Modelowanie uporczywego zakażenia Pseudomonas aeruginosa u zranionych larw danio pręgowanego

Podsumowanie

Obecnie brakuje modeli in vivo , które można by poddać badaniom przesiewowym w kierunku przewlekłych zakażeń bakteryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół zakażenia rany za pomocą izolatu klinicznego Pseudomonas aeruginosa w celu wywołania trwałej infekcji u larw danio pręgowanego.

Streszczenie

Pseudomonas aeruginosa jest głównym czynnikiem chorobotwórczym u ludzi, szczególnie w przewlekłych zakażeniach ran i przewlekłych zakażeniach płuc (zwłaszcza u pacjentów z mukowiscydozą). Przewlekłe infekcje bakteryjne są oporne na antybiotyki i istnieje pilna potrzeba stworzenia modeli przewlekłych zakażeń in vivo nadających się do badań przesiewowych leków w celu opracowania skutecznych terapii. W tym miejscu opisujemy protokół zakażenia izolatem klinicznym P. aeruginosa od pacjenta z mukowiscydozą, wykazującym konstytutywną ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) w celu wywołania trwałego zakażenia rany u larw danio pręgowanego. Zarodki z uszkodzeniem płetwy ogonowej zanurza się w zawiesinie bakteryjnej na 1,5 godziny, myje i monitoruje pod kątem obciążenia bakteryjnego przez 3 dni. Obciążenie bakteryjne oceniano ilościowo codziennie, licząc fluorescencyjne jednostki tworzące kolonie (CFU) z larw zakażonych lizą, co pozwoliło na trwałą infekcję. Co więcej, przetrwałe bakterie P. aeruginosa były oporne na antybiotykoterapię. Ten nowatorski model in vivo przetrwałego zakażenia P. aeruginosa daje możliwość oceny skuteczności innowacyjnych metod leczenia przewlekłych zakażeń.

Wprowadzenie

Pseudomonas aeruginosa jest bakterią chorobotwórczyą Gram-ujemną odpowiedzialną za przewlekłą kolonizację u pacjentów z mukowiscydozą (CF) i ranami ^1,2. P. aeruginosa należy do grupy patogenów ESKAPEE i jest uznawany przez Światową Organizację Zdrowia za krytyczny priorytet dla nowych terapii³. Przewlekłe infekcje bakteryjne są trudne do leczenia antybiotykami ze względu na adaptacyjną oporność na leki, która jest związana z wieloma czynnikami, w tym stylem życia biofilmu, zmniejszonym wzrostem, niską aktywnością metaboliczną⁴, a także wewnątrzkomórkowym cyklem życiowym⁵. Modele in vivo są niezbędne do lepszego zrozumienia i leczenia przewlekłego zakażenia P. aeruginosa.

Podczas gdy do oceny zjadliwości P. aeruginosa wykorzystano kilka modeli in vivo, bardzo niewiele modeli pozwoliło naśladować trwałą kolonizację i przetestować skuteczność leczenia przewlekłej infekcji⁶. Modele zwierzęce do badania przewlekłej patogenezy P. aeruginosa opierają się głównie na podawaniu bakterii osadzonych w kulkach agarowych do płuc⁷. Opracowano również mysi model przewlekłej infekcji skórnej⁸. Danio pręgowany (Danio rerio), który ma wiele zalet (umiarkowane problemy etyczne, niski koszt, wysoka produkcja jaj), jest atrakcyjnym modelem kręgowców in vivo do testów narkotykowych, który umożliwia również wizualizację w czasie rzeczywistym P. aeruginosa i komórek gospodarza w wysokiej rozdzielczości dzięki przezroczystości zarodka⁹.

Jak podano w przeglądzie, we wcześniejszych badaniach szczepy laboratoryjne P. aeruginosa (PAO1, PA14 i PAK) były stosowane głównie w modelu zakażenia danio pręgowanego, gdzie powodowały ostrą infekcję⁹. Niedawno opracowaliśmy protokół leczenia ran oparty na zanurzeniu zarodków po amputacji płetwy ogonowej w szczepie P. aeruginosa PAO1, który spowodował ostre zakażenie¹⁰. Zakażenie przez zanurzenie uszkodzonych zarodków, które odzwierciedla naturalny sposób zakażenia P. aeruginosa, jest sposobem infekcji, który jest powtarzalny i łatwiejszy niż mikroiniekcja.

Naszym celem było ustalenie protokołu uporczywego zakażenia P. aeruginosa u danio pręgowanego. W tym celu nasza strategia polegała na wykorzystaniu szczepów klinicznych P. aeruginosa, które rzadko były brane pod uwagę w modelu^danio pręgowanego ^11,12, w połączeniu z drogą zakażenia rany. W tym miejscu opisujemy protokół, który opracowaliśmy w celu modelowania trwałej kolonizacji zarodków danio pręgowanego w oparciu o zakażenie rany przez izolaty kliniczne P. aeruginosa CF. Ten nowatorski model in vivo spełnia nasze oczekiwania i oferuje nowe możliwości oceny skuteczności terapii w kontekście trwałej kolonizacji, jak opisano tutaj i w towarzyszącym mu artykule¹³.

Protokół

Wszystkie doświadczenia z danio pręgowanym opisane w niniejszym badaniu zostały przeprowadzone na Uniwersytecie w Montpellier zgodnie z zasadami 3R - Replacement, Reduction and Refinement - zgodnie z wytycznymi Unii Europejskiej dotyczącymi obchodzenia się ze zwierzętami laboratoryjnymi i zostały zatwierdzone przez Direction Sanitaire et Vétérinaire de l'Hérault oraz Comité d'Ethique pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques pod numerem CEEA-LR-B4-172-37. Wszystkie eksperymenty infekcyjne przeprowadzono na zarodkach do 5 dni po zapłodnieniu. Hodowla dorosłych ryb danio pręgowanego (Danio rerio) z ryb AB lub Golden Lines odbywa się zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi określonymi w dyrektywie UE w sprawie ochrony zwierząt 2010/63/UE. Zakład ryb pręgowanych Uniwersytetu w Montpellier z warunkami standardowymi ustalonymi jako cykl świetlny: 12 godzin i 12 godzin, zbiornik z poliwęglanu o pojemności 3,5 l (maksymalnie 22 ryby na zbiornik) podłączony do systemu recyrkulacyjnego o zasoleniu 4% / przewodności 400 μS i temperaturze wody 28 °C. Ryby były karmione 2 razy dziennie pokarmem dla ryb.

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj 1x roztwór roboczy do wody dla ryb z błękitem metylenowym lub bez niego do hodowli zarodków danio pręgowanego (patrz Tabela 1).
2. Przygotuj 20x bulion (0,4%) i 1x działający trikainowy roztwór znieczulający, jak opisano w Tabeli 1. Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania roztworu podstawowego, należy przygotować 10 ml porcji 20x Trikainy i przechowywać w temperaturze -20 °C.
3. Przygotować 2% roztwór trytonu rozcieńczony w 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS; Tabela 1).

2. Przygotowanie inokulum fluorescencyjnego P. aeruginosa wykazującego konstytutywną ekspresję GFP

UWAGA: Wszystkie prace z P. aeruginosa są wykonywane z zachowaniem środków ostrożności BSL-2 w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Szczepy P. aeruginosa powinny być genetycznie modyfikowane w celu konstytutywnej ekspresji fluorescencyjnego reportera, takiego jak GFP (stosowany tutaj i opisany w¹³). Zdecydowanie zaleca się stosowanie szczepów z chromosomalnie kodowanym reporterem fluorescencyjnym, aby uniknąć utraty plazmidu w przypadku reportera fluorescencyjnego kodowanego plazmidem.

1. Na 2 dni przed zakażeniem usunąć z temperatury -80 °C zapas genetycznie zmodyfikowanego P. aeruginosa wykazującego ekspresję GFP na płytkach agarowych LB (Tabela 1) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
2. Sprawdź fluorescencję kolonii za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (powiększenie 6x), aby zaszczepić kolonię GFP⁺P. aeruginosa w 1 ml bulionu LB (Tabela 1) i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (180 obr./min).
3. W dniu zakażenia rozcieńczyć powyższą nocną kulturę P. aeruginosa w stosunku 1:20 do 5 ml świeżego bulionu LB. Hodować bakterie w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (180 obr./min), aż kultura osiągnie OD₆₀₀ = 0,8. Powinno to zająć około 2-3 godzin.
4. Odwirować kulturę bakteryjną przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT) przy 3584 x g. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 4 ml wody dla ryb bez błękitu metylenowego.
5. Dostosuj objętość kultury z wodą dla ryb, aby uzyskać 7 x 10⁷ do 1 x 10⁸ jtk/ml. Odpowiada to OD₆₀₀ wynoszącemu około 0,15 (do dostosowania dla każdego szczepu).
6. W celu ilościowego określenia inokulum należy wykonać seryjne rozcieńczanie zawiesiny bakteryjnej, rozlać 20 μl rozcieńczenia ^10-4 na płytce agarowej LB i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
7. Policz kolonie GFP⁺ pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby określić CFU inokulum.

3. Pobieranie i przygotowanie zarodków danio pręgowanego

1. Na 3 dni przed eksperymentem z zanurzeniem bakteryjnym ustaw pary lęgowe danio pręgowanego. Umieść samca i samicę hodowlaną w zbiorniku krzyżowym.
2. Następnego ranka zbierz jaja po zapłodnieniu za pomocą sitka o drobnych oczkach. Umieść zebrane jaja na szalce Petriego zawierającej wodę dla ryb z błękitem metylenowym.
3. Aby uniknąć zanieczyszczenia, dodaj 1 kroplę wybielacza do szalki Petriego. Po 5 minutach zmień wodę rybną na błękit metylenowy, aby usunąć wybielacz.
4. Wyrzuć jaja z nieprawidłowym rozwojem zarodka (niezapłodnione jaja są podobne do stadium jaja 1-komórkowego) lub martwe (biały wygląd).
5. Rano w dniu zakażenia (przy 2 dpf) należy zdechorionować zarodki za pomocą dwóch bardzo cienkich kleszczyków pod mikroskopem stereoskopowym (powiększenie 11x). Rozerwij kosmówkę za pomocą kleszczy, nie ściskając zarodka w celu jego uwolnienia.
6. Umieść zdekorionowane zarodki na szalce Petriego zawierającej ryby z błękitem metylenowym. Inkubować szalki w temperaturze 28 °C aż do momentu wystąpienia infekcji.

4. Uszkodzenie zarodka

1. Znieczulenie zarodków danio pręgowanego należy umieścić w wodzie dla ryb bez błękitu metylenowego, zawierającej 0,02% trikainy, około 5 minut przed urazem w naczyniu do hodowli komórkowej (35 mm x 10 mm). Zarodki już się nie poruszają i nie reagują na bodźce.
2. Umieść igły 25G na dwóch pałeczkach, aby ułatwić obsługę igieł.
3. Pod mikroskopem stereoskopowym wyeliminuj zarodki o nieprawidłowym rozwoju lub martwe. Wykonując okrężny ruch naczynia, zbierz wszystkie zarodki w środku.
4. Izoluj zarodki jeden po drugim za pomocą dwóch igieł w pozycji pionowej (głowa w dół - ogon do góry) i umieść lewą igłę na ogonie, aby utrzymać ją prosto. Odetnij płetwę na krawędzi struny grzbietowej prawą igłą. Wykonaj cięcie za jednym razem. Nie należy przekraczać 10 minut między cięciem a zanurzeniem w roztworze bakteryjnym.

5. Zakażenie zranionych zarodków

1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego typu II należy przeprowadzić wir i dodać roztwór P. aeruginosa o stężeniu około 1 x 10⁷ jtk/ml do płytki 6-dołkowej.
2. Zbierz uszkodzone zarodki za pomocą jednorazowej szklanej pipety Pasteura i dodaj je do roztworu bakteryjnego pod słupkiem bezpieczeństwa mikrobiologicznego. Inkubować płytkę w temperaturze 28 °C przez 1,5 godziny.
   UWAGA: Jeśli potrzebna jest duża liczba zainfekowanych larw, utwórz grupy po około 50 larw, zrób ranę, zanurz je i powtórz dla następnej grupy.
3. Po zakażeniu umyj zarodki pod punktem bezpieczeństwa mikrobiologicznego, jak opisano poniżej.
   1. Przenieś zarodki za pomocą szklanej pipety do przemycia do 10 ml wody dla ryb bez błękitu metylenowego, dodając jak najmniej płynu, przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Ponownie przenieś zakażone zarodki za pomocą szklanej pipety do drugiego płukania do 4 ml wody rybnej bez błękitu metylenowego na kilka minut.
   3. Przenieś 24 zakażone zarodki pojedynczo do płytki wielodołkowej z 1 ml wody dla ryb bez błękitu metylenowego.
4. Umieścić płytki w plastikowym pudełku w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Nawilżać pudełko (npampampamp ręczniki papierowe), aby ograniczyć parowanie.

6. Przeżywalność zakażonych zarodków

1. W przypadku badań nad przeżywalnością zarodków należy sprawdzić żywotność pod mikroskopem stereoskopowym po 18 godzinach, 24 godzinach i 48 godzinach po zakażeniu (hpi). Zarodek uważa się za martwy, gdy ustaje krążenie serca i krwi.
2. Przedstaw wskaźniki śmiertelności/przeżycia za pomocą graficznych reprezentacji schodów Kaplana-Meiera (GraphPad Prism 8.3.0) i przeanalizuj dane za pomocą log-rank lub innych odpowiednich testów statystycznych.

7. Liczenie obciążenia bakteryjnego w zakażonych zarodkach (ryc. 1)

1. Wykonaj oznaczanie CFU z zakażonych zarodków w czterech różnych punktach czasowych: 1,5 hpi, tj. bezpośrednio po zakażeniu, oraz po każdym płukaniu przy 24, 48 i 72 hpi z 5 zarodkami / punkt czasowy. Wykonaj wszystkie czynności pod słupkiem bezpieczeństwa mikrobiologicznego.
2. Przygotować dla każdej zakażonej larwy 1,5 ml probówek wirówkowych zawierających 95 μl 1x PBS. Objętość larw wynosi około 5 μl.
3. Przenieś larwy na 6-dołkową płytkę z 4 ml wody dla ryb bez błękitu metylenowego, aby przeprowadzić płukanie i wyeliminować bakterie planktonowe.
4. Umieść każdy zarodek w probówce do mikrowirówki zawierającej PBS, dodając jak najmniej płynu. Wystarczy dotknąć szklanej pipety zawierającej larwy na powierzchni PBS, aby larwy mogły zanurzyć się w probówce do mikrowirówki bez dodawania płynu.
5. Rozdrobnić zarodki pojedynczo za pomocą tłuczka z boku probówki do mikrowirówki. Trzymaj tłuczek w tubie. Określ punkt końcowy, gdy nie ma już nienaruszonego zarodka.
6. Podnieś tłuczek i dodaj 100 μl PBS-Triton 2%, aby wypłukać wszelkie pozostałości bakterii z tłuczka (końcowe stężenie wynosi 1%). Wiruj i odczekaj 10 min. Nie przetwarzaj więcej niż pięciu zarodków w tym samym czasie.
7. Upuść 3x, 10 μl nierozcieńczonych lizatów na płytki agarowe LB dla każdego zarodka. Wykonaj seryjne rozcieńczanie lizatów w 96-dołkowej płytce, aż do osiągnięcia rozcieńczenia ^10-3 za pomocą pipety wielokanałowej. Upuść 3x, 10 μl rozcieńczenia ^10-1, ^10-2 i ^10-3 obok nierozcieńczonych na płytki agarowe LB i inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
8. Policz kolonie fluorescencyjne w każdym rozcieńczeniu pod mikroskopem i oblicz jtk na zakażony zarodek.

Rycina 1: Eksperymentalny harmonogram oceny zjadliwości i trwałości bakterii w zarodku danio pręgowanego. Skróty: CFU = jednostki tworzące kolonie, hpi = godziny po zakażeniu. Rysunek został utworzony za pomocą BioRender.com. Rysunek został zmodyfikowany z¹³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Testowanie leczenia pod kątem uporczywego zakażenia (ryc. 2)

1. Przygotować roztwory antybiotyków o stężeniu 40-krotnie większym niż minimalne stężenie hamujące (MIC) dla szczepu P. aeruginosa . Przed eksperymentem sprawdź, czy wybrane stężenie antybiotyku nie jest toksyczne dla zarodka.
2. Wykonaj kroki 7.1 i 7.2. Umieść 1 ml wody rybnej z antybiotykami w 24-dołkowej płytce i wykonaj kontrolę bez antybiotyków.
3. Przenieś pięć zarodków z etapu płukania na każdy zabieg do płytki 24-dołkowej, dodając jak najmniej płynu.
4. Inkubować z antybiotykami przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wróć do kroku 7.3. w celu ilościowego określenia obciążenia bakteryjnego po zabiegu.

Rycina 2: Procedura doświadczalna stosowana do oceny skuteczności leczenia antybiotykami na zakażonych zarodkach. Skróty: ATB 30' = antybiotykoterapia przez 30 minut, CFU = jednostki tworzące kolonie, hpi = godziny po zakażeniu. Rysunek został utworzony za pomocą BioRender.com. Rysunek został zmodyfikowany z¹³. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Zarodek danio pręgowanego jest odpowiednim modelem do monitorowania uporczywego zakażenia izolatami P. aeruginosa CF
Zastosowaliśmy tryb zanurzenia uszkodzonych zarodków do oceny in vivo zjadliwości trzech izolatów mukowiscydozy (A6520, B6513 i C6490)⁹. Oceniliśmy również zachowanie dobrze scharakteryzowanego późnego izolatu CF, RP73, znanego z długotrwałej kolonizacji w drogach oddechowych myszy^14,15

Dyskusja

Modelowanie przewlekłych zakażeń bakteryjnych in vivo jest niezbędne do zrozumienia patogenezy i oceny skuteczności leczenia. W tym przypadku ustaliliśmy model trwałego zakażenia ran u danio pręgowanego, nadający się do testowania leków przeciwko P. aeruginosa. Wypełnia to lukę w obecnej metodologii związaną z brakiem modeli in vivo nadających się do badań przesiewowych leków przeciwko przewlekłym infekcjom bakteryjnym. Warto zauważyć, że model ten naśladuje główną cechę przewlekłości, tj. adap...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Metanosulfonian etylo-3-aminobenzoesanu	Sigma	E50521 powiedział:
Śrut tłokowy	Eppendorf, Holandia	33522
sole morskie	Instant Ocean, Systemy akwariowe	218035
Tryton	Targi Euromedex	2000-B