Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hipoksja zmienia poziomy miRNA zaangażowane w dziedziczenie niemendelowskie zaburzeń ze spektrum autyzmu u myszy

41K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68435

⸱

11 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute, Erciyes University, 2Betül Ziya Eren Genome and Stem Cell (GENKÖK) Center, Erciyes University, 3Department of Medical Biology, Erciyes University, 4Department of Histology and Embryology, Yozgat Bozok University, 5Department of Physiology, Erciyes University, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 7University of Nice Sophia Antipolis, 8Department of Medical Genetics, Erciyes University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół indukujący hipoksję u noworodkowych myszy poprzez podawanie ich w kontrolowanych warunkach z różnym stężeniem tlenu. Modele mysie poddane zmianom tlenu przy urodzeniu trwało zmieniały ekspresję miRNA zaangażowanych w indukcję zmian behawioralnych fenotypowych, takich jak autyzm.

Streszczenie

Hipoksja może występować w różnym stopniu z różnych powodów w okresie okołoporodowym, wpływając na rozwój. Naszym celem jest analiza konsekwencji łagodnej do ciężkiej niedotlenienia noworodków u myszy, koncentrując się na jej potencjalnym związku z neurodegeneracyjnymi dysfunkcjami mózgu płodu powiązanymi z zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD).

Indukowaliśmy hipoksję u noworodkowych myszy, dostarczając je w kontrolowanych warunkach o różnym stężeniu tlenu. Wyniki wykazały podwyższony poziom HIF-1α (markera hipoksji) w korze mózgowej i hipokampie, a także zwiększoną neurodegenerację w tych obszarach. Ponadto zaobserwowaliśmy zmienioną ekspresję miRNA związanych z ASD (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p i miR-499a-5p) w grupach hipoksycznych, zgodną z wcześniejszymi wynikami w modelach ludzkich i zwierzęcych z ASD. Te molekularne zmiany towarzyszyły zmianom zachowania, takim jak zmniejszone ruchy, szybkość, interakcje społeczne i powtarzalne zachowania, a także zwiększona tendencja do przejawiania zachowań szukających kątów u myszy poddawanych warunkom hipoksyjnym. Chociaż zmiany behawioralne i molekularne były wykrywalne w grupie z 12%O2 (łagodna hipoksja), najbardziej wyraźne zmiany zaobserwowano w grupach z cięższym niedotlenieniem – 10%O2 i 8% O2.

Ogólnie wyniki sugerują, że niedotlenienie noworodków może wywoływać trwałe zmiany molekularne związane z chorobami neurodegeneracyjnymi z konsekwencjami behawioralnymi. Co więcej, nawet podczas normalnego porodu ekspozycja na hipoksję we wczesnym rozwoju może zaburzać pamięć i uczenie się. Wyniki podkreślają potrzebę wczesnego wykrywania i interwencji u noworodków narażonych na hipoksję, aby zapobiec długotrwałym problemom neurologicznym. Poziomy miRNA są regulowane podczas rozwoju, a ich modyfikacje w tkankach, zwłaszcza w komórkach rozrodczych, stanowią czynnik ryzyka dla następnego pokolenia. Analizy stanowią podstawę do badania szlaków regulacyjnych wpływających na zmiany funkcjonalne i behawioralne pod wpływem hipoksji.

Wprowadzenie

Hipoksja definiowana jako stan niedoboru tlenu, może wywoływać unikalne reakcje komórkowe i molekularne, które są kluczowe dla zrozumienia jej roli w różnych patologiach. Może zakłócać sekwencje rozwojowe, prowadząc do zmian i urazów molekularnych, komórkowych oraz neuronalnych. Ponadto wczesna ekspozycja na niedotoksję przerywa rozwój ośrodkowego układu nerwowego (OUN), upośledzając łączność aksonów i rozwój synaps1.

Ponadto, chociaż wykazano, że hipoksja ma niekorzystny wpływ na rozwój OUN, może również odgrywać kluczową rolę fizjologiczną w określonych warunkach, takich jak podczas embrigenezy. Normalna hipoksja fizjologiczna odnosi się do sytuacji, w której poziom tlenu jest naturalnie niski podczas rozwoju embrionalnego, co przynosi korzyści rozwojowi. Proces ten pozwala komórkom embrionalnym produkować energię poprzez wspieranie metabolizmu beztlenowego, wspiera rozwój układu krążenia poprzez przyspieszenie unaczynienia, zapewnia prawidłowy rozwój serca i kości oraz stymuluje migrację komórek grzebienia nerwowego2. Natomiast hipoksja występująca poza fizjologicznym kontekstem może negatywnie wpływać na rozwój i ogólne zdrowie, w tym rozwój embrionalny, co może prowadzić do przedwczesnego porodu lub nawet śmiertelności embrionalnej1. Jest to zatem poważny problem zdrowia publicznego, ponieważ wiele noworodków doświadcza schorzeń hipoksyjnych podczas normalnego porodu, często bez natychmiastowego zauważenia przez opiekunów lub personel medyczny3. Ponadto zmiany łączności neuronalnej związane z hipoksją są powiązane z zaburzeniami neurorozwojowymi, w tym zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD) oraz niepełnosprawnościami intelektualnymi1.

Z molekularnego punktu widzenia hipoksja może wpływać na rozwój neuro poprzez zmianę ekspresji genów regulujących funkcje synaptyczne, zaburzając łączność neuronalną i przyczyniając się do rozwoju zaburzeń neurorozwojowych4.

Klinicznie niedotlenienie noworodków wpływa na rozwój OUN poprzez szlaki hormonalne imetaboliczne 1. W odpowiedzi na ostrą hipoksję podwzgórze szybko uwalnia hormon uwalniający kortykotropinę oraz wazopresynę argininową, co następnie wywołuje uwalnianie hormonów adrenokortykotropowych z przedniej przysadki mózgowej, a następnie produkcję glukokortykoidów w korze nadnerczy płodu, a stopień tej reakcji koreluje z intensywnością i czasem trwania hipoksji. Ta szybka reakcja osi podwzgórze-przysadka-nadnercz (HPA) na ostry stres podkreśla kluczową rolę glukokortykoidów w ograniczaniu fizjologicznych skutków stresu i utrzymaniu homeostazy płodu poprzez wpływanie na powiązaną ekspresję genów, syntezę białek oraz metabolizm komórkowy 5,6.

Obniżony prawidłowy poziom tlenu aktywuje różne odpowiedzi na hipoksję, z których większość jest regulowana przez czynniki transkrypcyjne, czynniki indukujące hipoksję (HIF) oraz komórkowe czujniki tlenu, takie jak hydroksylazy prolilowe (PHDs)1. HIF-1, regulator homeostazyO2 , jak wykazano w badaniach in vitro 7, jest heterodimerem złożonym z HIF-1α i HIF-1β8. W warunkach hipoksycznych zastąpienie atomu wodoru grupą hydroksylową w kompleksie jest redukowane, co prowadzi do nagromadzenia HIF-1α, który następnie dimerizuje się z HIF-1β. W rezultacie dimer HIF-1 translokuje się do jądra, gdzie aktywuje transkrypcję setek genów1.

Zależność neuronów od tlenu sprawia, że są one szczególnie podatne na stres hipoksyczny. Dlatego hipoksja może mieć istotny wpływ na fizjologię mózgu, z długoterminowymi konsekwencjami dla funkcji neuronów, poprzez upośledzenie aksonalnego odznaczania ścieżek i rozwój synaps9. Te zmiany w połączeniach neuronalnych mogą predysponować do różnych zaburzeń neurorozwojowych, takich jak ASD czy niepełnosprawność intelektualna 9,10.

Asfiksja okołoporodowa definiowana jest jako niedobór tlenu podczas porodu i może wystąpić w wyniku zdarzeń okołoporodowych, takich jak krwotok matki i płodu, ucisk pępowiny, komplikacje łożyska, pęknięcie macicy, dystokcja barku lub niezdolność noworodka do wzięcia pierwszego oddechu. To poważne zdarzenie dotyka około czterech milionów noworodków na całym świecie każdego roku i skutkuje milionem zgonów noworodków(11, 12, 13). Chociaż większość niemowląt przeżywa epizody niedotlenienia oksiężności, niektórzy pacjenci rozwijają encefalopatię niedotleniono-niedokrwienną, która może prowadzić do trwałych problemów neurologicznych, takich jak napady padaczkowe, porażenie mózgowe, opóźnienia poznawcze i deficyty ruchowe. Dodatkowo uduszenie i niedokrwienie mogą powodować zaburzenia funkcjonowania różnych narządów i układów, takich jak OUN (28%), układ sercowo-naczyniowy (25%), nerki (50%) oraz płuca (23%).

Ponadto niedojrzałość układu naczyniowego mózgu oraz słaba autoregulacja są czynnikami predysponującymi noworodki do ryzyka niedokrwiennego. W takich procesach zapalenie i stres oksydacyjny są głównymi mediatorami uszkodzeń niedotleniowo-niedokrwiennych noworodków oraz powiązanych mechanizmów śmierci komórek. Nieprawidłowa apoptoza może narażać rozwijający się mózg na ryzyko zaburzeń ruchowych i poznawczych14.

Biorąc pod uwagę złożoność ASD, kluczowe jest zrozumienie genetyki, która wydaje się mieć strukturę poligeniczną, a także czynniki środowiskowe determinujące jego rozwój. W szczególności poligeniczne podstawy ASD implikują etiologię wieloczynnikową, w której predyspozycje genetyczne oddziałują z czynnikami zewnętrznymi, w tym z hipoksją. Zgodność 60%-92% zaobserwowana u bliźniąt jednojajowych podkreśla znaczenie wpływów genetycznych, podczas gdy niezgodność wskazuje, że rolę odgrywają także czynniki środowiskowe. Częstość występowania autyzmu szacowana jest na 13/10 000, a wskaźnik ten prawdopodobnie wzrósł w ostatnich latach15. Badania potwierdzają hipotezę, że narażenie na czynniki środowiskowe w czasie ciąży może zwiększać ryzyko autyzmu, jednak wyniki tych badań są często niespójne ze względu na różnice w kryteriach diagnostycznych, grupach porównawczych, wielkości próby oraz metodach oceny narażenia15,16.

Chociaż charakterystyczne wyniki neuropatologiczne są niejasne, badania ujawniają mikroskopijne i funkcjonalne nieprawidłowości mózgu. Te nieprawidłowości sugerują, że okres etiologicznie istotny może być w łonie matki, a patogeneza może rozpocząć się w okresie prenatalnym15. Ekspozycje w czasie ciąży są głównym tematem badań epidemiologicznych dotyczących potencjalnych czynników ryzyka autyzmu. W szczególności hipoteza, że powikłania położnicze mogą zwiększać ryzyko ASD, jest wspierana przez wiele badań, jednak skala i konsekwencje tych efektów różnią się w zależności od badań17.

Oprócz czynników genetycznych, mechanizmy epigenetyczne odgrywają kluczową rolę w regulacji ekspresji genów w warunkach hipoksyjnych. Warto zauważyć, że miRNA stanowią kluczowy mechanizm regulacyjny w odpowiedzi komórkowej na hipoksję, na przykład ich wpływ na HIF. We wczesnych stadiach hipoksji specyficzne zmiany poziomu miRNA mogą przyczyniać się do akumulacji HIF-1 oraz utrzymania stabilnych poziomów HIF-2 iHIF-3-18. Chociaż profil ekspresji wielu miRNA jest zmieniany w warunkach hipoksycznych i niedokrwiennych, wykazano, że ograniczona liczba miRNA związanych z hipoksją odgrywa rolę funkcjonalną i wpływa na ekspresję HIF . To wyjaśnia, dlaczego różne ludzkie tkanki różnią się w odpowiedziach hipoksycznych z powodu specyficznej ekspresji miRNAtkankowej 18.

Nowe dane wskazują również, że konkretne miRNA są powiązane z patologią ASD. W naszych wcześniejszych badaniach wykazaliśmy, że miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p oraz miR-499a-5p, które są znane z regulacji przeżycia komórek, różnicowania i reakcji stresowych w nowotworach, wykazują nieprawidłową ekspresję u pacjentów z ASD, co może wpływać na wyniki neurorozwojowe. Następnie potwierdziliśmy te wyniki we krwi, próbkach podwzgórza i plemników z myszymi modeli ASD, wykazując spójne powiązanie zmian regulatorów genów z chorobą19. Wyniki te wskazują, że obniżenie tych miRNA na kluczowych etapach wzrostu i rozwoju może mieć istotny wpływ na rozwój chorób takich jak ASD. To dodatkowo pokazuje głęboki wpływ niedotlenienia noworodków na cechy molekularne i behawioralne.

W tym badaniu testowaliśmy wpływ łagodnej do umiarkowanej niedotlenienia noworodka na ryzyko rozwoju autyzmu w dorosłości. Aby to osiągnąć, noworodkowe myszy były narażone na różne poziomy hipoksji. Rzeczywiście, myszy, które doświadczyły hipoksji przy urodzeniu, wykazują zmiany zachowań w dorosłości, a co ważniejsze – na poziomie molekularnym – zmiany związane z ASD. W ten sposób nasze wyniki dostarczyły cennych informacji na temat długoterminowych skutków hipoksji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Lokalny Komitet Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Erciyes (HAYDEK) i przeprowadzone na podstawie licencji numer 21/216.

1. Tematy zwierzęce

UWAGA: Badanie to obejmowało myszy Balb/c z Jednostki Transgenicznej Centrum Genomu i Komórek Macierzystych Betül-Ziya EREN (GENKÖK) na Uniwersytecie Erciyes.

  1. Użyj 2-miesięcznych myszy Balb/c ważących średnio 18-25 g. Utrzymuj myszy w temperaturze 20 ± 2°C, z wilgotnością 52 ± 3% w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności (6-18 h).
  2. Karm myszy standardowymi granulkami dla myszy, co tydzień wymieniaj ściółkę i pozwól na nieograniczony dostęp do jedzenia i wody.
    UWAGA: Badania molekularne przeprowadzono w Laboratoriach Genomiki i Niedotlenienia GENKÖK oraz w Laboratorium Histologii i Embriologii Uniwersytetu Bozok. "PUNKT STOP" wskazuje, gdzie możesz zatrzymać pracę i zachować pracę w określonej temperaturze.

2. Ustanowienie modelu hipoksji

  1. Zaprojektuj eksperyment tak, aby obejmował 4 grupy, w tym 3 grupy hipoksyczne i 1 pozorowaną grupę kontrolną.
  2. Rozmąż zdrowe samice myszy ze zdrowymi samcami, tworząc zdrowe ciężarne samice, które ostatecznie zostaną sklasyfikowane do następujących grup: ciężka hipoksja (8%O2) (n = 4), umiarkowana hipoksja (10%O2) (n = 4), łagodna hipoksja (12%O2) (n = 4) oraz normoksia (21%O2) jako grupa kontrolna pozorowana (n =4).
  3. Aby wywołać niedotlenienie, przenieś ciężarne myszy do laboratorium hipoksji i rozpocząć monitorowanie na 72 godziny przed dniem E21.5.
  4. Wykrywaj miejsce porodu ciężarnych myszy w grupach hipoksycznych i natychmiast umieść je w komorach hipoksji. Dostosuj poziom tlenu dla każdej komory zgodnie z opisem dla każdej grupy (pokazano w kroku 2.2).
  5. Trzymaj noworodki w warunkach niedotleniałych tylko przez 5 minut, a następnie natychmiast przenieś je do normalnych warunków mieszkaniowych.
    UWAGA: Utrzymywanie pacjentów w stanie niedotlenienia przez dłuższy czas może skutkować śmiertelnością.
  6. Użyj 2 noworodków (losowo wybranych) z każdej grupy, aby potwierdzić uszkodzenia wywołane hipoksją i określić płeć. Pozostałe młode trzymać obok matki w normalnych warunkach mieszkalnych do końca okresu laktacji w celu dalszych badań molekularnych i behawioralnych w fazie dorosłości (patrz projekt eksperymentalny w Rysunku Uzupełniającym 1).

3. Determinacja płci w celu oceny potencjalnych różnic w efektach hipoksycznych między płciami w stadium noworodkowym

  1. Waż każdą mysz (losowo wybraną (x2/grupę)) osobno, aby obliczyć wymaganą dawkę środków znieczulanych. Podawaj ketaminę w dawce 100 mg/kg oraz ksylazynę w dawce 10 mg/kg dootrzewnootwy.
  2. Po całkowitym znieczuleniu myszy należy przejść do eutanazji przez zwichnięcie szyjki i natychmiast pobrać tkanki ogona do sterylnie oznaczonych probówek o pojemności 1,5 mL (punkt STOP, -80 °C)
  3. Natychmiast pobierz i przenieś wszystkie tkanki mózgowe do rurek wirówek zawierających 10% formaldehydu do dalszej analizy (punkt STOP, 25 °C).
  4. Przygotuj tkanki do ekstrakcji DNA.
    1. Przygotuj próbki ogonowe i rozmroz w 25 °C (jeśli to konieczne). Do próbek należy dodać 300 μL buforu lizyzowego zawierającego 1 M Tris, 0,5 M EDTA, 4% SDS,dH2O oraz proteinazę K.
  5. Ujednolic próbki.
    1. Dokładnie wymieszaj próbki przez wirowanie i inkubuj przez noc w temperaturze 55 °C.
    2. Następnego dnia dodaj 100 μL octaniego amonu i krótko wymieszaj przez wirowanie. Wirówka w 12 000 g przez 20 minut w 25 °C
  6. Wykonaj separację fazową.
    1. Ostrożnie przelej przezroczystą fazę wodną do nowych, sterylnych, oznaczonych probówek o pojemności 1,5 mL.
    2. Dodaj 500 μL izopropanolu i inkubuj przez 5 minut w temperaturze 25 °C (punkt STOP, -20 °C). Wirówka w 12 000 g przez 10 minut w 25 °C
  7. Umyj granulki DNA.
    1. Po obejrzeniu pelletu na dnie rurki ostrożnie wyrzuć supernatant.
    2. Dodaj 1000 μL etanolu 70% i delikatnie stuknij w rurkę, aby unosić granulat. Wirówka w 7500 g przez 10 minut w 25 °C
  8. Oczyść DNA.
    1. Po obejrzeniu pelletu na dnie rurki ostrożnie wyrzuć supernatant.
    2. Użyj mikropipety 10 μL, aby usunąć resztki etanolu i pozwolić mu całkowicie wyschnąć.
    3. Dodaj 100 μL wody wolnej od nukleazy (NFW), aby ponownie zawiesić granulat. Inkubuj w temperaturze +4 °C przez 10-15 minut.
  9. Ilościowo i przechowuj DNA.
    1. Zmierz stężenie DNA za pomocą spektrofotometru. Przechowuj próbki DNA w temperaturze +4 °C do dalszego użycia. (punkt STOP).
  10. Wykonaj reakcję łańcuchową polimerazy (PCR).
    1. Projektuj zapalniki SRY-F, SRY-R oraz pośrednie PAX6-F, PAX6-R (patrz Tabela Uzupełniająca 1).
    2. Przygotuj mieszankę PCR w następujący sposób (na próbkę): 5 μL buforu PCR (10x), 4 μL MgCl2, 4 μL dNTP, 0,5 μL każdego z czterech starterów, 31 μLdH2O oraz 0,5 μL polimerazy Taq.
      UWAGA: Polimeraza taq powinna być dodawana na końcu, tuż przed użyciem, aby zapewnić optymalną amplifikację.
    3. Przygotuj oznaczone rurki PCR i umieść je na stojaku chłodzącym o temperaturze +4 °C. Rozprowadz 45 μL mieszanki do probówek.
    4. Delikatnie stuknij w blok, aby upewnić się, że krople mieszanki PCR znajdują się na dnie rurki.
    5. Dodaj 5 μL próbek DNA i krótko pipetuj. Krótko zacznij wirowaniem, a potem wiruj w rurkach.
    6. Umieść rurki w maszynie PCR i ustaw program w następujących warunkach: początkowo inkubacja w 95 °C przez 5 minut, 40 cykli denaturacji w 94 °C przez 1 minutę, wyżarzanie w 57 °C przez 45 sekund oraz przedłużanie w 72 °C przez 1 minutę. Po cyklach następuje ostateczne wydłużenie w 72 °C przez 10 minut, a następnie utrzymywanie w 40 °C na czas nieokreślony.
  11. Wizualizuj próbki uzyskane za pomocą elektroforezy żelu 2% agarozowego.
    UWAGA: Próbki pokazujące, że dwa pasma to mężczyźni, a te z jednym to kobiety.

4. Potwierdzenie uszkodzenia hipoksji u noworodkowych myszy

  1. Mikroskopowo oceniaj tkanki mózgu pobrane od ofiarowanych myszy, aby potwierdzić uszkodzenia hipoksyczne, a następnie oceniaj immunohistochemicznie w celu zbadania HIF-1α.
    1. Utrwal i osadził tkankę parafiną.
      1. Konserwuj chusteczki w formaldehydzie przez 12 godzin, a następnie myj w wodzie przez 6 godzin.
      2. Napraw tkanki, odwodniając w serii alkoholu etylowego przez 1 dzień dla każdego stężenia: 70%, 80%, 90%, a następnie 3 godziny w 100% alkoholu etylowym. Umieść chusteczki w ksylenie na 15 minut, żeby się wyczyściły.
      3. Przenieś tkanki do parafiny serii I, II i III na 1 godzinę każda. Po trzeciej godzinie odpowiednio ukierunkuj próbki mózgu i umieść je w czystej parafinie.
      4. Za pomocą rotacyjnego mikrotomu wyciął fragmenty o grubości 5 μm z bloków parafinowych.
    2. Przygotuj slajdy.
      1. W przypadku barwienia hematoksyliny i eozyny (HE) umieść fragmenty na szkiełkach szkiełkowych.
      2. W immunohistochemii umieść przekroje na dodatnio naładowanych szkiełkach szklanych.
        UWAGA: (punkt STOP), slajdy można archiwizować na tym etapie do dalszej oceny i pracy.
    3. Wykonaj barwienie HE (HE staining).
      1. Zanurz próbki w roztworze ksyleny I na 10 minut.
      2. Zanurz próbki w roztworze Xylene II na dodatkowe 10 minut.
      3. Przełóż próbki do serii malejących stężeń alkoholu, każda przez 1 minutę: 100%, 96% i 80%.
      4. Przemyj próbki wodą destylowaną przez 2 minuty.
      5. Zanurz próbki w hematoksylinie na 8 minut, a następnie myj je w wodzie destylowanej przez 2 minuty.
      6. Po umyciu poddaj próbki alkoholowi kwaśnemu przez 1 sekundę, a następnie myj je przez 1 minutę.
      7. Umieść próbki w wodzie z amoniakiem na 10 sekund, a następnie powtórz 1-minutowe mycie.
      8. Umieść próbki w alkoholu 70% na 30 sekund.
      9. Zanurz próbki w eozynie na 10 minut.
      10. Stopniowo przenosz próbki, zwiększając stężenie alkoholu przez 1 minutę każda: 96%, 96% i 100%.
      11. Zanurz próbki w roztworach ksyleny I, ksyleny II i ksyleny III przez 1 minutę każda.
      12. Przykryj się folią na przykrycie.
    4. Sprawdź pod mikroskopem.
      1. Po barwieniu HE obejrzyj całe tkanki mózgowe każdej grupy pod mikroskopem świetlnym.
      2. Ocenić obszary hipokampa i kory pod kątem degeneracji neuronalnej oraz obrzęku okołokomórkowego/okołonaczyniowego.
  2. Wykonaj barwienie HIF-1α.
    1. Inkubuj próbki na dodatnio naładowanych preparatach przez noc w temperaturze 67 °C w inkubatorze, aby zapewnić odpowiednie utrwalenie.
    2. Przeprowadzić przekroje przez roztwory ksyleny I i ksyleny II, aby zakończyć deparafinizację.
    3. Nawodnij sekcje, umieszczając je kolejno w roztworach etanolu 100%, 96%, 80% i 70% przez 5 minut, a następnie płukaj w wodzie destylowanej przez 5 minut.
    4. Odmaskuj epitopy, podgrzewając fragmenty w mikrofalówce w kwasie cytrynowym 0,01 M (pH 6,0) w temperaturze 665 W przez dwa cykle po 5 minut.
    5. Schładz sekcje w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.
    6. Wyznacz obwod sekcji hydrofobowym długopisem, a następnie myj je 3 razy w PBS przez 5 minut każdy.
    7. Inkubuj fragmenty w nadtlenku wodoru 3% w metanolu przez 10 minut, aby zablokować endogenną aktywność nadoksydazy.
    8. Myj fragmenty ponownie 3 razy w PBS przez 5 minut za każdym razem.
    9. Aby zapobiec wiązaniu immunoglobuliny niespecyficznej, inkubuj fragmenty odczynnikiem blokującym UV przez 7 minut.
    10. Inkubuj sekcje przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnym przeciwciałem anty-HIF-1α (rozcieńczenie 1:200).
    11. Myj sekcje 3 razy w PBS przez 5 minut za każdym razem.
    12. Aplikuj biotynilowane przeciwciała wtórne na przecięcia i inkubuj w RT przez 40 minut.
    13. Myj fragmenty ponownie 3 razy w PBS przez 5 minut za każdym razem.
    14. Na przecięcia nałóż roztwór streptawidyny i inkubuj przez 30 minut w RT.
    15. Myj te sekcje 3 razy w PBS przez 5 minut za każdym razem.
    16. Reakcję barwienia można wywołać, stosując 3,3'-diaminobenzydynę (DAB) i obserwując pod mikroskopem świetlnym.
    17. Rozbarw przekroje zmodyfikowanym roztworem Gill II hematoksyliny, aby zabarwić jądra.
    18. Sekcje odwodnia, przepuszczając je przez rosnące stężenia etanolu (70%, 80%, 96% i 100% etanolu).
    19. Oczyścić sekcje, inkubując je w roztworach ksyleny I i ksyleny II przez 10 minut każdy.
    20. Montaż sekcji na medium montażowym i slipie pokrywkowym.
    21. Obejrzyj zamontowane wycinki pod mikroskopem świetlnym oraz przeanalizuj obszary hipokampa i kory przedczołowej.
    22. Mierz poziomy immunoreaktywności za pomocą otwartoźródłowego oprogramowania do przetwarzania obrazów.

5. Eksperymenty behawioralne

  1. Po potwierdzeniu hipoksji pozwól pozostałym myszom zakończyć okres laktacji razem z matkami.
  2. Wykonaj określenie płci w 21. dniu poporodowym na podstawie odległości anogenitalnej, a następnie umieść zwierzęta w różnych klatkach w zależności od płci. Gdy myszy z grup kontrolnych hipoksyjnych i pozorowanych osiągną 2 miesiące, poddaj je eksperymentom behawioralnym.
  3. Przed przeprowadzeniem testów behawioralnych przyzwyczaj uczestników do środowiska testowego przez 15-30 minut przed testem.
  4. Upewnij się, że wszystkie urządzenia/urządzenia między uczestnikami a badaniami dezynfekujesz przy użyciu 70% etanolu.
  5. Wykonaj test rozpoznawania obiektów (NOR).
    1. Ustaw aparat w miejscu, gdzie obiekty są wyraźnie widoczne i monitorowane.
    2. Zainstaluj odpowiednie oprogramowanie do śledzenia wideo.
    3. Przygotuj arenę testową (60 cm × 60 × cm × 40 cm pudełko) z dwoma obiektami nie większymi niż mysz. Upewnij się, że oba obiekty są podobnej wielkości i kształtu oraz łatwo dostępne (10 cm × 10 cm od ścian i równolegle).
    4. Dzień 1: Faza zapoznania:
      1. Umieść mysz na arenie z dwoma identycznymi przedmiotami. Pozwól myszy swobodnie eksplorować obiekty przez określony czas (np. 10 minut).
      2. Podczas tej sesji obserwuj i zapisuj, ile czasu mysz spędziła z każdym obiektem. Zapisz także liczbę razy, gdy mysz obróciła się w stronę lub wchodziła w interakcję z każdym obiektem
    5. Dzień 2: Wprowadzenie do obiektu nowatorskiego:
      1. Zamień jeden z znanych przedmiotów z pierwszego dnia na nowy przedmiot (różniący się wyglądem, fakturą lub kształtem).
      2. Wróć mysz na arenę, pozwalając jej swobodnie eksplorować przez ten sam czas co podczas pierwszej sesji.
    6. Zapisz całkowity czas, jaki mysz spędziła z znanym obiektem (od pierwszego dnia) oraz z obiektem nowatorskim. Zapisz liczbę razy, gdy mysz obróciła się w stronę lub wchodziła w interakcję z każdym obiektem.
    7. Oblicz wskaźnik dyskryminacji (DI), aby ocenić pamięć i uczenie się myszy, stosując wzór:
      Wskaźnik dyskryminacji (DI) = {(Czas spędzony z nowym obiektem − Czas spędzony z znanym obiektem)/(Łączny czas spędzony z obiema obiektami)} × 100.
      UWAGA: Wyższy wskaźnik DI oznacza większe zainteresowanie nowym obiektem, co sugeruje lepszą pamięć i zdolności uczenia się. DI bliski 0 oznacza brak preferencji, sugerując równe zainteresowanie lub słabą pamięć dla znanego obiektu.
    8. Użyj DI do obiektywnej oceny zdolności uczenia się i pamięci myszy, opierając się na jej naturalnej ciekawości oraz zdolności rozpoznawania i rozróżniania znanych od nowych obiektów.
  6. Wykonaj test zawieszenia tylnego (TST)
    1. Zainstaluj kamerę w miejscu, gdzie myszy są wyraźnie widoczne i można je monitorować. Zainstaluj odpowiednie oprogramowanie do śledzenia wideo.
    2. Przygotuj eksperymentalne rozwiązanie z miejscem na 3 myszy jednocześnie.
    3. Użyj kartonowych paneli o wysokości 25 cm z odstępami co 20 cm, aby odizolować myszy i nie widzieć się nawzajem podczas testu.
    4. Wytnij 12 cm paski taśmy i ostrożnie przyklej je do ogona każdej myszy, dbając o to, by ogon był dobrze przymocowany bez uszkodzenia. Umieść taśmę na końcu ogona (2 cm), aby mysz mogła być zawieszona bez urazu.
    5. Nagrywaj myszy przez 6 minut, gdy są zawieszone.
    6. Po upływie czasu trwania zatrzymaj nagrywanie, wyjmij mysz i odłóż ją do klatki w obudowach. Przeanalizuj filmy, aby określić czas aktywnego ruchu oraz czas nieruchomości.
      UWAGA: To pozwoli na wgląd w reakcję na stres, ponieważ nieruchomość często wskazuje na stan wyuczonej bezradności lub stresu. Stopień nieruchomości jest powszechnie stosowany do pomiaru rozpaczy behawioralnej lub reakcji stresowej u myszy, co może być związane ze skutkami stresu lub stanów depresji.
    7. Na podstawie obserwowanych wzorców ruchu i nieruchomości należy ocenić stan emocjonalny oraz mechanizmy radzenia sobie ze stresem u myszy w odpowiedzi na wymuszone zawieszenie.
  7. Wykonaj test zakopania marmuru
    1. Wypełnij pustą klatkę (20 cm × 35 cm × 15 cm) kolbą kukurydzy o wysokości 5 cm. Ułóż 20 kulek w 5 rzędach, po 4 kulki każda. Upewnij się, że kulki są równomiernie rozłożone na powierzchni.
    2. Umieść obiekt w rogu klatki, zapewniając łatwy dostęp do całej klatki.
    3. Daj myszy 20 minut na eksplorację klatki. W tym czasie mysz może wykazywać zachowanie zakopywania, próbując przykryć kulki kolbą kukurydzy. Po 20 minutach wyjmij mysz z klatki.
    4. Policz łączną liczbę kulek, które mysz zakopała pod kolbą kukurydzy w ciągu 20 minut. Zanotuj łączną liczbę zakopanych kulek, ponieważ to kluczowa miara zachowania.
      UWAGA: Liczba zakopanych kulek jest powszechnie używana jako wskaźnik lęku, kompulsywnego zachowania lub neofobii u gryzoni. Większa liczba zakopanych kulek często wiąże się z wyższym poziomem lęku lub skłonności kompulsywnych.
    5. Na podstawie całkowitej liczby zakopanych kulek oceń należy ocenić zachowania związane z lękiem oraz tendencje kompulsywne u myszy, co może posłużyć do oceny efektów leczenia lub schorzeń eksperymentalnych.
  8. Wykonaj test interakcji społecznych.
    1. Zainstaluj kamerę w miejscu, gdzie myszy są wyraźnie widoczne i można je monitorować.
    2. Podłącz kamerę do komputera i ustaw odpowiednie oprogramowanie do śledzenia wideo. Rozstaw prostokątną skrzynkę (60 cm × 40 cm × 25 cm) z dwoma ścianami (40 cm × 25 cm) i dwoma drzwiami (8 cm), aby oddzielić trzy komory.
    3. Umieść klatkę (15 cm × 10 cm) zawierającą mysz znaną badanemu eksperymentu oraz inną klatkę (15 cm × 10 cm) z myszą, która wcześniej nie miała kontaktu z badanym eksperymentem.
    4. Zacznij nagrywać i umieść obiekt w środkowej komorze.
      UWAGA: Myszy używane w tym teście, inne niż zwierzęta doświadczalne, muszą być tej samej płci i zdrowe.
    5. Obserwuj obiekt przez 5 minut i nagrywaj go kamerą wideo. Po upływie czasu trwania zatrzymaj nagrywanie, usuń mysz i wróć ją do klatki w obudowach.
    6. Korzystając z oprogramowania SIT, przeanalizuj czas interakcji społecznych oraz tendencje myszy do nowości społecznej i porównaj je z grupą kontrolną fikcyjną.
      UWAGA: Więcej czasu poświęcanego na zachowania społeczne (np. pielęgnacja czy wąchanie) i mniej czasu na unikanie lub okazywanie agresji można interpretować jako wykaz wysokiej towarzyskości. Unikanie kontaktów, spędzanie więcej czasu w izolacji lub przejawianie większej agresji może sugerować lęk, wycofanie społeczne lub ograniczoną zdolność do interakcji społecznych.
  9. Przeprowadz test na otwartym polu.
    1. Ustaw kamerę tak, aby myszy były wyraźnie widoczne i monitorowane. Podłącz kamerę do komputera i ustaw odpowiednie oprogramowanie do śledzenia wideo.
    2. Ustaw arenę testową (60 cm × 60 cm × 40 cm boks) i podziel pole wyimaginowanymi liniami, aby utworzyć 16 kwadratów.
    3. Zacznij nagrywać i ostrożnie umieść mysz na środku areny. Obserwuj i zapisuj zachowanie myszy przez 5 minut.
    4. Po upływie czasu trwania zatrzymaj nagrywanie, wyjmij mysz i odłóż ją do klatki w obudowach.
    5. Za pomocą oprogramowania do śledzenia mierz zachowania zewnętrzne i wewnętrzne, takie jak chodzenie, wspinaczka, ucieczka, pielęgnacja, nieruchomość, całkowite przejścia, wypróżnianie i oddawanie moczu, aby ocenić poziom lęku, ruchu, aktywności eksploracyjnej i emocjonalnej u uczestników.
  10. Wykonaj test morris water maze (MWM).
    1. Przygotuj labirynt wodny o średnicy 120 cm i głębokości 60 cm w stabilnej pozycji w laboratorium behawioralnym w temperaturze 23 ± 1 °C.
    2. Podziel labirynt na cztery wyimaginowane ćwiartki i umieść różne wskazówki wizualne (kształt i kolor) na środku każdego kwadrantu ścian labiryntu, około 20 cm od podstawy. Ustaw platformę o długości 17 cm i średnicy 10 cm 20 cm od ściany.
      UWAGA: Labirynt, wskazówki i platforma nie powinny zmieniać pozycji ani lokalizacji, aby myszy mogły dokładnie trenować swoją pamięć.
    3. Wypełnij labirynt wodą o temperaturze 21-26 °C do 1 cm poniżej platformy i połóż czarnym, wielopowierzchniowym barwnikiem akrylowym.
      UWAGA: W przypadku stosowania innych szczepów myszy woda powinna być zabarwiona kontrastem do koloru myszy, aby móc je monitorować.
    4. Umieść kamerę w pozycji, która rejestruje pełny obraz i podłącz ją do oprogramowania MWM na komputerze.
      UWAGA: Miejsce na peronie powinno zostać przypisane w programie na piąty dzień prób.
    5. Test trwa 5 dni, każdy z czterema próbami. Przez pierwsze cztery dni rozpocznij nagrywanie i rozpocznij próbę, starannie umieszczając obiekt w innym kwadrancie każdego dnia, z twarzą skierowaną w stronę ściany zbiornika.
    6. Przypisz lokalizację peronu w harmonogramie testów na 5. dzień.
      UWAGA: Zapobiega to tworzeniu pamięci asocjacyjnej przez uczestników. Ostrożne umieszczanie obiektów w wodzie i utrzymanie właściwej temperatury jest niezbędne, aby uniknąć dodatkowego stresu zewnętrznego. Próby trwają 5 minut i kończą się automatycznie, gdy (i) peron zostanie osiągnięty (ii) upłynie 5-minutowego limitu czasu. W ciągu kilku dni uczestnicy powinni poznać lokalizację platformy i znaleźć ją w krótszym czasie.
    7. Piątego dnia usuń platformę i ostrożnie umieść myszy w kwadratze labiryntu, jak opisano wcześniej.
      UWAGA: Proces kończy się automatycznie, gdy (i) mysz znajdzie i wejdzie na platformę, (ii) upłynie 5-minutowy limit czasowy. Zdrowi pacjenci powinni znaleźć lokalizację poprzedniej platformy. Oprogramowanie automatycznie oblicza czas, jaki mysz potrzebowała na znalezienie platformy w każdym badaniu i pomaga ocenić pamięć krótkotrwałą i zdolność uczenia się uczestników.

6. Potwierdzenie uszkodzeń hipoksji u dorosłych myszy

  1. Po zakończeniu testów behawioralnych poświęca się badanych przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Pobierz tkankę hipokampa i próbki krwi od 6 myszy z każdej grupy, w tym grupy kontrolnej pozorującej, do analizy molekularnej (sekcja 7).
  3. Umieść mózgi pozostałych 4 myszy w roztworze 10% formaldehydu, aby zbadać wpływ ekspozycji na hipoksję w okresie noworodkowym na morfologię mózgu dorosłych.
  4. Stosuj tę samą technikę, co wcześniej opisaną w sekcji 4, aby przeprowadzić analizę histologiczną mózgów dorosłych myszy.

7. Całkowita izolacja RNA od próbek fazy dorosłych

  1. Do każdej próbki tkanki dodano 500 μL trizolu oraz 500 μL krwi.
  2. W przypadku tkanki mózgowej ujednolic próbki za pomocą strzykawki.
  3. Inkubuj mieszankę w RT przez 5 minut.
  4. Dodaj 200 μL chloroformu do każdej probówki i inkubuj przez dodatkowe 5 minut w RT.
  5. Wirówka w 12 000 g przez 20 minut w +4 °C.
  6. Ostrożnie przenieś fazę wodną (RNA) do nowej sterylnej rurki.
  7. Dodaj izopropanol (stosunek 1:1 do fazy wodnej) i inkubuj mieszankę przez noc. (punkt STOP/-20 °C).
  8. Następnego dnia wirówka w 12 000 g przez 10 minut w temperaturze +4 °C.
  9. Ostrożnie wyrzuć supernatant i dodaj 1000 μL etanolu 75% do pelleta.
  10. Wirować w 7 500 × g przez 5 minut w temperaturze +4 °C.
  11. Powtórz krok mycia etanolem dwa razy.
    UWAGA: Jeśli granulka jest zbyt mała, wystarczy jedno przepłukanie.
  12. Usuń supernatant i pozwól pelletu wyschnąć na powietrzu w RT.
  13. Gdy jest całkowicie suchy, ponownie zawiesij pellet z 50 μL NFW i inkubuj na lodzie w temperaturze +4 °C przez 10-15 minut.
  14. Zmierz stężenie RNA spektrofotometrycznie.
  15. Przechowuj próbki RNA w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

8. Synteza komplementarnego DNA (cDNA)

  1. Pracując na chłodzącym stojaku o temperaturze +4 °C, przygotuj próbki RNA wyizolowane z krwi i tkanek mózgowych.
  2. Przygotuj oznaczone rurki PCR.
  3. Mieszaj odczynniki z zestawu syntezy cDNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Przygotuj łącznie 14 μL mieszaniny reakcyjnej dla każdej próbki i rozprowadz ją do probówek.
  5. Dodaj do mieszanki 6 μL próbki RNA.
  6. Synteza cDNA w urządzeniu PCR należy wykonać zgodnie z warunkami temperatury i czasu określonym przez producenta.
    UWAGA: CDNA syntetyzowane na tym etapie można przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
  7. Rozcieńcz syntetyzowane cDNA w proporcji 1:5.
  8. Przechowuj rozcieńczone cDNA w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy qPCR.

9. Ilościowe PCR w czasie rzeczywistym dla ekspresji miRNA (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p, miR-499a-5p oraz U6 małego jądrowego RNA jako kontroli normalizacji)

  1. Zaprojektuj primery dla każdego miRNA (zobacz Tabelę Uzupełniającą 2 dla sekwencji).
  2. Przygotuj mieszankę reakcji PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Należy podawać 14 μL mieszanki reakcyjnej do każdego dołka płytki PCR z 96 dołkami.
  4. Dodaj 6 μL rozcieńczonego cDNA w 1:5 do każdego dołka, co daje całkowitą objętość reakcji 20 μL.
  5. Wykonaj PCR w duplikatach dla każdej próbki, aby zminimalizować zmienność, stosując ten program: początkowa denaturacja w 95 °C przez 120 s, 45 cykli denaturacji w 95 °C przez 10 s, wyżarzanie i amplifikacja w 56 °C przez 60 s, a analiza krzywej topnienia w 60 °C przez 15 s, a następnie w 95 °C.
  6. Przeanalizuj wyniki za pomocą wartości Ct (prog cyklu) i normalizuj dane metodą 2-ΔΔCt .

10. Analiza statystyczna

  1. . Oceń normalność danych za pomocą histogramów, wykresów Q-Q oraz testu Shapiro-Wilka do analizy danych o ekspresji miRNA.
    1. Jeśli dane są normalnie rozproszone, użyj One-Way ANOVA.
    2. Jeśli dane nie są normalnie rozłożone, należy zastosować test Kruskala-Walliego, test t ucznia lub test Mann-Whitney U.
  2. Przy ocenie różnic płciowych w każdej grupie należy stosować test t-test ucznia lub test Mann-Whitney U, w zależności od rozkładu danych. Istotność statystyczna określa się przez wartość p <0,05.
    UWAGA: Wszystkie analizy powinny być wykonywane przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Tutaj używany jest GraphPad Prism 8.
  3. Oceń normalność danych za pomocą histogramów, wykresów Q-Q oraz testu Shapiro-Wilka do analizy wyników eksperymentów behawioralnych.
    1. Jeśli dane są normalnie rozproszone, użyj dwukierunkowej ANOVA.
    2. Dla danych, które nie są normalnie rozłożone, wykonaj test Kruskala-Walliego, test Studenta lub test Mann-Whitney U.
    3. Oceń różnice płciowe w każdej grupie, stosując test t ucznia lub test Mann-Whitney U, w zależności od rozkładu danych. Ponownie, rozważmy wyniki statystycznie istotne, jeśli wartość p wynosi < 0,05.
  4. Do analiz immunohistochemicznych stosuj dwukierunkową metodę ANOVA, a następnie test pooperacyjny Tukeya do porównania grup żeńskich i męskich.
  5. Aby porównać grupy żeńskie i męskie w każdej schorzeniu hipoksji, użyj testu post-hoc Sidaka. Istotność statystyczna jest określana, jeśli wartość p wynosi < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym badaniu ciężarne myszy Balb/c były narażone na warunki niedotlenienia 8%O2 (ciężkie), 10%O2 (umiarkowane) i 12%02 (łagodne) podczas porodu, a nowo narodzone myszy były utrzymywane w tych warunkach niedotlenienia przez 5 minut, aby ustalić modele łagodnej, umiarkowanej i ciężkiej niedotlenienia noworodków. Grupa oznaczona jako fikcyjna grupa kontrolna była poddana normoksyjnym (21%O2) warunkom porodowym, a następnie pozwolono jej żyć w warunkach standardowej opiek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Okołoporodowa hipoksja, poważny problem noworodkowy, może powodować zmiany molekularne, komórkowe i neuronalne poprzez zakłócanie kluczowych procesów rozwojowych i była powiązana z różnymi zaburzeniami neurorozwojowymi, w tym zaburzeniami ze spektrum autyzmu (ASD)1. Chociaż ciężka hipoksja była szeroko badana pod kątem jej natychmiastowych skutków, długoterminowe skutki łagodnej do umiarkowanej hipoksji w okresie okołoporodowym pozostają mniej poznane. Nasze badanie miało na celu wypełnienie tej l...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Badanie zostało sfinansowane przez Turecką Radę Badań Naukowo-Technologicznych (TÜBİTAK), a autorzy dziękują Celalettinowi Göktaşowi (ośrodek zwierząt transgenicznych) oraz biolożce Seldzie Taşdemir (laboratorium behawioralne).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(-20 stopni; C) ZamrażarkaSiemens KD86NAWE0N
(+4 i stopnie; C) BlokAntagen Biosciencehttps://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/
(+4 i stopnie; C) LodówkaSiemens KD86NAWE0N
(-20 stopni; C) BlokCleaver Sientifichttps://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/
Absolute EthanolMerck1070172511
Octan amonuSigma238074-500G
Analityczna równowaga  Adam EquipmentLAB214i
ChloroformMerck1024451000
Kwas cytrynowy  Merck100241
KomputerHPhttps://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1
EDTASigmaE9884-1KG
Entellan Merck107961
EosinMerck109844
Ependorf (1,5 mL)?solab078.03.021
Ethovision SystemNoldushttps://noldus.com/ethovision-xt
EtuvNUVEEN 400/500 N/A
Falcon Tubes (15 mL)Izolatorium078.02.001
FormaldehydMerck104002
Kamera termicznaSamsungSC2000
HematoksylynaMerck105175
HIF-1α PrzeciwciałaBiossbs-20398R 
Komory hipoksji  BiosferixKomora A
IzoproponalneMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Klatka testu zakopywania marmuruWisznu https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel
Rurki mikrowirówki (1,5 mL)Greiner616201
Końcówki mikropipety (100 & mikro; L)Greiner774353
Końcówki mikropipety (1000 & mikro; L)Greiner778353
Mikropipety (10 & micro; L)GilsonFD10001
Mikropipety (100 & mikro; L)GilsonFD10004
Mikropipety (1000 &; L)GilsonFD10003
Końcówki mikropipet (10 & mikro; L)Greiner772353
Mikropipety (2 i mikro; L)GilsonGFAM00064
MikroskopiaOlympusBx53
miRCURY LNA RT Kit (zestaw do syntezy cDNA)Qiagen339340
miRCURY LNA SYBR Zielony zestaw PCRQiagen339346
Płyty wielowarstwoweRoche4729692001
Nano spektrofotometrShimadzuC101-E112
Arena Testu Rozpoznawania Nowych ObiektówGlobalna biotechnologia137
Arena testów na otwartym poluGlobalna biotechnologia117
Oxycycler BiosferixA42OC
Parafina  Leica  39602012
PBS TabletSigmaP4417-50TAB
Urządzenie PCRSensoquestT3-0140
Plate SpinPeqlab91-PSPIN-P
PryzmatGraphPadhttps://www.graphpad.com/
Proteinaza KSigmaP6556-10MG
QIAzol Lysis Reagent Isolation ReagentQiagen79306
SDSSigma8170342500
Przeciwciała wtórne AbcamA0545-1ML
Trzy komory testu interakcji społecznychGlobalna biotechnologia118
SpinGilsonPMC880
Strzykawka (2 mL)Baybihttps://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler
Konfiguracja testu zawieszenia ogonowegoSelf Made, można znaleźć podobne rzeczy na Harvard ApparatusSelf Made, można znaleźć podobne na (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html)
TermomieszarkaEppendorf#5355
Baza TrizmaSigma1503-1KG
WirHeidolph541-10000-00-1
Xyleny Isolab 9,90,01,92,501

Bibliografia

  1. Bonkowsky, J. L., Son, J. -H. Hypoxia and connectivity in the developing vertebrate nervous system. Dis Model Mech. 11 (12), dmm037127(2018).
  2. Dunwoodie, S. L. The role of hypoxia in development of the mammalian embryo. Dev Cell. 17 (6), 755-773 (2009).
  3. Beck, S., et al. The worldwide incidence of preterm birth: a systematic review of maternal mortality and morbidity. Bull World Health Organ. 88 (1), 31-38 (2010).
  4. Milash, B., et al. Temporal dysynchrony in brain connectivity gene expression following hypoxia. BMC Genomics. 17 (1), 334(2016).
  5. Adachi, K., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters ovine fetal endocrine and physiological responses to hypotension. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 287 (1), R209-R217 (2004).
  6. Imamura, T., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters endocrine and physiologic responses to umbilical cord occlusion in the ovine fetus. J Soc Gynecol Investig. 11 (3), 131-140 (2004).
  7. Fajersztajn, L., Veras, M. M. Hypoxia: from placental development to fetal programming. Birth Defects Res. 109 (17), 1377-1385 (2017).
  8. Ruas, J. L., Poellinger, L. Hypoxia-dependent activation of HIF into a transcriptional regulator. Semin Cell Dev Biol. 16 (4-5), 514-522 (2005).
  9. Mukandala, G., Tynan, R., Lanigan, S., O'Connor, J. J. The effects of hypoxia and inflammation on synaptic signaling in the CNS. Brain Sci. 6 (1), 6(2016).
  10. Lee, S., et al. Gene networks associated with non-syndromic intellectual disability. J Neurogenet. 32 (1), 6-14 (2018).
  11. Fattuoni, C., Palmas, F., Noto, A., Fanos, V., Barberini, L. Perinatal asphyxia: a review from a metabolomics perspective. Molecules. 20 (4), 7000-7016 (2015).
  12. Locci, E., et al. Exploring perinatal asphyxia by metabolomics. Metabolites. 10 (4), 141(2020).
  13. De Haan, M., et al. Brain and cognitive-behavioural development after asphyxia at term birth. Dev Sci. 9 (4), 350-358 (2006).
  14. Armstrong-Wells, J., Bernard, T. J., Boada, R., Manco-Johnson, M. Neurocognitive outcomes following neonatal encephalopathy. NeuroRehabilitation. 26 (1), 27-33 (2010).
  15. Gardener, H., Spiegelman, D., Buka, S. L. Prenatal risk factors for autism: comprehensive meta-analysis. Br J Psychiatry. 195 (1), 7-14 (2009).
  16. Hicks, S. D., Middleton, F. A. A comparative review of microRNA expression patterns in autism spectrum disorder. Front Psychiatry. 7, 176(2016).
  17. Cassidy, F. C., Charalambous, M. Genomic imprinting, growth and maternal-fetal interactions. J Exp Biol. 221 (Suppl_1), jeb164517(2018).
  18. Serocki, M., et al. miRNAs regulate the HIF switch during hypoxia: a novel therapeutic target. Angiogenesis. 21 (2), 183-202 (2018).
  19. Ozkul, Y., et al. A heritable profile of six miRNAs in autistic patients and mouse models. Sci Rep. 10 (1), 9011(2020).
  20. Siniscalco, D., et al. Autism spectrum disorders: is mesenchymal stem cell personalized therapy the future. J Biomed Biotechnol. 2012, 480289(2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Hipoksja noworodkowadysregulacja mikroRNAtesty behawioralnewodny labirynt Morrisatest rozpoznawania nowych obiektówtest zakopywania kulektest interakcji społecznychmarkery neurodegeneracjiwczesna interwencja
Hipoksja zmienia poziomy miRNA zaangażowane w dziedziczenie niemendelowskie zaburzeń ze spektrum autyzmu u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.