Wielomodalny mikroskop Ramana z szeroką polową transformacją Fouriera

Podsumowanie

Mikroskop szerokokątowy z transformatem Fouriera, oparty na kompaktowym i ultrastabilnym interferometrze dwułamannym, umożliwia równoległe pozyskiwanie widm dla wszystkich pikseli detektora 2D. Podejście w dziedzinie czasowej umożliwia rozplątanie sygnałów fotoluminescencyjnych i Ramana oraz umożliwia szybkie mapowanie Ramana (~5 ms/piksel) z rozdzielczością przestrzenną ~1 μm i spektralną 23 ^cm-1 .

Streszczenie

Mikroskopia Ramana to potężna technika określająca skład chemiczny próbki. Głównym wyzwaniem nowoczesnych mikroskopów Ramana opartych na detekcji częstotliwości punktowej jest uzyskanie map Ramana dużych obszarów ze względu na zazwyczaj długie czasy zatrzymywania się pikseli (0,1-1 s). Szerokokątny mikroskop transformaty Fouriera (FT) prezentowany tutaj umożliwia szybkie pomiary rozległych próbek z rozdzielczością przestrzenną ~1 μm i spektralną ~23 ^cm-1 . Opiera się na ultra-stabilnym i kompaktowym interferometrze dwułamnym o wspólnej ścieżce, dodanym wzdłuż ścieżki detekcji mikroskopu komercyjnego, który umożliwia równoległe pozyskiwanie widm dla wszystkich pikseli detektora 2D, znacząco skracając czas pomiaru (10-100 razy szybciej). Podejście w dziedzinie czasu skutecznie rozwiązuje kolejne ograniczenie techniki w dziedzinie częstotliwości, czyli rozplątanie sygnału Ramana od tła fotoluminescencji, w którym sygnał Ramana może być ukryty. Protokół ten opisuje, jak wykonywać pomiary hiperspektralne za pomocą ulepszonego mikroskopu komercyjnego: wyrównanie schematu oświetlenia, kryteria wyboru parametrów pomiarowych oraz analizę danych w celu pobrania i badania widm.

Wprowadzenie

Obrazowanie spektralne to technika dostarczająca zarówno informacje spektralne, jak i przestrzenne, i była stosowana w różnych dziedzinach, od mikroskopii¹ po teledetekcję². Obrazowanie wielospektralne i hiperspektralne rozróżnia się na podstawie tego, czy dla każdego piksela czujnika 2D zarejestrowano kilka dyskretnych pasm spektralnych, czy jedno widmo ciągłe. Obrazowanie Ramana to szczególna implementacja obrazowania spektralnego.

Mikroskopia rozpraszania Ramana to potężna technika pomiaru częstotliwości drgań ν_R układu. Tryby drgań są powiązane z wiązaniami chemicznymi, dlatego spektroskopia Ramana³ umożliwia badanie składu chemicznego próbek w biologii⁴ oraz naukach o materiałach⁵. W spontanicznej spektroskopii Ramana próbka jest oświetlana monochromatycznym promieniowaniem o częstotliwości ν₀, zwanym pompą. Część światła pompy, oddziałując z trybami drgań, może ulegać rozpraszaniu nieelastycznemu, co skutkuje powstawaniem fotonów o częstotliwościach ν_S (ν_AS)=ν₀-(+)_{ν R}, gdzie ν_R to częstotliwość drgań molekularnych w próbce. Światło rozproszone o niższej energii (ν_S) nazywane jest promieniowaniem Stokesa, natomiast promieniowanie o wyższej energii (ν_AS) to promieniowanie anty-Stokesa. W równowadze termicznej większość cząsteczek zajmuje niższe stany energetyczne, dlatego składowe anty-Stokesa są znacznie słabsze niż składowe Stokesa. Z tego powodu mikroskopia rozpraszająca Ramana zazwyczaj wykrywa fotony Stokesa. Ponieważ cząsteczki i ciała stałe mają wiele trybów drgań, widmo Ramana charakteryzuje się wyraźnymi pasmami, które łącznie tworzą unikalny chemiczny podpis, umożliwiający identyfikację i analizę materiału. Głównym wyzwaniem tego podejścia jest niezwykle niski przekrój poprzeczny spontanicznego rozpraszania Ramana, przy czym tylko jeden z ponad 10^{9-10 12} fotonów podlega temu procesu.

W standardowej konfiguracji mikroskopu rozpraszającego Ramana światło wzbudzające jest ściśle skupione na jednym punkcie próbki. Po odrzuceniu fotonów pompowych rozpraszanych sprężysto (zazwyczaj z filtrami spektralnymi), pozostałe światło jest zbierane i charakteryzowane spektrometrem w dziedzinie częstotliwości (np. siatką dyspersyjną); rozdzielczość spektralna tych urządzeń może sięgać ~0,5-1 ^cm-1. Pomiar powtarza się dla każdego punktu (x,y) w polu widzenia (FOV) próbki metodą zwaną skanowaniem punktowym lub rastrowym⁶. Istnieją dwa główne problemy tego podejścia: (1) niski przekrój czynny spontanicznego rozpraszania Ramana zazwyczaj wymaga długich czasów całkowania (0,1-1 s), aby zebrać wystarczającą ilość fotonów na każdy piksel spektrometru, dlatego mapa Ramana rozszerzonej próbki może wymagać długich czasów pomiaru; (2) wzbudzenie przez światło pompy powoduje również fotoluminescencję (PL), która nakłada się na spontaniczny sygnał Ramana i często może go przytłoczyć.

Aby zwiększyć szybkość akwizycji, można przyjąć podejście line scanning⁷ , w którym pompa skupia się wzdłuż linii FOV (np. na współrzędnej x), a zebrany sygnał (PL lub rozpraszanie Ramana) jest rozpraszany przez spektrometr z czujnikiem 2D, co daje dla danej współrzędnej x zbiór danych 2D, w którym jedna oś odpowiada widmowi, a druga jednej współrzędnej przestrzennej y. Niemniej jednak ta implementacja nadal cierpi na znaczne straty spowodowane przez szczelinę wejściową spektrometru, której wąska szerokość zapewnia lepszą rozdzielczość spektralną, ale także ogranicza ilość zebranego światła.

Konfiguracja szerokopolna może być bardziej odpowiednia do skrócenia czasu pomiaru: tą metodą oświetlany jest duży obszar próbki, a widmo jest rejestrowane dla wszystkich pikseli sensora 2D jednocześnie. W tym przypadku informacje spektralne można zbierać, używając zestawu filtrów pasmowych⁸ lub regulowanego filtra^{spektralnego 9} przed kamerą monochromatyczną. Ponadto metoda ta opiera się na podejściu w dziedzinie częstotliwości i obejmuje jedynie określoną liczbę pasm widmowych.

Alternatywną metodą pomiaru widma jest podejście transformaty Fouriera (FT). Jest to technika w dziedzinie czasu oparta na twierdzeniu¹⁰ Wiener-Kintchina, które mówi, że gęstość widmowa sygnału jest transformatą Fouriera jego autokorelacji czasowej. W optyce uzyskuje się to w praktyce poprzez generowanie dwóch opóźnionych replik przebiegu za pomocą interferometru. Ich interferencja jest mierzona przez detektor jako funkcja opóźnienia względnego, co daje tzw. interferogram¹¹. Podejście FT jest szeroko stosowane do pomiaru widm w obszarze spektralnym podczerwieni, gdzie nazywa się spektroskopią podczerwieni z transformatem Fouriera (FTIR)¹². FTIR jest rutynowo używany do pomiaru spektrum absorpcji przejść drgań w zakresie spektralnym średniej podczerwieni (~2,5−25 μm długości fali).

Podejście FT w dziedzinie czasu oferuje pewne zalety w porównaniu do konwencjonalnych spektrometrów dyspersyjnych: osiąga większą przepustowość dzięki braku szczelin (przewaga Jacquinota etendue¹²); zapewnia elastyczną rozdzielczość spektralną, która zależy wyłącznie od zakresu skanowania. Co więcej, jest dobrze przystosowany do konfiguracji szerokopolnych: w rzeczywistości, przy użyciu detektora 2D, metoda ta mierzy jeden interferogram na każdy piksel równolegle, co umożliwia jednoczesne rejestrowanie ciągłych widm na wszystkich pikselach. Z drugiej strony, system obrazowania FT musi spełniać dwa trudne wymagania: (1) względne opóźnienie między dwoma replikami światła musi być kontrolowane do niewielkiej części cyklu optycznego; (2) przesunięcie fazy między promieniami interferującymi w pojedynczym pikselu musi być ograniczone, aby zagwarantować dobrą spójność, a tym samym wysoki kontrast. Niektóre rozwiązania zostały zaproponowane na podstawie wspólnej ścieżki^{13, 14} lub^{prawie 15} interferometrów, ale są one dość nieporęczne lub mają rozdzielczość spektralną większą niż 100 ^cm-1.

W tej pracy opisano nowatorski mikroskop szerokokątny, który umożliwia pozyskiwanie zdjęć fotoluminescencyjnych i rozpraszania Ramana. Innowacyjnym blokiem tego systemu jest kompaktowy i ultrastabilny interferometr dwułamiący o wspólnej ścieżce, zwany Translating-Wedge-based Translating-Wedge-based Identical pulses eNcoding System (TWINS)¹⁶. Zapewnia skanowanie opóźnione przez setki cykli optycznych z dokładnością fazową niewielkiej części samego cyklu optycznego i wysoką stabilnością. Obie repliki światła mają polaryzacje ortogonalne i poruszają się kolijowo tą samą wspólną ścieżką, dlatego nie są podatne na fluktuacje długości ścieżki, typowe dla interferometru dwuwiązkowego. Schemat, pokazany na wkładzie na Rysunku 1, składa się z dwóch bloków kryształu dwułamnego o ortogonalnych osiach optycznych: jeden (B₂) o stałej długości, a drugi (B₁) podzielony na dwa kliny, które można przesuwać wzdłuż wspólnego kierunku przepustki. Światło padające jest spolaryzowane przez P₁ pod kątem 45° względem osi optycznej kryształu dwułamnego, tak że połowa energii przypada wzdłuż polaryzacji zwyczajnej, a połowa wzdłuż nadzwyczajnej. Podczas przemieszczania się wzdłuż bloków dwułomnych dwa ortogonalne elementy kumulują względne opóźnienie, które jest precyzyjnie regulowane przez zmianę całkowitej grubości bloku B₁ poprzez zmianę wstawienia klina. Drugi polaryzator_P2 projektuje składowe pola na wspólną polaryzację liniową, aby zakłócić ich interferencję. Opóźnienie τ między replikami zależy od przemieszczenia klina x wzdłuż wspólnej przepustki jako (Równanie 1) , z prędkością c prędkości światła, α kątem wierzchołka klinów, Δn= n_{e-n o} różnicy w zwykłych i nadzwyczajnych współczynnikach załamania (dwójłomność). Ponieważ rozdzielczość spektralna Δv jest odwrotnie proporcjonalna do zakresu skanowania T=|T_{2-T 1}|, z opóźnieniem początkowym i końcowym interferogramu T₁,_T2 , wysoka rozdzielczość spektralna wymagana przez spektroskopię Ramana wymaga wysokiej dwułamności i długich translacji klinowych. Wśród najczęściej spotykanych kryształów dwułomnych, YVO₄ (ortowowandan ytru) jest szczególnie odpowiedni ze względu na wysokie Δn i przezroczystość w podczerwieni widzialnej i bliskiej. Kliny zaprojektowano z kątem wierzchołkowym 10°, dzięki czemu przy długości skanu 15,3 mm interferometr może nadawać opóźnienie 2500 fs przy 600 nm, uzyskując rozdzielczość spektralną 23 ^cm-1 na całym zakresie spektralnym zainteresowania (czułość kamery krzemowej stanowi górną granicę). Praca ta przedstawi strategię właściwego ustawienia próbkowania interferogramu (tj. zakres krokowy i skanowy), aby osiągnąć pożądaną rozdzielczość spektralną oraz poradzić sobie z tłem szerokopasmowym, oddzielając sygnał Ramana od fotoluminescencji.

Jak opisali Candeo i ^in.17, ten spektrometr dwułamny może być połączony z komercyjnym mikroskopem optycznym do wykonywania pomiarów hiperspektralnych. Wymagania to: konfigurowalny korpus mikroskopu optycznego, interferometr dwułamiący TWINS, niskoszumowy aparat monochromatyczny (np. CCD lub sCMOS) oraz wąskopasmowe źródło laserowe. Dla tego ostatniego typowe długości fal wzbudzenia dla spektroskopii Ramana i fluorescencji to 355 nm, 488 nm, 514 nm, 532 nm, 633 nm i 785 nm. Pomimo że lasery o wysokiej czystości spektralnej, takie jak ten wymieniony w Tabeli Materiałów, są najlepszym wyborem, można również użyć lasera o szerszej szerokości linii, np. ~0,1 nm, ze względu na ograniczoną rozdzielczość spektralną instrumentu. Mikroskop jest modernizowany poprzez umieszczenie TWINS w ścieżce detekcji, pomiędzy soczewką rury a detektorem monochromatycznym. Ta konfiguracja zapewnia jednolite opóźnienie ścieżki w polu widzenia oraz średni kontrast 55%. Ścieżka wzbudzenia jest zaprojektowana tak, aby uzyskać równomierne oświetlenie próbki: w praktyce końcówka wyjściowa światłowodu wielordzeniowego jest obrazowana na płaszczyźnie próbki. Dzięki użyciu mechanicznego scramblera mody są silnie sprzężone w rdzeniu włókna, tworząc płaski profil na płaszczyźnie próbki. Ponadto drgająca cewka głosowa uśrednia wzór plamkowy typowy dla promieniowania monochromatycznego. Charakterystyka tego oświetlenia cylindra przedstawiona jest na Rysunku Uzupełniającym 1. Wiązka jest skupiona na próbce za pomocą obiektywu korygowanego o nieskończoność, który również zbiera rozproszone światło Ramana i luminescencyjne w kierunku ścieżki detekcji. Filtry potrzebne do odrzucenia oświetlenia zostaną szczegółowo opisane.

Aby pokazać, jak mierzyć cechy spektralne szerokopasmowe i wąskopasmowe za pomocą tego mikroskopu hiperspektralnego, mierzy się zarówno luminescencję, jak i rozpraszanie Ramana dla próbki testowej specjalnie wybranej do celów ilustracyjnych. Próbka składa się z mieszaniny trzech pigmentów proszkowych o dobrze znanych widmach Ramana: dwóch polimorfów białych tytanów (TiO₂), mianowicie rutylu i anatasu, oraz żółci siarczkowej kadmu (CdS). Jednak ta sama procedura może być stosowana w szerszym zakresie zastosowań, od nauki o materiałach po biologię.

Celem tego artykułu jest zilustrowanie kroków przeprowadzenia pomiaru hiperspektralnego, natomiast montaż i wyrównanie interferometru TWINS zostały szczegółowo opisane przez Candeo i ^in.17. Dlatego zainteresowany eksperymentator powinien zacząć od wcześniej złożonego interferometru opartego na tej technologii.

Protokół zaczyna się od przygotowania próbki i od sposobu ustawienia mikroskopu, aby wzbudzić i zebrać fotony rozpraszania Ramana oraz PL. Następnie parametry skanowania (długość skanowania, krok próbkowania) oraz parametry akwizycji (czas ekspozycji, sprzętowe binowanie) są ustawiane zgodnie z wymaganiami badanego sygnału. Na koniec zostanie przedstawiony proces postprocessingu, opisujący procedurę pobierania widma dla każdego piksela (hiperkostka spektralna, rysunek 2B) z pozyskanego zbioru danych czasowych (hiperkostka czasowa, rysunek 2A) oraz przedstawiający algorytmy redukcji szumów i zaawansowanej analizy spektralnej. Cały proces pracy przedstawiony jest na Rysunku 3.

Protokół

Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie próbki

UWAGA: Podczas tego przygotowania noś rękawiczki lateksowe, ponieważ pigment CdS jest toksyczny, zwłaszcza podczas inhalacji.

1. Użyj skrobaka, aby nałożyć 20 mg każdego proszku pigmentowego na precyzyjną wagę, uzyskując proporcję wagową 1:1:1.
   UWAGA: Ostrożnie czyść końcówkę skrobaczka przy każdej próbce, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
2. Wymieszaj proszki z moździerzem, aby usunąć grudki.
3. Wylej powstałą mieszankę na szkiełko mikroskopowe; Użyj końcówki skrobaka, aby delikatnie docisnąć i uzyskać niemal jednolitą grubość warstwy.
4. Nałóż lakier na krawędzie pokrywy mikroskopu. Nałóż go na mieszankę, skierowanym do paznokci skierowanym do dołu, i przyłóż wystarczający nacisk, by ją uszczelnić. Pozwól wyschnąć przez kilka sekund, żeby polera stwardniała.

2. Ustawienie mikroskopu

UWAGA: Noś okulary ochronne, gdy laser jest włączony, ponieważ maksymalna moc osiągalna na płaszczyźnie próbki wynosi 300 mW.

UWAGA: Wydajność lasera pompowego pozostaje niezmieniona przez wahania temperatury, o ile jest on używany w zakresie temperatur określonych w karcie katalogowej (np. 10-40 °C dla lasera podanego w Tabeli Materiałów).

1. Ustaw interferometr TWINS wzdłuż ścieżki detekcji mikroskopu.
   UWAGA: Jak szczegółowo opisali Candeo i ^in.17, moduł interferometryczny musi być umieszczony pomiędzy soczewką lampy a detektorem, co zapewnia odpowiednią odległość między nimi. W przypadku mikroskopu używanego w tej pracy jest to gwarantowane tylko po usunięciu modułu okularu.
2. Aby dostosować schemat oświetlenia Koehlera do wzbudzenia laserowego, usuń wbudowaną lampę wzbudzającą mikroskopu i użyj obiektywu mikroskopowego do zbierania światła na wyjściu z dużego rdzenia światłowodu wielokodowego.
   UWAGA: Powiększenie obiektywne określa rozmiar wzoru oświetlenia, gdy czubek włókna jest sprzężony z płaszczyzną próbki. Jednym z możliwych wyborów jest cel 10x/0,25-0,30.
3. Wybierz długość fali wzbudzenia i skoncentruj laser wzbudzający na wejściu światłowodu wielordzeniowego o dużym rdzeniu. Włącz kamerę i uruchom oprogramowanie do wizualizacji.
   1. Przymocuj środkową część włókna do drgającej membrany cewki głosowej, co usunie plamkę. Mechanicznie mieszaj światłowód, mocno je wyginając tak, aby połączyć wszystkie jego mody przestrzenne. Włącz laser.
   2. Przygotuj próbkę do wyrównania, np. fluorescencyjne czerwone paski markerowe na okładce mikroskopu.
   3. Dostosuj pozycję końcówki światłowodu względem systemu optycznego oświetlenia, przesuwając światłowód za pomocą precyzyjnego stopnia translacji, aby uzyskać plamę o jednolitej intensywności i dobrze określonych krawędziach na płaszczyźnie próbki.
      UWAGA: Do wszystkich zgłaszanych pomiarów używany jest laser o częstotliwości 532 nm. Przy włóknie o rozmiarze rdzenia 400 μm, średnica plamki pokrywa 82% szerokości pola widzenia kamery.
4. Stosuj zestaw filtrów dla ścieżek wzbudzenia i detekcji, przyjmując następujące kryteria (Rysunek Uzupełniający 2):
   1. Użyj filtra wąskopasmowego o średnicy 532 nm (szerokość pasma 2,0 nm) do czyszczenia linii laserowej i odrzucania wszelkich pasm bocznych pompy powstałych w wyniku nieliniowego rozszerzania się w wyniku propagacji w światłowodzie.
   2. Użyj lustra dichroicznego (DM na Rysunku 1), aby odbijać światło laserowe w kierunku próbki i przepuszczać przesunięte ku czerwieni promieniowanie wsteczne zebrane przez obiektyw.
   3. Użyj filtra długprzepustowego (LPF na rysunku 1) przy 532 nm, aby odrzucać pozostałe światło oświetleniowe.
   4. Podczas pomiaru rozpraszania Ramana używaj filtra krótkprzepustowego (SPF na Rysunku 1) przy 600 nm, aby tłumić fluorescencję tła.
5. Zmierz moc na samolocie próbkowym za pomocą miernika mocy. Osłabić wiązkę pompy, aby uzyskać natężenie w próbce, które nie powoduje uszkodzeń (rzędu 2 W/cm², jak podano w Tabeli 1). Używaj migawki laserowej, ustawiając pozostałe parametry pomiarowe.
   UWAGA: Ze względu na niewielki przekrój spontanicznego rozpraszania Ramana, potrzebna jest wysoka gęstość mocy, aby poprawić zbieranie sygnału. Jednak należy wziąć pod uwagę próg próbnych obrażeń. W przeciwieństwie do systemów punktowego skanowania, system szerokopolowy oświetla duży obszar, co zmniejsza efektywność rozpraszania energii i wymaga starannego zarządzania energią, aby zapobiec uszkodzeniom próbki.
6. Połóż próbkę na stole mikroskopowym i dostosuj ostrość.
   UWAGA: Aby łatwo znaleźć ognisko, najpierw oświetl próbkę białą lampą w transmisji lub odbiciu. W tym drugim przypadku można użyć żarówki umieszczonej obok mikroskopu. Ostrość próbki zostanie następnie zoptymalizowana za pomocą światła lasera pompowego.

3. Parametry pomiarowe

1. Włącz sterownik silnika, który wykonuje translację klina. Sterować komponentami sprzętowymi (kamerą i silnikiem) jednocześnie w celu wykonania pomiarów hiperspektralnych (przykład interfejsu użytkownika pokazany na Dodatkowym Rysunku 3).
2. Ustaw parametry akwizycji kamery, czas ekspozycji oraz sprzętowe binowanie, aby zoptymalizować natężenie sygnału, stosując następujące instrukcje:
   1. Ponieważ wysoki stosunek sygnału do szumu (SNR) w sygnale czasowym prowadzi do wysokiego SNR w uzyskanych widmach, należy uznać za długi czas naświetlania, który lepiej wypełnia zakres dynamiczny sensora.
      UWAGA: Dla słabych sygnałów, podobnie jak przy rozpraszaniu Ramana, należy znaleźć kompromis między poziomem sygnału a całkowitym czasem pomiaru: najdłuższy czas naświetlania może być niemożliwy.
   2. Wybierz sprzętowe binowanie, aby pobrać ładunek z większej liczby pikseli przed odczytem.
      UWAGA: Sumowanie ładunku i wykonanie pojedynczego odczytu daje lepszą wydajność szumu niż odczyt kilku pikseli i sumowanie ich sygnału w procesie końcowym. Wybór binningu jest również zależny od akceptowalnego zmniejszenia rozdzielczości przestrzennej.
3. Wybierz parametry skanowania, całkowitą długość skanowania oraz krok próbkowania zgodnie z następującymi kryteriami:
   1. Aby uzyskać wysoką rozdzielczość spektralną dla szczytów Ramana, ustaw asymetryczną translację długiego klina (-2526 fs→ -36 fs). Z kolei wykonaj symetryczne skanowanie wokół pozycji zerowego opóźnienia (-65 fs → 65 fs), aby uzyskać więcej szerokopasmowych cech widmowych sygnału PL.
   2. Używając równania 1 dla opóźnienia τ jako funkcji translacji klina x, wybierz krok próbkowania, aby spełnić granicę Nyquista dla interesującej szerokości pasma widmowego.
      UWAGA: Dla danego minimalnego długości fali widma λ_min, należy nałożyć (Równanie 2).
      
      gdzie dwułomność Δn zależy od długości fali (zob. równania Sellemeiera).
4. Otwórz migawkę, aby oświetlić próbkę laserem. Jeśli zaobserwuje się spadek intensywności sygnału, należy poczekać, aż próbka osiągnie stan stacjonarny (zazwyczaj kilka sekund).
   UWAGA: Aby zrekompensować spadek intensywności sygnału, dostosuj binning i czas ekspozycji, aby utrzymać dobrą SNR.
5. Rozpocznij pobieranie obrazu monochromatycznego dla każdej pozycji klina, czyli opóźnienia czasowe między replikami z każdego punktu czujnika 2D.
   UWAGA: Oprogramowanie do rejestracji powinno zapisywać dwie zmienne: hiperkostkę czasową (zestaw obrazów 2D) oraz wektor pozycji silników rejestrowany przez enkoder podczas skanowania.
6. Po zakończeniu pomiaru wyłącz laser i przejdź do analizy danych.

4. Przetwarzanie pozyskanej datacube

1. Wygeneruj hiperkostkę spektralną z pozyskanego zbioru danych, stosując się do następujących instrukcji:
   1. Załaduj plik korekcji pozycji silnika konkretnego silnika krokowego (zobacz dyskusję).
   2. Załaduj plik kalibracji częstotliwości dla konkretnego interferometru, aby powiązać zmierzone częstotliwości przestrzenne (pseudoczęstotliwości) z rzeczywistymi częstotliwościami optycznymi (patrz sekcja Dyskusja).
   3. Wybierz zakres częstotliwości widm, które zostaną obliczone przez transformację interferogramów wszystkich pikseli przez Fouriera.
   4. Spośród dostępnych funkcji apodizacyjnych¹² do okienkowania zmierzonego interferogramu, wybierz tę, która oferuje dobry kompromis między poszerzaniem widma a redukcją artefaktów w odzyskanych widmach, na przykład okno Happ-Genzel (Hamming).
   5. Generuj hiperkostkę spektralną przez transformację Fouriera apodizowanych interferogramów dla wszystkich pikseli. Zapisz to w złożonych wartościach.
      UWAGA: Złożone widmo z FT niesie dodatkowe informacje, które będą przydatne do odszumienia zbioru danych i wyodrębnienia średnich widm zestawu wybranych pikseli.
2. Po obliczeniu hiperkostki widmowej należy przeprowadzić różne badania, np. uzyskać średnie widmo w wybranych obszarach; generować obraz RGB w fałszywych kolorach; piki spektralne na mapie; odejmij tło.
3. Aby zmniejszyć szum spektralny, który może przytłoczyć znaczące piki, zwłaszcza w widmach Ramana, zaimplementuj Dekompozycję Wartości Osobliwych (SVD)¹⁸ , stosując następujące kroki:
   1. Przekształcić hipersześcian czasowy w macierz A z interferogramami wzdłuż jej rzędów.
   2. Wykonaj SVD macierzy, uzyskując macierze U, S i V takie, że A = USV^T.
      UWAGA: Kolumny U to rozkłady przestrzenne wektorów własnych V (kolumn), natomiast S to macierz diagonalna o liczbach osobliwych (SV) w kolejności malejącej.
   3. Przekształc każdą kolumnę U w macierz pikseli i wykonaj jej 2D FT, aby uzyskać częstotliwości przestrzenne.
   4. Ponieważ wysokie częstotliwości wiążą się z bardzo nagłymi zmianami mapy, traktujemy je jako szum; definiuj kwadratowy obszar centrowany w obliczonej przestrzeni Fouriera, który oddziela niskie (głównie sygnałowe) i wysokie (głównie szumy).
      UWAGA: Możliwym wyborem dla tego pola jest bok 1/4 względem rozmiaru przestrzeni Fouriera.
   5. Oblicz przestrzenny stosunek sygnału (SSR) dla każdego SV, dzieląc sumę intensywności pikseli (moduł zespolony) w obrębie granicy przez sumę intensywności poza granicą. Wyznacz SSR jako funkcję numeru SV.
   6. Zdefiniuj próg dla SSR, czyli liczbę istotnych SV, które należy zachować, aby zmniejszyć wkład szumu w zbiorze danych i uniknąć artefaktów.
      UWAGA: SSR zazwyczaj wykazuje tendencję malejącą, która wraz ze wzrostem liczby wartości osobliwych stabilizuje się w płaskowyż. Zasadą jest zachowanie wartości osobliwych do momentu, w którym zaczyna się plateau.
   7. Ustaw wszystkie dolne SV na zero w macierzy diagonalnej S, co daje S_{bez szumowania,} i oblicz denoizowany hipersześcian temporalny jako amerykański_denoizowany V^T.
      UWAGA: SVD to faktoryzacja macierza, którą można również zastosować do przekształconej hipersześcianu spektralnego (z wierszami zawierającymi widma zamiast interferogramów).
4. Powtórz kroki 4.1-4.2 z odemizowaną hiperkostką czasową, aby odzyskać widma.
5. Pobierz program z linku w Referencji¹⁹ , aby przeprowadzić głębszą analizę zbioru danych za pomocą algorytmu Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS).
   UWAGA: Programiści przedstawiają szczegółowy opis algorytmu²⁰. Jest to metoda iteracyjny do rozwiązania problemu analizy mieszaninowej: każde widmo wyraża się jako liniowa kombinacja czystych profili spektralnych. Przy reprezentacji macierzowej: B = C R^T+E, gdzie B to zbiór danych, C zawiera stężenia dla każdego widma, kolumny R to widma odniesienia składników składowych, a E wyraża błąd.
   1. Przekształc hiperkostkę spektralną w macierz N_pikseli x_{N częstotliwości}, z łączną liczbą pikseli _{i N} częstotliwością wektora częstotliwości.
   2. Wybierz liczbę gatunków oczekiwanych w próbce i załaduj ich spektra odniesienia.
      UWAGA: Widma odniesienia można mierzyć dla każdego pigmentu osobno. W przeciwnym razie program tworzy SVD zbioru danych i używa tylu głównych komponentów, ile wybranych składników do początkowych przypuszczeń.
   3. Wybierz ograniczenia: uzyskane profile spektralne muszą być nieujemne i jak najbardziej podobne do widm referencyjnych.
   4. Na wykresie narysuj mapę koncentracji (przekształcone kolumny C) oraz widma (kolumny litery R) dla każdego gatunku.
   5. Eksportuj te mapy i użyj ich do wygenerowania obrazu w fałszywych kolorach (rysunek 4A), kończąc analizę.
      UWAGA: Programy użyte do uzyskania przedstawionych tutaj wyników nie są publicznie dostępne, ale można je uzyskać od autorów na życzenie.

Wyniki

Rysunek 4A przedstawia mapę Ramana dla wybranego obszaru mieszaniny proszkowej. Jest to fałszywa reprezentacja map obfitości pobranych za pomocą MCR-ALS, opisanych w kroku 4.5. Dostarcza informacji o składzie próbki, ponieważ trzy gatunki można wyraźnie rozróżnić w polu widzenia. Rysunek 4B przedstawia średnie widma w wybranych regionach mapy, z rozdzielczością spektralną 23 ^cm-1, określoną przez wybraną długość skanu. Wybrany zestaw filtrów pozwala z...

Dyskusja

Wprowadzono szerokokątowy mikroskop multimodalny FT do pozyskiwania spontanicznych obrazów rozpraszania Ramana i luminescencji, który jest stosowany w nauce o materiałach. Zastosowanie do próbek biologicznych wykazują Candeo i ^in.17, którzy przedstawiają hiperspektralny obraz fluorescencyjny barwionych ludzkich komórek. Głównym wyzwaniem przy pomiarach rozpraszania Ramana w tej dziedzinie jest zapobieganie uszkodzeniom foto wynikającym z nieefektywnego rozpraszania ciepła z szeroko oświetlonego ob...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anatase	Kronos	1200	Polimorfia białego TiO2 pigment
Proszek siarczku kadmu	Kremer Pigmente GmbH & Kompanii	21060	Kadmowy żółty, indeks koloru ciemny/PY35
Kamera	Andor	Luca R	Kamera CCD mnożąca elektrony z 1004x1002 pikselami 8&mikro; m x 8µ m
Filtr oczyszczający	Semrock	LL01-532-12.5	Ø 1/2" 2,0 nm - FWHM filtr liniowy laserowy na 532 nm
Pokrywki	BRAND GmbH & Co	4700 55	Szkło borokrzemowe 22x22x0,15 mm pokrywy mikroskopu
Lustro dichroiczne	Semrock	Di02-R532-25x36	25,2x35,6 mm laserowy dichroiczny rozdzielacz wiązki jednokrawędziowej na 532 nm
Światłowód	Thorlabs	M74L05	400&mikro; Rozmiar rdzenia m, światłowód wielomodowy NA 0.39
Laser	Fotonika Hubnera	Cobolt Samba 1000	Laser pompowany diodą CW z prędkością 532 nm, maksymalna moc 1000 mW
Filtr długprzepustowy	Semrock	LP03-532RU-25	Ultra stromy filtr długprzepustowy na krawędzi przy 532 nm
Mikroskop	Leica	DMRBE	Mikroskop badawczy trójnoczny (NPP);
Cel	Leica	PL-FLUOTAR, 10x/0,30	Cel wzbudzania i zbierania z powiększeniem 10x, 0,3 NA
Cel	Newport	M-10X	Soczewka obiektywu w ścieżce oświetlenia, z powiększeniem 10x, 0,25 NA
Rutile	Kronos	2900	Polimorfia białego TiO2 pigment
Filtr krótkprzepustowy	Thorlabs	FESH600	Ø Filtr krótkoprzepustowy 25,0 mm z długością fali odcięciowej 600
Slajdy	Marienfeld	1000612	Szkiełka mikroskopowe 76x26x1 mm