Pobieranie płynu do płukania nosa dla myszy bez zanieczyszczenia krwi

Zarówno w badaniach klinicznych, jak i podstawowych, odpowiednie metody pobierania próbek są najważniejsze dla oceny wyników. Płukanie nosa to technika irygacji stosowana do analizy składników komórkowych i humoralnych w drogach oddechowych^1,2,3. Klinicznie płyn z płukania nosa (NLF) został wykorzystany jako skuteczna nieinwazyjna próbka do odkrywania biomarkerów, z kilkoma badaniami potwierdzającymi jego zastosowanie w różnych chorobach układu oddechowego, w tym zapaleniu zatok, mukowiscydozie i ogólnych zaburzeniach układu oddechowego^4,5,6,7. U zwierząt doświadczalnych NLF został również wykorzystany do badania modeli chorób układu oddechowego, w tym grypy, choroby koronawirusowej-2019 (COVID-19) i choroby alergicznej^3,8,9. Metoda ta jest szeroko stosowana do określania kluczowych biomarkerów stanu zapalnego, takich jak komórki wielojądrzaste i cytokiny, które są często badane jako wskaźniki odpowiedzi na alergeny, astmę i infekcje dróg oddechowych^10,11,12. Ostatnio, w celu zbadania skuteczności i bezpieczeństwa potencjalnych kandydatów na szczepionki donosowe, próbki NLF były często pobierane od zwierząt doświadczalnych, a poziomy patogenu i immunoglobuliny (Ig) w próbkach NLF zostały określone ilościowo jako wskaźniki¹³.

U myszy eksperymentalnych, NLF może być pobierany metodą przezgardłową lub transtchawiczą. W metodzie przezgardłowej mysia głowa, w tym obszar podniebienno-gardłowy, została oddzielona od krtani, a następnie przez otwór gardłowy wprowadzono cewnik do choany w celu wstrzyknięcia soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i pobrania NLF z nozdrza¹⁴. Metoda transtchawicza pozwoliła uzyskać dostęp do dróg oddechowych przez tchawicę bez odcinania głowy, a NLF pobrano z nozdrza, minimalizując ryzyko zanieczyszczenia krwi. Chociaż te dwie podstawowe metody zostały zastosowane do zbierania NLF u myszy eksperymentalnych, obie konwencjonalne metody mają swoje własne ograniczenia. Wykazano, że metoda przeztchawicza daje mniejsze ilości NLF niż metoda przezgardłowa ze względu na wyciek płynu z płukania przez tchawicę do jamy ustnej. Poprzednie badanie wykazało, że po wstrzyknięciu PBS odzyskane objętości płynów w NLF wynosiły 70%-80% i 90%-100% odpowiednio w metodzie transtchawiczej i przezgardłowej¹⁴. Chociaż metoda przezgardłowa może być uważana za lepszą przy większych ilościach NLF niż metoda przeztchawicza, zanieczyszczenie krwi podczas zabiegu było do pewnego stopnia nieuniknione^14,15. Podobnie, kilka badań wykazało, że próbki NLF były często zanieczyszczone wysokim poziomem białek w surowicy krwi^16,17,18. Może to zakłócać wykrywanie i kwantyfikację specyficznych dla NLF biomarkerów chorób układu oddechowego¹⁹. Może to również wpływać na stężenia Ig, zwłaszcza IgA i IgG, w próbkach NLF, ponieważ krew zawiera większe ilości IgA i IgG niż NLF.

Aby sprostać tym wyzwaniom, to badanie miało na celu stworzenie unikalnej, prostej i niezawodnej metody przezgardłowej do pobierania próbek NLF od myszy eksperymentalnych, maksymalizując wydajność próbek i minimalizując zanieczyszczenie krwi. Podczas procesów eksperymentalnych waciki umieszczono w ustach myszy w celu zahamowania zanieczyszczenia krwi, a następnie wstrzyknięto PBS w celu pobrania próbek NLF z nozdrza. Poziomy zanieczyszczenia krwi w NLF określono za pomocą techniki kryminalistycznej, chemiluminescencji opartej na luminolach, która umożliwia częściową kwantyfikację poziomów hemoglobiny (Hb) w próbkach NLF; reakcja luminolu w NLF zebrana nową metodą była ujemna. W związku z tym obecna nowatorska metoda może poprawić jakość próbki NLF w różnych eksperymentach biologicznych, takich jak testy immunoenzymatyczne (ELISA), profile cytokin, oznaczanie biomarkerów immunologicznych i medycznych oraz modele chorób układu oddechowego u myszy.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Wydziału Medycyny Uniwersytetu Kindai i przeprowadzone zgodnie z kryteriami określonymi przez National Institutes of Health (NIH)²⁰. W tym badaniu wykorzystano 4-miesięczne samce myszy C57BL/6. Informacje o odczynnikach i sprzęcie użytym w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Kolekcja NLF

1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą 5% izofluranu^{21 zgodnie z} instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami.
2. Połóż mysz na plecach na płytce chirurgicznej i przymocuj ją, przytrzymując wszystkie cztery kończyny.
3. Pobrać krew z serca za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml.
4. Otwórz jamę brzuszną za pomocą nożyczek, aby odsłonić narządy trzewne i przeponę.
5. Naciąć przeponę i żebra za pomocą nożyczek, aby zobaczyć prawy przedsionek.
6. Nakłuj prawy przedsionek nożyczkami, aby dalej usunąć krew.
7. Umieść trzy waciki w pysku zwierzęcia, ciągnąc za język.
8. Oddziel dolną szczękę za pomocą nożyczek, jednocześnie podnosząc głowę (pozycja nosem do góry), aby zahamować zanieczyszczenie krwi w NLF.
9. Wymień waciki na nowe, aby uniknąć zanieczyszczenia krwi.
10. Po ustaniu krwawienia wstrzyknąć 200 μl sterylnego PBS do choany i zebrać NLF wyrzucony z nozdrzy do probówki o pojemności 1,5 ml.
11. Powtórz krok 1.10 jeszcze raz.

2. Wykrywanie zanieczyszczenia krwi przez chemiluminescencję luminolu

1. Rozpuścić 1 mg luminolu i 5 mg nadtlenku sodu (Na_2O2) w 1 ml sterylnej wody, używając probówki o pojemności 1,5 ml do przygotowania roztworu podstawowego.
   UWAGA: Końcowe stężenie wynosi 1 mg/ml luminolu i 5 mg/ml Na₂O₂.
2. Przykryj probówkę folią aluminiową i przechowuj ją w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
3. Rozcieńczyć roztwór podstawowy 10-krotnie wodą dejonizowaną, aby uzyskać roztwór roboczy.
   UWAGA: Końcowe stężenie wynosi 0,1 mg/ml luminolu i 0,5 mg/ml Na₂O₂.
4. Pobrać pipetę z 2 μl próbek NLF do studzienek na płytce 96-dołkowej.
5. Dodać 100 μl rozcieńczonego roztworu luminolu do każdej studzienki.
6. Krótko wstrząsnąć płytką 96-dołkową, aby wymieszać próbki z roztworem luminolu.
7. Bezpośrednio obserwuj chemiluminescencję luminolu w ciemności.
8. W razie potrzeby częściowo określić ilościowo stężenie Hb za pomocą luminometru.

3. Kwantyfikacja IgA i IgG za pomocą testów ELISA

1. Pokryj studzienki 96-dołkowe płytkami 100 μl / basenik całkowitego przeciwciała anty-mysiego IgA (20 ng / basenik; 200 ng / ml) lub IgG (10 ng / basenik; 100 ng / ml) (patrz tabela materiałów).
2. Uszczelnić płytki i inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc.
3. Umyj płytki trzykrotnie 300 μl/studzienkę buforu myjącego zawierającego 0,05% Tween 20 w PBS za każdym razem, a następnie osusz płytki na ręcznikach papierowych.
4. Do każdej studzienki dodać 200 μl rozcieńczalnika do oznaczania zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 0,2% Tween 20 w PBS.
5. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej (RT) przez 60 minut.
6. Zassać rozcieńczalnik do oznaczania, a następnie osuszyć płytki na ręcznikach papierowych.
7. Przygotować 100 ng/ml mysiego wzorca IgA lub IgG z rozcieńczalnikiem do oznaczania i wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia: 50 ng/mL, 25 ng/mL, 12,5 ng/mL, 6,25 ng/ml, 3,13 ng/mL, 1,56 ng/ml i 0,78 ng/mL.
   UWAGA: Wymagana objętość każdego wzorca wynosi 100 μl na studzienkę.
8. Rozcieńczyć próbki rozcieńczalnikiem do oznaczania w odpowiednich rozcieńczeniach: surowicy (10⁴ do 10⁶), NLF (10, 50, 200 i 500) i BALF (10¹ do 10⁴).
   UWAGA: Wymagana objętość każdej próbki wynosi 100 μl na studzienkę.
9. Dodać 100 μl wzorców IgA lub IgG i próbek do odpowiednich studzienek.
10. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 75 minut.
11. Umyj płytki trzykrotnie 300 μl/studzienkę buforu myjącego za każdym razem, a następnie osusz płytki na ręcznikach papierowych.
12. Rozcieńczyć sprzężone z peroksydazą przeciwciało anty-mysie F(ab')₂ (patrz tabela materiałów) rozcieńczalnikiem do oznaczania w odpowiednim rozcieńczeniu: 10^4-krotne rozcieńczenie.
    UWAGA: Wymagana objętość to 100 μl na studzienkę.
13. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała anty-mysiego F(ab')₂ sprzężonego z peroksydazą do każdej studzienki.
14. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 75 minut.
15. Umyj płytki pięciokrotnie za każdym razem 300 μl/dołek buforu myjącego, a następnie osusz płytki na papierowych wieżach.
16. Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu substratu zawierającego tetrametylobenzydynę (TMB) i nadtlenek wodoru.
17. Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
18. Dodać 50 μl roztworu zatrzymującego, 2 N kwasu siarkowego (2N_H2SO4) do każdego dołka.
19. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
20. Określić stężenia IgA i IgG w każdej próbce, wykorzystując krzywe wzorcowe.

Korzystając z konwencjonalnej lub nowatorskiej metody, próbki NLF zostały pobrane od myszy C57BL/6 drogą przezgardłową. Jak pokazano na rysunku Rysunek 1, próbki NLF pobrane metodą konwencjonalną były lekko zabarwione na różowo (Rysunek 1A); próbki NLF pobrane nową metodą były czyste (Rysunek 1B). Ponieważ różnica wydawała się wynikać z zanieczyszczenia krwi w próbkach NLF metodą konwencjonalną, zanieczyszczenie krwi w próbkach NLF badano za pomocą reakcji luminolu. Jak pokazano na Rysunek 2, chemiluminescencja w próbkach NLF pobranych metodą konwencjonalną była dodatnia, co wskazuje na zanieczyszczenie krwi (Rysunek 2A). Z drugiej strony, chemiluminescencja w próbkach NLF pobranych nową metodą była ujemna (Rysunek 2B). Aby zaprzeczyć prawdopodobnym tendencjom do krwawień u myszy, pobrano również płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) przy użyciu standardowej metody transtchawiczej; próbka BALF nie miała zanieczyszczenia krwi. Wyniki te pokazały, że nowatorska metoda zbierania NLF była lepsza od konwencjonalnej.

Aby ustalić, czy zanieczyszczenie krwi w próbkach NLF może wpływać na stężenia IgA i IgG, poziomy IgA i IgG w surowicach i NLF zostały określone ilościowo za pomocą testów ELISA. Jak pokazano na Rysunek 3, poziomy IgA i IgG w surowicy były podobne między tymi dwiema metodami; stężenia zarówno IgA (Figura 3A), jak i IgG (Figura 3B) były znacznie wyższe w surowicach niż w NLF. Poziomy IgA w próbkach NLF były zwykle niższe w nowej metodzie niż w metodzie konwencjonalnej (P < 0,1, test t-Studenta); stężenia IgG w próbkach NLF były istotnie niższe w nowej metodzie niż w metodzie konwencjonalnej (P < 0,05, test t Studenta). W związku z tym zanieczyszczenie krwi metodą konwencjonalną wydaje się dawać niedokładne stężenia przeciwciał IgA i IgG w próbkach NLF; Nowatorska metoda była bardziej precyzyjna niż metoda konwencjonalna.

Rysunek 1: Pobieranie płynu z płukania nosa (NLF) metodą konwencjonalną lub nowatorską. (A) W metodzie konwencjonalnej NLF został zanieczyszczony krwią, a kolor próbki NLF stał się bladoróżowy. (B) W nowej metodzie nie stwierdzono zanieczyszczenia krwi w NLF. Panie przewodniczący, panie i panowie! W obu grupach płyn z popłuczyn oskrzelowo-pęcherzykowych (BALF) pobrany drogą przeztchawiczą był klarowny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zanieczyszczenie krwi wykryte przez reakcję luminolu. Panie przewodniczący, panie i panowie! Dwie μl próbek NLF i BALF dodano do 96-dołkowej płytki i zmieszano ze 100 μl rozcieńczonego roztworu luminolu. Niebiesko-biały sygnał chemiluminescencji wykryto w zanieczyszczonej próbce NLF pobranej metodą konwencjonalną (A), ale niewykrywalny w próbce NLF pobranej nową metodą (B). Próbki krwi i BALF wykorzystano odpowiednio jako kontrolę pozytywną i ujemną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kwantyfikacja stężeń IgA i IgG w próbkach surowicy, NLF i BALF za pomocą testów immunoenzymatycznych (ELISA). (A,B) NLF pobrano od myszy przy użyciu metody konwencjonalnej (open bar) i novel (closed bar); surowice i BALF zostały również zebrane od tych samych myszy. Stężenia IgA i IgG określono ilościowo za pomocą testu ELISA. Próbki surowicy miały znacznie wyższe poziomy IgA i IgG niż próbki NLF i BALF. W NLF stężenia IgA były zwykle niższe, a stężenia IgG były istotnie niższe w nowej metodzie niż w metodzie konwencjonalnej (IgA, P < 0,1; IgG, P < 0,05, test t-Studenta). Wyniki są średnią + błąd standardowy średniej z sześciu myszy na grupę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.