Wysokoprzepustowy, trójwymiarowy model tkankowy do ilościowego oznaczania progów elektroporacji

Summary

Protokół ten wykorzystuje modelowanie obliczeniowe do ilościowego określenia odwracalnych i nieodwracalnych progów elektroporacji przy użyciu przestrzennego rozkładu transfekowanych komórek w trójwymiarowym naśladownictwie tkankowym w celu wysokoprzepustowej analizy protokołów elektroporacji.

Abstract

Elektroporacja to obiecująca technologia wykorzystująca impulsy elektryczne do dostarczania makrocząsteczek i ablacji tkanek miękkich, z zastosowaniami obejmującymi profilaktykę nowej generacji i leczenie chorób genetycznych, takich jak rak. W badaniu tym przedstawiono wysokoprzepustowy model 3D hodowli tkankowej do ilościowego określania odwracalnych i nieodwracalnych progów elektroporacji dla danego protokołu elektroporacji. Wykorzystując niejednorodne pole elektryczne i analizując rozkład przestrzenny transfekowanych komórek, w jednej próbce można zidentyfikować zarówno odwracalne, jak i nieodwracalne progi, co zwiększa efektywność, z jaką można scharakteryzować protokoły elektroporacji, zwłaszcza w przypadku translacji in vivo . Aby wykazać tę zdolność, tkanki 3D naśladujące komórki HEK293 zostały przetransfekowane za pomocą elektrody pierścieniowej i szpilkowej w celu dostarczenia plazmidu kodującego GFP. Następnie wyznaczono progi elektroporacji na podstawie obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej transfekowanych próbek. Model ten wykazuje potencjał do wykorzystania jako środek do wysokoprzepustowej oceny protokołów elektroporacji, co stanowi kluczową przewagę nad obecnymi metodami oceny tych progów, które są zwykle czasochłonne i mniej reprezentatywne dla warunków in vivo .

Introduction

Odwracalna elektroporacja (RE) jest dobrze ugruntowaną metodologią dostarczania do komórek ^1,2,3 różnych normalnie nieprzepuszczalnych dla błony związków i cząsteczek. W tym przypadku pulsacyjne pola elektryczne (PEF) są wykorzystywane do osiągnięcia krytycznego natężenia pola elektrycznego, które indukuje przejściowe, zlokalizowane nanopory wzdłuż części błony komórkowej. RE jest używany do dostarczania różnych cząsteczek i związków, od barwników i kwasów nukleinowych po chemioterapeutyki i inne leki 4,5,6,7,8,9,10.<....

Protocol

Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie komórek

1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego, płytka 1 × 10⁵ komórek/ml linii komórkowej HEK293 w objętości 10 ml na kulturę tkankową kolba T75 w minimalnym niezbędnym podłożu Eagle'a uzupełnionym 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny.
2. Inkubować komórki HEK293 w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO_{2 .}
3. Zbierz komórki do eksperymentów 2 dni po wysianiu, usuwając pożywkę hodowlaną i traktując komórki 4 ml 0,2....

Results

Elektroda pierścieniowa i szpilkowa z powodzeniem dostarczyły plazmid DNA kodujący zielone białko fluorescencyjne (GFP) do naśladowców tkanki kolagenowej 3D osadzonej w komórkach HEK293. Pomyślną kwantyfikację progu RE osiągnięto poprzez pomiar zewnętrznego promienia transfekowanego obszaru i wyprowadzenie odpowiedniego natężenia pola z modelu obliczeniowego układu eksperymentalnego, jak pokazano na rysunku 2. Próg IRE został podobnie określony ilościowo, mie.......

Discussion

Dzięki tej metodzie można zidentyfikować odwracalne i nieodwracalne progi elektroporacji bez konieczności badania wielu próbek przy dyskretnych napięciach. Zastosowanie niejednorodnego pola elektrycznego umożliwia kwantyfikację w oparciu o rozkład przestrzenny transfekowanych komórek w modelu. Istnieją jednak ograniczenia związane z tym niejednorodnym rozkładem. Przede wszystkim opisane tutaj progi RE i IRE są progami odpowiednio udanej transfekcji i śmierci komórki, które mogą nie być bezpośrednimi pomiarami zakresu ele.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% trypsyna-EDTA	Gibco (firma Gibco)	25200056
Końcówki do pipet 1000 μl	Fisher Naukowy	13-811-164
Rurka stożkowa 15 ml	Fisher Naukowy	14-959-70C
Końcówki do pipet 200 μl	Fisher Naukowy	13-811-139
Igły z końcówką ze stali nierdzewnej 304	McMaster Carr	Zobacz materiał 75165A753 TGL
316 Rury ze stali nierdzewnej	McMaster Carr	Numer katalogowy: 89785K319
Akrylowe	McMaster Carr	Numer katalogowy: 8505K754
Szafa bezpieczeństwa biologicznego	Fisher Naukowy	13-261-312
Oprogramowanie CAD	Systemy Dassault	SolidWorks (SolidWorks)
Wirówka	Nuaire powiedział:	NU-C200R
Elektroporator	Język hbio	45-0662	W badaniu wykorzystano specjalnie zbudowane urządzenie oraz system BTX ECM 830
EMEM (EMEM)	Fisher Naukowy	MT10009CV	Może się to różnić  w przypadku korzystania z linii komórkowej innej niż HEK293
Falcon 12-dołkowa, przezroczysta, wielodołkowa płytka do hodowli komórkowych z płaskim dnem i powłoką TC, z pokrywką	Corning	353043	Można użyć dowolnej płytki 12-dołkowej, należy tylko upewnić się, że wymiary studni są brane pod uwagę podczas produkcji uchwytu elektrody.
FBS (Sieć Usługowa	Fisher Naukowy	A5670701
Światłowodowa sonda temperatury	Micronor Inc.	Zobacz materiał TS5-20MM-02
Plazmid GFP	Aldeveron powiedział:	gWiz-GFP
Ogniwa HEK293	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-1573	Można użyć innych linii komórkowych, wystarczy upewnić się, że używana jest odpowiednia pożywka hodowlana
Płyta grzejna	Termoelectric Cooling America Corporation (Termoelektryczne Chłodzenie Ameryka)	AHP-301CPV
Kąpiel lodowa lub z kulkami chłodzącymi	Fisher Naukowy	10-876-001
Oprogramowanie do analizy obrazu	Księga Leica	LAS X
Inkubator	Fisher Naukowy	15-015-2633
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Księga Leica	DMi8 powiedział:
Wycinarka laserowa	McMaster Carr	Zobacz materiał 7344N11 TGL
Penicylina-streptomycyna	Fisher Naukowy	15140122
Zestaw pipet	Fisher Naukowy	14-388-100
Oprogramowanie symulacyjne	COMSOL	COMSOL Multifizyka 6.2
Kolba T75	Fisher Naukowy	156499
Roztwór kolagenu bydlęcego typu I	Zaawansowana biomatryca	5005	3 mg/ml