Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy, trójwymiarowy model tkankowy do ilościowego oznaczania progów elektroporacji

839 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68494

⸱

19 sierpnia 2025

 ,  ,  , 
1North Carolina State University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten wykorzystuje modelowanie obliczeniowe do ilościowego określenia odwracalnych i nieodwracalnych progów elektroporacji przy użyciu przestrzennego rozkładu transfekowanych komórek w trójwymiarowym naśladownictwie tkankowym w celu wysokoprzepustowej analizy protokołów elektroporacji.

Streszczenie

Elektroporacja to obiecująca technologia wykorzystująca impulsy elektryczne do dostarczania makrocząsteczek i ablacji tkanek miękkich, z zastosowaniami obejmującymi profilaktykę nowej generacji i leczenie chorób genetycznych, takich jak rak. W badaniu tym przedstawiono wysokoprzepustowy model 3D hodowli tkankowej do ilościowego określania odwracalnych i nieodwracalnych progów elektroporacji dla danego protokołu elektroporacji. Wykorzystując niejednorodne pole elektryczne i analizując rozkład przestrzenny transfekowanych komórek, w jednej próbce można zidentyfikować zarówno odwracalne, jak i nieodwracalne progi, co zwiększa efektywność, z jaką można scharakteryzować protokoły elektroporacji, zwłaszcza w przypadku translacji in vivo . Aby wykazać tę zdolność, tkanki 3D naśladujące komórki HEK293 zostały przetransfekowane za pomocą elektrody pierścieniowej i szpilkowej w celu dostarczenia plazmidu kodującego GFP. Następnie wyznaczono progi elektroporacji na podstawie obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej transfekowanych próbek. Model ten wykazuje potencjał do wykorzystania jako środek do wysokoprzepustowej oceny protokołów elektroporacji, co stanowi kluczową przewagę nad obecnymi metodami oceny tych progów, które są zwykle czasochłonne i mniej reprezentatywne dla warunków in vivo .

Wprowadzenie

Odwracalna elektroporacja (RE) jest dobrze ugruntowaną metodologią dostarczania do komórek 1,2,3 różnych normalnie nieprzepuszczalnych dla błony związków i cząsteczek. W tym przypadku pulsacyjne pola elektryczne (PEF) są wykorzystywane do osiągnięcia krytycznego natężenia pola elektrycznego, które indukuje przejściowe, zlokalizowane nanopory wzdłuż części błony komórkowej. RE jest używany do dostarczania różnych cząsteczek i związków, od barwników i kwasów nukleinowych po chemioterapeutyki i inne leki 4,5,6,7,8,9,10. Jeśli jednak natężenie pola elektrycznego zostanie wystarczająco zwiększone, może osiągnąć wyższy próg krytyczny, co skutkuje szybkim spadkiem żywotności ogniw 1,2,11,12. Proces ten jest znany jako nieodwracalna elektroporacja (IRE) i był badany pod kątem ablacji tkanek miękkich, w tym w leczeniu nieoperacyjnych guzów i zaburzeń rytmu serca 11,12,13,14,15,16. Aby zrozumieć wyniki leczenia i poinformować o przyszłych terapiach, kwantyfikacja tych progów RE i IRE jest powszechną praktyką w badaniach nad elektroporacją 12,17,18,19,20. Jednak progi RE i IRE różnią się w zależności od wielu czynników, w tym typu ogniwa, przyłożonego napięcia, czasu trwania impulsu, liczby impulsów i szybkości dostarczania impulsów 1,17,18,21,22.

Protokoły elektroporacji mają szereg parametrów, które skutkują różnymi progami RE i IRE 1,17,18,21,22. Optymalne napięcia i przebiegi zabiegu są od dawna badane. Większość dostępnych na rynku technologii elektroporacji wykorzystuje protokoły z monopolarnymi PEF rzędu 100 μs-10 ms23. Chociaż protokoły te osiągają klinicznie istotne wyniki, wywołują intensywne skurcze mięśni in vivo 24,25,26. Z tego powodu krótsze, bipolarne impulsy mikrosekundowe, które łagodzą tę stymulację, stały się ostatnio przedmiotem zainteresowania 1,11,24. Jednak impulsy te wprowadzają nowe czynniki, które wpływają na progi RE i IRE, w tym symetrię impulsów, czas trwania impulsu i zależność od temperatury 1,17,22,27. Ponadto wykazano również, że typ komórki i właściwości tkanek znacząco wpływają zarówno na wyniki RE, jak i IRE 19,28,29. Wraz z dalszym rozwojem tej dziedziny istnieje potrzeba dalszego scharakteryzowania, w jaki sposób te czynniki i ich interakcje ze sobą oraz inne możliwe czynniki środowiskowe wpływają na progi RE i IRE, co sprawia, że coraz bardziej konieczna jest poprawa wydajności eksperymentalnej, aby umożliwić eksperymenty o wyższej przepustowości.

Typowe eksperymenty z elektroporacją in vitro testują protokoły polegające na traktowaniu komórek w kuwecie z równoległymi płytkami przewodzącymi, co skutkuje równomiernym rozkładem pola elektrycznego w kuwecie podczas leczenia 19,30,31,32,33,34. Jak wspomniano powyżej, konieczne jest określenie progów RE i/lub IRE protokołu, aby określić optymalne zastosowane napięcie dla danego zabiegu. Aby można to osiągnąć w badaniach kuwetowych, należy poddać obróbce wiele kuwet, z których każda ma dyskretnie przyłożone napięcia. Wymaga to znacznej liczby próbek, które muszą być przygotowywane, poddawane obróbce i analizowane oddzielnie, co ogranicza przepustowość eksperymentalną. Aby usprawnić ten proces, opracowano modele hodowli 2D35,36 i 3D 13,20,27,37,38,39 w celu oceny kontinuum natężenia pola w pojedynczej próbce przy użyciu elektrod, które tworzą niejednorodne rozkłady pola 13,20,27 ,37,38,39. Progi RE i IRE są następnie wyprowadzane z modeli obliczeniowych rozkładu pola elektrycznego 13,20,27,37,38. To znacznie zmniejsza liczbę potrzebnych próbek, umożliwiając bardziej przepustowe podejście do oznaczania wartości progowej.

Niniejszy artykuł ma na celu zademonstrowanie tego podejścia do kwantyfikacji pola RE i IRE w modelu 3D in vitro , aby zademonstrować jego potencjał jako środka do efektywnej oceny protokołów elektroporacji w kilku środowiskach (np. typy komórek, parametry leczenia, cząsteczki, które mają być dostarczone).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Odczynniki i sprzęt używany w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie komórek

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego, płytka 1 × 105 komórek/ml linii komórkowej HEK293 w objętości 10 ml na kulturę tkankową kolba T75 w minimalnym niezbędnym podłożu Eagle'a uzupełnionym 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny-streptomycyny.
  2. Inkubować komórki HEK293 w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO2 .
  3. Zbierz komórki do eksperymentów 2 dni po wysianiu, usuwając pożywkę hodowlaną i traktując komórki 4 ml 0,25% trypsyny-EDTA.
  4. Inkubować komórki i trypsynę przez 3-5 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO2 lub do momentu, gdy komórki oderwą się od powierzchni hodowli.
  5. Dezaktywuj aktywność enzymatyczną trypsyny, dodając 4 ml pożywki hodowlanej.
  6. Osadzać komórki przez odwirowywanie przez 5 minut przy 180 × g i ponownie zawiesić w pożywce hodowlanej do końcowego stężenia 8 × 106 komórek/ml.

2. 3D tworzenie modelu tkankowego

UWAGA: W tym celu należy użyć pipetowania wstecznego, aby zapobiec wprowadzeniu pęcherzyków powietrza do mieszaniny.

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dokładnie wymieszaj przygotowane 8 × 106 komórek/ml zawiesiny komórek z roztworem kolagenu bydlęcego typu I (3 mg/ml) w stosunku 1:1. Umieścić na lodzie lub w zimnej kąpieli perełkowej, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji podczas pracy z mieszanką.
  2. Odpipetować 500 μl połączonego roztworu, aby pokryć dno każdego dołka na 12-dołkowej płytce. Upewnij się, że żel równomiernie pokrywa dno, zaczynając dozowanie roztworu na środku studzienki, a następnie delikatnie przesuwając spiralnie na zewnątrz.
  3. Delikatnie zakręć płytką, aby krawędzie żelu stykały się ze ściankami studzienki.
  4. Żele inkubować w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% środowisku CO2 przez 6 godzin lub do momentu, gdy żele staną się twarde i nie będą się przesuwać podczas przechylania płytki.
  5. Przechylić płytkę dołka i delikatnie dodać 500 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki co najmniej 1 godzinę przed poddaniem działaniu substancji. Żele należy leczyć w ciągu 48 godzin od utworzenia.

3. Produkcja elektrod

  1. Usuń plastikowe złącze Luer z dwóch igieł strzykawkowych ze stali nierdzewnej 304 o średnicy 1.64 mm z końcówką. Odłóż jedną igłę na bok, aby służyła jako elektroda szpilkowa. W przypadku drugiej igły spłaszcz ostatnie 5 mm jednego końca.
  2. Utwórz elektrodę pierścieniową, przecinając odcinek rurki ze stali nierdzewnej 316 o średnicy zewnętrznej 19 mm, który jest wystarczająco długi, aby przylegać do dna płyty studziennej.
  3. Zaprojektuj uchwyt elektrody, jak pokazano na rysunku 1 , za pomocą oprogramowania CAD. Upewnij się, że uchwyt ma centralny otwór na elektrodę kołkową, rowek na elektrodę oczkową oraz otwór, który przecina rowek, tak aby można było włożyć spłaszczoną igłę w celu utworzenia pasowania wtłaczanego, które utrzymuje elektrodę pierścieniową na miejscu.
    1. Upewnij się również, że uchwyt ma wargę zaprojektowaną tak, aby ściśle pasowała do 12-dołkowej płytki i aby wyśrodkować elektrody pierścieniowe i kołkowe w studzience tak, aby elektrody i studzienka były współosiowe38.
  4. Wykonaj uchwyt elektrody z akrylu przy użyciu sprawdzonych technik cięcia laserowego40.
  5. Zamontuj elektrodę, wkładając elektrody pierścieniowe i kołkowe do uchwytu elektrody.
  6. Zabezpiecz elektrodę oczkową, wciskając igłę ze spłaszczonym końcem w uchwyt.

4. Obróbka modelu tkankowego 3D za pomocą elektroporacji

  1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego przechylić płytkę i odessać 400 μl pożywki hodowlanej z każdej studzienki. Uważaj, aby nie dotknąć żelu. W każdej zasysanej studzience należy pozostawić 100 μl pożywki, aby utrzymać nawodnienie żelu. Jeśli do odessania jest mniej niż 400 μl płynu (pipeta nie pozostawia płynu/zasysa powietrze), dodaj 100 μl pożywki hodowlanej.
  2. Dodaj 20 μl 5 μg/μl roztworu plazmidu GFP do tych zasysanych studzienek (dla całkowitej objętości 120 μl na studzienkę), przechylając płytkę i dodając odczynnik do płynu, który gromadzi się przy ścianie każdej studzienki. Delikatnie zamieszaj, aby upewnić się, że równomiernie rozprowadza się po powierzchni żelu.
  3. Inkubować żele w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO2 przez 10 minut.
  4. Włóż światłowodową sondę temperatury do elektrody kołkowej i rozpocznij odczyt temperatury.
  5. Podłącz dodatni przewód elektroporatora do elektrody sworzniowej, a przewód ujemny do igły mocującej elektrodę pierścieniową.
  6. Włącz płytę grzejną i podgrzej żele tak, aby utrzymały temperaturę 37 °C.
  7. Włóż elektrodę pierścieniowo-szpilkową ze światłowodową sondą temperatury do kołka do studni. Upewnij się, że kołek jest prostopadły do płytki i że obie elektrody całkowicie stykają się z żelem.
  8. Upewnij się, że żel ma temperaturę 37 °C.
  9. Zapewnij zabieg elektroporacji.
  10. Dodaj 100 μl pożywki do wszystkich żeli, które wydają się suche.
  11. Powtórz kroki 4.7-4.10.
  12. Po zakończeniu wszystkich zabiegów inkubować żele w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% środowisku CO2 przez 10 minut.
  13. Przechylić płytkę dołka i delikatnie dodać 500 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki.
  14. Żele inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO2 przez 24 godziny.

5. Mycie i obrazowanie

  1. Przechyl płytkę i zasysaj pożywkę hodowlaną z każdej studzienki. Uważaj, aby nie dotknąć żelu.
  2. Przechylić płytkę i delikatnie dodać 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki.
  3. Żele inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% środowiskuCO2 przez 5 minut.
  4. Przechyl płytkę i zassaj PBS z każdej studzienki. Uważaj, aby nie dotknąć żelu.
  5. Przechylić płytkę i delikatnie dodać 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki.
  6. Delikatnie zakręć płytką, przechyl ją i zassaj PBS z każdej studzienki. Uważaj, aby nie dotknąć żelu.
  7. Dodaj 100 μl świeżego PBS, aby żele były nawodnione do obrazowania.
  8. Płytka pamięciowa przy użyciu standardowych technik mikroskopii fluorescencyjnej. Powinno to dać obrazy żeli z wyraźnym zielonym obszarem w kształcie torusa, w którym odwracalne i nieodwracalne progi pola elektrycznego wiązały odpowiednio zewnętrzne i wewnętrzne krawędzie obszaru.
  9. Przechylić płytkę dołka i delikatnie dodać 500 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki, pozwalając jej zsunąć się po ściance płytki.
  10. Żele inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w środowisku 5% CO2 przez 24 godziny.
  11. Powtórz kroki 5.1–5.10 dla każdego punktu czasowego.

6. Tworzenie modeli obliczeniowych

  1. Otwórz oprogramowanie do symulacji fizyki i utwórz nowy model osiowosymetryczny 2D, który wykorzystuje fizykę prądów elektrycznych, wymiany ciepła w ciałach stałych i ogrzewania elektromagnetycznego.
  2. Utwórz parametry napięcia, temperatury otoczenia, temperatury płyty grzejnej, wartości zadanej temperatury, szybkości dostarczania impulsów, zintegrowanej dawki elektrycznej oraz wymiarów elektrod pierścieniowych i kołkowych, żelu i płytki studziennej w układzie eksperymentalnym.
  3. Utwórz geometrie domenowe reprezentujące przekrój promieniowy elektrod pierścieniowych i kołkowych, żelu i płytki studzienkowej układu doświadczalnego, jak pokazano na rysunku 2A.
  4. Umieść punkt sondy wewnątrz elektrody środkowej w połowie wysokości żelu, aby reprezentować światłowodową sondę temperatury używaną podczas eksperymentów in vitro.
  5. Utwórz funkcję fragmentaryczną, która używa temperatury jako argumentu wejściowego.
  6. Zdefiniuj funkcję w taki sposób, aby jej wartość wynosiła 1, gdy temperatura jest mniejsza niż parametr nastawy temperatury zdefiniowany w kroku 6.2, a w przeciwnym razie 0.
  7. Zastosuj warunek brzegowy napięcia do najwyższej powierzchni geometrii domeny reprezentującej elektrodę sworzniową i ustaw wartość napięcia na parametr napięcia zdefiniowany w kroku 6.2 pomnożony przez funkcję odcinkową z kroku 6.6 obliczoną w temperaturze punktu sondy utworzonego w kroku 6.4.
  8. Zastosuj warunek brzegowy Grunt do najwyższej powierzchni geometrii domeny reprezentującej elektrodę pierścieniową.
  9. Zastosuj warunek brzegowy izolacji elektrycznej do wszystkich pozostałych granic domeny.
  10. Utwórz funkcję ciągłą, która używa temperatury.
  11. Zdefiniuj funkcję przy użyciu ustalonego modelu27 przewodności zależnej od temperatury żelu kolagenowego jako 0,8277 + 0,0323*T.
  12. Zdefiniuj materiał niestandardowy i ustaw przewodność elektryczną na funkcję ciągłą zdefiniowaną w kroku 6.11. Nałóż ten materiał na domenę żelu.
  13. Zdefiniuj materiały lub użyj domyślnych ustawień oprogramowania, jeśli są dostępne, aby przypisać materiały ze stali nierdzewnej 304 i 316 odpowiednio do domen elektrod kołkowych i pierścieniowych, a polistyren do domen płytek studzienkowych.
  14. Zastosuj warunek brzegowy Temperatura do podstawy modelu i ustaw wartość temperatury na 37 °C.
  15. Zastosuj warunek brzegowy Powierzchniowe promieniowanie otoczenia do wszystkich innych krawędzi domeny, które nie łączą się z inną domeną, i ustaw emisyjność na 0,97, 0,9 i 0,075, w zależności od tego, czy domena była częścią płytki, żelu czy elektrody,odpowiednio27.
  16. Dodaj do modelu dowolną siatkę trójkątną. Ustaw rozmiar elementu na drobniejszy.
  17. W przypadku oceniania różnych poziomów parametrów należy utworzyć zamiatanie parametryczne, które zawiera listę wszystkich wartości, dla których parametr ma być oceniany.
  18. Uruchom symulację, klikając przycisk Oblicz .
  19. Po zakończeniu utwórz wykres przekroju 2D pola elektrycznego w sekcji Wyniki.
  20. Zdefiniuj linię cięcia, która ma przechodzić od elektrody kołkowej do elektrody pierścieniowej przez środek domeny żelu. Powinno to spowodować wykładniczy zanik od krawędzi elektrody kołkowej do krawędzi elektrody pierścieniowej.
  21. Wyeksportuj dane wykresu jako plik .csv lub .xlsx, aby utworzyć tabelę przeglądową.

7. Wyprowadzenie progu

  1. Za pomocą oprogramowania mikroskopu zmierz średnicę zewnętrznej i wewnętrznej krawędzi obszaru w kształcie torusa wzdłuż osi pionowej i poziomej. Jeśli oprogramowanie nie ma tej możliwości, użyj do tego ImageJ.
  2. Uśrednij odpowiednio średnicę zewnętrzną i wewnętrzną i podziel przez dwa, aby obliczyć zewnętrzny i wewnętrzny promień obszaru w kształcie torusa. Promień zewnętrzny wyznacza próg RE. Promień wewnętrzny wyznacza próg IRE.
  3. Korzystając z tabeli przeglądowej utworzonej w kroku 6.21, wyznacz natężenie pola elektrycznego w zmierzonych promieniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Elektroda pierścieniowo-igłowa skutecznie wprowadziła plazmid DNA kodujący zielone białko fluorescencyjne (GFP) do 3D kolagenowych imitacji tkanki z zatopionymi komórkami HEK293. Skuteczne ilościowe oznaczenie progu RE osiągnięto poprzez pomiar promienia zewnętrznego obszaru transfekcji i wyprowadzenie odpowiadającej mu natężenia pola z modelu obliczeniowego układu doświadczalnego, co przedstawiono na Rysunku 2. Próg IRE określono w podobny sposób, mierząc pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dzięki tej metodzie można zidentyfikować odwracalne i nieodwracalne progi elektroporacji bez konieczności badania wielu próbek przy dyskretnych napięciach. Zastosowanie niejednorodnego pola elektrycznego umożliwia kwantyfikację w oparciu o rozkład przestrzenny transfekowanych komórek w modelu. Istnieją jednak ograniczenia związane z tym niejednorodnym rozkładem. Przede wszystkim opisane tutaj progi RE i IRE są progami odpowiednio udanej transfekcji i śmierci komórki, które mogą nie być bezpośrednimi pomiarami zakresu ele...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

Praca ta została wykonana na Uniwersytecie Stanowym Karoliny Północnej i sfinansowana przez National Institutes of Health (R01CA272550).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna-EDTAGibco (firma Gibco)25200056
Końcówki do pipet 1000 μlFisher Naukowy13-811-164
Rurka stożkowa 15 mlFisher Naukowy14-959-70C
Końcówki do pipet 200 μlFisher Naukowy13-811-139
Igły z końcówką ze stali nierdzewnej 304McMaster CarrZobacz materiał 75165A753 TGL
316 Rury ze stali nierdzewnejMcMaster CarrNumer katalogowy: 89785K319
AkryloweMcMaster CarrNumer katalogowy: 8505K754
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoFisher Naukowy13-261-312
Oprogramowanie CADSystemy DassaultSolidWorks (SolidWorks)
WirówkaNuaire powiedział:NU-C200R
ElektroporatorJęzyk hbio45-0662W badaniu wykorzystano specjalnie zbudowane urządzenie oraz system BTX ECM 830
EMEM (EMEM)Fisher NaukowyMT10009CVMoże się to różnić  w przypadku korzystania z linii komórkowej innej niż HEK293
Falcon 12-dołkowa, przezroczysta, wielodołkowa płytka do hodowli komórkowych z płaskim dnem i powłoką TC, z pokrywkąCorning353043Można użyć dowolnej płytki 12-dołkowej, należy tylko upewnić się, że wymiary studni są brane pod uwagę podczas produkcji uchwytu elektrody.
FBS (Sieć UsługowaFisher NaukowyA5670701
Światłowodowa sonda temperaturyMicronor Inc.Zobacz materiał TS5-20MM-02
Plazmid GFPAldeveron powiedział:gWiz-GFP
Ogniwa HEK293Kontroler ATCC (Kontroler TCRL-1573Można użyć innych linii komórkowych, wystarczy upewnić się, że używana jest odpowiednia pożywka hodowlana
Płyta grzejnaTermoelectric Cooling America Corporation (Termoelektryczne Chłodzenie Ameryka)AHP-301CPV
Kąpiel lodowa lub z kulkami chłodzącymiFisher Naukowy10-876-001
Oprogramowanie do analizy obrazuKsięga LeicaLAS X
InkubatorFisher Naukowy15-015-2633
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyKsięga LeicaDMi8 powiedział:
Wycinarka laserowaMcMaster CarrZobacz materiał 7344N11 TGL
Penicylina-streptomycynaFisher Naukowy15140122
Zestaw pipetFisher Naukowy14-388-100
Oprogramowanie symulacyjneCOMSOLCOMSOL Multifizyka 6.2
Kolba T75Fisher Naukowy156499
Roztwór kolagenu bydlęcego typu IZaawansowana biomatryca50053 mg/ml

Bibliografia

  1. Sano, M. B., Fan, R. E., Xing, L. Asymmetric waveforms decrease lethal thresholds in high frequency irreversible electroporation therapies. Sci Rep. 7 (1), 40747(2017).
  2. Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochem. 141, 107871(2021).
  3. Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models. Annu Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).
  4. Schipilliti, F. M., et al. Electrochemotherapy for solid tumors: literature review and presentation of a novel endoscopic approach. Radiol Oncol. 56 (3), 285-291 (2022).
  5. Hoejholt, K. L., et al. Calcium electroporation and electrochemotherapy for cancer treatment: importance of cell membrane composition investigated by lipidomics, calorimetry and in vitro efficacy. Sci Rep. 9 (1), 4758(2019).
  6. Gary, E. N., Weiner, D. B. DNA vaccines: Prime time is now. Curr Opin Immunol. 65, 21-27 (2020).
  7. Sachdev, S., Potočnik, T., Rems, L., Miklavčič, D. Revisiting the role of pulsed electric fields in overcoming the barriers to in vivo gene electrotransfer. Bioelectrochem. 144, 107994(2022).
  8. Lambricht, L., et al. Clinical potential of electroporation for gene therapy and DNA vaccine delivery. Expert Opin Drug Deliv. 13 (2), 295-310 (2016).
  9. Gothelf, A., Gehl, J. What you always needed to know about electroporation-based DNA vaccines. Hum Vaccin Immunother. 8 (11), 1694-1702 (2012).
  10. Lin, F., et al. Optimization of electroporation-enhanced intradermal delivery of DNA vaccine using a minimally invasive surface device. Hum Gene Ther Methods. 23 (3), 157-168 (2012).
  11. Sano, M. B., DeWitt, M. R., Teeter, S. D., Xing, L. Optimization of a single insertion electrode array for the creation of clinically relevant ablations using high-frequency irreversible electroporation. Comput Biol Med. 95, 107-117 (2018).
  12. Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. Tissue ablation with irreversible electroporation. Ann Biomed Eng. 33 (2), 223-231 (2005).
  13. Ivey, J. W., et al. Targeted cellular ablation based on the morphology of malignant cells. Sci Rep. 5, 17157(2015).
  14. Meijerink, M. R., et al. Irreversible electroporation to treat unresectable colorectal liver metastases (COLDFIRE-2): A phase II, two-center, single-arm clinical trial. Radiology. 299 (2), 470-480 (2021).
  15. Sugrue, A., et al. Irreversible electroporation for catheter-based cardiac ablation: A systematic review of the preclinical experience. J Interv Card Electrophysiol. 55 (3), 251-265 (2019).
  16. Wittkampf, F. H. M., van Es, R., Neven, K. Electroporation and its relevance for cardiac catheter ablation. JACC Clin Electrophysiol. 4 (8), 977-986 (2018).
  17. Fesmire, C. C., Petrella, R. A., Kaufman, J. D., Topasna, N., Sano, M. B. Irreversible electroporation is a thermally mediated ablation modality for pulses on the order of one microsecond. Bioelectrochem. 135, 107544(2020).
  18. Fesmire, C. C., et al. Integrated Time Nanosecond Pulse Irreversible Electroporation (INSPIRE): Assessment of dose, temperature, and voltage on experimental and clinical treatment outcomes. IEEE Trans Biomed Eng. 71 (5), 1511-1520 (2023).
  19. Potočnik, T., Sachdev, S., Polajžer, T., Maček Lebar, A., Miklavčič, D. Efficient gene transfection by electroporation-In vitro and in silico study of pulse parameters. Appl Sci. 12 (16), 8237(2022).
  20. Jacobs IV, E. J., Campelo, S. N., Charlton, A., Altreuter, S., Davalos, R. V. Characterizing reversible, irreversible, and calcium electroporation to generate a burst-dependent dynamic conductivity curve. Bioelectrochem. 155, 108580(2024).
  21. Weaver, J. C., Smith, K. C., Esser, A. T., Son, R. S., Gowrishankar, T. R. A brief overview of electroporation pulse strength-duration space: a region where additional intracellular effects are expected. Bioelectrochem. 87, 236-243 (2012).
  22. Sano, M. B., Arena, C. B., DeWitt, M. R., Saur, D., Davalos, R. V. In-vitro bipolar nano- and microsecond electro-pulse bursts for irreversible electroporation therapies. Bioelectrochem. 100, 69-79 (2014).
  23. Sokołowska, E., Błachnio-Zabielska, A. U. A critical review of electroporation as a plasmid delivery system in mouse skeletal muscle. Int J Mol Sci. 20 (11), 2776(2019).
  24. Mercadal, B., Arena, C. B., Davalos, R. V., Ivorra, A. Avoiding nerve stimulation in irreversible electroporation: a numerical modeling study. Phys Med Biol. 62 (20), 8060-8079 (2017).
  25. Fusco, R., Di Bernardo, E., D'Alessio, V., Salati, S., Cadossi, M. Reduction of muscle contraction and pain in electroporation-based treatments: an overview. World J Clin Oncol. 12 (5), 367-381 (2021).
  26. Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses. Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).
  27. Fesmire, C. C., et al. Temperature dependence of high frequency irreversible electroporation evaluated in a 3D tumor model. Ann Biomed Eng. 48 (8), 2233-2246 (2020).
  28. Ĉemazˆr, M., et al. Effect of electric-field intensity on electropermeabilization and electrosensitivity of various tumor-cell lines in vitro. Electro Magnetobiol. 17 (2), 263-272 (1998).
  29. Young, J. L., Dean, D. A. Electroporation-mediated gene delivery. Adv Genet. 89 (1), 49-88 (2015).
  30. Bosnjak, M., Lorente, B. C., Pogacar, Z., Makovsek, V., Cemazar, M. Different incubation times of cells after gene electrotransfer in fetal bovine serum affect cell viability, but not transfection efficiency. J Membr Biol. 247 (5), 421-428 (2014).
  31. Hyder, I., Eghbalsaied, S., Kues, W. A. Systematic optimization of square-wave electroporation conditions for bovine primary fibroblasts. BMC Mol Cell Biol. 21 (1), 9(2020).
  32. Sherba, J. J., et al. The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency. Sci Rep. 10 (1), 3053(2020).
  33. Potter, H., Heller, R. Transfection by electroporation. Curr Protoc Mol Biol. 62 (9), Unit 9.3 (2003).
  34. Silve, A., Vezinet, R., Mir, L. M. Nanosecond-duration electric pulse delivery in vitro and in vivo: Experimental considerations. IEEE Trans Instrum Meas. 61 (7), 1945-1954 (2012).
  35. Avazzadeh, S., et al. Establishing electroporation thresholds for targeted cell-specific cardiac ablation in a 2D culture model. J Cardiovasc Electrophysiol. 33 (9), 2050-2061 (2022).
  36. Fiorentzis, M., et al. Conjunctival melanoma and electrochemotherapy: preliminary results using 2D and 3D cell culture models in vitro. Acta Ophthalmol. 97 (4), e632-e640 (2019).
  37. Arena, C. B., Szot, C. S., Garcia, P. A., Rylander, M. N., Davalos, R. V. A three-dimensional in vitro tumor platform for modeling therapeutic irreversible electroporation. Biophys J. 103 (9), 2033-2042 (2012).
  38. Sano, M. B., Fesmire, C. C., DeWitt, M. R., Xing, L. Burst and continuous high frequency irreversible electroporation protocols evaluated in a 3D tumor model. Phys Med Biol. 63 (13), 135022(2018).
  39. Marrero, B., Heller, R. The use of an in vitro 3D melanoma model to predict in vivo plasmid transfection using electroporation. Biomaterials. 33 (10), 3036-3046 (2012).
  40. Berrie, P. G., Birkett, F. N. The drilling and cutting of polymethyl methacrylate (Perspex) by CO2 laser. Opt Lasers Eng. 1 (2), 107-129 (1980).
  41. Gothelf, A., Mir, L. M., Gehl, J. Electrochemotherapy: results of cancer treatment using enhanced delivery of bleomycin by electroporation. Cancer Treat Rev. 29 (5), 371-387 (2003).
  42. Tasu, J. P., Tougeron, D., Rols, M. P. Irreversible electroporation and electrochemotherapy in oncology: state of the art. Diagn Interv Imaging. 103 (11), 499-509 (2022).
  43. Babiuk, S., et al. Electroporation improves the efficacy of DNA vaccines in large animals. Vaccine. 20 (27), 3399-3408 (2002).
  44. Bernelin-Cottet, C., et al. Electroporation of a nanoparticle-associated DNA vaccine induces higher inflammation and immunity compared to its delivery with microneedle patches in pigs. J Control Release. 308, 14-28 (2019).
  45. Jorritsma, S. H. T., Gowans, E. J., Grubor-Bauk, B., Wijesundara, D. K. Delivery methods to increase cellular uptake and immunogenicity of DNA vaccines. Vaccine. 34 (46), 5488-5494 (2016).
  46. Edd, J. F., Horowitz, L., Davalos, R. V., Mir, L. M., Rubinsky, B. In vivo results of a new focal tissue ablation technique: irreversible electroporation. IEEE Trans Biomed Eng. 53 (7), 1409-1415 (2006).
  47. Williamson, R. H., DeWitt, M. R., Elhanafi, D., Zaharoff, D. A., Sano, M. B. Optimization of bipolar microsecond electric pulses for DNA vaccine delivery. IEEE Trans Biomed Eng. 72 (1), 1-12 (2025).
  48. Vera Tizatl, C. E., Vega López, M. A., Vera Hernández, A., Leija Salas, L. A., Vera Tizatl, A. L. Proceedings of the 2024 Global Medical Engineering Physics Exchanges / Pan American Health Care Exchanges (GMEPE/PAHCE). 1, 1-5 (2024).
  49. Vera-Tizatl, A. L., et al. Liver-tumor mimics as a potential translational framework for planning and testing irreversible electroporation with multiple electrodes. Bioeng Transl Med. 9 (1), e10607(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model wysokoprzepustowyelektroporacja tkanekelektroporacja odwracalnaelektroporacja nieodwracalnarozkład pola elektrycznegokomórki HEK293mikroskopia fluorescencyjnatransfekcja plazmidowa
Wysokoprzepustowy, trójwymiarowy model tkankowy do ilościowego oznaczania progów elektroporacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.