Znakowanie hESC i hMSC nanocząsteczkami tlenku żelaza w celu nieinwazyjnego śledzenia in vivo za pomocą obrazowania MR

Podsumowanie

W celu oceny nowych terapii komórkami macierzystymi istotne jest nieinwazyjne śledzenie wstrzykniętych komórek in vivo. W tym filmie dowiedzą się Państwo, jak znakować ludzkie mezenchymalne i embrionalne komórki macierzyste za pomocą środków kontrastowych opartych na tlenku żelaza w celu późniejszego obrazowania MR in vivo.

Streszczenie

W ostatnich latach badania nad komórkami macierzystymi doprowadziły do lepszego zrozumienia biologii rozwoju, różnych jednostek chorobowych oraz potencjalnego wpływu tych badań na medycynę regeneracyjną. Nieinwazyjna metoda umożliwiająca wielokrotne monitorowanie przeszczepionych komórek macierzystych in vivo znacznie zwiększyłaby nasze możliwości w zakresie zrozumienia mechanizmów kontrolujących śmierć komórek macierzystych oraz identyfikacji czynników troficznych i szlaków sygnałowych poprawiających ich engrafting. Wykazano, że obrazowanie rezonansem magnetycznym (MR) jest skutecznym narzędziem do obrazowania komórek macierzystych in vivo z niemal mikroskopową rozdzielczością anatomiczną. Aby wykryć komórki macierzyste za pomocą MR, komórki te muszą zostać znakowane specyficznymi dla komórek środkami kontrastowymi do MR. W tym celu stosuje się nanocząsteczki tlenku żelaza, takie jak superparamagnetyczne cząsteczki tlenku żelaza (SPIO), ze względu na ich wysoką czułość w wykrywaniu komórek oraz doskonałą biokompatybilność. Cząsteczki SPIO składają się z rdzenia z tlenku żelaza oraz otoczki z dekstranu, karboksydekstranu lub skrobi i działają poprzez tworzenie lokalnych niejednorodności pola, co powoduje spadek sygnału na obrazach MR ważonych w czasie T2. Niniejsza prezentacja przedstawi techniki znakowania komórek macierzystych za pomocą klinicznie stosowalnych środków kontrastowych do MR w celu późniejszego nieinwazyjnego śledzenia znakowanych komórek in vivo za pomocą obrazowania MR.

Protokół

Znakowanie hMSC ferukarbotronem

Niniejsza technika opisuje sposób znakowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych za pomocą Ferucarbotranu, kontrastowego środka na bazie tlenku żelaza stosowanego w obrazowaniu MR:

1. Na początek, 18–24 godziny przed procedurą znakowania, wysiej komórki w kolbach T75 do osiągnięcia 80% konfluencji. W przypadku użycia innego naczynia hodowlanego odpowiada to około 10000 komórek na cm².
2. Następnego dnia przygotuj medium do znakowania, dodając 30 µl Resovistu do 8 ml medium bezsurowiczego. Taka ilość wystarczy do oznakowania jednej kolby T75 przy 80% konfluencji, co odpowiada stężeniu 100 µg Fe/ml medium.
3. Usuń medium hodowlane i wypłucz komórki raz za pomocą PBS lub medium bezsurowiczego. Jest to konieczne w celu usunięcia pozostałości białek surowicy oraz innych składników medium, które mogłyby wiązać środek kontrastowy i wpływać na wydajność znakowania.
4. Dodaj medium do znakowania do kolby i wprowadź kolbę z powrotem do inkubatora.
5. Po 2 godzinach dodaj 2 ml FCS, aby uzyskać stężenie końcowe 20% FCS. Ma to na celu zapobieganie stymulacji różnicowania komórek i zapewnienie im wzrostu w znanym im środowisku.
6. Inkubuj komórki przez 18 godzin. Najlepiej przeprowadzić ten etap przez noc.
7. Następnego dnia wypłucz komórki za pomocą PBS, a następnie poddaj je trypsynizacji w sposób rutynowy.
8. Po trypsynizacji zawiesinę komórkową należy przemyć 3 razy, aby usunąć z medium pozostałości wolnego środka kontrastowego. Należy to wykonać za pomocą PBS, wirując komórki przy 400 rcf przez 5 minut.
9. Otrzymany osad komórkowy można resuspenderować; jest on gotowy do dalszych eksperymentów.
10. Przeprowadź teraz liczenie komórek, ponieważ część z nich mogła zostać utracona podczas wcześniejszych etapów płukania. W tym momencie wykonaj również test żywotności metodą wykluczania błękitu trypanu oraz pobierz próbki do analizy spektrometrycznej w celu pomiaru wydajności znakowania.

Znakowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych ferumoksydami

1. Na początek, zgodnie ze standardową procedurą, wysiej hESC w naczyniach 10 cm. Naczynia te są wcześniej pokryte żelatyną i zawierają napromieniowane komórki karmne. Niniejszy protokół można stosować również dla kultur bezkomórkowych (feeder-free).
2. Pozostaw hESC do przyczepienia i wzrostu przez około 3-4 dni, aż utworzą kolonie średniej wielkości. W tym czasie dopilnuj, aby kolonie nie urosły zbyt duże, ponieważ większe kolonie są trudniejsze do rozbicia na późniejszym etapie.
3. Kultury te mogą zostać zanieczyszczone przez komórki zróżnicowane, więc w zależności od czystości kolonii, może być konieczne usunięcie zróżnicowanych kultur poprzez dyssekcję.
4. Przygotuj medium do znakowania, składające się z ferumoksydów w stężeniu 100µg/ml oraz pełnego medium do hESC. W tym celu zmieszaj 89µl ferumoksydów i 10 ml pełnego medium wzrostowego.
5. Przepłucz naczynie raz pełnym medium.
6. Dodaj 10 ml medium do znakowania na naczynie i inkubuj komórki przez 4 godziny.
7. Znakowanie jest teraz zakończone. W kolejnym kroku konieczne jest wypłukanie komórek i uzyskanie zawiesiny pojedynczych komórek do dalszego wykorzystania. W tym celu najpierw opłucz naczynie roztworem PBS.
8. Następnie zastąp PBS 5ml 0,25% trypsyny i inkubuj w inkubatorze przez 5 minut lub do czasu odklejenia się komórek. Pomocne jest częste opukiwanie naczynia.
9. Komórki zostały teraz odklejone. Należy pamiętać, że jeśli w naczyniu znajdowały się większe kolonie, mogły pozostać niektóre skupiska.
10. Aby pozbyć się tych skupisk, można raz wymieszać całą zawiesinę za pomocą pipety serologicznej, a następnie pozostawić ją na kolejne 2 minuty.
11. Nie używamy pipety typu Eppendorf, ponieważ wielokrotne zasysanie komórek przez cienką końcówkę może uszkodzić membrany komórkowe.
12. Jeśli obecne są pozostałości skupisk, zawiesinę komórkową można przefiltrować przez sitko komórkowe 40µm.
13. Jeśli wszystko przebiegło prawidłowo, uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek zmieszaną z dużą ilością debris, pochodzących z powłoki żelatynowej, macierzy ESC i martwych komórek. Aby się ich pozbyć, wypłucz komórki dwukrotnie, wirując je przy 400 rcf przez 5 minut i resuspendując w pełnym medium.
14. Teraz ESC muszą zostać odizolowane od napromieniowanych komórek karmnych. Można to zrobić efektywnie, wysiewając zawiesinę komórkową na naczynie pokryte żelatyną.
15. Jeśli naczyniem nie manipulować, wszystkie komórki osiądą na dnie, ale komórki karmne przyczepią się szybciej niż ESC.
16. Zatem, jeśli supernatant zostanie zebrać po 45 minutach, powinien zawierać głównie ESC, podczas gdy komórki karmne powinny być w większości przyczepione do naczynia.
17. W ten sposób uzyskuje się zawiesinę pojedynczych, znakowanych magnetycznie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, które mogą być wykorzystane w dalszych eksperymentach.
18. Podobnie jak w poprzednim protokole, na tym etapie należy policzyć komórki oraz pobrać próbki do oceny żywotności i pomiaru wydajności znakowania.

 

Dyskusja

Nieinwazyjne obrazowanie komórek macierzystych jest kluczowe dla monitorowania niemal każdej terapii opartej na komórkach macierzystych. Lepsze zrozumienie kinetyki in vivo znakowanych komórek macierzystych, wizualizowanej na obrazach MR, może utorować drogę do racjonalnego i bardziej efektywnego wykorzystania terapii komórkowych. Ponieważ stosujemy klinicznie dostępne środki kontrastowe i techniki obrazowania, prezentowane protokoły powinny być łatwo możliwe do przeniesienia na zastosowania u pacjentów. Potencjalne zast...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
D-MEM High Glucose	Odczynnik	Sigma-Aldrich	D5648
Żelatyna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	G1890	rozcieńczyć żelatynę w PBS do stężenia końcowego 0.1 %
PBS (bez Ca++ Mg++)	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsyna-EDTA 0.05%	Odczynnik	Invitrogen	25300-120
Trypsyna-EDTA 0.25%	Odczynnik	Invitrogen	25200-114
FBS charakteryzowany	Odczynnik	Hyclone	SH30071.03
Sito do komórek (40 μm nylon)	Narzędzie	BD Biosciences	352340
Knockout DMEM	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	10829018
Knockout Serum Replacer	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	10828028
b-merkapto–etanol	Odczynnik	Sigma-Aldrich	7522
nieistotne aminokwasy	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	11140050
FGF-2	Odczynnik	R&D Systems	233-FB-025
Glutamina	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	25030081
Penicylina/Streptomycyna	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Ferumoksydy (Endorem)	Odczynnik	Guerbet
Ferukarbotran (Resovist®)	Odczynnik	Bayer AG