Artykuł metodologiczny

Szybka dyssekcja i dysocjacja nabłonka węchowego myszy w celu uzyskania zawiesin jednojądrowych

DOI:

10.3791/68472

⸱

1 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genetics and Genomics Graduate Program, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 4Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 5Cytometry and Cell Sorting Core, Baylor College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiono uproszczony protokół rozwarstwiania i dysocjacji mysiego nabłonka węchowego w celu sekwencjonowania jednojądrowego RNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysi nabłonek węchowy jest początkowym punktem wejścia układu węchowego, w którym znajdują się różne typy komórek, w tym węchowe neurony czuciowe, ich regenerujące się komórki progenitorowe i komórki podporowe. Węchowe neurony czuciowe przekształcają chemiczne substancje zapachowe w sygnały neuronowe, jednak mechanizmy leżące u podstaw rozwoju i obrotu tych komórek, tworzenia synaps z opuszką węchową i regulowania ich receptorów zapachowych pozostają obszarami intensywnych badań. Zlokalizowany na grzbietowej stronie jamy nosowej nabłonek węchowy przylega do skomplikowanych struktur kostnych zwanych małżowinami. Anatomia ta stwarza wyjątkowe wyzwania dla jego ekstrakcji i dysocjacji, zwłaszcza w kontekście przygotowania żywotnych zawiesin jednokomórkowych. Ponieważ protokoły zawieszenia pojedynczych komórek często obejmują etapy przygotowawcze (np. dysocjacja papainy, FACS), które mogą stresować żywotność komórek i/lub opóźniać przygotowanie biblioteki, minimalizacja czasu ekstrakcji tkanek ma kluczowe znaczenie. W artykule przedstawiono uproszczoną metodę szybkiego rozwarstwienia nabłonka węchowego oraz protokół generowania wysokiej jakości zawiesin jednojądrowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysi nabłonek węchowy (OE) jest niezbędnym składnikiem układu węchowego i jest odpowiedzialny za wykrywanie i przekazywanie sygnałów zapachowych do ośrodkowego układu nerwowego. Jego najbardziej powierzchowna warstwa zawiera rzęski wykrywające zapachy węchowych neuronów czuciowych, które są pokryte warstwą śluzu i otoczone podporowymi komórkami sustentakularnymi i mikrovillarowymi 1,2. OSN są dwubiegunowe, rozciągając swoje rzęski wierzchołkowo, tworząc siatkę w warstwie śluzu, a ich aksony zasadniczo przez kostną płytkę grzebienia, aby połączyć się w kłębuszki nerkowe w opuszce węchowej. Te kłębuszki nerkowe ....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z Baylor College of Medicine IACUC. Użyto samic myszy C57BL/6J (JAX:000664). Szczegółowe informacje na temat odczynników i wyposażenia są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Rozwarstwienie nabłonka węchowego

  1. Zacznij od głębokiego znieczulenia myszy przy użyciu dowolnej preferowanej metody (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami). Potwierdź chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia mocnym szczypnięciem palca u nogi i przystąp do perfuzji przezsercowej co najmniej 10 ml lodowatego 1x PBS. Us....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zapewnić kontekst anatomiczny do sekcji i analizy, szwy i kości czaszki myszy C57BL/6, a także centralna część nabłonka węchowego (OE), zostały zwizualizowane i oznaczone kolorami (ryc. 1). Jedna strona każdego obrazu została opatrzona adnotacjami, aby podkreślić odpowiednie szwy, kości i małżowiny, podczas gdy druga strona pozostała nieoznaczona w celach informacyjnych. Przekrój OE został przygotowany zgodnie z ustalonymi protokołami20, a identyfikacja małżowiny .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj procedura umożliwia konsekwentne usuwanie nienaruszonego OE po dosercowej perfuzji 1x PBS. Stanowi to znaczną poprawę szybkości w porównaniu z poprzednimi metodami16 i ma szczególne znaczenie, biorąc pod uwagę, że OSN zaczynają się degenerować po aksotomii2, co ma miejsce podczas usuwania mózgu.

Staranne usunięcie kości czołowej, przedszczękowej i nosowej ma kluczowe znaczenie dla konsekwentnego usuwania nienaruszonego OE. Dodatkowo.......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że badanie to zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Baylor College of Medicine's Single Cell Genomics Core. Projekt ten był wspierany przez Cytometry and Cell Sorting Core w Baylor College of Medicine dzięki finansowaniu z NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 i SS10 RR024574) oraz pomocy eksperta Joela M. Sederstroma. Projekt ten został częściowo sfinansowany przez NIH/NICHD [P50HD103555], NIH/NINDS [5R01NS078294] oraz NIH/NIA [5F30AG076265]. Rysunek 3 został utworzony w BioRender. https://BioRender.com/5418352.

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka wirówkowa 15 mlLeczenie komórkowe229411
Szczypce do kości Narzędzia naukowe16102-11
Bonn Miniaturowe nożyczki do tęczówki Miltex 18-1392
Roztwór albuminy surowicy bydlęcejSigma-AldrichA1595 (wersja angielska)
Kleszcze Dumont #3 Narzędzia naukowe11231-30
Samica myszy C57BL/6JLaboratorium JacksonaJAX:000664
Rurki gentleMACS C Miltenyi Biotec130-093-237
GentleMACS Octo Disocjator Miltenyi Biotec130-096-427
Filtry siatkowe MACS SmartStrainers 30 um Miltenyi Biotec130-098-458
Filtry siatkowe MACS SmartStrainers 70 um Miltenyi Biotec130-098-462
Mikro Friedman-Pearson RongeursNarzędzia naukowe16220-14
Bufor do ekstrakcji jąder Miltenyi Biotec130-128-024
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x bez wapnia i magnezu, pH 7,4 i plusmn; 0.1Corning21-040-CV
Inhibitor RNAzy Protektora Millipore Sigma3335402001
Wirówka z chłodzeniem Sorvall Legend XTRThermo Scientific50119927-5

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Graziadei, P. P. C., Graziadei, G. A. M. Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neurons. J Neurocytol. 8 (1), 1-18 (1979).
  2. Monti Graziadei, G. A., Graziadei, P. P. C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sekcja myszyzawiesina pojedynczych j der kom rkowychsekwencjonowanie pojedynczych kom rekneurony sensoryczne w chudysocjacja tkankicytometria przep ywowageny markerowejama nosowakom rki progenitorowe

Powiązane artykuły