Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zarządzanie po przeszczepieniu wątroby i pobieranie próbek u wiewiórek ziemnych Daurian do sekwencjonowania jednokomórkowego RNA

578 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68443

⸱

16 września 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hepatic Surgery and Liver Transplantation Center of the Third Affiliated Hospital, Organ Transplantation Institute, Sun Yat-sen University; Organ Transplantation Research Center of Guangdong Province, Guangdong Province Engineering Laboratory for Transplantation Medicine, 2Guangdong Key Laboratory of Liver Disease Research, the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 3Collage of Life Science, Shenyang Normal University, 4Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology; Key Laboratory of Organ Transplantation, Ministry of Education, Chinese Academy of Medical Sciences, NHC Key Laboratory of Organ Transplantation, 5The School of Life Science, Peking University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje procedury przedłużonego przechowywania wątroby w chłodni i przeszczepu ortotopowego u wiewiórki dauryjskiej (DGS; Spermophilus dauricus), typowy hibernator sezonowy. Obejmuje metody pobierania przeszczepów wątroby i próbek krwi do ocen prognostycznych, a następnie przetwarzania ich do badań na pojedynczych komórkach.

Streszczenie

Przywrócenie funkcjonalności przeszczepu i zgodność immunologiczna przeszczepu z gospodarzem stanowią główne problemy prognostyczne po przeszczepieniu wątroby. Co najważniejsze, konwencjonalne modele gryzoni wykorzystujące szczury lub myszy oferują ograniczony wgląd w mechanizmy urazów przeszczepów wywołanych hipotermią podczas konserwacji. Luka ta uwypukla potrzebę alternatywnych modeli. Ponieważ przeszczepy wątroby od przystosowującej się do zimna wiewiórki dauryjskiej (DGS; Spermophilus dauricus) może wytrzymać długotrwałe przechowywanie w zimnie, a tym samym zapewnić wysoką przeżywalność w DGS po przeszczepie, w związku z czym protokół ten szczegółowo opisuje niezbędną pooperacyjną opiekę nad zwierzętami i monitorowanie fizjologiczne wymagane dla osób po przeszczepie. Ponadto zapewnia ustandaryzowane procedury przygotowania wysokiej jakości próbek przeszczepów wątroby do dalszych technik analitycznych, w tym sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq) do profilowania transkryptomicznego i badania histopatologicznego. Pomyślne wygenerowanie dobrze przygotowanych próbek przeszczepów DGS jest kluczowym początkowym krokiem w zastosowaniu zarówno tradycyjnych, jak i najnowocześniejszych metodologii do badania tego niekonwencjonalnego, ale bardzo istotnego modelu. Protokół ten odnosi się do informacji multiomicznych dla DGS, ułatwiając w ten sposób przyszłe badania nad interwencjami chirurgicznymi i modelowaniem chorób nie tylko u hibernujących gryzoni, ale także u innych wyspecjalizowanych organizmów.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad coraz więcej badaczy uznało, że doskonałe zdolności adaptacyjne gatunków hibernujących dają nieocenione możliwości odkrycia nowych mechanizmów adaptacji biologicznej i mogą zainspirować przełomy w różnych dziedzinach medycyny, takich jak konserwacja narządów i rehabilitacja metaboliczna 1,2,3,4,5,6,7,8 . Pierwszy kompleksowy protokół chirurgiczny do przedłużonego zachowania wątroby w zimnie i przeszczepu ortotopowego w hibernatorze, wiewiórce ziemnej Daurian (DGS; Spermophilus dauricus), został niedawno ustalony. Wydaje się, że adaptacyjny charakter DGS do chłodzenia umożliwia dłuższe przechowywanie przeszczepów dawcy w chłodni i wysoką przeżywalność po przeszczepie zwierząt biorców. W związku z tym potrzebny jest protokół kontrolny w celu monitorowania pooperacyjnego powrotu zwierząt do zdrowia i przygotowania próbek do różnych badań histopatologicznych i omicznych.

Biorąc pod uwagę znaczące różnice fizjologiczne między DGS a standardowymi modelami gryzoni oraz złożone i dynamiczne zmiany fizjologiczne po przeszczepieniu wątroby u zwierząt biorców, uzyskanie od nich wysokiej jakości próbek ma kluczowe znaczenie dla dalszych analiz, a tym samym dla zrozumienia fizjologii przeszczepu i gospodarza po przeszczepie. Poza pozyskiwaniem, przetwarzaniem i badaniem próbek krwi i tkanki wątroby konwencjonalnymi metodami, udana dysocjacja komórek miąższowych wątroby, które są hepatocytami, i komórek niemiąższowych (NPC), które obejmują komórki śródbłonka, komórki gwiaździste, komórki Kupffera i inne komórki odpornościowe, umożliwiłaby wyjaśnienie złożonych pooperacyjnych interakcji komórkowych i molekularnych z szybko rozwijającą się multiomiką opartą na pojedynczych komórkach. W tym celu od początku lat 50. XX wieku rozwijana jest klasyczna metoda oparta na perfuzji kolagenazy i jest stale udoskonalana 9,10,11. Niemniej jednak odrębna budowa anatomiczna wątroby DGS, zrosty pooperacyjne wywołane rekonstrukcją naczyń krwionośnych oraz wywołane operacją zmiany fizjologiczne w przeszczepach wątroby wymagają precyzyjnego dostrojenia warunków ekstrakcji.

Protokół ten zawiera szczegółowe wytyczne dotyczące postępowania pooperacyjnego i pobierania próbek w systemach gwarancji bezpieczeństwa po przeszczepieniu wątroby. W szczególności protokół ten umożliwia izolację hepatocytów z przeszczepów wątroby z wysoką wydajnością i żywotnością komórek, a także szczegółowo opisuje późniejsze przetwarzanie izolowanych hepatocytów do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNA-seq).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Pekińskiego (LSC-WangSQ-2). DGS użyte w tym badaniu zostały wyprodukowane w laboratorium przez ciężarne samice DGS schwytane na łąkach miasta Zhangjiakou. W czasie eksperymentu zwierzęta miały około 1-2 lat. DGS, zarówno samce, jak i samice, o masie od 180 g do 400 g, były wykorzystywane jako dawcy i biorcy. Masa biorcy była nieco większa niż dawcy, przy czym różnica wynosiła mniej niż 50 g. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Opieka po przeszczepie

  1. Umieść DGS po przeszczepie wątroby w ciepłym i czystym środowisku w cyklu światło/ciemność 12:12, ze standardową karmą laboratoryjną i wodą dostarczaną ad libitum.
  2. Codziennie monitoruj masę ciała, oceniaj nacięcie brzucha pod kątem krwawienia oraz obserwuj stan psychiczny i poziom aktywności biorcy.
  3. Bezpośrednio po operacji należy podawać podskórne wstrzyknięcie cefuroksymu (16 mg/kg) i buprenorfiny (0,05 mg/kg) co 12 godzin przez 3 dni.
  4. Takrolimus (1 mg/kg) należy wstrzykiwać domięśniowo codziennie do 24 godzin przed pobraniem tkanek.
    UWAGA: Ponieważ DGS pochodzą głównie z dzikich zwierząt, czynniki immunologiczne przeszczepu pozostają nieistotne. Przeszczepienie między DGS jest uważane za przeszczepienie allogeniczne (nie przeszczepienie syngeniczne). Jeśli w badaniu konieczne jest wykluczenie czynników immunologicznych, takich jak odrzucenie przeszczepu, należy upewnić się, że takrolimus jest standaryzowany w okresie pooperacyjnym.

2. Przygotowanie próbki przeszczepu wątroby

  1. Przygotowanie roztworów i przyrządów
    1. Przygotować 50 ml HBSS z 500 μM EGTA (wolne od Ca2+ i Mg2+; pH 7,4). Przed użyciem podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C.
    2. Rozpuścić kolagenazę IV (0,4 mg/ml) w 50 ml HBSS (z Ca2+ i Mg2+) i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 40 °C przez 30 minut.
    3. Roztwór Percoll: Wymieszaj Percoll z 10× PBS w stosunku 9:1 (v/v) i rozcieńcz 1× PBS w stosunku 9:1 (v/v) do probówki o pojemności 15 ml. Utrzymuj roztwór na lodzie.
      UWAGA: 5 ml 90% roztworu Percoll jest wystarczające na DGS.
    4. Zanurz narzędzia chirurgiczne w 70% etanolu na 30 minut przed użyciem.
    5. Zmontuj system perfuzyjny składający się z pompy perystaltycznej z regulowaną prędkością, rurki silastycznej i łaźni wodnej. Przepłucz rurkę ciepłą solą fizjologiczną, aby usunąć pęcherzyki powietrza i podłącz sterylny filtr 0,22 μm do wylotu rurki.
      UWAGA: Przed usunięciem pęcherzyków powietrza należy wypłukać ponownie zużytą rurkę poprzez dokładne przepuszczenie 70% etanolu przez 15 minut, a następnie całkowite płukanie ddH2O przez 15 minut w celu usunięcia pozostałości etanolu.
  2. Procedura na zwierzętach
    1. Znieczulić DGS po przeszczepie poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 2,5% tribromoetanolu w dawce 1 ml/100 g masy ciała. Wykonaj testy pod kątem utraty odruchów, takich jak reakcja na szczypanie palców u stóp, aby zapewnić pełne znieczulenie.
    2. Ogolić sierść na brzuchu i przymocować DGS na tablicy operacyjnej brzuszną stroną skierowaną do góry.
    3. Rozpyl 70% etanolu na okolice brzucha zwierzęcia, a następnie otwórz jamę brzuszną, wykonując duże nacięcie krzyżowe skóry i otrzewnej ostrymi nożyczkami i kleszczami zębatymi.
    4. Delikatnie przesuń jelita w prawo na zewnątrz jamy brzusznej za pomocą bawełnianego wacika, aż przeszczep wątroby, żyła wrotna (PV) i żyła główna dolna (IVC) zostaną wyraźnie odsłonięte (ryc. 1A).
      UWAGA: Ze względu na zrosty pooperacyjne w jamie brzusznej po przeszczepieniu wątroby, delikatnie wypreparuj zrosty za pomocą wilgotnego wacika.
    5. Włożyć strzykawkę o pojemności 5 ml do IVC poniżej stomii zespolenia, aby zebrać 1-2 ml krwi, a następnie natychmiast lekko uciskać miejsce nakłucia suchym wacikiem, aby uzyskać hemostazę po wyjęciu igły z naczynia (ryc. 1B).
      UWAGA: Aby zminimalizować krwawienie, igłę można wymienić na igłę ze strzykawki o pojemności 1 ml, czyli około 30 g.
    6. W orientacji skośnej do góry delikatnie nakłuć PV za pomocą cewnika 22-G pod kątem 15° w stosunku do powierzchni naczynia, a następnie cofnąć igłę cewnika. Po potwierdzeniu udanego nakłucia delikatnie przesuń kaniulę o dodatkowe 1-1,5 cm przez naczynie. Zabezpiecz pozycję kaniuli za pomocą zacisku naczyniowego (ryc. 1C).
      UWAGA: Jeśli kaniula zostanie prawidłowo umieszczona, widoczny będzie wsteczny przepływ krwi. Jeśli kaniulacja PV nie powiedzie się lub napotka problemy techniczne, przełącz się na kaniulację podwątrobowego IVC i wyznacz PV jako ścieżkę odpływu perfuzatu.
    7. Uruchom pompę perfuzyjną z ciepłą solą fizjologiczną o prędkości 6-8 ml/min, a następnie podłącz wspomniany powyżej filtr 0,22 μm do kaniuli.
    8. Po zainicjowaniu perfuzji przez PV należy wykonać nacięcie w IVC, aby umożliwić drenaż krwi. Do odpowiedniej perfuzji wymagane jest 50-80 ml roztworu soli fizjologicznej (ryc. 1D).
      UWAGA: Pomyślna perfuzja jest potwierdzana, gdy przeszczepiona wątroba przechodzi w bladożółto-biały kolor podczas tego procesu. Niektóre ciemnoczerwone obszary przekrwienia mogą pozostać na powierzchni wątroby i nie mogą być całkowicie usunięte, prawdopodobnie w wyniku śródoperacyjnego urazu wątroby, takiego jak uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne.
    9. Po odpowiedniej perfuzji z 50-80 ml ciepłej soli fizjologicznej wstrzymaj pompę.
    10. Podwiązać lewy płat boczny u podstawy za pomocą szwu jedwabnego 2-0, a następnie wyciąć płat dystalnie do miejsca podwiązania. Podobnie płat środkowy jest podwiązany u podstawy i wycięty tą samą metodą (ryc. 1E,F).
      UWAGA: Częściowa hepatektomia jest wykonywana w celu maksymalizacji wykorzystania przeszczepionej wątroby do wielu celów eksperymentalnych oraz zmniejszenia zużycia buforu kolagenazy przy jednoczesnym ułatwieniu dokładnego trawienia wątroby.
    11. Podziel wyciętą tkankę wątroby na kilka części: jedna część jest używana do izolacji NPC, a następnie sekwencjonowania scRNA, pozostałe części są utrwalane w 4% paraformaldehydzie do sekcji histologicznej lub zamrażane w ciekłym azocie do innych eksperymentów.
      UWAGA: Krok 2.2.11 może być wykonany przez inną osobę jednocześnie z kolejnymi krokami, aby zaoszczędzić czas.
    12. Izolacja NPC. Pokrój tkanki na około 1-2 mm3 kawałki w pożywce RPMI-1640 i enzymatycznie strawij za pomocą gentleMACS zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów). Żywotność i stężenie komórek określono za pomocą automatycznego licznika komórek.
      UWAGA: Krok 2.2.12 i kroki 2.2.13-2.3.5 przebiegają równocześnie.
    13. Przeciąć membranę i zacisnąć IVC nadwątrobowy (ryc. 1G).
    14. Przenieść rurkę doprowadzającą do wstępnie podgrzanego bufora EGTA. Uruchom ponownie pompę z szybkością 6-8 ml/min.
    15. Okresowo zaciskaj IVC przez 5-10 s, aby ułatwić równomierne rozprowadzenie roztworu perfuzyjnego w miąższu wątroby. Wątroba wyraźnie puchnie podczas zaciskania i rozluźnia się po uwolnieniu.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby unikać długotrwałych przerw w drenażu, ponieważ długotrwała blokada grozi pęknięciem cienkiej tkanki łącznej otaczającej wątrobę, zakłócając perfuzję lub dynamikę płynów w łożysku naczyń włosowatych wątroby. Ponadto utrzymująca się niedrożność może zagrozić żywotności komórek i zmniejszyć wydajność z powodu wrażliwości hepatocytów na siły mechaniczne.
    16. Po perfuzji z 40-50 ml roztworu EGTA, należy rozpocząć perfuzję buforu kolagenazy z szybkością 4-6 ml / min przez 8-10 minut. Na krótko zacisnąć naczynie krwionośne odpływu, jak w powyższych krokach (Rysunek 1H).
      UWAGA: Po 5-6 minutach perfuzji kolagenazy wątroba staje się zauważalnie bardziej miękka i pojawiają się szczeliny powierzchniowe. Jeśli te zmiany morfologiczne nie są obecne, zmniejsz prędkość perfuzji do 3-4 ml/min i wydłuż całkowity czas trawienia do 12-13 minut. Po zakończeniu 50 ml perfuzji kolagenazy wątroba wykazuje kruchą, podobną do tofu konsystencję, która jest wskaźnikiem wystarczającego trawienia (ryc. 1I).
    17. Zatrzymaj pompę i wyjmij kaniulę. Odetnij wątrobę od ciała, umieść ją w 5 cm naczyniu z 10 ml lodowatego podłoża DMEM/F12.
  3. Oczyszczanie hepatocytów
    1. Rozerwij wątrobę, aby uwolnić komórki i przenieś roztwór komórkowy do stożka o pojemności 50 ml z filtrem 70 μm umieszczonym na górze.
    2. Po odwirowaniu zawiesiny komórek o masie 50 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 20 ml 1× PBS. Powtórz ten krok 3 razy. Po ostatnim odwirowaniu zawiesić osad komórkowy za pomocą 5 ml pożywki DMEM/F12.
    3. Delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową z równą objętością 90% roztworu perkolu w probówce o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Po odwirowaniu Percoll mieszanina rozdziela się na trzy odrębne warstwy: górna warstwa (około 0,5-1 ml) zawiera martwe komórki, podczas gdy żywotne hepatocyty są skoncentrowane w dolnej warstwie (około 0,5-0,8 ml) (ryc. 2). Za pomocą tego protokołu zwykle uzyskuje się wydajność 5-8 × 107 żywotnych hepatocytów o żywotności >80%. (Rysunek 3A,B).
    4. Martwe komórki i supernatant należy ostrożnie odessać, unikając energicznego naruszania warstw, a następnie ponownie zawiesić żywe komórki za pomocą 10 ml pożywki DMEM/F12. Wirować przy 50 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić oczyszczone hepatocyty za pomocą 1-5 ml 1× PBS uzupełnionego 2% płodową surowicą bydlęcą do końcowego stężenia 500-1200 komórek/μl.
    6. Wymieszaj hepatocyty i NPC w stosunku ilościowym 1:1, tj. zawiesinę komórkową przygotowano przez zmieszanie 10 000 hepatocytów i 10 000 NPC.
  4. Sekwencjonowanie ScRNA
    UWAGA: Kroki 2.4.1-2.4.3 zostały wykonane zgodnie z instrukcją obsługi zestawu do przygotowania biblioteki ekspresji genów 12′ na bazie kropelek12′. Wykorzystano opartą na kropelkach mikroprzepływową platformę do partycjonowania i kodowania kreskowego pojedynczych komórek, która obejmuje krytyczne etapy generowania żelowych emulsji perełek w żelu (GEM), budowy biblioteki cDNA i sekwencjonowania Illumina zgodnie ze standardowymi protokołami.
    1. Aby wykonać generowanie GEM i kodowanie kreskowe, użyj zawiesiny komórkowej zawierającej 20 000 hepatocytów i NPC. Skuteczność wychwytywania komórek wynosi nie mniej niż 60%.
    2. W celu amplifikacji cDNA oczyść próbki po GEM-RT zgodnie z instrukcją obsługi12.
    3. Budowa biblioteki
    4. Sekwencjonowanie jednokomórkowych bibliotek RNA przy użyciu platformy sekwencjonowania w celu uzyskania głębokości 150 Gb na próbkę; Demultipleksuj nieprzetworzone pliki wywołań podstawowych do plików FASTQ przy użyciu narzędzia Cell Ranger (wersja 8.0.0).
    5. Dopasuj pliki FASTQ do genomu Ictidomys tridecemlineatus (akces NCBI: GCF_016881025.1) w celu ilościowej oceny ekspresji, kończąc eksperymentalny przepływ pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Badanie histologiczne przeszczepów przechowywanych w temperaturze 4 °C przez 24 godziny i przeszczepionych do DGS wykazało normalną architekturę zrazików wątroby z minimalnymi objawami zapalenia, martwicy lub cholestazy w 3 i 6 dniu po operacji, porównywalną z grupą operowaną pozorowaną (ryc. 4A-C).

Izolacja hepatocytów pierwotnych z pooperacyjnego DGS trwa około 1 godziny. Za pomocą opisanego protokołu można uzyskać ponad 5 × 10<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zgodnie z protokołem, który opisuje zachowanie i przeszczepienie wątroby dawcy w systemie bezczynności, opisane tutaj procedury szczegółowo opisują monitorowanie pooperacyjne i dostosowane do potrzeb postępowanie farmakologiczne w przypadku DGS przeszczepionych z wątrobą przechowywaną w chłodni przez co najmniej 24 godziny. Protokół ten umożliwia przeżycie biorcy powyżej 7 dni po przeszczepie, wykazując wyraźną przewagę hibernatorów jako modeli badawczych do konserwacji narządów13,14

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Badanie to było wspierane przez Niezakaźne choroby przewlekłe - Narodowy projekt naukowy i technologiczny (2023ZD0507600), granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82170671, 92254301, 32230048, 82371794, 32301306), Narodowy Program Badawczo-Rozwojowy (2024YFA0916804) oraz Akademik Shusen Lanjuan Talent Foundation Fundacji Edukacyjnej Uniwersytetu Zhejiang.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 i razy; PBSSerwis bioZobacz materiał G4202
10 i razy; PBSSerwis bioKlasa G4207
4% paraformaldehyduOstrze biologiczneBL539A
BuprenorfinaShafei powiedział:H12020276
Kaniula (22 g)BBRAUN4254090B
CefuroksymSelleck powiedział:E4838 powiedział:
Naczynie do hodowli komórkowych (60 mm)GNIAZDO705001
Kolagenaza IVSigma-AldrichZobacz materiał C5138
Rurka stożkowa (15 ml)GNIAZDO601052
Rurka stożkowa (50 ml)GNIAZDO602052
WymazówkaSklep z artykułami gospodarstwa domowego
Countstar Automatyczne liczenie komórekRuiyu powiedział:Hrabia Rygel S2
DMEM/F12Gibico (powiat Gibico)C11330500BT
EGTA (EGTA)Sigma-AldrichE4378 powiedział:
FBS (Sieć UsługowaGibco (firma Gibco)10099-141
Filtr (0,22 μ m)Merck MilliporeSLGP033RB
Filtr (70 μ m)Biologix (Biblioteka Biologiczna15-1070
gentleMACS (Adresy GentleMACS)Miltenyi Miltenyi130-093-235
HBSS (z Ca2+ i Mg2+)Serwis bioKontroler G4204
HBSS (bez Ca2+ i Mg2+)Serwis bioKlasa G4203
Zestaw dysocjacyjny NPCMiltenyi Miltenyi130-096-730
Percoll powiedział:Cytiva (Cytiwa)17-0891-09
Pompa perystaltycznaYuyan powiedział:Zobacz materiał BT100
Przekaźnik RPMI-1640Gibico (powiat Gibico)C11875500BT
SłonySRBZobacz materiał SRB009 powiedział:
SekwenserIluminacja NovaSeq X Plus
Rurki krzemiastyczneTygonE-3603 powiedział:
Szew jedwabnyETYKASA845G
Strzykawka (1 ml)Lige ScienceLG05-124Potrzebna będzie tylko igła strzykawki
Strzykawka (2 ml)Lige ScienceLG05-124Potrzebna będzie tylko beczka ze strzykawką
TakrolimusSelleck powiedział:Zobacz materiał S5003
Pipeta transferowaBiologix (Biblioteka Biologiczna30-0138A1
Alkohol tribromoetylowySigma-AldrichZobacz materiał T48402
Kąpiel wodnaDotacjaSAP2 (Język SAP2)

Bibliografia

  1. Ou, J., et al. IPSCs from a hibernator provide a platform for studying cold adaptation and its potential medical applications. Cell. 173 (4), 851-863 (2018).
  2. Zhang, X., et al. 5-aminolevulinate improves metabolic recovery and cell survival of the liver following cold preservation. Theranostics. 12 (6), 2908-2927 (2022).
  3. Zhang, X., et al. Cold-induced Foxo1 nuclear transport aids cold survival and tissue storage. Nat Commun. 15 (1), 2859(2024).
  4. Zhang, L., et al. Cross-species metabolomic profiling reveals phosphocholine-mediated liver protection from cold and ischemia/reperfusion. Am J Transplant. 24 (11), 1979-1993 (2024).
  5. Chen, L., et al. Synergy of 5-aminolevulinate supplement and cx3cr1 suppression promotes liver regeneration via elevated igf-1 signaling. Cell Rep. 42 (8), 112984(2023).
  6. Arnold, C. Hibernation science harnessed to treat obesity and modify metabolism. Nat Med. 30 (10), 2700-2703 (2024).
  7. Bao, Z., et al. Fatty acid metabolization and insulin regulation prevent liver injury from lipid accumulation in Himalayan marmots. Cell Rep. 42 (7), 112718(2023).
  8. Carey, H. V., Andrews, M. T., Martin, S. L. Mammalian hibernation: Cellular and molecular responses to depressed metabolism and low temperature. Physiol Rev. 83 (4), 1153-1181 (2003).
  9. Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-c14. J Exp Med. 94 (5), 431-453 (1951).
  10. Shen, L., Hillebrand, A., Wang, D. Q., Liu, M. Isolation and primary culture of rat hepatic Cells. J Vis Exp. (64), e3917(2012).
  11. Breuer, E., Humar, B. Isolation of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. J Vis Exp. (190), e64493(2022).
  12. User guides. , X Genomics. https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1725314293/support-documents/CG000731_ChromiumGEM-X_SingleCell3v4_UserGuide_RevB.pdf (2024).
  13. Hadj-Moussa, H., Storey, K. B. Bringing nature back: Using hibernation to reboot organ preservation. FEBS J. 286 (6), 1094-1100 (2019).
  14. Ratigan, E. D., McKay, D. B. Exploring principles of hibernation for organ preservation. Transplant Rev (Orlando). 30 (1), 13-19 (2016).
  15. Merriman, D. K., Lahvis, G., Jooss, M., Gesicki, J. A., Schill, K. Current practices in a captive breeding colony of 13-lined ground squirrels (Ictidomys tridecemlineatus). Lab Anim (NY). 41 (11), 315-325 (2012).
  16. Vaughan, D. K., Gruber, A. R., Michalski, M. L., Seidling, J., Schlink, S. Capture, care, and captive breeding of 13-lined ground squirrels, Spermophilus tridecemlineatus. Lab Anim (NY). 35 (4), 33-40 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

S cza ziemia Dauriafunkcjonalna regeneracja przeszczepuimmunokompatybilnokonserwacja w niskiej temperaturzeopieka pooperacyjnamonitorowanie fizjologiczneprofilowanie transkryptomicznebadanie histopatologiczne

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.