Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68482

⸱

15 lipca 2025

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Schepens Eye Research Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodologię izolowania siatkówki od oka myszy w celu przeprowadzenia rozszerzonych eksperymentów ex vivo. Protokół ten kładzie nacisk na udostępnienie tego wymagającego technicznie podejścia badaczom, którzy chcieliby skorzystać z możliwości badawczych, jakie daje utrzymanie gleju siatkówki in situ w żywej tkance.

Streszczenie

Rola gleju w jaskrze jest coraz bardziej ważnym tematem badawczym, ale wiele pozostaje niewiadomych na temat tego, jak populacje tych komórek podporowych - mianowicie astrocyty i mikroglej - wpływają na przeżycie komórek zwojowych siatkówki. Podczas gdy modele in vivo i in vitro zapewniają pewien stopień wglądu, oba podejścia mają istotne ograniczenia, takie jak wpływ obwodowej odpowiedzi immunologicznej w pierwszym przypadku i zmiany funkcji fizjologicznych wywołane izolacją i hodowlą komórek w przypadku drugiego. Aby zminimalizować te czynniki zakłócające, opracowaliśmy system eksplantacji siatkówki ex vivo, w którym astrocyty, mikroglej i inne typy komórek siatkówki mogą być utrzymywane in situ przez okres co najmniej 3 dni, umożliwiając ukierunkowane badania z większą przepustowością niż jest to zwykle możliwe w przypadku modeli in vivo. Co najważniejsze, podejście to jest wysoce podatne na metodologie, które byłyby trudne lub niewykonalne w przypadku żywego zwierzęcia, a jednocześnie pozostaje zgodne z powszechnymi dalszymi testami nienaruszonej tkanki nerwowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół odpowiedni do izolacji i hodowli nienaruszonych eksplantatów siatkówki wraz z reprezentatywnymi wynikami mikroskopii immunofluorescencyjnej dokumentującymi zmiany zachodzące przez komórki glejowe i zwojowe siatkówki w siatkówce ex vivo.

Wprowadzenie

Siatkówka światłoczuła, przedłużenie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) znajdująca się w tylnej części oka, jest niezbędna dla wzroku, ale podatna zarówno na ostre urazy, jak i przewlekłe choroby. Podobnie jak w przypadku innych regionów OUN, neurony w dorosłej siatkówce nie są zastępowane w przypadku utraty, a komórki zwojowe siatkówki (RGC), które agregują i przekazują informacje wizualne do mózgu, są szczególnie podatne na dysfunkcję i śmierć w jaskrze, co powoduje nieodwracalną utratę wzroku1,2. Jaskra jest główną przyczyną ślepoty na całym świecie3, jednak pomimo niszczycielskiego wpływu na osoby dotknięte chorobą i ogólnych kosztów dla społeczeństwa, wiele pozostaje niewiadomych na temat tego, jak wczesne stadia choroby przyczyniają się do utraty RGC4. Rola gleju jest głównym obszarem badań w patofizjologii jaskry, ponieważ te nieneuronalne komórki podporowe są niezbędne do przeżycia RGC5, ale ulegają fenotypowym zmianom w chorobie, które mogą zmniejszać korzystne zachowanie6 lub nawet napędzać przyjęcie szkodliwych fenotypów7. Chociaż termin glej obejmuje szereg wyspecjalizowanych typów komórek w całym OUN8, można je ogólnie podzielić na dwie kategorie - te, które dzielą linię rozwojową z neuronami i zapewniają wsparcie troficzne, energetyczne i strukturalne9, oraz te o pochodzeniu szpikowym, które wykonują specjalistyczne zadania związane z nadzorem immunologicznym i reagowaniem10. Przedstawiciele obu kategorii - astrocyty i komórki Müllera w pierwszej, mikroglej w drugiej - zasiedlają siatkówkę5 i przechodzą poważne zmiany w jaskrze, które rodzą istotne pytania o ich rolę w progresji choroby i przeżyciu RGC11.

Próby odpowiedzi na te pytania są częściowo utrudnione przez wewnętrzne cechy gleju siatkówki, które stanowią wyzwanie zarówno dla badań in vivo, jak i in vitro. W przeciwieństwie do neuronów, są one stosunkowo ciche elektrycznie, co sprawia, że podejścia takie jak ERG, które umożliwiają funkcjonalną ocenę RGC i fotoreceptorów in vivo, nie nadają się do badania zmian w funkcji i zachowaniu gleju. I chociaż dostępne są modele jaskry indukowalne12 i spontaniczne13 jaskry, wiele pozostaje niewiadomych na temat zmian w gleju w najwcześniejszych punktach choroby, które mogą poprzedzać wykrywalną utratę RGC, problem potęgowany przez zmienną penetrację stanu chorobowego w wielu z tych modeli. Co więcej, dowody zarówno kliniczne, jak i eksperymentalne dotyczące jaskry sugerują wkład obwodowych komórek odpornościowych, które mogą być trudne do odróżnienia od komórek mikrogleju, pomimo wskaźników, że mogą one działać w różnych "kierunkach", wpływając na postęp choroby14,15.

Wyzwania również obfitują w badanie gleju siatkówki in vitro. Chociaż izolacja i hodowla astrocytów16,17 i microglia18 z mózgu są dobrze znane, ostatnie prace podkreślają rozległą heterogeniczność glejową między regionami OUN, zwłaszcza w astrocytach19, a fenotypy obecne w jednym regionie mogą nie być obecne w gleju z innego, takiego jak retina20,21. Jednak bezpośrednia izolacja astrocytów siatkówki i mikrogleju do badań jest szczególnie trudna, ponieważ oba typy komórek są stosunkowo rzadkie - każdy z nich stanowi mniej niż 1% z szacowanych 6,5 miliona komórek w siatkówce myszy22,23,24. Ponadto, w przeciwieństwie do neuronów, komórki glejowe są bardzo plastyczne i szybko przystosowują się do dramatycznych zmian w swoim otoczeniu16,18,25; W rezultacie, zachowania obserwowane w tych komórkach in vitro mogą reprezentować specyficzne adaptacje do ich nowego środowiska, a nie wzorce fenotypowe, które zwykle byłyby obserwowane w zdrowiu lub chorobie. Biorąc pod uwagę ograniczenia zarówno eksperymentów in vivo, jak i pierwotnej hodowli gleju siatkówki, poszukiwaliśmy podejścia pośredniego - eksplantatów siatkówki - w którym glej, RGC i inne elementy siatkówki są zachowane in situ w kontekście ex vivo. W porównaniu z modelami in vivo, podejście to oferuje skrócony eksperymentalny przebieg czasowy26, umożliwia bezpośrednią eksperymentalną manipulację glejem siatkówki27 i pozwala uniknąć potencjalnie mylącego wpływu infiltracji obwodowych komórek odpornościowych14. I odwrotnie, w przeciwieństwie do pierwotnej hodowli komórkowej, zakłócenia środowiska zewnątrzkomórkowego są minimalne, a glej pozostaje nienaruszony i morfologicznie rozpoznawalny, eliminując wyzwania związane z zasadniczo odrastaniem i identyfikacją tych komórek po rozerwaniu enzymatycznym i mechanicznym16,25.

W stosunku do wcześniej opisanych metodologii eksplantacji siatkówki, to podejście kładzie nacisk na niezawodność techniczną, odtwarzalność i maksymalizację 'przyjazności dla użytkownika' podejścia w celu poprawy dostępności26,28. W osobistej komunikacji z innymi badaczami stwierdziliśmy, że wyzwania techniczne związane z obsługą żywej siatkówki stanowią główną przeszkodę dla wielu osób chcących wykorzystać eksplantaty, podczas gdy utrzymanie eksplantowanej siatkówki w hodowli było stosunkowo proste dla grup z odpowiednimi urządzeniami do hodowli komórek. W związku z tym protokół ten zawiera szereg innowacji mających na celu skrócenie krzywej uczenia się związanej z izolacją siatkówki i umożliwienie naukowcom szybszego rozpoczęcia zbierania danych eksperymentalnych. Wreszcie, chociaż położyliśmy szczególny nacisk na potencjał tego modelu eksplantatu do badania zachowania gleju siatkówki i scharakteryzowaliśmy go głównie za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, inne typy i struktury komórek siatkówki są również w dużej mierze konserwatywne, a eksplantowane siatkówki pozostają podatne na szeroki zakres dodatkowych technik badawczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Schepens Eye Research Institute (protokół nr 2022N000030, zatwierdzony 4.03.2025). Postępowanie ze zwierzętami odbywało się zgodnie z oświadczeniem Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i nad wzrokiem.

UWAGA: Rysunek 1 przedstawia kluczowe etapy izolacji żywej siatkówki z enukleowanego oka myszy.

Schemat procesu ekstrakcji siatkówki; krok po kroku z narzędziami do dysekcji, pokazany w układzie z szalką Petriego.
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie kluczowych etapów izolacji żywej siatkówki z enukleowanego oka myszy. Odpowiednie numery poszczególnych kluczowych etapów zostały zamieszczone w okręgach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie

  1. Zdezynfekuj pipetę o pojemności 1 mL oraz parę pęset kątowych i umieść je w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Będą one potrzebne w sekcji 3 protokołu.
  2. Zmodyfikuj pipetę transferową, przecinając ją prostopadle w poprzek trzonia około 2 cm poniżej zbiorniczka, w miejscu, gdzie otwór jest najszerszy, aby skrócić pipetę i poszerzyć otwór. Upewnij się, że cięcie jest czyste, aby siatkówka nie zahaczała o krawędź.
    UWAGA: Narzędzie to można zachować do ponownego użycia, jeśli jest czyste i zostanie przepłukane sterylną wodą pomiędzy zastosowaniami.
  3. Przygotuj aseptycznie w komorze z laminarnym przepływem powietrza 50 ml pożywki do eksplantów, uzupełniając 47,5 mL pożywki Neurobasal o 500 µL suplementu N-2, 1 mL suplementu B-27, 500 µL Glutamax oraz 500 µL mieszanki penicyliny i streptomycyny (stężenie końcowe 100 U/mL penicyliny i 100 mg/mL streptomycyny).
    UWAGA: Przygotowuj świeżą pożywkę do eksplantów dla każdej serii izolacji; nadmiar pożywki można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia i wykorzystać do wymian pożywki, jeśli będzie to konieczne. Po otwarciu wymień niewykorzystaną pożywkę Neurobasal po 1 miesiącu. Suplementy N-2 i B-27 należy przechowywać w stanie zamrożonym w pojedynczych alikwotach, unikając cykli zamrażania i rozmrażania.
  4. W komorze z laminarnym przepływem powietrza aseptycznie przygotuj płytkę(i) hodowlaną, wkładając insert do każdego otworu, który będzie użyty; operuj za pomocą „ wypustek” wystających z krawędzi insertu, aby uniknąć dotykania powierzchni, które będą miały kontakt z pożywkami hodowlanymi.
    1. Do insertu dodaj 1 mL pożywki do eksplantów, a następnie dodatkowe 3 mL bezpośrednio do otworu płytki. Do niewykorzystanych otworów dodaj 2-3 mL sterylnej wody, aby kontrolować parowanie.
    2. Przenieś płytkę(i) do inkubatora w temperaturze 37 °C przy 5% CO2, aby ustabilizowały się przez około 30 min przed izolacją tkanki.
  5. Przygotuj kwadraty z filtra, aby stworzyć podłoże do stabilizacji i transferu tkanki. Wyjmij filtr z zestawu do filtracji nakładanego na butelkę, przecinając materiał wzdłuż obwodu żyletką lub skalpelem. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć skaleczeń lub uszkodzenia filtra poprzez zagięcie lub rozdarcia.
    UWAGA: Usunięcie przezrozystego plastikowego zbiorniczka za pomocą mocnej żyletki poprzez przecięcie bardziej plastycznego, nieprzezroczystego plastiku w miejscu, gdzie adapter z gwintem łączy się ze zbiorniczkiem, upraszcza proces wyjmowania, jednak należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec urazom.
    1. Po wycięciu filtra wyjmij go pęsetą. Zwróć uwagę na orientację filtra podczas i po wyjmowaniu; strona matowa (skierowana w stronę zbiorniczka) powinna być zwrócona do góry podczas montażu siatkówki w kroku 2.16 do transferu.
    2. Potnij filtr na małe kwadraty o wymiarach około 7 mm × 7 mm; każdy eksplant siatkówki będzie wymagał jednego kwadratu. Namocz kwadraty w sterylnej wodzie w 100 mm szalce Petriego przez co najmniej 20 min.
      UWAGA: Kwadraty z filtra mogą pozostawać zanurzone w sterylnej wodzie do 1 tygodnia przed użyciem. Ze względu na tendencję kwadratów z filtra do gromadzenia wysokich ładunków elektrostatycznych przed zanurzeniem, przygotuj tylko tyle kwadratów, ile jest potrzebnych. Pozostały suchy materiał filtracyjny można przechowywać bezterminowo w sterylnej 100 mm szalce Petriego do późniejszego użycia.

2. Izolacja i montaż

  1. Uśmiercić mysz za pomocą zatwierdzonej metody, a następnie potwierdzić śmierć drugą metodą; w niniejszym badaniu zastosowano uduszenie CO2, a następnie zwichnięcie szyi. Wyciąć oba gałki oczne za pomocą zakrzywionych pęset o tępym końcu i umieścić je w sterylnym PBS.
  2. Przygotować stanowisko pracy, napełniając 100-milimetrową szalkę Petriego sterylnym PBS i umieszczając ją na stoliku binokularowego mikroskopu sekcyjnego.
    1. Wyciąć pasek chłonnej ściereczki laboratoryjnej o szerokości 1 cm i zanurzyć go w szalce, aby służył jako stabilizujące podłoże.
    2. Przenieść jedno oko do szalki sekcyjnej, drugie pozostawić w PBS i umieścić na lodzie lub w lodówce w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ze względu na wrażliwość siatkówki na przedłużony odstęp czasu po śmierci, zaleca się uśmiercanie jednej myszy na raz.
  3. Ustawić i unieruchomić oko. Używając pęsety, przesunąć oko na zanurzoną ściereczkę laboratoryjną, co pomoże w stabilizacji.
    1. Zidentyfikować odpowiedni punkt uchwytu, chwycić go pęsetą kątową i delikatnie obrócić oko tak, aby było trzymane z boku lub, idealnie, od dołu. Upewnić się, że oś przednio-tylna (tj. od rogówki do nerwu wzrokowego) znajduje się w pozycji poziomej. Taka orientacja poprawia widoczność i minimalizuje nacisk na oko podczas sekcji.
      UWAGA: Jeśli to możliwe, chwytać tkankę pozaorbitową, aby uniknąć przebicia lub ściśnięcia oka, preferując mięśnie lub spojówkę zamiast nerwu wzrokowego lub tkanki tłuszczowej.
  4. Podtrzymując oko pęsetą kątową, upewnić się, że jest ono całkowicie zanurzone i stabilnie unieruchomione. Wykonać nacięcie końcówką skalpela nr 11 równolegle i około 0,5 mm za limbusiem, w miejscu przejścia rogówki w twardówkę.
    UWAGA: Nacięcie powinno być na tyle duże, aby zmieściła się w nim końcówka jednego ramienia nożyczek sprężynowych. Ponieważ ostrość końcówki skalpela jest kluczowa dla czystego przebicia gałki, należy wymieniać ostrze po każdych dwóch siatkówkach.
    1. Włożyć jedno ramię nożyczek sprężynowych do wnętrza gałki i rozpocząć cięcie okólne wokół limbusa, delikatnie repozycjonując oko pęsetą w razie potrzeby.
      UWAGA: Cięcie to powinno być jak najbardziej proste i równoległe do limbusa; repozycjonowanie oka może wymagać odłożenia nożyczek i użycia jednej pary pęset w każdej ręce. Po odsłonięciu siatkówkę należy utrzymywać w zanurzeniu przez cały czas trwania sekcji.
  5. Po okrążeniu oka cięciem, ostrożnie usunąć segment przedni i soczewkę, a następnie obrócić kielich gałki tak, aby był skierowany ku górze, co ułatwi inspekcję wizualną i usunięcie ciała szklistego. Jeśli pozostał przymocowany dłuższy odcinek nerwu wzrokowego, przyciąć go do krótszej długości (1-2 mm), aby ułatwić ten proces.
  6. Obejrzeć siatkówkę pod kątem widocznych uszkodzeń, a komorę ciała szklistego pod kątem zanieczyszczeń, takich jak zmieienione komórki z nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) lub naczyniówki, które mogły przedostać się do środka podczas usuwania segmentu przedniego. Użyć pęsety kątowej, aby unieruchomić kielich gałki w tej pozycji.
    UWAGA: Dla uzyskania optymalnych wyników należy usunąć zanieczyszczenia z komory ciała szklistego oraz zminimalizować pozostałości ciała szklistego i przylegające szczątki ciała rzęskowego na obwodzie siatkówki. Może to być trudny proces; dodatkowe uwagi znajdują się w sekcjach „Recognizing and troubleshooting mechanical injury” oraz „Metabolic injury” w części Wyniki Reprezentatywne.
    1. Użyć zmodyfikowanej pipety transferowej, aby wypłukać komorę ciała szklistego za pomocą PBS w celu usunięcia drobnych zanieczyszczeń cząsteczkowych, unikając pęcherzyków powietrza poprzez utrzymywanie końcówki pipety poniżej powierzchni cieczy i zachowanie odpowiedniej ilości PBS w zbiorniku.
    2. Usunąć większe zanieczyszczenia za pomocą cienkiego pędzla akwarelowego, minimalizując kontakt z powierzchnią siatkówki. W razie potrzeby usunąć bardziej uporczywe zanieczyszczenia pęsetą o cienkim końcu; należy jednak unikać bezpośredniego kontaktu metalowych końcówek narzędzi z siatkówką, aby zapobiec uszkodzeniom.
  7. Po usunięciu widocznych zanieczyszczeń, kilkakrotnie (3-5 razy) wypłukać komorę ciała szklistego za pomocą pipety transferowej z PBS, jak opisano powyżej. Pozwoli to usunąć słabo przylegające ciało szkliste, które mogło pozostać po usunięciu zanieczyszczeń. Użyć cienkiego pędzla, aby delikatnie zbadać komorę, szczególnie w pobliżu obwodu, jeśli pozostały elementy ciała rzęskowego. Choć ciało szkliste jest optycznie przezroczyste, stawia ono opór włóknom pędzla, co pozwala na jego wykrycie w ten sposób.
    UWAGA: Cienka resztkowa warstwa ciała szklistego na siatkówce nie wydaje się negatywnie wpływać na izolację lub utrzymywanie siatkówki ex vivo, jednak obecność znacznych ilości na obwodzie siatkówki, często związana z resztkowymi strukturami ciała rzęskowego, może powodować zwijanie się siatkówki i utratę próbki, jeśli nie zostanie usunięta.
    1. Jeśli pozostały znaczne kieszonki ciała szklistego, użyć pędzla do jego usunięcia, delikatnie omiatając powierzchnię na zewnątrz w kierunku obwodu, upewniając się, że jeśli włókna pędzla dotkną siatkówki, dzieje się to pod płytkim kątem i pędzel jest prowadzony tak, aby wyciągać, a nie spychać ciało szkliste z komory.
      UWAGA: Usuwanie ciała szklistego wymaga szczególnie ostrożnego obchodzenia się, aby uniknąć uszkodzeń siatkówki, które mogą nie być widoczne makroskopowo; wskazówki dotyczące rozpoznawania i unikania takich uszkodzeń znajdują się w sekcjach „Recognizing and troubleshooting mechanical injury” oraz „Metabolic injury” w części Wyniki Reprezentatywne.
  8. Po oczyszczeniu komory ciała szklistego z zanieczyszczeń i pozostawieniu jedynie minimalnej ilości ciała szklistego, delikatnie oddzielić siatkówkę zewnętrzną od kielicha gałki, nadal stabilizując próbkę pęsetą kątową. Unikać uszkodzenia głowy nerwu wzrokowego i pozostawić tę strukturę nienaruszoną, aby zakotwiczyć siatkówkę.
    1. Użyć pary pęset, trzymając je w pozycji zamkniętej z zetkniętymi końcówkami, i delikatnie wsunąć je między siatkówkę a naczyniówkę, jeśli to możliwe korzystając z istniejącej już szczeliny powstałej podczas wcześniejszych czynności. Używać płaskich ramion pęsety, a nie końcówek, aby powiększyć kieszeń między siatkówką a naczyniówką, aż do momentu całkowitego oddzielenia tych struktur.
      UWAGA: Kłaść nacisk na ruchy boczne, zamiast pchać końcówkami, aby poszerzyć szczelinę między siatkówką a naczyniówką. Delikatne skręcanie pęsety podczas tych ruchów może poprawić oddzielanie, jednocześnie zmniejszając naprężenia ścinające wynikające z tarcia między pęsetą a tkanką.
  9. Po oddzieleniu siatkówki zewnętrznej od naczyniówki, kontynuować stabilizację próbki, używając drugiej pary pęset do pociągnięcia kielicha gałki (twardówki, naczyniówki itd.) w dół. Jeśli siatkówka została pomyślnie oddzielona, powinna pozostać na miejscu, zakotwiczona w głowie nerwu wzrokowego, podczas gdy kielich gałki może być trzymany jedną parą pęset. Jeśli siatkówka opada wraz z kielichem gałki, kontynuować delikatne badanie i oddzielanie punktów połączenia poza głową nerwu wzrokowego.
  10. Przy siatkówce zakotwiczonej w głowie nerwu wzrokowego, kontynuować unieruchamianie tkanki i użyć drugiej pary pęset, aby zmarszczyć kielich gałki poniżej głowy nerwu wzrokowego.
    1. Sprawdzić, czy żaden z fragmentów obwodu siatkówki nie jest zgięty z powodu nadmiaru ciała szklistego w kącie między siatkówką a jakąkolwiek pozostałością ciała rzęskowego. W razie potrzeby wypłukać komorę PBS za pomocą pipety transferowej, aby usunąć dodatkowe zanieczyszczenia i delikatnie użyć pędzla do rozprostowania tkanki i wyeliminowania nadmiaru ciała szklistego, uważając, aby nie szarpać tkanki nadmiernie.
  11. Gdy siatkówka zostanie odsłonięta z obu stron, użyć nożyczek sprężynowych do wykonania serii nacięć odciążających, rozmieszczonych w odstępach około 90°, biegnących w linii prostej od obwodu w kierunku głowy nerwu wzrokowego, zatrzymując się około 1 mm przed środkiem. Minimalizuje to przecięcie aksonów komórek zwojowych siatkówki, co poprawia jakość hodowanych eksplantów.
  12. Podtrzymując zanurzoną tkankę na miejscu, delikatnie usunąć ściereczkę laboratoryjną, używając pęsety, aby odsunąć ją od tkanki bocznie przed wyjęciem z szalki. Unikać kontaktu z siatkówką, aby zapobiec jej przywarciu do ściereczki i możliwej utracie próbki.
  13. Następnie, nadal trzymając tkankę, użyć nożyczek sprężynowych do przecięcia nerwu wzrokowego bezpośrednio pod siatkówką, a następnie usunąć resztę kielicha gałki z szalki.
  14. Po odizolowaniu siatkówki od reszty oka, napełnić 35-milimetrową szalkę Petriego PBS i za pomocą pęsety umieścić na dnie kwadrat filtra, stroną matową (bardziej chropowatą) do góry. Należy uważać, aby nie zagnieść filtra, ponieważ może to utrudnić jego wykorzystanie jako podłoża do przesuwania siatkówki.
  15. Delikatnie zassać siatkówkę pipetą transferową i ostrożnie przenieść ją do szalki 35 mm. Używając pędzla, ustawić siatkówkę tak, aby jej wewnętrzna powierzchnia była skierowana do góry, a tkanka spoczywała bezpośrednio nad kwadratem filtra.
  16. Powoli odsysać PBS z szalki za pomocą pipety transferowej, aby opuścić siatkówkę na filtr. W razie potrzeby przerwać czynność, aby skorygować ułożenie tkanki, a następnie kontynuować, aż siatkówka osiądzie na filtrze.
    UWAGA: Szybkie odsysanie może spowodować gwałtowny ruch boczny siatkówki, co prowadzi do uszkodzeń lub utraty tkanki. Cała siatkówka musi spoczywać na kwadracie, aby uniknąć uszkodzeń; jednak jeśli siatkówka osiądzie w problematycznej pozycji, można ponownie dodać PBS do szalki, aż siatkówka zostanie zawieszona, i spróbować zamontować ją ponownie.
  17. Gdy siatkówka osiądzie na filtrze, użyć pędzla, aby rozprostować wszelkie fragmenty obwodowe siatkówki, które mogły się zwinąć. Ostrożnie zrównoważyć poziom PBS tak, aby siatkówka nie przemieszczała się łatwo z filtra, zapewniając jednocześnie, że pozostało go wystarczająco dużo, aby próbka nie wyschła, a pędzel mógł poruszać się gładko bez uszkadzania wewnętrznej warstwy siatkówki.
  18. Ponownie obejrzeć siatkówkę pod kątem zanieczyszczeń. Aby uniknąć uszkodzeń, czyścić siatkówkę bez bezpośredniego kontaktu, używając pipety transferowej do nakraplania PBS na siatkówkę z odległości około 1 cm nad tkanką. Powinno to wypłukać wszelkie pozostałe zanieczyszczenia, ale jeśli do szalki zostanie dodane zbyt dużo PBS, siatkówka może ponownie wypłynąć. Jeśli tak się stanie, ponownie wykonać aspirację, aby ponownie zamontować tkankę.
    UWAGA: Próbki „pozorne” (sham) można przygotować, przenosząc siatkówki do płytki 24-dołkowej w celu fiksacji, blokowania/permeabilizacji i barwienia przeciwciałami, zgodnie z opisem w innym miejscu21. Takie kontrole pozorne są przydatne do rozwiązywania problemów związanych z mechanicznym uszkodzeniem siatkówki, które może wystąpić podczas izolacji.

3. Przeniesienie do pożywek hodowlanych i utrzymanie

  1. Zamknij pokrywkęy szalki 35 mm przed przeniesieniem do komory z laminarnym przepływem powietrza, trzymając szalkę poziomo, aby zapobiec odseparowaniu siatkówki od filtra. Jeśli tak się stanie, powtórz proces montażu zgodnie z powyższą instrukcją.
  2. Umieść zamkniętą szalkę 35 mm zawierającą siatkówkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza, dbając o to, aby nie dotykać żadnego sprzętu ani powierzchni wewnątrz komory przed dezynfekcją lub zmianą rękawiczek.
  3. Zdezynfekuj rękawiczki etanolem i/lub wymień je, a następnie przenieś płytkę 6-dołkową z uprzednio naniesionym medium do eksplantacji z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza. Wykonaj kroki 3.4 i 3.5 wewnątrz komory, używając narzędzi umieszczonych tam w kroku 1.1.
  4. Zdejmij pokrywkę z szalki 35 mm zawierającej siatkówkę i za pomocą pęsety kątowej ostrożnie podnieś kwadrat filtra, nie dotykając bezpośrednio siatkówki. Zdejmij pokrywkę z płytki 6-dołkowej i umieść filtr nad środkiem wkładu w odpowiednim dołku, a następnie powoli opuść go do medium. W tym kroku siatkówka oddzieli się od filtra i będzie unosić się tuż poniżej granicy fazy powietrze-ciecz.
  5. Po oddzieleniu się siatkówki od filtra powoli odsuń filtr od siatkówki i wyjmij go z medium. Za pomocą pipety 1 mL usuń 500 µL medium z wkładu, aby zapewnić płaskie ułożenie siatkówki poprzez uwięzienie jej między dnem wkładu a granicą fazy powietrze-ciecz.
  6. Nałóż pokrywkę na płytkę i wprowadź ją z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C z 5% CO2, dbając o to, aby siatkówka znajdowała się blisko środka dołka. W jednej płytce można przechowywać do 6 siatkówek.
    UWAGA: Jeśli eksplanty mają być przechowywane przez 24 h lub krócej, można je pozostawić w inkubatorze do końca eksperymentu. W przypadku dłuższego przechowywania zaleca się wymianę 50% medium po 1 dniu in vitro oraz w kolejnych dniach naprzemiennie.

4. Fixacja do immunobarwienia (opcjonalnie)

  1. W przypadku wykonywania immunostainingu należy odnieść się do poniższych kroków dotyczących fiksacji; choć immunostaining można przeprowadzić zgodnie z parametrami opisanymi wcześniej dla siatkówek zamontowanych na płasko21, fiksacja wyeksplantowanej siatkówki wymaga uwzględnienia specyficznych kwestii.
  2. Wyjąć wkłady do hodowli komórkowych z eksplantatami i pożywką z 6-dołkowej płytki hodowlanej i umieścić je na nieporowatej powierzchni (np. plastikowej pokrywce płytki hodowlanej), którą można będzie odpowiednio zutylizować po fiksacji, ponieważ wkłady są lekko porowate i niewielkie ilości utrwalacza przenikną na tę powierzchnię.
  3. Ostrożnie usunąć pożywkę hodowlaną z wkładów, a następnie dodać 1 mL 4% paraformaldehydu (PFA) do każdego z nich. Pozostawić siatkówki do fiksacji na 15 min w dygestorium, następnie usunąć PFA i zutylizować go zgodnie z zasadami instytucji.
    OSTRZEŻENIE: Paraformaldehyd jest substancją niebezpieczną i prekursorem formaldehydu, znanego kancerogenu. Należy zachować ostrożność i przeprowadzać fiksację w dygestorium, stosując odpowiednie środki ostrożności.
  4. Przemyć siatkówki 3 razy (po 5 min każdorazowo) PBS w celu usunięcia PFA, a następnie za pomocą zmodyfikowanej pipety transferowej przenieść siatkówki w PBS do poszczególnych dołków w płytce 24-dołkowej w celu blokowania, permeabilizacji i immunostainingu, zgodnie z opisem w innej publikacji21. Zplastikowane elementy zanieczyszczone PFA (końcówki pipet, wkłady oraz nieporowatą powierzchnię użytą podczas fiksacji) zutylizować zgodnie z zasadami instytucji.
    UWAGA: Pipetę transferową można zachować do przeniesienia ufiksowanych i zabarwionych siatkówek na szkiełko w celu montażu i obrazowania. Chociaż nie powinna ona mieć bezpośredniego kontaktu z PFA, zaleca się stosowanie oddzielnych pipet transferowych do manipulacji tkanką żywą i ufiksowaną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W skali makroskopowej wyeksplantowane siatkówki pozostają w zasadzie niezmienione zarówno w 1., jak i 3. dniu, choć w tym drugim terminie stają się stosunkowo kruche, co wymaga ostrożnego obchodzenia się z nimi przed fiksacją lub innymi końcowymi etapami eksperymentu. Siatkówki powinny być stosunkowo płaskie, bez zagięć (które mogą prowadzić do miejscowych zaburzeń dyfuzji tlenu i składników odżywczych) i powinny być zawieszone w medium między powierzchnią styku powietrze-ciecz a wkładem do hodowli komórkowej. Do 3. dnia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podejścia do hodowli organotypowych32 , takie jak eksplantaty siatkówki, wykorzystują eksperymentalną elastyczność i szybki czas realizacji hodowli komórkowych, zachowując jednocześnie wiele z kontekstu in situ badań in vivo , co czyni je skuteczną drogą do badania złożonych interakcji między typami komórek. Przedstawiamy ten protokół jako punkt wyjścia dla badaczy, którzy mogą mieć duże doświadczenie z okiem i czuć się komfortowo manipulując stałą siatkówką, ale nie nową; W zwią...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

M.A.M. był wspierany przez NIH/NEI R01EY035312, Jaskrę Research Foundation Catalyst for a Cure Award, Fundację Melzy M. i Franka Theodore'a Barrów, Fundację Roberta M. Sinskeya, MD, Fundację Ruettgers Family Charitable Foundation oraz Fundację B.L. Manger. P.F.C. był wspierany przez NIH/NEI 2T32EY007145. Prace te były również możliwe dzięki grantowi NIH Core Grant for Vision Research P30 EY003176. Rysunek 1 został wygenerowany za pomocą Biorender. Autorzy pragną podziękować dr Nasirowi Uddinowi za opinie na temat manuskryptu oraz dr Qiurong Zhu za pomoc i wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#11 Ostrza skalpelaBard-Parker3,71,311
Piper 1 ml ('Pipetman P1000')GilsonF144059M
100 mm szalka PetriegoFalcon351029
16% paraformaldehyduTed Pella Inc18,505Rozcieńczony do 4% w celu utrwalenia
24-dołkowa płytkaFalcon353047Do utrwalania, blokowania i inkubacja przeciwciał
35 mm szalka PetriegoFalcon351008
6-dołkowa płytka i zestaw wkładekGreiner bio-one657641
Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-545-152Rozcieńczenie 1:800
Alexa Fluor 594 Osioł anty-IgG IgG (H+L) Wysoce zaadsorbowanykrzyżowo InvitrogenA-21209Rozcieńczenie 1:800
Alexa Fluor 594-F(ab')2 Osioł Anty-Mysi IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 715-586-150Rozcieńczenie 1:800
Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 706-605-148Rozcieńczenie 1:800
Alexa Fluor 647-F(ab')2 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 703-606-155Rozcieńczenie 1:800
Kleszcze kątowe ('5/45')FST / Dumont11251-35
Przeciwciało anty-Brn3a (mysz)ChemiconMAB15851:200 rozcieńczenie
Przeciwciało anty-CD206 (szczur)BioradMCA22351:200 rozcieńczenie
Przeciwciało anty-GFAP (kurczak)Abcamab46741:1000 rozcieńczenie
Anty-Iba1 przeciwciało (królik)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation019-197411:500 rozcieńczenie
Przeciwciało anty-Tmem119 (świnka morska)Systemy synaptyczne400 0041:500 rozcieńczenie
B-27, 50xGibco (Thermofisher)17504044
zakrzywione kleszcze ("Extra Fine Graefe)FST11152-10
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA9647Użyj 1% w/v do blokowania i inkubacji przeciwciał
Zestaw filtrów (0,2 i mikro; m aMembrana PES, filtr butelkowy 150 ml) FisherscientificFB12566508
Cienki pędzel, rozmiar 3/0Princeton Art & Brush Co.06435-1030
GlutaMaxGibco (Thermofisher)35050061
Chusteczki laboratoryjne (chusteczki Kim) KIMTECH34155
N-2, 100xGibco (Thermofisher)17502048
Neurobasal-A Medium, bez czerwieni fenolowejGibco (Thermofisher)12349015
Normalna surowica osłaJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 017-000-121Stosować w stężeniu 10% do blokowania i inkubacji przeciwciał
Penicylina-StreptomycynaGibco (Thermofisher)15140122
Końcówki do pipet, 1000 i mikro; LTipOne1126-7810
Nożyczki sprężynowe ('Cohan-Vannas')FST15000-11
Sterylna woda ("Dnase, bez rnazy)Invitrogen10977-015
Sterylnie filtrowane PBSGibco10010-023
Kleszcze proste ("mini")FST / Dumont11200-14
Pipet transferowy, 5,8 mlfisherscientific13-711-9AMMD
Triton X-100Thermo Scientific ChemicalsA16046. Stosować APw stężeniu 0,5% do blokowania i inkubacji przeciwciał

Bibliografia

  1. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
  2. Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M. All roads lead to glaucoma: induced retinal injury cascades contribute to a common neurodegenerative outcome. Exp Eye Res. 183, 88-97 (2019).
  3. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  4. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644 (2022).
  5. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  6. Livne-Bar, I., et al. Astrocyte-derived lipoxins A4 and B4 promote neuroprotection from acute and chronic injury. J Clin Invest. 127 (12), 4403-4414 (2017).
  7. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
  8. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  9. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiol Rev. 98 (1), 239-389 (2018).
  10. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
  11. Tezel, G. Molecular regulation of neuroinflammation in glaucoma: current knowledge and the ongoing search for new treatment targets. Prog Retin Eye Res. 87, 100998(2022).
  12. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  13. Schlamp, C. L., Li, Y., Dietz, J. A., Janssen, K. T., Nickells, R. W. Progressive ganglion cell loss and optic nerve degeneration in DBA/2J mice is variable and asymmetric. BMC Neurosci. 7, 66(2006).
  14. Paschalis, E. I., et al. Permanent neuroglial remodeling of the retina following infiltration of CSF1R inhibition-resistant peripheral monocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (48), E11359-E11368 (2018).
  15. Rutigliani, C., et al. Widespread retina and optic nerve neuroinflammation in enucleated eyes from glaucoma patients. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 118(2022).
  16. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  17. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
  18. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Front Cell Neurosci. 12, 242(2018).
  19. Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nat Commun. 11 (1), 1220(2020).
  20. Cullen, P. F., Sun, D. Astrocytes of the eye and optic nerve: heterogeneous populations with unique functions mediate axonal resilience and vulnerability to glaucoma. Front Ophthalmol (Lausanne). 3, 1217137(2023).
  21. Cullen, P. F., Gammerdinger, W. J., Ho Sui, S. J., Mazumder, A. G., Sun, D. Transcriptional profiling of retinal astrocytes identifies a specific marker and points to functional specialization. Glia. 72 (9), 1604-1628 (2024).
  22. Cullen, P. F., Mazumder, A. G., Sun, D., Flanagan, J. G. Rapid isolation of intact retinal astrocytes: a novel approach. Acta Neuropathol Commun. 11 (1), 154(2023).
  23. Li, F., Jiang, D., Samuel, M. A. Microglia in the developing retina. Neural Dev. 14 (1), 12(2019).
  24. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  25. Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (1), 149-170 (2017).
  26. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  27. Tao, C., Zhang, X. Retinal proteoglycans act as cellular receptors for basement membrane assembly to control astrocyte migration and angiogenesis. Cell Rep. 17 (7), 1832-1842 (2016).
  28. Schaeffer, J., Delpech, C., Albert, F., Belin, S., Nawabi, H. Adult mouse retina explants: from ex vivo to in vivo model of central nervous system injuries. Front Mol Neurosci. 13, 599948(2020).
  29. Vagaja, N. N., et al. Changes in murine hyalocytes are valuable early indicators of ocular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1445-1451 (2012).
  30. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  31. Rodrigues, E. B., et al. The use of vital dyes in ocular surgery. Surv Ophthalmol. 54 (5), 576-617 (2009).
  32. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  33. Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  34. Kinuthia, U. M., Wolf, A., Langmann, T. Microglia and inflammatory responses in diabetic retinopathy. Front Immunol. 11, 564077(2020).
  35. Reboussin, E., et al. Evaluation of neuroprotective and immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells in an ex vivo retinal explant model. J Neuroinflammation. 19 (1), 63(2022).
  36. Do, M. T. H. Melanopsin and the intrinsically photosensitive retinal ganglion cells: biophysics to behavior. Neuron. 104 (2), 205-226 (2019).
  37. Yu, A., et al. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model eksplantu siatk wkineurozapalenie w jaskrzekom rki zwojowe siatk wkiastrocyty i mikroglejmikroskopia immunofluorescencyjnaizolacja kom rek siatk wkisiatk wka ex vivoekspresja GFAP
Model eksplantatu ex vivo do badania interakcji glejowych w siatkówce myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.