Artykuł metodologiczny

Ookluc: Linia Plasmodium berghei do identyfikacji związków blokujących transmisję

715 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68466

⸱

11 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Parasitology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

W tym artykule

Podsumowanie

Rozwój płciowy zarodźca zachodzi w jelicie środkowym komara. Celowanie w stadia płciowe pasożyta jest obiecującą strategią blokowania transmisji. Opracowaliśmy Ookluc, transgeniczny P. berghei wykazujący ekspresję nanolucyferazy po utworzeniu zygoty, umożliwiający wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków blokujących transmisję. W tym artykule szczegółowo opisano metody badań przesiewowych przy użyciu Ookluc.

Streszczenie

Malaria pozostaje światowym wyzwaniem zdrowotnym; W 2023 roku na całym świecie zgłoszono 263 miliony przypadków i 597 000 zgonów. Cykl życiowy pasożyta jest złożony i potrzebne są ukierunkowane interwencje w krytycznych stadiach rozwoju, aby skutecznie kontrolować chorobę. Strategie blokowania transmisji (TB) mają na celu przerwanie transmisji Plasmodium poprzez celowanie w wektora komara lub stadia płciowe pasożyta za pomocą szczepionek i leków. Interwencje gruźlicy mogą koncentrować się na gametocytach w ludzkim gospodarzu lub innych formach w jelicie środkowym komara, takich jak gamety, zygoty, ookinety i oocysty.

Opracowanie nowych metod leczenia gruźlicy stoi przed poważnymi wyzwaniami. Badanie stadiów płciowych pasożyta jest z natury trudne, a wysokoprzepustowe badania przesiewowe (HTS) pod kątem związków gametocytocydowych opierają się głównie na kulturach P. falciparum . Solidne narzędzia in vitro do oceny interwencji w późniejszych stadiach płciowych są jednak nadal ograniczone. Aby przyspieszyć odkrywanie związków gruźlicy, nasza grupa opracowała nowatorski test HTS do aktywacji i zapłodnienia gametocytów przy użyciu P. berghei, mysiego modelu infekcji Plasmodium . Transgeniczny pasożyt, Ookluc, ulega ekspresji nanolucyferazy wyłącznie po utworzeniu zygoty, ze szczytem luminescencji podczas rozwoju ookinte. Ten test oparty na luminescencji zapewnia ilościowy odczyt różnicowania gamet do zygoty i zygoty do ookinte, gdzie zwiększona luminescencja bezpośrednio koreluje z tworzeniem ookinte. W tym artykule wideo przedstawiono metody badań przesiewowych związków gruźlicy malarii przy użyciu Ookluc.

Wprowadzenie

Malaria to starożytna choroba, która głęboko ukształtowała historię ludzkości. Tylko w 2023 roku w 85 krajach endemicznych zgłoszono 263 miliony przypadków, co spowodowało 597 000 zgonów1. Choroba jest wywoływana przez pasożyty pierwotniaków z rodzaju Plasmodium, należące do gromady Apicomplexa. Spośród pięciu gatunków, które zarażają ludzi - P. falciparum, P. vivax, P. knowlesi, P. ovale i P. malariae - P. falciparum i P. vivax stanowią większość przypadków. P. falciparum jest związany z ciężką postacią malarii i dominuje w Afryce, podczas gdy P. vivax ma najszersze rozmieszczenie geograficzne, jest bardziej rozpowszechnione w Ameryce Południowej i Azji2.

Złożoność cyklu życiowego Plasmodium , który obejmuje wiele etapów rozwojowych u dwóch gospodarzy, ułatwia jego przenoszenie i utrzymywanie się w regionach endemicznych3. Kluczowym krokiem w tym cyklu jest przejście od człowieka do wektora komara, co czyni go kluczowym celem interwencji. Transmisja rozpoczyna się w ludzkim gospodarzu, gdzie etapy płciowe Plasmodium rozwijają się, gdy merozoity różnicują się w gametocyty męskie i żeńskie. Po spożyciu przez komara, sygnały środowiskowe wyzwalają aktywację gametocytów i tworzenie gamet, co prowadzi do zapłodnienia w świetle jelita środkowego. Powstała zygota różnicuje się w ruchliwy ookinet, który aktywnie atakuje nabłonek jelita środkowego i przekształca się w oocystę w blaszce podstawnej. Wewnątrz oocysty wytwarzane są tysiące sporozoitów, które następnie są uwalniane do hemolimfy, umożliwiając im migrację do gruczołów ślinowych. Tam sporozoity atakują komórki groniaste i przemieszczają się do światła gruczołu, gdzie pozostają do momentu, gdy komar spożyje kolejny posiłek z krwi, przenosząc pasożyta na ludzką skórę4.

Poszukiwanie nowych strategii blokowania transmisji (TB) ma kluczowe znaczenie ze względu na ograniczenia dostępnych leków i rosnącą oporność na leki przeciwmalaryczne5. Tradycyjne metody badań przesiewowych, takie jak infekcje komarami, ręczna analiza mikroskopowa lub inkorporacja radioaktywnej hipoksantyny, są pracochłonne, trudne do standaryzacji i nieodpowiednie do zastosowań o wysokiej przepustowości 6,7. Nowsze podejścia wykorzystujące detekcję opartą na fluorescencji (np. barwienie DNA lub reportery GFP) poprawiły skuteczność, jednak nadal istnieją poważne wyzwania w ocenie związków, które celują w stadia płciowe pasożyta 6,7,8.

Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowano transgeniczną linię P. berghei wykazującą ekspresję nanolucyferazy (nLuc), nazwaną Ookluc 8. W tym systemie gen nLuc jest umieszczany pod kontrolą specyficznego dla ookinete promotora białka związanego z okosynoitem i TRAP (CTRP), który jest aktywowany w zygotach, co prowadzi do produkcji nLuc rozpoczynającej się około 6 godzin po aktywacji gamet i osiągającej szczyt 24 godziny po teście konwersji8. Konstrukcja ta umożliwia zautomatyzowaną, opartą na luminescencji kwantyfikację żywotności pasożyta wkrótce po zapłodnieniu - eliminując potrzebę bezpośredniej manipulacji wektorami - i ułatwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe tysięcy związków8.

Chociaż ekspresja nLuc zachodzi niezależnie od żywotności ookinatów, co ogranicza wykrywanie związków, które specyficznie wpływają na późniejsze etapy, takie jak morfogeneza ookinate, Ookluc pozostaje wysoce skuteczny w identyfikacji związków gruźlicy, które celują w gametogenezę, rekombinację płciową lub przeżycie pasożyta w komara, w tym czynników indukujących produkcję reaktywnych form tlenu. Poprzednie badania potwierdziły ten system, skutecznie identyfikując związki, o których wiadomo, że hamują etapy płciowe Plasmodium 9,10,11,12,13,14,15. W związku z tym Ookluc stanowi solidną i innowacyjną platformę do wysokoprzepustowych badań przesiewowych stadiów płciowych Plasmodium, ułatwiając odkrywanie nowych związków gruźlicy i przyspieszając wysiłki na rzecz eliminacji malarii w nadchodzących latach8. Protokół ten przedstawia zastosowanie systemu Ookluc do badań przesiewowych leków i oznaczania stężenia hamującego 50% (IC50).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone w ścisłej zgodności z wytycznymi etycznymi i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Wykorzystywania Zwierząt Instytutu Nauk Biomedycznych Uniwersytetu w São Paulo (CEUA-ICB/USP). Zwierzęta były trzymane i utrzymywane zgodnie ze standardami ustalonymi przez ten komitet. Eksperymenty z genetycznie zmodyfikowanymi pasożytami Plasmodium , a także ich kriokonserwowanym przechowywaniem w temperaturze -80 °C, przeprowadzono zgodnie z przepisami ustanowionymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Instytutu Nauk Biomedycznych Uniwersytetu w São Paulo (CIBio-ICB/USP). W sumie w tym badaniu wykorzystano trzy samice myszy BALB/c w wieku 3-5 tygodni - dwie zakażone i jedną niezakażoną.

1. Materiały i odczynniki

  1. Przygotuj pożywkę ookinetową, uzupełniając RPMI 1640 0,025 M HEPES, penicyliną-streptomycyną-neomycyną (PSN), 50 mg/l hipoksantyny i 100 μM kwasem ksanturenowym. Dostosować pH do 8,3 8,16.
  2. Przygotować roztwór roboczy do testu luminescencji, mieszając 1 objętość substratu z 50 objętościami buforu do lizy dostarczonym w systemie oznaczania lucyferazy.
  3. Ustawić w inkubatorze temperaturę 21 °C.

2. Zakażenie i pobieranie krwi pasożytniczej

  1. Zainfekuj dwie samice myszy BALB/c (w wieku 4-6 tygodni) 150 μl kriokonserwowanego szczepu Ookluc poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) (Dzień 0).
    UWAGA: W tym protokole zalecamy stosowanie myszy BALB/c ze względu na ich łatwą dostępność i powszechne stosowanie w obiektach dla zwierząt. Jednak każdy szczep myszy typu dzikiego, który jest podatny na zakażenie P. berghei i wspiera gametocytogenezę, powinien być odpowiedni do użycia.
  2. Począwszy od dnia 3, oceń parazytemię i gametocytemię za pomocą badania mikroskopowego rozmazów krwi zabarwionych metodą Giemsa.
  3. Gdy parazytemia i gametocytemia osiągną odpowiednio około 5% i 0,5% (zwykle w dniu 4), należy pobrać krew przez nakłucie serca za pomocą strzykawek z heparyną i zebrać krew od obu zakażonych myszy.
    UWAGA: Chociaż jest to transgeniczna linia P. berghei, jej wzrost i profil gametocytemii są podobne do tych obserwowanych w szczepie ANKA. W tym kontekście odsetek gametocytów w stosunku do całkowitej parazytemii jest około 10 razy niższy.
    UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby płytka złożona (patrz poniżej) była przygotowywana przed pobraniem spasożytowanej krwi, tak aby krew była pipetowana do płytki natychmiast po pobraniu. Jeżeli krew myszy musi być pobrana w innym pomieszczeniu lub z jakiegokolwiek innego powodu nie może być natychmiast odpipetowana do płytki złożonej, pobrana krew musi być przechowywana w temperaturze 37 °C nie dłużej niż 30 minut.

3. Test konwersyjny - badanie przesiewowe na płytkach 96-dołkowych

UWAGA: Aby zapewnić spójne wyniki, cały eksperyment należy powtórzyć trzy razy w różnych dniach, aby potwierdzić wyniki.

  1. Przygotować próbki złożone, używając pożywki ookinetu jako rozcieńczalnika (końcowe stężenie 10 μM). Rozcieńczyć podstawowy związek do 1 mM i przygotować próbki robocze, rozcieńczając 1 mM materiał podstawowy w stosunku 1:100 v:v w pożywce Ookinete. Dla jednego powtórzonego testu należy przygotować końcową objętość 200 μl próbki roboczej.
  2. Jeżeli związek jest rozcieńczony w rozpuszczalniku innym niż woda, należy dołączyć próbkę kontrolną zawierającą rozpuszczalnik rozcieńczony w pożywce ookinte w tej samej proporcji, co w próbce badanej, aby zapewnić, że wszelkie zaobserwowane zahamowanie można przypisać związkowi, a nie rozpuszczalnikowi.
    UWAGA: Jako przykład przebadamy 90 związków.
  3. Używając dwóch płytek 96-dołkowych, umieścić 80 μl próbek w każdym dołku, w następujący sposób i zilustrowany na rysunku 1, w dwóch dwóch płytkach: Kontrola dodatnia: 80 μl pożywki ookinitowej; Kontrola ujemna: 80 μl pożywki ookinitowej; Kontrola rozpuszczalnika: 80 μl pożywki ookinte z 1% DMSO; Próbki: 80 μL po 10 μM każdego związku w pożywce ookinitowej.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie układu 96-dołkowej płytki przeznaczonej do przesiewania złożonego. Układ płytek obejmuje kontrolę dodatnią (C+), kontrolę ujemną (C-), kontrolę plus rozpuszczalnik rozcieńczający (C+S) oraz 90 badanych związków (S1-S90). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Dodać 4 μl spasożytowanej krwi myszy do każdego dołka 96-dołkowej płytki w stosunku 1:20 v:v, z wyjątkiem kontroli ujemnej (C-). Delikatnie homogenizować przez pipetowanie.
    UWAGA: Biorąc pod uwagę straty, obliczamy zapotrzebowanie na ~400 μL spasożytowanej krwi na każdą płytkę.
  2. W celu kontroli ujemnej dodaj niezakażoną krew myszy w stosunku 1:20 (v:v, krew:próbka). Delikatnie homogenizować.
  3. Inkubować w temperaturze 21 °C przez 6 godzin lub 24 godziny.
    UWAGA: aktywność nLuc jest wykrywalna po 6 godzinach inkubacji i osiąga szczyt po 24 godzinach testu8. Test nie jest w stanie zidentyfikować związków o aktywności po utworzeniu zygoty, takich jak związki, które hamują morfogenezę ookinte, ponieważ powstałe zygoty będą gromadzić nLuc niezależnie od zakończenia morfogenezy. Dlatego 6 godzinna inkubacja jest wystarczająca do wykrycia wszystkich związków, które będą blokować aktywność nLuc poprzez hamowanie gametogenezy, rekombinacji płciowej lub będą miały wczesną cytotoksyczność. Jednak zwykle preferujemy inkubacje trwające 24 godziny, aby uzyskać silniejsze sygnały i lepszy stosunek sygnału do szumu.

4. Test luminescencji

  1. Po okresie inkubacji homogenizować próbki, pipetując w górę i w dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie krwi z pożywką.
  2. Przygotować mieszaninę buforu do lizy/substratu lucyferazy bezpośrednio przed użyciem w stosunku 1:50 (v:v, substrat:bufor do lizy).
  3. Wymieszać mieszaninę substratu z próbkami w stosunku 1:1 (v:v), zapewniając delikatne mieszanie, aby uniknąć pęcherzyków. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut.
    UWAGA: W tym przykładzie dodaliśmy 84 μl substratu: buforu do lizy do każdej studzienki.
  4. Przenieść próbki na 96-dołkową białą płytkę o płaskim dnie. Zmierz luminescencję za pomocą czytnika płytek. Użyj następującej konfiguracji parametrów: filtr emisyjny: soczewka; czas interwału pomiaru: 1 s na studzienkę.

5. Analiza danych - screening

  1. Po teście luminescencji zanotuj pojawiające się surowe dane (rysunek 2).
    UWAGA: Uzyskane względne jednostki światła (RLU) zależą od użytego luminometru. W naszym przypadku wartości RLU dla kontroli pozytywnej wahały się od 10 000 do 500 000 w 24-godzinnym teście inkubacji. Krótszy czas inkubacji (6 godzin) spowoduje niższe wartości RLU.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Wyniki uzyskane z symulowanego odczytu testu konwersji do badania przesiewowego związków. Obraz przedstawia symulowane odczyty luminescencji z testu przeprowadzonego po konwersji ookinety w obecności panelu 90 związków. Niższe wartości względnych jednostek światła wskazują na zmniejszone tworzenie ookinte. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Korzystając z arkusza kalkulacyjnego, oblicz średnią z każdego pomiaru, korzystając z poniższego wzoru. Zastąp XX adresem pierwszej komórki pomiarowej, a YY adresem drugiej komórki pomiarowej. Powtórzyć wzór dla wszystkich próbek.
    =(ŚREDNIA(XX:RR)
  2. Przekształć dane w % inhibicji, aby uzyskać lepszą analizę wyników. W arkuszu kalkulacyjnym użyj poniższego wzoru. Zastąp A przykładową wartością RLU, a B kontrolną wartością RLU. Powtórz wzór dla wszystkich badanych związków:
    = 1 - (A/B) x 100
    UWAGA: Dane będą wyświetlane tak, jak pokazano na rysunku 3.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Wyniki uzyskane z symulowanego odczytu testu konwersji dla badania przesiewowego związków reprezentujących % inhibicji dla każdego związku. Procentowa wartość zahamowania konwersji dla każdego badanego związku, obliczona w sposób opisany powyżej. Podświetlone kwadraty wskazują związki, które promują ponad 95% hamowanie konwersji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zidentyfikuj związki, które wykazują więcej niż 95% hamowanie.
    UWAGA: Związki te wykazują wysoką aktywność wobec stadiów płciowych przy stężeniu 10 μM. W naszym przykładzie znaleźliśmy pięć związków o wysokiej aktywności przeciwko etapom płciowym.
  2. Dla zidentyfikowanych związków należy przeprowadzić oznaczenie IC50 w sposób opisany poniżej.

6. Test konwersyjny - oznaczanie IC 50

  1. Zainfekuj myszy Ookluc i zbierz krew pasożytów, jak opisano w punkcie 2.
  2. Przygotować próbki, używając pożywki ookinete jako rozcieńczalnika. Należy stosować stężenie początkowe, przy którym obserwuje się 100% zahamowanie konwersji przez związek.
    UWAGA: Ponieważ związki czynne zostały zidentyfikowane w badaniu przesiewowym o stężeniu 10 μM, używamy 20 μM jako stężenia początkowego dla pierwszej krzywej dawka-odpowiedź. Aby uzyskać dokładną krzywą dawka-odpowiedź, ważne jest, aby test zawierał początkowe stężenia, które powodują 100% zahamowanie konwersji i końcowe stężenia, które prowadzą do 0% zahamowania. Takie podejście zapewnia precyzyjne obliczenia IC50 . Pierwsza krzywa dawka-odpowiedź poinformuje o najniższych stężeniach związku z ~100% inhibicją. W tym protokole jako przykładu użyjemy PyAz90, ostatnio zidentyfikowanego przy użyciu Ookluc13.
  3. Na płytce 96-dołkowej dodać trzykrotnie (patrz rysunek 4): Kontrola dodatnia (C+): 80 μl pożywki ookinitowej; Kontrola ujemna (C-): 80 μl pożywki ookinitowej; Pierwsze rozcieńczenie próbki (Cpd D1): 160 μl związku w początkowym stężeniu w pożywce ookinitowej, co powoduje 100% zahamowanie konwersji; Studzienki od D2 do D12: 80 μl pożywki ookinitowej.
  4. Wykonaj dwukrotne seryjne rozcieńczenia, pipetując 80 μl basenika D1 do D2, homogenizować i pipetować 80 μl basenika D2 do D3 i tak dalej. Upewnij się, że wszystkie studzienki mają 80 μl całkowitej objętości, więc wyrzuć ostatnie 80 μl usunięte z dołka D12.
    UWAGA: Przeprowadzić eksperyment z co najmniej trzema powtórzeniami dla wszystkich próbek, jak pokazano na rysunku 4. Aby zapewnić wiarygodność i powtarzalność wyników, cały eksperyment należy powtórzyć w ciągu trzech oddzielnych dni przy użyciu nowo zakażonych zwierząt za każdym razem.
    UWAGA: Jeśli na pierwszym ekranie wyniki nie wykazują wpływu rozpuszczalnika na konwersję, nie jest konieczne uwzględnianie tych kontroli w seryjnych rozcieńczeniach. W przeciwnym razie należy również uwzględnić seryjne rozcieńczenia rozpuszczalnika.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Układ 96-dołkowych płytek przeznaczony do oznaczania IC50 w związku Formacja 50.Układ płytek obejmuje rozcieńczenia kontroli dodatniej (C+), kontroli ujemnej (C-) i związków (Cpd) (D1 do D12). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Dodaj krew pasożytów myszy do 96-dołkowej płytki w stosunku 1:20 v:v. Delikatnie homogenizować przez pipetowanie.
    UWAGA: Do każdej studzienki dodaje się łącznie 4 μl spasożytowanej krwi, z wyjątkiem kontroli ujemnej (C-). Biorąc pod uwagę straty, obliczamy zapotrzebowanie na ~200 μL spasożytowanej krwi na każdy badany związek.
  2. W studzienkach kontroli ujemnej dodaj niezakażoną krew myszy w stosunku 1:20 (v:v, krew:próbka). Delikatnie homogenizować.
  3. Inkubować w temperaturze 21 °C przez 6 godzin lub 24 godziny.
  4. Wykonać test luminescencji, jak opisano w sekcji 4.

7. Analiza danych - oznaczanie IC 50

UWAGA: IC50 definiuje się jako stężenie związku wymagane do zahamowania 50% aktywności biologicznej/inhibicji. W tym teście hamowanie odnosi się do zmniejszenia konwersji ookinte. Dane są reprezentowane jako sigmoidalna krzywa dawka-odpowiedź, gdzie oś X reprezentuje stężenie związku (przekształcone logarytmicznie), a oś Y reprezentuje % inhibicji.

  1. Obliczyć % zahamowania zgodnie z opisem w sekcji 5 krok 5.3.
  2. Otwórz oprogramowanie i utwórz tabelę XY.
  3. Ustaw opcje osi Y na Wprowadź 3 replikowane wartości w równoległych podkolumnach.
  4. Wklej dane, gdzie X oznacza stężenie związku, a Y oznacza % inhibicji (rysunek 5A).
  5. Na pasku menu kliknij Analizuj i wybierz Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej), a następnie Krzywe dawka-odpowiedź - Hamowanie i [inhibitor] a odpowiedź znormalizowana - zmienne nachylenie; kliknij OK.
  6. W lewym panelu obserwuj krzywą dawka-odpowiedź danych. Zastosuj żądaną personalizację, taką jak zmiany kolorów i formaty punktów.
  7. Znajdź tabelę dopasowania Nonlin , aby znaleźć obliczony IC50 i 95% przedział ufności (95% CI) (Rysunek 5B).

figure-protocol-5
Rysunek 5: Krzywa dawka-odpowiedź PyAz90. % inhibicji mierzono w funkcji stężenia PyAz90 (μM) w skali logarytmicznej. Krzywa esowata reprezentuje dopasowane dane użyte do wyznaczenia IC50, który wynosił 0,013 μM (95% przedział ufności: 0,012-0,014 μM). Punkty danych reprezentują średnią ± błąd standardowy średniej z kontrprób doświadczalnych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wytwarzanie pasożytów Ookluc umożliwia ocenę nowych kandydatów na leki przeciwgruźlicze z perspektywy nieoferowanej przez istniejące testy, w szczególności w ocenie wpływu związków na aktywację gamet, zapłodnienie i tworzenie zygoty8. Rycina 2 i Rycina 3 ilustrują zdolność metody do badania przesiewowego panelu związków pod kątem stadiów płciowych pasożyta w sposób wysokoprzepustowy, ułatwiając id...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Większość metod HTS stosowanych do opracowywania nowych związków gruźlicy koncentruje się na hamowaniu gametocytogenezy lub aktywności gametocytobójczej. Do tej pory opracowano tylko dwa modele P. berghei, które pozwalają na ocenę funkcji gametocytów, gametogenezy, tworzenia zygoty i morfogenezy ookinety5.

Jeden z tych modeli jest podobny do Ookluc, ponieważ wykorzystuje reporter fluorescencyjny połączony z promotorem ctrp 17...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Projekt ten został wsparty dotacjami z Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2021/06769-0) oraz Instituto Serrapilheira (grant G-1709-16618).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichZobacz materiał D8418
GraphPad Prism w wersji 10.0.0 dla WindowsGraphPad Software, Boston, Massachusetts, Stany Zjednoczone
Sól sodowa heparyny z błony śluzowej jelit świńSigma-AldrichZobacz materiał H3393
HEPESY (1 m)Thermo Scientific15630106
HipoksantynaSigma-AldrichZobacz materiał H9636
Myszy------Samice myszy BALB/c w wieku od 3 do 5 tygodni
System oznaczania lucyferazy Nano-GloPreparat PromegaZobacz materiał N1110
Penicylina − Streptomycyna − Stabilizowany roztwór neomycynySigma-AldrichZobacz materiał P4083
Czytnik mikropłytek POLARStar Omega BMG Labtech----
RPMI 1640 Medium, suplement GlutaMAXThermo Scientific61870036
Kwas ksanturenowySigma-AldrichD120804

Bibliografia

  1. World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024 (2025).
  2. Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments. Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).
  3. Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era. Vaccines. 11 (9), 1452(2023).
  4. Ménard, R., et al. Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity. Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).
  5. Appetecchia, F., et al. Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development. Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).
  6. Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).
  7. Delves, M., et al. The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites. PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).
  8. Calit, J., et al. Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds. Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).
  9. Calit, J., et al. Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc. Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).
  10. Lima, M. N. N., et al. Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits. Front Chem. 7, 773(2019).
  11. Ferreira, L. T., et al. Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparum and P. vivax. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).
  12. Krishnan, K., et al. Torin 2 derivative, NCATS-SM3710, has potent multistage antimalarial activity through inhibition of P. falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (Pf ACS Pharmacol). Transl Sci. 3 (5), 948-964 (2020).
  13. Calit, J., et al. Pyrimidine azepine targets the Plasmodium bc1 complex and displays multistage antimalarial activity. JACS Au. 4 (10), 3942-3952 (2024).
  14. Lima, M. N., et al. Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria. Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).
  15. Ferreira, L. T., et al. A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants. PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).
  16. Blagborough, A. M., et al. Assessing transmission blockade in Plasmodium spp. Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).
  17. Azevedo, R., et al. Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds. Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).
  18. Gaitán, X. A., et al. Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen. Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiewy wysokoprzepustowestadia p cioweaktywacja gametocyt wtest luminescencyjnyrozw j ookinet wwyznaczanie IC50krzywa dawka odpowiedczytnik p ytek

Powiązane artykuły