono w sposób opisany powyżej. Absorbancje przeliczono na pikole cGMP na mililitr przygotowanej próbki, a następnie na nanomole cGMP na gram tkanki (nmol/g tkanki), jak stwierdzono w powyższym protokole.

Stężenia cGMP mierzone w tkankach wątroby dały optymalne wyniki eksperymentalne w powyższych warunkach. Stężenia cGMP w grupie kontrolnej i grupie leczonej azotanami w wątrobie świni wynoszą odpowiednio 0,0202 nmol/g ± 0,003 nmol/g tkanki i 0,0364 nmol/g ± 0,011 nmol/g tkanki (ryc. 3). Kilka wartości potwierdza wiarygodność wyników. Absorbancja studzienek B0 z odjętymi ślepymi próbami, które mieszczą się w zakresie od 0,466 do 0,475, mieszczą się w zakresie od 0,3 AU do 1,0 AU, potwierdzając wystarczający rozwój mikropłytki za pomocą odczynnika Ellmana. Wysoka jakość krzywej wzorcowej przejawia się zarówno w przyrostowym wzroście absorbancji od wzorca 1 do wzorca 8, jak i w liniowości krzywej wzorcowej, zweryfikowanej za pomocą współczynnika determinacji 0,99. Procent figure-results-1 dla każdej zmierzonej studzienki (31,5%-71,2%) wynosi od 20% do 80%, co potwierdza, że wszystkie próbki mieszczą się na krzywej standardowej. Próbki, które posiadają określone cechy, nadają się do interpretacji.

Stężenia cGMP mierzone w tkankach mięśni pośladkowych dawały nieoptymalne wyniki eksperymentalne. Suboptymalna etykieta jest przypisana do wyników mięśni pośladkowych, ponieważ większość wartości procentowych figure-results-2 studzienek mięśni pośladkowych (3,69%-27,3%) spadła poniżej 20%, co wskazuje, że potrzeba więcej rozcieńczonych próbek, aby absorbancje spadły na krzywą standardową. Stężenia cGMP w grupie kontrolnej i w grupie leczonej azotanami w mięśniu pośladkowym świni wynoszą odpowiednio 1,22 nmol/g ± 0,49 nmol/g tkanki i 0,732 nmol/g ± 0,18 nmol/g tkanki (wykres nie pokazany). Próbki mięśni pośladkowych mają takie same absorbancje jak dołki B0 i wzorce próbek wątroby. Korzystanie z tych nieoptymalnych próbek może prowadzić do nieprawidłowych wniosków; w związku z tym konieczne jest przygotowanie bardziej rozcieńczonych próbek i ponowny pomiar stężeń cGMP.

figure-results-3
Rycina 3: stężenie cGMP w tkance wątroby. Średnie stężenie cGMP w wątrobie świni poddanej działaniu chlorku sodu (0,15 mmol/kg) lub azotanu znakowanego 15N (0,15 mmol/kg) w nmol/g tkanki. n = 4; słupki błędów wskazują odchylenie standardowe; dane analizowano za pomocą testu t Welcha; ns nie ma znaczenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół zawiera instrukcje dotyczące kroków wymaganych do pomiaru stężeń cGMP w tkankach stałych przy użyciu konkurencyjnego testu ELISA. Różnice w stężeniach cGMP mogą wskazywać na różnice w obfitości NO w tkankach. Badając te różnice w tkankach stałych, można uzyskać informacje na temat NO w różnych narządach.

W protokole próbki tkanek zostały najpierw zhomogenizowane w ramach przygotowań do testu ELISA. Zaczęło się od błyskawicznego zamrożenia masy tkanki stałej, a następnie sproszkowania jej. Rozbijanie tkanek przed etapem homogenizacji ma na celu pomóc homogenizatorowi kulkowemu w lizie komórek. Tkanki homogenizowano w 0,1 N kwasie solnym w celu wytrącenia białek, technika stosowana w innych metodach 20,21. Na koniec ciała stałe i osad oddzielono od rozpuszczalnych składników poprzez odwirowanie. Aby uzyskać krzywą wzorcową, zapas cGMP (300 pmol cGMP/ml) został seryjnie rozcieńczony w celu wytworzenia ośmiu różnych wzorców. Wzorce i próbki poddano acetylacji w celu poprawy czułości testu poprzez wykrywanie stężeń do 0,1 pmol cGMP/ml. Ten wzrost czułości osiąga się, gdy grupa acetylowa tworzy wiązanie z cGMP, poprawiając zdolność każdego przeciwciała (obecnego w surowicy) do wiązania się z acetylowanym cGMP18. Acetylacja zarówno wzorców, jak i próbek zapewnia jednorodność wiązania cGMP między studzienkami. Etap acetylacji można pominąć zarówno w przypadku wzorców, jak i próbek, jeżeli oczekuje się, że stężenie cGMP w studzienkach mikropłytki przekroczy 1,0 pmol/ml18.

W ramach przygotowań do dodania próbek do studzienek, próbki rozcieńczano buforem ELISA. Dodatkowe rozcieńczenie pozwoliło na to, aby próbki spadły na krzywą wzorcową i bardziej przypominały zawartość studni NSB, B0 i standardowych, tworząc jednorodność. Wraz z próbkami i wzorcami w studzienkach miesza się kilka innych roztworów. W studzienkach NSB dodaje się bufor ELISA (z odczynnikami acetylacji i bez nich), podczas gdy surowica jest wstrzymywana. Ma to na celu określenie ilości znacznika AChE (acetylocholinoesterazy związanej z cGMP), który wiąże się z mysią IgG przylegającą do dołka przy braku specyficznego przeciwciała wchodzącego w skład surowicy. Studzienki B0 zawierały bufor ELISA (z odczynnikami acetylacji), znacznik AChE i surowicę odpornościową; w związku z tym studzienki B0 wykazują zdolność wiązania znacznika AChE bez konkurencji cGMP. Po odpowiednim napełnieniu wszystkich studzienek mikropłytka jest inkubowana, a następnie myta. Do studni dodano odczynnik Ellmana. Wreszcie, znacznik AChE został dodany do TA dobrze po dodaniu odczynnika Ellmana. To dobrze reprezentuje aktywność katalityczną znacznika AChE niezależnie od tego, ile znacznika było związane z mikropłytką przez przeciwciała. Mikropłytka została opracowana w temperaturze pokojowej, dzięki czemu znacznik AChE może katalizować reakcję kolorymetryczną.

Kilka etapów protokołu może zmienić wyniki testu; Należy zachować szczególną ostrożność podczas wykonywania kolejnych kroków, aby uzyskać optymalne wyniki. Określenie odpowiednich rozcieńczeń dla każdego typu tkanki dla etapu homogenizacji i po acetylacji jest konieczne w celu zagwarantowania, że próbki mieszczą się na krzywej wzorcowej. Podczas przygotowywania wzorców, roztwory powinny być dokładnie zawirowane lub wymieszane przed usunięciem podwielokrotności lub po dodaniu podwielokrotności. Ten krok jest ważny, aby osiągnąć oczekiwane stężenia cGMP dla każdego wzorca. Podczas etapów acetylacji każdy wzorzec i próbka powinny być wirowane przez ten sam czas, aby uzyskać spójne odczyty absorbancji. Wzorce i próbki powinny być również wirowane bezpośrednio przed dodaniem podwielokrotności do odpowiedniego studzienki. Praktyka ta skutkuje dokładniejszymi stężeniami cGMP. Dokładne mycie mikropłytki poprawia również dokładność wartości absorbancji, ponieważ usuwa cały niezwiązany znacznik AChE ze studzienki. Po dodaniu odczynnika Ellmana należy pozostawić odpowiedni czas na rozwinięcie się mikropłytki, zwracając uwagę na kolor i, co najważniejsze, absorbancję studzienek B0 . Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że stężenie cGMP między duplikatami lub potrójnymi może różnić się bardziej w próbkach o niższych poziomach cGMP w porównaniu z próbkami o wyższych stężeniach. Pomiar bardziej skoncentrowanej próbki może pomóc w rozwiązaniu tego problemu. Dodatkowo, aby uwzględnić wszelkie różnice między mikropłytkami, próbki tego samego typu tkanki powinny być mierzone na tej samej płytce, gdy tylko jest to możliwe. Oczekuje się, że przestrzeganie tych wytycznych poprawi jakość danych wynikowych testu.

Powyższy protokół można ekstrapolować na inne tkanki miękkie, stałe. Dalszy rozwój podrozdziału dotyczącego przygotowania tkanek w powyższym protokole może doprowadzić do opracowania metody odpowiedniej do przetwarzania tkanek twardych, w tym kości, które mogą być interesujące ze względu na swoje unaczynienie. Ciągły rozwój tej techniki może zaowocować uzyskaniem metody odpowiedniej do pomiaru stężeń cGMP w szerokiej gamie tkanek stałych, co zaowocuje użyteczną metodą zbierania dodatkowych informacji na temat obfitości NO w praktycznie każdej tkance. Chociaż konkurencyjny protokół ELISA, o którym mowa powyżej, jest przydatną techniką pomiaru cGMP i szacowania obfitości NO, ma dwa istotne ograniczenia: (1) Ten test nie rozróżnia cGMP syntetyzowanego przez rozpuszczalną cyklazę guanylilu i cGMP syntetyzowanego przez cząsteczkową cyklazę guanylilu (pGC). Peptydy natriuretyczne stymulują aktywność pGC22 , a zatem zmiany w cGMP przez ten szlak nie wskazują na zmiany w obfitości NO; (2) Dodatkowo enzymy fosfodiesterazy (PDE) wpływają na wyniki testu ELISA. Kilka PDE hydrolizuje cGMP, zmniejszając jego stężenie po stymulacji sGC przez NO23. W związku z tym aktywność katalityczna PDE może przesłaniać związek między stężeniami cGMP a obfitością NO. Dodanie inhibitora PDE5, takiego jak sildenafil, w celu zapobieżenia utracie cGMP jest wskazane w przypadku eksperymentów skoncentrowanych przede wszystkim na uzyskaniu dokładnych stężeń cGMP, w przeciwieństwie do uzyskiwania pomiarów w celu obserwacji trendów stężeń cGMP. Inhibitory PDE5 mogą być podawane zwierzętom w postaci syldenafilu na około 1 godzinę przed pobraniem próbki (efekty utrzymują się do 4 godzin24) lub, jeśli takie podanie nie jest możliwe, syldenafil można dodać do pobranych próbek. Podczas hamowania PDE po pobraniu tkanek należy dodać syldenafil do 0,1 N kwasu solnego, aby tkanki były homogenizowane w obecności syldenafilu. Należy wykonać pomiary z syldenafilem i bez niego, aby upewnić się, że nie ma wzajemnych oddziaływań między leczeniem zwierząt a syldenafilem.

Nawet ze swoimi ograniczeniami, test jest wykorzystywany jako informacyjny wgląd w dalszą transmisję sygnału NO. Podsumowując, sprzężenie pomiaru stężeń cGMP w tkankach stałych z innymi metodami pomiaru NO pozwala na lepsze zrozumienie wpływu NO na narządy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez grant 1ZIADK025104-18 przyznany Alanowi N. Schechterowi przez NIDDK/NIH.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 ml przezroczystej strzykawki doustnej BDBecton Dickinson50382903052177
14 ml probówka z okrągłym dnemSokół352059
Mikroprobówki 2,0 ml, różneOlympus Plastics24-283A
30-300 i mikro; Pipeta wielokanałowa L Eppendorf powiedział:3125000052
Bezwodnik octowy (w zestawie cGMP)Firma chemiczna Kajmanów40003198% czysty
Zagrożenie: Łatwopalny,: poważnie poparzenia skóry, uszkodzenie oczu, Ostra toksyczność
Bezpieczna obsługa: Przechowywać z dala od źródeł zapłonu, pracować w przewiewnym miejscu, nosić rękawice
cGMP Acetylocholinoesterazy Znacznik (w zestawie cGMP)Firma chemiczna Kajmanów481020fosforan potasu dwuzasadowy, chlorek sodu,  fosforan potasu jednozasadowy, albumina bydlęca, azydek sodu, EDTA, cGMP AChE tracer
Hazard: Zagrożenie dla zdrowia: toksyczność narządowa spowodowana powtarzającym się narażeniem,
: uszkodzenie oczu,
Działa drażniąco na skórę i drogi oddechowe
Bezpieczna obsługa: Praca w wentylowanym pomieszczeniu, Nosić rękawiczki
Surowica odpornościowa cGMP ELISA (w zestawie cGMP)Firma chemiczna Kajmanów481022fosforan potasu dwuzasadowy, chlorek sodu,  fosforan potasu jednozasadowy, albumina bydlęca,  Azydek sodu, EDTA, królicze anty-cGMP poliklonalne Antysurowica
Zagrożenie: Zagrożenie dla zdrowia: toksyczność narządowa spowodowana powtarzającym się narażeniem,
: uszkodzenie oczu,
Działa drażniąco na skórę i drogi oddechowe, Toksyczność ostra
Bezpieczna obsługa: Pracuj w wentylowanym pomieszczeniu, nosić rękawice
Wzorzec cGMP ELISA (w zestawie cGMP)Firma chemiczna Kajmanów481024fosforan potasu dwuzasadowy, chlorek sodu,  fosforan potasu jednozasadowy, albumina bydlęca,  azydek sodu, EDTA, norma cGMP
Zagrożenie: Zagrożenie dla zdrowia: toksyczność narządowa spowodowana powtarzającym się narażeniem,
: uszkodzenie oczu,
Działa drażniąco na skórę i drogi oddechowe
Bezpieczny Obsługa: Pracuj w wentylowanym pomieszczeniu, nosić rękawice
Cykliczny zestaw ELISA GMPFirma chemiczna Kajmanów581021
Koncentrat buforowy ELISA 10X (w zestawie cGMP)Firma chemiczna Kajmanów4000601 M fosforan, 1% BSA, 4 M chlorek sodu, 10 mM EDTA, 0,1% azydek sodu
Zagrożenie: Zagrożenie dla zdrowia: toksyczność narządów spowodowana powtarzającym się narażeniem,
: uszkodzenie oczu,
Działa drażniąco na skórę i drogi oddechowe
Bezpieczny Obsługa: Pracuj w przewiewnym miejscu, przechowuj w pojemniku z zamykaną pokrywą, nosić rękawice
Zbiornik odczynnika ELISAPierce (obecnie Thermo Fisher Scientific)15075
Odczynnik Ellmana (w zestawie cGMP)Firma chemiczna Kajmanów400050fosforan potasu dwuzasadowy, chlorek sodu, fosforan potasu jednozasadowy, acetylotiocholina (jodek), kwas 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoesowy)
Zagrożenie: Ostra toksyczność, Zagrożenie dla zdrowia: toksyczność narządowa,: Uszkodzenie oczu, Drażniące skórę, Drażniący reprymalny
Bezpieczna obsługa: Pracuj w przewiewnym miejscu, nosić rękawice
Kwas solnySigma-Aldrich320331Hazard:: powoduje korozję metalu, silne oparzenia skóry, Uszkodzenie oczu, Działa drażniąco na drogi oddechowe
Bezpieczna obsługa: Pracuj w przewiewnym miejscu, nosić rękawice
Ciekły azotTlen RobertaAzot
Zagrożenie: Sprężony gaz: Ryzyko oparzeń kriogenicznych, frosbite, uduszenia
Bezpieczna obsługa: Pracuj w wentylowanym miejscu, nosić rękawice
Mysia płytka pokryta IgG Anti-Rabbit (w zestawie cGMP)Firma chemiczna Kajmanów400006
Zagrożenie: Brak
Nowy klasyczny balans MFMettler Toledo
Wytrząsarka orbitalna Stovall Life Science, Inc. (obecnie IBI Scientific)15-453-211 (Różnie)
ParafilmFirma Bemis, Inc.3023-4526 (Różnie)
Polisorbat 20 (w zestawie cGMP)Firma chemiczna Kajmanów400035
Zagrożenie: Brak
Wodorotlenek potasu (w zestawie cGMP)Firma chemiczna Kajmanów40002985% czysty
Zagrożenie:: powoduje korozję metali i skóry,
Uszkodzenie oczu, Toksyczność ostra
Bezpieczna obsługa: Pracuj w przewiewnym miejscu, nosić rękawice
Homogenizator Precellys EvolutionTechnologie BertinPE000062-PEVO0-A
Zestaw do lizowania Precellys Homogenizacja tkanek twardychTechnologie BertinP000911-LYSK0-A
Czytnik mikropłytek SenseKRYJÓWKA425-301
Wirówka Sorvall Legend Micro 17RThermo Fisher Naukowy75002441
Rozdrabniacz tkanekKruszarka do komórekZestaw do kruszenia komórek
Dżin wirowy 2Branże naukowe SI-0246 powiedział:
Butelka do myciaSigma-AldrichZ423092
Koncentrat buforowy do przemywania 400X (w zestawie cGMP)Firma chemiczna Kajmanów400062fosforan potasu dwuzasadowy, fosforan potasu jednozasadowy, woda
Zagrożenie:: Uszkodzenie oczu, Ostra toksyczność, Działa drażniąco na skórę, Toksyczność narządowa
Bezpieczna obsługa: Pracuj w przewiewnym miejscu, nosić rękawice

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dierks, E. A., Burstyn, J. N. Nitric oxide (NO), the only nitrogen monoxide redox form capable of activating soluble guanylyl cyclase. Biochem Pharmacol. 51 (12), 1593-1600 (1996).
  2. Koglin, M., Behrends, S. A functional domain of the alpha1 subunit of soluble guanylyl cyclase is necessary for activation of the enzyme by nitric oxide and YC-1 but is not involved in heme binding. J Biol Chem. 278 (14), 12590-12597 (2003).
  3. Olson, L. J., Knych, E. T., Herzig, T. C., Drewett, J. G. Selective guanylyl cyclase inhibitor reverses nitric oxide-induced vasorelaxation. Hypertension. 29 (1), 254-261 (1997).
  4. Bailey, S. J., et al. Dietary nitrate supplementation reduces the O2 cost of low-intensity exercise and enhances tolerance to high-intensity exercise in humans. J Appl Physiol (1985). 107 (4), 1144-1155 (2009).
  5. Vanhatalo, A., et al. Acute and chronic effects of dietary nitrate supplementation on blood pressure and the physiological responses to moderate-intensity and incremental exercise. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (4), R1121-R1131 (2010).
  6. Qin, X., et al. Balancing role of nitric oxide in complement-mediated activation of platelets from mcd59a and mcd59b double-knockout mice. Am J Hematol. 84 (4), 221-227 (2009).
  7. Radomski, M. W., Palmer, R. M., Moncada, S. An l-arginine/nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation. PNAS. 87 (13), 5193-5197 (1990).
  8. Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: Implications for the perivascular dynamics of NO and O2. PNAS. 98 (1), 355-360 (2001).
  9. Park, J. W., et al. Preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements. J Vis Exp. (173), e62427(2021).
  10. Park, J. W., et al. Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye. Sci Rep. 10 (1), 13166(2020).
  11. Srihirun, S., et al. Nitrate uptake and metabolism in human skeletal muscle cell cultures. Nitric Oxide. 94, 1-8 (2020).
  12. Montoliu, C., et al. Correlation of nitric oxide and atrial natriuretic peptide changes with altered cGMP homeostasis in liver cirrhosis. Liver Int. 25, 787-795 (2005).
  13. Origlia, C., et al. Platelet cGMP inversely correlates with age in healthy subjects. J Endocrinol Invest. 27 (2), RC1-RC4 (2004).
  14. Calamera, G., et al. Fret-based cyclic GMP biosensors measure low cGMP concentrations in cardiomyocytes and neurons. Commun Biol. 2, 394(2019).
  15. Rutkowski, N., et al. Real-time imaging of cGMP signaling shows pronounced differences between glomerular endothelial cells and podocytes. Sci Rep. 14, 26099(2024).
  16. Straub, A. C., Beuve, A. A primer for measuring cGMP signaling and cGMP-mediated vascular relaxation. Nitric Oxide. 117, 40-45 (2021).
  17. Huang, K. T., Lin, T. J., Hsu, M. H. Determination of cyclic GMP concentration using a gold nanoparticle-modified optical fiber. Biosens Bioelectron. 26 (1), 11-15 (2010).
  18. Cyclic gmp elisa kit. , https://cdn.caymanchem.com/cdn/seawolf/insert/581021.pdf (2024).
  19. Park, J. W., et al. Dietary nitrate metabolism in porcine ocular tissues determined using 15N-labeled sodium nitrate supplementation. Nutrients. 16 (8), 1154(2024).
  20. Cgmp enzyme immunoassay kit, direct technical bulletin. , https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/289/571/cg200bul.pdf?srsltid=AfmBOoqWnOVurQ549ESXk_E7DJoqNs7v268ktTabHHYc6I_6NZkc-j_V (2025).
  21. Cyclic gmp competitive elisa lysate and homogenate samples. , https://assets.thermofisher.com/TFS Assets/LSG/certificate/Certificates%20of%20Analysis/RA229061_EMSCGMPL.pdf (2025).
  22. Hamad, A. M., Range, S., Holland, E., Knox, A. J. Regulation of cGMP by soluble and particulate guanylyl cyclases in cultured human airway smooth muscle. Am J Physiol. 273 (4), L807-L813 (1997).
  23. Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway. J Biol Chem. 279 (25), 26149-26158 (2004).
  24. Corbin, J. D., et al. [3h]sildenafil binding to phosphodiesterase-5 is specific, kinetically heterogeneous, and stimulated by cGMP. Mol Pharmacol. 63 (6), 1364-1372 (2003).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pomiar cyklicznego GMPszlak tlenku azotukonkurencyjny test ELISAanaliza tkanek sta ychaktywno cyklazy guanylowejhomogenizacja tkanekhomogenizator kulowyanaliza tkanek wi skichznacznik acetylcholinoesterazypomiar g sto ci optycznej

Powiązane artykuły