Zapisy fal siatkówkowych z matrycą wieloelektrodową o dużej gęstości przy użyciu platformy elektrofizjologicznej

Summary

Matryce wieloelektrodowe o wysokiej gęstości (HD-MEAs) są używane do badania spontanicznych fal siatkówkowych, które odgrywają kluczową rolę w rozwoju obwodów nerwowych. Protokół ten określa etapy przygotowania tkanki siatkówki myszy i wykonywania zapisów elektrofizjologicznych za pomocą HD-MEA na platformie elektrofizjologicznej.

Abstract

Spontaniczne fale siatkówkowe są cechą charakterystyczną aktywności sieci siatkówkowej podczas rozwoju, odgrywając kluczową rolę w tworzeniu układu wzrokowego, wpływając na wyrafinowanie aksonów, przepuszczalność układu naczyniowego i ogólne dojrzewanie obwodów nerwowych. Fale te są powszechnie badane w preparatach siatkówkowych ex vivo przy użyciu matryc wieloelektrodowych (MEA), które umożliwiają elektrofizjologiczne zapisy aktywności dużych populacji komórek zwojowych siatkówki (RGC). Elektrofizjologia oparta na MEA stała się potężnym narzędziem ze względu na łatwość użycia do szybkiego gromadzenia danych o wysokiej przepustowości, dzięki czemu idealnie nadaje się do badania aktywności siatkówki w różnych warunkach eksperymentalnych.

W tym protokole opisujemy kluczowe kroki przygotowania tkanki siatkówki do pozyskiwania danych elektrofizjologicznych za pomocą MEA o wysokiej gęstości (HD-MEA) na platformie elektrofizjologicznej. Proces rozpoczyna się od starannej izolacji nienaruszonych siatkówek od noworodków w warunkach fizjologicznych. Po przygotowaniu siatkówka jest starannie montowana na chipie HD-MEA, który składa się z siatki 26 400 elektrod zdolnych do jednoczesnego wykonywania nagrań zewnątrzkomórkowych z co najmniej 1000 RGC. Nagrania mogą trwać do kilku godzin. Ostatecznie to podejście metodologiczne oferuje cenne zastosowania w badaniu rozwoju siatkówki, chorób i potencjalnie międzygatunkowych badań porównawczych, przyczyniając się do szerszego postępu w neuronauce i badaniach nad wzrokiem.

Introduction

Spontaniczne fale siatkówkowe to okresowe wybuchy skorelowanej aktywności obserwowane w rozwijającej się siatkówce przed pojawieniem się widzenia. U myszy obwody, które inicjują i propagują fale siatkówkowe, zmieniają się szybko podczas rozwoju, zaczynając się w zarodku i kończąc w momencie otwarcia oczu (14 dzień po urodzeniu)¹. Wraz z rozwojem obwodów siatkówki czasoprzestrzenne właściwości fal siatkówkowych zmieniają się dramatycznie^2,3. Kilka badań potwierdza, że te specyficzne właściwości czasoprzestrzenne instruują rozwój układu wzrokowego: asynchroniczna aktywność między oczami i....

Protocol

Ten protokół opisuje etapy izolacji i przygotowania tkanki siatkówki od noworodków myszy do rejestracji fal siatkówkowych MEA za pomocą platformy HD-MEA Maxwell Biosystems. Zabieg ma na celu zachowanie warunków fizjologicznych, zapewniając, że tkanka siatkówki pozostaje strukturalnie nienaruszona, wolna od uszkodzeń i odpowiednio przygotowana do optymalnego kontaktu z elektrodami. Eksperymenty te zostały zatwierdzone przez Vanderbilt Animal Care and Use Program, zgodnie z protokołem numer M2200056-00. Myszy (w wieku 1-2 tygodni, obie płcie) były trzymane w 12-godzinnym wiwarium w cyklu dzień/noc i karmione regularną dietą.

1. Przygoto....

Results

Wysokoprzepustowe nagrania i analiza fal siatkówkowych za pomocą HD-MEAs
Przeprowadziliśmy godzinny zapis HD-MEA spontanicznych fal siatkówkowych (Ryc. 2). Wykres rastrowy aktywności neuronalnej pokazuje ustrukturyzowany wzór fal siatkówki, gdzie każda kropka reprezentuje wykryty potencjał czynnościowy z pojedynczej elektrody (Rysunek 2A, na dole). Sumowanie aktywności między elektrodami daje pojedynczy ślad, co ułatwia wizualizację czasu fal w.......

Discussion

Opisany tutaj protokół zapewnia powtarzalną i wysokoprzepustową metodę przygotowania tkanki siatkówki i wykonywania nagrań HD-MEA, oferując solidną metodę badania aktywności sieci siatkówki. Technologia HD-MEA oferuje znaczące korzyści w porównaniu z tradycyjnymi technikami elektrofizjologicznymi i obrazowania, szczególnie w zakresie pozyskiwania danych o wysokiej przepustowości. HD-MEA zapewnia w czasie rzeczywistym, z dokładnością w skali milisekundowej, zapisy dynamiki spontanicznych fal siatkówkowych, umożliwiając pr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Jednorazowa pipeta transferowa 3 ml (z odciętym końcem)	Fisherbarnd	13-711-9CM	Pomaga w przesuwaniu siatkówki między szalkami Petriego.
Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF)			Utrzymuje warunki fizjologiczne dla tkanki siatkówki; składa się z NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, glukozy i bąbelkuje karbogenem.
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
Zaopatrzenie w karbok (95% O2, 5% CO2)			Służy do natleniania aCSF i utrzymania żywotności tkanek.
Skalpel z zakrzywionym ostrzem (#10)	Integra	4-110	Służy do precyzyjnego cięcia tkanki.
Mikroskop preparacyjny (stereoskop)	Zeiss	Stemi 508	Niezbędny do wizualizacji i obsługi tkanki siatkówki.
glukoza	Fisher Chemicals	BP350-1	Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
Grzałka liniowa	System wielokanałowy	TC02	Podgrzewa aCSF do 32-34° C dla optymalnych warunków.
System perfuzyjny Ismatec	ISM4208		Utrzymuje ciągły przepływ natlenionego aCSF.
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
KH2PO4	Sigma	Aldrich P5504-100g	Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
Jednostka rejestrująca MaxOne Maxwell	Biosystems	MX1-BRD	Interfejs między MaxOne Chip a systemem
MaxOne System	Maxwell Biosystems	MX1-SYS	Podstawowy system do elektrofizjologicznego kodowania w oparciu o MEA.
MaxOne Tissue Holder z 3-osiowym mikromanipulatorem i wymiennymi wkładkami	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	Zapewnia precyzyjne umieszczenie siatkówki na chipie MEA.
Układ MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	Układ mikroelektrod o dużej gęstości do rejestrowania aktywności neuronalnej.
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF)
Igła (30 G x ½)	BD Biosciences	305106	Pomaga w wykonywaniu nacięć w rogówce.
Zwierzęta noworodkowe (P1-P14; mysz)Organizmy			modelowe, takie jak myszy, szczury lub inne wykorzystywane do badań siatkówki.
Komputer PC z oprogramowaniem MaxLab Live Scope	HP	Z4	Służy do akwizycji danych i analizy nagrań.
Szalka Petriego (35 mm lub 60 mm)	Pyrex	3483E12	Używana jako przestrzeń robocza do sekcji.
Kleszczyki Roboz micro Adson (RS-5232, długość 4,75", 1 x 2 zęby, końcówka 0,5 mm)	Roboz	RS-5232	Specjalistyczne kleszcze do precyzyjnego preparowania.
Nożyczki sprężynowe Roboz (RS-5671, krawędź tnąca 10 mm, szerokość końcówki 0,15 mm, 3¾ " długość całkowita)	Roboz	RS-5671	Precyzyjne nożyczki do cięcia delikatnych tkanek.
Szczotka			Mały pędzel zmodyfikowany do pojedynczego włosia do pracy z delikatnymi tkankami.
Dwa kleszczyki z cienką końcówką	Roboz	RS-5060	Służy do delikatnego obchodzenia się z tkankami.
Bibuły filtracyjne Whatman (#1), pokrojone na małe kawałki	GE Healthcare	1001-042	Służy do przenoszenia i suszenia tkanki siatkówki.