Matryce wieloelektrodowe o wysokiej gęstości (HD-MEAs) są używane do badania spontanicznych fal siatkówkowych, które odgrywają kluczową rolę w rozwoju obwodów nerwowych. Protokół ten określa etapy przygotowania tkanki siatkówki myszy i wykonywania zapisów elektrofizjologicznych za pomocą HD-MEA na platformie elektrofizjologicznej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zapisy fal siatkówkowych z matrycą wieloelektrodową o dużej gęstości przy użyciu platformy elektrofizjologicznej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Spontaniczne fale siatkówkowe są cechą charakterystyczną aktywności sieci siatkówkowej podczas rozwoju, odgrywając kluczową rolę w tworzeniu układu wzrokowego, wpływając na wyrafinowanie aksonów, przepuszczalność układu naczyniowego i ogólne dojrzewanie obwodów nerwowych. Fale te są powszechnie badane w preparatach siatkówkowych ex vivo przy użyciu matryc wieloelektrodowych (MEA), które umożliwiają elektrofizjologiczne zapisy aktywności dużych populacji komórek zwojowych siatkówki (RGC). Elektrofizjologia oparta na MEA stała się potężnym narzędziem ze względu na łatwość użycia do szybkiego gromadzenia danych o wysokiej przepustowości, dzięki czemu idealnie nadaje się do badania aktywności siatkówki w różnych warunkach eksperymentalnych.
W tym protokole opisujemy kluczowe kroki przygotowania tkanki siatkówki do pozyskiwania danych elektrofizjologicznych za pomocą MEA o wysokiej gęstości (HD-MEA) na platformie elektrofizjologicznej. Proces rozpoczyna się od starannej izolacji nienaruszonych siatkówek od noworodków w warunkach fizjologicznych. Po przygotowaniu siatkówka jest starannie montowana na chipie HD-MEA, który składa się z siatki 26 400 elektrod zdolnych do jednoczesnego wykonywania nagrań zewnątrzkomórkowych z co najmniej 1000 RGC. Nagrania mogą trwać do kilku godzin. Ostatecznie to podejście metodologiczne oferuje cenne zastosowania w badaniu rozwoju siatkówki, chorób i potencjalnie międzygatunkowych badań porównawczych, przyczyniając się do szerszego postępu w neuronauce i badaniach nad wzrokiem.
Wprowadzenie
Spontaniczne fale siatkówkowe to okresowe wybuchy skorelowanej aktywności obserwowane w rozwijającej się siatkówce przed pojawieniem się widzenia. U myszy obwody, które inicjują i propagują fale siatkówkowe, zmieniają się szybko podczas rozwoju, zaczynając się w zarodku i kończąc w momencie otwarcia oczu (14 dzień po urodzeniu)1. Wraz z rozwojem obwodów siatkówki czasoprzestrzenne właściwości fal siatkówkowych zmieniają się dramatycznie2,3. Kilka badań potwierdza, że te specyficzne właściwości czasoprzestrzenne instruują rozwój układu wzrokowego: asynchroniczna aktywność między oczami i....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ten protokół opisuje etapy izolacji i przygotowania tkanki siatkówki od noworodków myszy do rejestracji fal siatkówkowych MEA za pomocą platformy HD-MEA Maxwell Biosystems. Zabieg ma na celu zachowanie warunków fizjologicznych, zapewniając, że tkanka siatkówki pozostaje strukturalnie nienaruszona, wolna od uszkodzeń i odpowiednio przygotowana do optymalnego kontaktu z elektrodami. Eksperymenty te zostały zatwierdzone przez Vanderbilt Animal Care and Use Program, zgodnie z protokołem numer M2200056-00. Myszy (w wieku 1-2 tygodni, obie płcie) były trzymane w 12-godzinnym wiwarium w cyklu dzień/noc i karmione regularną dietą.
1. Przygoto....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wysokoprzepustowe rejestracje i analiza fal siatkówkowych za pomocą HD-MEA
Przeprowadziliśmy godzinną rejestrację spontanicznych fal siatkówkowych przy użyciu HD-MEA (Rysunek 2). Wykres rastrowy aktywności neuronalnej pokazuje uporządkowany wzorzec fal siatkówkowych, gdzie kropka reprezentuje wykryty potencjał czynnościowy z pojedynczej elektrody (Rysunek 2A, dół). Sumowanie aktywności z wielu elektrod pozwala uzyskać pojedy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj protokół zapewnia powtarzalną i wysokoprzepustową metodę przygotowania tkanki siatkówki i wykonywania nagrań HD-MEA, oferując solidną metodę badania aktywności sieci siatkówki. Technologia HD-MEA oferuje znaczące korzyści w porównaniu z tradycyjnymi technikami elektrofizjologicznymi i obrazowania, szczególnie w zakresie pozyskiwania danych o wysokiej przepustowości. HD-MEA zapewnia w czasie rzeczywistym, z dokładnością w skali milisekundowej, zapisy dynamiki spontanicznych fal siatkówkowych, umożliwiając pr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Wspierane przez NIH przyznaje R00EY030909 A.T.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Jednorazowa pipeta transferowa 3 ml (z odciętym końcem) | Fisherbarnd | 13-711-9CM | Pomaga w przesuwaniu siatkówki między szalkami Petriego. |
| Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) | Utrzymuje warunki fizjologiczne dla tkanki siatkówki; składa się z NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, glukozy i bąbelkuje karbogenem. | ||
| CaCl2 | Fisher Chemicals | C79-500 | Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) |
| Zaopatrzenie w karbok (95% O2, 5% CO2) | Służy do natleniania aCSF i utrzymania żywotności tkanek. | ||
| Skalpel z zakrzywionym ostrzem (#10) | Integra | 4-110 | Służy do precyzyjnego cięcia tkanki. |
| Mikroskop preparacyjny (stereoskop) | Zeiss | Stemi 508 | Niezbędny do wizualizacji i obsługi tkanki siatkówki. |
| glukoza | Fisher Chemicals | BP350-1 | Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) |
| Grzałka liniowa | System wielokanałowy | TC02 | Podgrzewa aCSF do 32-34° C dla optymalnych warunków. |
| System perfuzyjny Ismatec | ISM4208 | Utrzymuje ciągły przepływ natlenionego aCSF. | |
| KCl | Fisher Chemicals | P271-500 | Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) |
| KH2PO4 | Sigma | Aldrich P5504-100g | Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) |
| Jednostka rejestrująca MaxOne Maxwell | Biosystems | MX1-BRD | Interfejs między MaxOne Chip a systemem |
| MaxOne System | Maxwell Biosystems | MX1-SYS | Podstawowy system do elektrofizjologicznego kodowania w oparciu o MEA. |
| MaxOne Tissue Holder z 3-osiowym mikromanipulatorem i wymiennymi wkładkami | Maxwell Biosystems | MX1-HLD | Zapewnia precyzyjne umieszczenie siatkówki na chipie MEA. |
| Układ MEA (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems) | Maxwell Biosystems | MX1-S-CHP | Układ mikroelektrod o dużej gęstości do rejestrowania aktywności neuronalnej. |
| MgCl2 | Fisher Chemicals | M33-500 | Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) |
| NaCl | Fisher Chemicals | S271-1 | Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) |
| NaHCO3 | Fisher Chemicals | S233-500 | Do przygotowania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) |
| Igła (30 G x ½) | BD Biosciences | 305106 | Pomaga w wykonywaniu nacięć w rogówce. |
| Zwierzęta noworodkowe (P1-P14; mysz)Organizmy | modelowe, takie jak myszy, szczury lub inne wykorzystywane do badań siatkówki. | ||
| Komputer PC z oprogramowaniem MaxLab Live Scope | HP | Z4 | Służy do akwizycji danych i analizy nagrań. |
| Szalka Petriego (35 mm lub 60 mm) | Pyrex | 3483E12 | Używana jako przestrzeń robocza do sekcji. |
| Kleszczyki Roboz micro Adson (RS-5232, długość 4,75", 1 x 2 zęby, końcówka 0,5 mm) | Roboz | RS-5232 | Specjalistyczne kleszcze do precyzyjnego preparowania. |
| Nożyczki sprężynowe Roboz (RS-5671, krawędź tnąca 10 mm, szerokość końcówki 0,15 mm, 3¾ " długość całkowita) | Roboz | RS-5671 | Precyzyjne nożyczki do cięcia delikatnych tkanek. |
| Szczotka | Mały pędzel zmodyfikowany do pojedynczego włosia do pracy z delikatnymi tkankami. | ||
| Dwa kleszczyki z cienką końcówką | Roboz | RS-5060 | Służy do delikatnego obchodzenia się z tkankami. |
| Bibuły filtracyjne Whatman (#1), pokrojone na małe kawałki | GE Healthcare | 1001-042 | Służy do przenoszenia i suszenia tkanki siatkówki. |
Bibliografia
- Ford, K. J., Feller, M. B. Assembly and disassembly of a retinal cholinergic network. Vis Neurosci. 29 (1), 61-71 (2012).
- Maccione, A., et al. Following the ontogeny of retinal waves: Pan-retinal recordings of population dynamics in the neonata....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
