Protokół ten umożliwia wyizolowanie wystarczającej liczby chondrocytów pierwotnych w ciągu 6-8 godzin, ułatwiając dalsze dogłębne badania biologii chrząstki i mechanizmów chorób chrząstki.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Izolacja in vitro i hodowla pierwotnych chondrocytów myszy w biologii chrząstki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zniszczenie chrząstki stawowej prowadzi do zmienionej aktywności chondrocytów, która jest głównym czynnikiem sprawczym w różnych chorobach chrząstek, w tym chorobie zwyrodnieniowej stawów (OA) i reumatoidalnym zapaleniu stawów (RZS). Ze względu na to, że chondrocyty są najliczniejszym typem komórek w chrząstce, dogłębne badanie właściwości biologicznych chondrocytów jest niezbędne do opracowania skutecznych strategii leczenia choroby. Izolacja i hodowla pierwotnych chondrocytów dostarczają ważnego materiału doświadczalnego do badania chorób chrząstki i przyczyniają się do rozwikłania mechanizmów uszkodzenia i naprawy chrząstki. Protokół ten zawiera szczegółowy opis metod izolacji i hodowli in vitro pierwotnych chondrocytów pochodzących od myszy. Dzięki zastosowaniu zoptymalizowanego protokołu kolagenazy II, izolację chondrocytów można zakończyć w ciągu 8 godzin w przypadku próbek chrząstki stawu kolanowego noworodków myszy. Wydajność komórek wynosi około 1-2 × 10³ komórek/mg tkanki chrzęstnej, zmieniając się w zależności od świeżości tkanki i początkowej gęstości komórek; Wyizolowane komórki wykazują żywotność >90%. W protokole tym jako przykładzie użyto pierwotnych chondrocytów myszy, pokazując cechy morfologiczne i status adhezji komórek hodowanych przez 1, 2 i 5 dni po izolacji. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) i western blot wykazały, że leczenie interleukiną-1β (IL-1β) zmniejszyło ekspresję kolagenu typu II alfa 1 (Col2a1) i zwiększyło ekspresję metallopeptydazy macierzy 13 (Mmp13), potwierdzając, że izolowane chondrocyty reagują na bodźce zapalne. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami, protokół ten wykorzystuje wyższe stężenie kolagenazy, aby zmniejszyć wpływ przedłużonego czasu izolacji na żywotność komórek, jednocześnie unikając potencjalnego uszkodzenia komórek w wyniku leczenia trypsyną. Uzyskane chondrocyty pierwotne są czyste i żywotne, nadają się do dogłębnych badań nad mechanizmami związanymi z uszkodzeniem chrząstki, które mają ważne implikacje dla badań in vitro i klinicznego leczenia chorób chrząstki.
Wprowadzenie
Niszczenie chrząstki stawowej jest główną przyczyną różnych chorób chrząstek, takich jak choroba zwyrodnieniowa stawówi RZS 1,2. Chondrocyty, dominujący typ komórek w chrząstce, są niezbędne do utrzymania homeostazy i ułatwienia naprawy w odpowiedzi na uraz3. Zmiany w aktywności chondrocytów nie tylko wpływają na integralność strukturalną chrząstki, ale także wywołują reakcje zapalne i postępującą degenerację tkanek4. Dlatego dogłębne badanie właściwości biologicznych chondrocytów ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia etiopatogenezy tych chorób.
W ostatnich latach coraz więcej uwagi poświęca się roli chondrocytów w reakcjach zapalnych. Badania wykazały, że cytokiny zapalne, takie jak IL-1β i czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α), znacznie upośledzają procesy metaboliczne chondrocytów, powodując zwiększoną ekspresję enzymów rozkładających macierz i zmniejszoną syntezę macierzy 5,6,7. Zmiany te ostatecznie prowadzą do stopniowej degeneracji dysfunkcji chrząstki i stawów. W związku z tym szczególnie konieczne stało się badanie biologicznych zmian chondrocytów w warunkach patologicznych w modelach in vitro. Opierając się na tradycyjnej dwuwymiarowej (2D) hodowli jednowarstwowej, najnowsze postępy w trójwymiarowej (3D) hodowli chondrocytów i technologiach organoidowych są coraz częściej stosowane w badaniach związanych z chrząstkami. Te udoskonalone systemy oferują bardziej fizjologicznie istotne mikrośrodowisko i dostarczają cennych informacji na temat zachowania chondrocytów w kontekście choroby8.
Wybór źródła komórkowego ma decydujące znaczenie dla tego, czy wyniki badań in vitro dokładnie oddają patofizjologię stawów. W przeciwieństwie do unieśmiertelnionych linii chondrocytów lub eksplantatów chrząstek, pierwotne chondrocyty zachowują natywne tło genetyczne, mechanowrażliwe szlaki sygnałowe wapnia i stabilność fenotypową chrząstki stawowej, wykazując w ten sposób lepszą zdolność chondrogenną i zachowania biologiczne, które bardziej odzwierciedlają te z komórek chrząstki rezydentnej9. Udokumentowano systematyczne różnice w źródłach sygnalizacji wapniowej oraz kluczowych kanałach jonowych i dalszych szlakach między pierwotnymi chondrocytami a liniąkomórkową ATDC5 10. W związku z tym, badając fizjologię lub patologię stawów, pierwszorzędowe chondrocyty powinny być traktowane priorytetowo. Dlatego optymalizacja izolacji i hodowli pierwotnych chondrocytów jest niezbędna do dokładnego modelowania biologii związanej z chorobą i badania potencjalnych leków terapeutycznych 11,12,13,14,15. Niemniej jednak istniejące metody zagrażają żywotności komórek lub integralności fenotypu z powodu przedłużonego trawienia16,17.
W tym miejscu opisujemy protokół izolacji in vitro i hodowli pierwotnych chondrocytów pochodzących z tkanki chrzęstnej myszy, która szybko daje wystarczającą ilość komórek. W porównaniu z konwencjonalnymi protokołami przedłużonego trawienia o niskim stężeniu enzymów, badanie to zoptymalizowało warunki trawienia enzymów i etapy wstępnej obróbki tkanek. Ta optymalizacja znacznie skróciła czas trawienia do 6-8 godzin, unikając jednocześnie potencjalnego uszkodzenia komórek w wyniku leczenia trypsyną15,17. Stosując tę metodę, można uzyskać około 1-2 × 103 chondrocytów z każdego mg tkanki chrzęstnej myszy. Protokół ten stanowi wiarygodny przewodnik do izolowania i hodowli pierwotnych chondrocytów in vitro, zapewniając solidny model do badań nad chorobami chrząstki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Xi'an Honghui (nr 202309009), a procedury eksperymentalne ściśle przestrzegały zasad 3R dotyczących zastępowania, zmniejszania i udoskonalania w eksperymentach na zwierzętach.
Rysunek 1A przedstawia schematyczny schemat przygotowania odczynników i sprzętu. Tabela materiałów zawiera informacje o odczynnikach i sprzęcie użytym w tym protokole.
1. Myszy eksperymentalne
UWAGA: W tym badaniu wykorzystano cztery 3-dniowe myszy C57BL / 6J typu dzikiego.
- Utrzymuj klatki w stałej temperaturze 25 °C ± 2 °C i wilgotności 50%-60%, z cyklem 12 godzin/12 godzin światła/ciemności. Zapewnij sterylną dietę myszy wolną od specyficznych patogenów (SPF) (sterylizowaną promieniowaniem 60Co) i sterylną wodę ad libitum.
- Zbierz chrząstkę stawu kolanowego (~ 10 mg / mysz) od czterech 3-dniowych myszy post mortem , aby wyizolować pierwotne chondrocyty.
2. Pobieranie i przetwarzanie próbek chrząstki
- Przetwarzanie na myszach i preparowanie tkanek
- Poddaj eutanazji nowonarodzone myszy w ciągu 3 dni po urodzeniu. Wysterylizuj powierzchnię ciała, przecierając 75% alkoholem medycznym.
- Odizoluj stawy kolanowe myszy za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych. Umieść je w sterylnym 1x PBS.
- Ostrożnie wyciąć mięśnie, kości, błonę maziową i inne proliferacyjne tkanki łączne otaczające staw kolanowy za pomocą sterylnych narzędzi chirurgicznych. Zachowaj tylko tkankę chrzęstną stawu kolanowego.
- Przepłukać próbki tkanek 3x sterylnym 1x PBS. Wylej płyn.
UWAGA: Rysunek 1B ilustruje uproszczony schemat ideowy pozyskiwania i wstępnego przetwarzania tkanki chrzęstnej.
Rysunek 1: Uproszczony proces przygotowania materiału i przetwarzania próbek chrząstek. (A) Schemat ideowy konfiguracji odczynników i sprzętu, w tym odczynników, materiałów eksploatacyjnych i głównych instrumentów. (B) Protokół krok po kroku do przetwarzania tkanek chrzęstnych ze stawów kolanowych myszy. Skróty: PBS = sól fizjologiczna buforowana fosforanami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
3. Izolacja i hodowla chondrocytów pierwotnych
- Przenieś izolowaną tkankę chrzęstną do nowej 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego nr 11 zmiel tkankę na małe kawałki o wielkości około 0,25mm3 . Spłukać raz wstępnie schłodzonym sterylnym 1x PBS. Wylej płyn.
- Dodać 2 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) roztworu wytrawiającego zawierającego kolagenazę II o wysokim stężeniu (25 mg/ml, rozpuszczoną w sterylnym roztworze podstawowym Dulbecco's Modified Eagle Media/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12]) w celu pokrycia bloku tkankowego.
- Inkubować płytkę do hodowli komórkowej w zwilżonym inkubatorze z 5% stężeniemCO2 w temperaturze 37 °C przez 15 minut w celu przeprowadzenia trawienia enzymatycznego. Po inkubacji wyrzucić płyn.
- Powtórz kroki 3.2 i 3.3.
UWAGA: Trawienie enzymatyczne o wysokim stężeniu jest krokiem wstępnym. Ma na celu wstępne trawienie tkanki, częściowe rozbicie jej struktury w celu lepszego późniejszego trawienia i usunięcie zrostów macierzy, które mogą istnieć w wyniku cięcia z obwodu tkanki. - Dodać 2 ml podgrzanego (37 °C) roztworu wytrawiającego zawierającego kolagenazę II o niskim stężeniu (5 mg/ml, rozpuszczoną w sterylnym podłożu podstawowym DMEM/F12) w celu pokrycia bloku tkankowego.
- Inkubować płytkę do hodowli komórkowej w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 6-8 godzin w celu roztrawienia i obserwować postęp separacji komórek. Od czasu do czasu wykonuj powolne wytrząsanie poziome (80-120 obr./min) lub delikatne pipetowanie, aby zwiększyć wydajność lizy.
UWAGA: W przypadku tkanki noworodka myszy uwalnianie komórek jest widoczne po około 3 godzinach, przy czym pełna izolacja jest osiągalna między 6 a 8 godzin. Podczas trwającej 6-8 godzin kuracji kolagenazą II należy obserwować lizę co godzinę i zakończyć trawienie, gdy gołym okiem nie widać żadnych widocznych fragmentów tkanki, a 90% komórek jest wolnych i w zawiesinie pod mikroskopem. Podczas procesu trawienia pod mikroskopem optycznym można zaobserwować stopniowe odklejanie się chondrocytów przypominających wakuolę od masy tkanki chrzęstnej. Ten krok można powtórzyć kilka razy, aby zminimalizować uszkodzenia chondrocytów spowodowane długotrwałym trawieniem, a roztwór trawiący można zastąpić świeżym roztworem do trawienia kolagenazy II o niskim stężeniu, aby zwiększyć wydajność komórek. - Przefiltrować wszystkie produkty wytrawiania przez sitko o pojemności 100 μm do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
UWAGA: Użyj sitka do komórek 100 μm, aby zapobiec utracie agregatów chondrocytów i zwiększyć wydajność. Resztkowe fragmenty tkanek są usuwane podczas wymiany pożywki. - Przepłukać płytkę do hodowli komórkowej sterylnym 1x PBS. Ponownie przefiltrować przez sitko do komórek.
- Zebrać cały filtrat z poprzedniego kroku w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonym hamulcu. Po odwirowaniu odrzucić supernatant.
- Dodać 2 ml sterylnego 1x PBS i delikatnie zawiesić osad, lekko i zasysając pipetą. Przenieść do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonym hamulcu. Po odwirowaniu odrzucić supernatant.
- Zawiesić osad z kroku 4.10 za pomocą 2 ml świeżo przygotowanej sterylnej kompletnej pożywki DMEM/F12, która zawiera 15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% P/S. Proszę oznaczyć zawiesinę pobranych komórek za pomocą hemocytometru, a następnie umieścić komórki w sterylnym naczyniu hodowlanym o średnicy 10 cm w temperaturze 2-2,5 × 105 komórek/cm2. Uzupełnić do końcowej objętości 10 ml kompletną pożywką.
UWAGA: Gęstość wysiewu chondrocytów powinna wynosić 2-2,5 × 105 komórek/cm2, ponieważ wysiew o niskiej lub średniej gęstości może prowadzić do fenotypowego przesunięcia chondrocytów stawowych w kierunku fibroblastów. Aktywność proliferacyjną i żywotność wyizolowanych komórek pierwotnych można ocenić za pomocą opcjonalnych testów MTT lub barwienia wykluczającego błękitem trypanowym (krok opcjonalny). - Inkubować w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
- Zastąp świeżą kompletną pożywką DMEM/F12 (zawierającą 10% FBS, 1% P/S) po zaobserwowaniu, że komórki całkowicie przylegają do ściany pod mikroskopem optycznym.
- Zmieniaj podłoże co 2 dni. Kontynuuj hodowlę, aż zbieg osiągnie 70%, w którym to momencie można przeprowadzić kolejne eksperymenty.
UWAGA: Stężenie surowicy w pożywce hodowlanej można zwiększyć do 15% w zależności od stanu komórek. Rysunek 2 ilustruje uproszczony schemat trawienia, izolacji i hodowli komórek pierwotnych w tkance chrzęstnej.
Rycina 2: Uproszczona procedura trawienia tkanki chrzęstnej, pierwotnej izolacji komórek i hodowli. Chrząstkę mielono i trawiono w sposób ciągły roztworem do wytrawiania kolagenazy II o wysokim stężeniu przez 15 minut, powtórzono raz, a następnie trawiono roztworem do wytrawiania kolagenazy II o niskim stężeniu przez 6-8 godzin w celu wyizolowania komórek. Strawioną tkankę następnie przefiltrowano, a filtrat pobrano i odwirowano. Osad komórkowy przemyto 1x PBS i hodowano w pożywce DMEM/F12 aż do osiągnięcia konfluencji 70%, w którym to momencie komórki były gotowe do kolejnych eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
4. Weryfikacja funkcjonalna chondrocytów pierwotnych
- Metabolizm i zmiany chondrocytów w stanach zapalnych.
- Traktuj komórki 10 ng / ml IL-1β przez 24 godziny, aby symulować stany zapalne.
- W przypadku RT-qPCR i western blotting należy wyekstrahować całkowite RNA lub białko całkowite, aby wykryć wskaźniki metaboliczne macierzy zewnątrzkomórkowej chondrocytów, takie jak COL2A1, MMP13.
UWAGA: Rysunek 3 ilustruje schematyczny schemat walidacji funkcjonalnej pierwotnych chondrocytów i późniejszych procedur eksperymentalnych. Informacje o przeciwciałach znajdują się w Tabeli materiałów. Szczegółowe procedury dotyczące western blotting i RT-qPCR przedstawiono w Tabeli 1, Tabeli 2, Tabeli 3, Tabeli 4 i Tabeli 5. Wszystkie metody były zgodne ze standardowymi protokołami11,18.
Rysunek 3: Schemat ideowy programu walidacji funkcjonalnej pierwotnych chondrocytów. Stany zapalne wywołane leczeniem IL-1β; wpływ na fenotypy związane z chrząstką oceniany za pomocą RT-qPCR i Western blot. Skróty: IL-1β = interleukina-1β; RT-qPCR = ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
| Warunki pracy Western Blotting | |
| Krok | Stan / Odczynnik |
| Preparat żelu SDS-PAGE | 8 % (m/v) żel separujący Tris-HCl |
| Elektroforeza układania w stosy | 80 V, 30–40 min |
| Rozdzielczość elektroforezy | 120 V, 1–1,5 h |
| Przelać | Półsuche, 15 V, 30–60 min |
| Blokowanie | Bufor szybko blokujący, 2 h w temperaturze pokojowej |
Tabela 1: Warunki pracy z Western blot. Podsumowanie warunków western blot, w tym skład SDS-PAGE, parametry elektroforezy, ustawienia transferu i procedura blokowania.
| Mieszanina reakcji odwrotnej transkrypcji | |
| Składnik | Objętość (μL) |
| 5× Bufor reakcji odwrotnej transkryptazy transkryptora | 4 |
| Mieszanka deoksynukleotydów ( 10 mM każdy) | 2 |
| Inhibitor RNazy Protector (40 U/μL) | 0.5 |
| Odwrotna transkryptaza transkryptora (20 U/μL) | 0.5 |
| Woda wolna od nukleaz | do 20 |
| Całkowita objętość | 20 |
Tabela 2: Mieszanina reakcji odwrotnej transkrypcji. Kompozycja reakcji odwrotnej transkrypcji do syntezy cDNA.
| Informacje o starterze dla RT-qPCR pierwszorzędowego chondrocytu myszy | ||||
| Nazwa genu | Sekwencja(5'3 ') | Temperatura wyżarzania (°C) | ||
| mGapdh powiedział: | Naprzód | TGGCCTTCCGTGTTCCTAC powiedział: TGGCCTTGTGTGTTCCTAC powiedział: | 60 | |
| Rewers | GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA | |||
| mCol2a1 powiedział: | Naprzód | TGACCTCAACTACATGGTCTACA powiedział: | 60 | |
| Rewers | CTTCCCATTCTCGGCCTTG powiedział: | |||
| mMmp13 powiedział: | Naprzód | CTTCTTCTTGTTGAGCTGGACTC powiedział: | 60 | |
| Rewers | CTGTGGAGGTCACTGTAGACT | |||
Tabela 3: Informacje o starterze dla RT-qPCR pierwotnego chondrocytu myszy. Sekwencje i temperatura wyżarzania (60 °C) starterów stosowanych do ilościowego oznaczania transkryptów Gapdh, Col2a1 i Mmp13 w pierwotnych chondrocytach myszy.
| Mieszanina reakcyjna RT-qPCR | |
| Składnik | Objętość (μL) |
| 2 × SYBR Zielony qPCR Master Mix | 10 |
| Rozcieńczona matryca cDNA | 8 |
| Podkład do przodu (10 μM) | 1 |
| Podkład odwrotny (10 μM) | 1 |
| Całkowita objętość | 20 |
Tabela 4: Mieszanina reakcyjna RT-qPCR. Mieszanina reakcyjna RT-qPCR (20 μl) z mieszanką wzorcową SYBR Green, matrycą i starterami.
| Protokół cykliczny RT-qPCR | ||
| Krok | Temperatura (°C) | Godzina |
| Początkowa denaturacja (×1) | 95 | Czas trwania: 10 min |
| Denaturacja (×40) | 95 | 5 sekund |
| Wyżarzanie/przedłużanie (×40) | 60 | 15 sekund |
| Rozszerzenie (×40) | 72 | 30 sekund |
| Krzywa topnienia (×1) | 95 55 95 | 60 s 30 s 30 s |
Tabela 5: Protokół cykliczny RT-qPCR. Przez 40 cykli przeprowadzono denaturację w temperaturze 95 °C przez 5 s, wyżarzanie/wydłużanie w temperaturze 60 °C przez 15 s oraz końcową analizę krzywej topnienia.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Jak opisano na rycinie 1, rycinie 2 i rycinie 3, przeprowadziliśmy protokół i z powodzeniem wyizolowaliśmy pierwotne chondrocyty ze stawów kolanowych myszy. Z około 10 mg nowonarodzonej chrząstki myszy uzyskaliśmy około 1 × 104 komórek o żywotności >90%. W pierwszym dniu hodowli in vitro pierwotne chondrocyty myszy wykazywały zaokrągloną morfologię, przy czym większość komórek była zawieszona ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Izolacja i hodowla pierwotnych chondrocytów są niezbędne do wyjaśnienia patofizjologii chorób chrząstki22. W pierwotnej hodowli chondrocytów optymalizacja stężenia kolagenazy i czasu trawienia ma kluczowe znaczenie, ponieważ równoważy degradację macierzy zewnątrzkomórkowej, jednocześnie zmniejszając potencjalne uszkodzenie komórek17. W niniejszym artykule opisujemy niezawodną i powtarzalną metodę izolowania pierwotnych chondrocytów z tkanek chrząstki myszy. Stosując tę meto...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Prace te były wspierane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 82370909). Rysunki 1, 2 i 3 zostały utworzone za pomocą narzędzia Figdraw.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1 i razy; PBS w proszku (2 l) | Serwis bio | G0002-2L | |
| Szalki do hodowli komórkowych 100 mm | Serwis bio | Przetwornik CCD-100 | |
| 100 μ m sito komórkowe | Sangon Biotechnologia | F613463-0001 | |
| Stożkowa probówka wirówkowa 15 ml (sterylna, bez enzymów) | Serwis bio | EP-1501-J | |
| Stożkowa probówka wirówkowa 50 ml (sterylna, bez enzymów) | Serwis bio | EP-5001-J | |
| 6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej | Serwis bio | CCP-6H | |
| Królicze przeciwciało poliklonalne anty-COL2A1 | Droga immunologiczna | YT1022 powiedział: | Przeciwciała pierwszorzędowe; Kąt obrotu: 1/500 |
| Mysie przeciwciało monoklonalne anty-GAPDH | Technologia białkowa | 60004-1-IG | Przeciwciała pierwszorzędowe; WB: 1/2000 |
| Przeciwciało poliklonalne królika anty-MMP13 | Droga immunologiczna | YT2796 powiedział: | Przeciwciała pierwszorzędowe; Kąt obrotu: 1/1000 |
| Aseptyczne, ultra czyste stanowisko | Rybak termiczny | 51029704 | |
| Inkubator do hodowli komórkowych | Rybak termiczny | 51033782 | |
| Kolagenaza II | Solarbio (Słoneczna Biologia) | Zobacz materiał C8150 powiedział: | |
| Niestandardowe podkłady (Gapdh, Col2a1, Mmp13) | Sangon Biotechnologia | Zaprojektowany przy użyciu Primer BLAST | |
| DMEM/F12 średni | Klon | SH30023.01 | |
| Surowica bydlęca płodu | Komórka ExCell | FCS500 powiedział: | |
| Przeciwciało poliklonalne HRP-Goat Anti-Mouse | Droga immunologiczna | Przekaźnik RS0001 | przeciwciała drugorzędowe; Kąt obrotu: 1/10000 |
| Przeciwciało poliklonalne HRP-Goat Anti-Rabbit | Droga immunologiczna | Przekaźnik RS0002 | przeciwciała drugorzędowe; Kąt obrotu: 1/10000 |
| Mikroskop z odwróconą fazą kontrastu | OLYMPUS | CKX53 powiedział: | |
| Mikropipeta | Rybak termiczny | ||
| Miniaturowa wirówka stołowa | SŁONECZNY | Zobacz materiał SN-TDL-6 | |
| Ostrze chirurgiczne nr 11 | Serwis bio | QXJZ-11 powiedział: | |
| Roztwór penicyliny-streptomycyny (100X) | Beyotime | Zobacz materiał C0222 | |
| Zestaw narzędzi do preparacji małych zwierząt | Serwis bio | QXTZ01 powiedział: |
Bibliografia
- Makris, E. A., Gomoll, A. H., Malizos, K. N., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Repair and tissue engineering techniques for articular cartilage. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 21-34 (2015).
- Bierma-Zeinstra, S., Van Middelkoop, M., Runhaar, J., Schiphof, D. Nonpharmacological and nonsurgical approaches in OA. Best Pract Res Clin Rheumatol. 34 (2), 101564(2020).
- Urlic, I., Ivkovic, A. Cell sources for cartilage repair-biological and clinical perspective. Cells. 10 (9), 2496(2021).
- Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Nat Med. 26 (10), 1583-1592 (2020).
- Zhao, K., Ruan, J., Nie, L., Ye, X., Li, J. Effects of synovial macrophages in osteoarthritis. Front Immunol. 14, 1164137(2023).
- Wang, B. W., et al. Aucubin protects chondrocytes against IL-1β-induced apoptosis in vitro and inhibits osteoarthritis in a mouse model. Drug Des Devel Ther. 13, 3529-3538 (2019).
- Kuswanto, W., Baker, M. C. Repurposing drugs for the treatment of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (8), 886-895 (2024).
- Heywood, H. K., Thorpe, S. D., Jeropoulos, R. M., Caton, P. W., Lee, D. A. Modulation of sirtuins during monolayer chondrocyte culture influences cartilage regeneration upon transfer to a 3d culture environment. Front Bioeng Biotechnol. 10, 971932(2022).
- Piñeiro-Ramil, M., et al. Generation of human immortalized chondrocytes from osteoarthritic and healthy cartilage : A new tool for cartilage pathophysiology studies. Bone Joint Res. 12 (1), 46-57 (2023).
- Li, W., Zhou, Y., Han, L., Wang, L., Lucas Lu, X. Calcium signaling of primary chondrocytes and atdc5 chondrogenic cells under osmotic stress and mechanical stimulation. J Biomech. 145, 111388(2022).
- Zhao, Y., et al. Protein folding dependence on selenoprotein m contributes to steady cartilage extracellular matrix repressing ferroptosis via PERK/ATF4/CHAC1 axis. Osteoarthritis Cartilage. 33 (2), 261-275 (2025).
- Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
- Tang, H., et al. The IRF1/GBP5 axis promotes osteoarthritis progression by activating chondrocyte pyroptosis. J Orthop Translat. 44, 47-59 (2024).
- Bittner, N., et al. Primary osteoarthritis chondrocyte map of chromatin conformation reveals novel candidate effector genes. Ann Rheum Dis. 83 (8), 1048-1059 (2024).
- Ramser, A., Greene, E., Rath, N., Dridi, S. Primary growth plate chondrocyte isolation, culture, and characterization from the modern broiler. Poult Sci. 102 (1), 102254(2023).
- Mao, J., et al. Insufficiency of collagenases in establishment of primary chondrocyte culture from cartilage of elderly patients receiving total joint replacement. Cell Tissue Bank. 24 (4), 759-768 (2023).
- Lau, T. T., Peck, Y., Huang, W., Wang, D. A. Optimization of chondrocyte isolation and phenotype characterization for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (2), 105-111 (2015).
- Pagani, S., et al. Rna extraction from cartilage: Issues, methods, tips. Int J Mol Sci. 24 (3), 2120(2023).
- Goldring, M. B., Otero, M., Tsuchimochi, K., Ijiri, K., Li, Y. Defining the roles of inflammatory and anabolic cytokines in cartilage metabolism. Ann Rheum Dis. 67 (Suppl 3), 75-82 (2008).
- Wang, G., et al. TGFbeta attenuates cartilage extracellular matrix degradation via enhancing FBXO6-mediated MMP14 ubiquitination. Ann Rheum Dis. 79 (8), 1111-1120 (2020).
- Pang, Y., Zhao, L., Ji, X., Guo, K., Yin, X. Analyses of transcriptomics upon IL-1β-stimulated mouse chondrocytes and the protective effect of catalpol through the NOD2/NB-κb/MAPK signaling pathway. Molecules. 28 (4), 1606(2023).
- Naranda, J., Gradisnik, L., Gorenjak, M., Vogrin, M., Maver, U. Isolation and characterization of human articular chondrocytes from surgical waste after total knee arthroplasty (TKA). PeerJ. 5, e3079(2017).
- Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sci. 89 (19-20), 741-747 (2011).
- Lawrence, J. E. G., et al. Single-cell transcriptomics identifies chondrocyte differentiation dynamics in vivo and in vitro. Dev Cell. , (2025).
- Huang, C., et al. Single-cell transcriptomic analysis of chondrocytes in cartilage and pathogenesis of osteoarthritis. Genes Dis. 12 (2), 101241(2025).
- Wu, C. L., et al. Single cell transcriptomic analysis of human pluripotent stem cell chondrogenesis. Nat Commun. 12 (1), 362(2021).
- Zhang, H., Huang, J., Alahdal, M. Exosomes loaded with chondrogenic stimuli agents combined with 3d bioprinting hydrogel in the treatment of osteoarthritis and cartilage degeneration. Biomed Pharmacother. 168, 115715(2023).
- Mahapatra, C., Jin, G. Z., Kim, H. W. Alginate-hyaluronic acid-collagen composite hydrogel favorable for the culture of chondrocytes and their phenotype maintenance. Tissue Eng Regen Med. 13 (5), 538-546 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.