Mikroskop szerokokątowy z transformatem Fouriera, oparty na kompaktowym i ultrastabilnym interferometrze dwułamannym, umożliwia równoległe pozyskiwanie widm dla wszystkich pikseli detektora 2D. Podejście w dziedzinie czasowej umożliwia rozplątanie sygnałów fotoluminescencyjnych i Ramana oraz umożliwia szybkie mapowanie Ramana (~5 ms/piksel) z rozdzielczością przestrzenną ~1 μm i spektralną 23 cm-1 .
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wielomodalny mikroskop Ramana z szeroką polową transformacją Fouriera
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia Ramana to potężna technika określająca skład chemiczny próbki. Głównym wyzwaniem nowoczesnych mikroskopów Ramana opartych na detekcji częstotliwości punktowej jest uzyskanie map Ramana dużych obszarów ze względu na zazwyczaj długie czasy zatrzymywania się pikseli (0,1-1 s). Szerokokątny mikroskop transformaty Fouriera (FT) prezentowany tutaj umożliwia szybkie pomiary rozległych próbek z rozdzielczością przestrzenną ~1 μm i spektralną ~23 cm-1 . Opiera się na ultra-stabilnym i kompaktowym interferometrze dwułamnym o wspólnej ścieżce, dodanym wzdłuż ścieżki detekcji mikroskopu komercyjnego, który umożliwia równoległe pozyskiwanie widm dla wszystkich pikseli detektora 2D, znacząco skracając czas pomiaru (10-100 razy szybciej). Podejście w dziedzinie czasu skutecznie rozwiązuje kolejne ograniczenie techniki w dziedzinie częstotliwości, czyli rozplątanie sygnału Ramana od tła fotoluminescencji, w którym sygnał Ramana może być ukryty. Protokół ten opisuje, jak wykonywać pomiary hiperspektralne za pomocą ulepszonego mikroskopu komercyjnego: wyrównanie schematu oświetlenia, kryteria wyboru parametrów pomiarowych oraz analizę danych w celu pobrania i badania widm.
Wprowadzenie
Obrazowanie spektralne to technika dostarczająca zarówno informacje spektralne, jak i przestrzenne, i była stosowana w różnych dziedzinach, od mikroskopii1 po teledetekcję2. Obrazowanie wielospektralne i hiperspektralne rozróżnia się na podstawie tego, czy dla każdego piksela czujnika 2D zarejestrowano kilka dyskretnych pasm spektralnych, czy jedno widmo ciągłe. Obrazowanie Ramana to szczególna implementacja obrazowania spektralnego.
Mikroskopia rozpraszania Ramana to potężna technika pomiaru częstotliwości drgań νR układu. Tryby drgań są powiązane z wiąza....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
1. Przygotowanie próbki
UWAGA: Podczas tego przygotowania noś rękawiczki lateksowe, ponieważ pigment CdS jest toksyczny, zwłaszcza podczas inhalacji.
- Użyj skrobaka, aby nałożyć 20 mg każdego proszku pigmentowego na precyzyjną wagę, uzyskując proporcję wagową 1:1:1.
UWAGA: Ostrożnie czyść końcówkę skrobaczka przy każdej próbce, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. - Wymieszaj proszki z moździerzem, aby usunąć grudki.
- Wylej powstałą mieszankę na szkiełko mikroskopowe; U....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 4A przedstawia mapę Ramana dla wybranego obszaru mieszaniny proszkowej. Jest to fałszywa reprezentacja map obfitości pobranych za pomocą MCR-ALS, opisanych w kroku 4.5. Dostarcza informacji o składzie próbki, ponieważ trzy gatunki można wyraźnie rozróżnić w polu widzenia. Rysunek 4B przedstawia średnie widma w wybranych regionach mapy, z rozdzielczością spektralną 23 cm-1, określoną przez wybraną długość skanu. Wybrany zestaw filtrów pozwala z.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wprowadzono szerokokątowy mikroskop multimodalny FT do pozyskiwania spontanicznych obrazów rozpraszania Ramana i luminescencji, który jest stosowany w nauce o materiałach. Zastosowanie do próbek biologicznych wykazują Candeo i in.17, którzy przedstawiają hiperspektralny obraz fluorescencyjny barwionych ludzkich komórek. Głównym wyzwaniem przy pomiarach rozpraszania Ramana w tej dziedzinie jest zapobieganie uszkodzeniom foto wynikającym z nieefektywnego rozpraszania ciepła z szeroko oświetlonego ob.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
G.C. wyraża wsparcie ze strony Unii Europejskiej projektu Marie Skłodowska-Curie Actions ENOSIS H2020-MSCA-IF-2020-101029644 oraz programu badawczo-innowacyjnego Unii Europejskiej Horizon Europe (HORIZON) w ramach Marie Skłodowska-Curie Action PIONEER (Umowa Grantowa 101066108). G.V. i G.C. potwierdzają wsparcie w ramach programu NextGenerationEU Unii Europejskiej w ramach IPHOQS Infrastructure [IR0000016, ID D2B8D520, CUP B53C22001750006] "Zintegrowanej Inicjatywy Infrastruktury w Naukach Fotonicznych i Kwantowych".
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Anatase | Kronos | 1200 | Polimorfia białego TiO2 pigment |
| Proszek siarczku kadmu | Kremer Pigmente GmbH & Kompanii | 21060 | Kadmowy żółty, indeks koloru ciemny/PY35 |
| Kamera | Andor | Luca R | Kamera CCD mnożąca elektrony z 1004x1002 pikselami 8&mikro; m x 8µ m |
| Filtr oczyszczający | Semrock | LL01-532-12.5 | Ø 1/2" 2,0 nm - FWHM filtr liniowy laserowy na 532 nm |
| Pokrywki | BRAND GmbH & Co | 4700 55 | Szkło borokrzemowe 22x22x0,15 mm pokrywy mikroskopu |
| Lustro dichroiczne | Semrock | Di02-R532-25x36 | 25,2x35,6 mm laserowy dichroiczny rozdzielacz wiązki jednokrawędziowej na 532 nm |
| Światłowód | Thorlabs | M74L05 | 400&mikro; Rozmiar rdzenia m, światłowód wielomodowy NA 0.39 |
| Laser | Fotonika Hubnera | Cobolt Samba 1000 | Laser pompowany diodą CW z prędkością 532 nm, maksymalna moc 1000 mW |
| Filtr długprzepustowy | Semrock | LP03-532RU-25 | Ultra stromy filtr długprzepustowy na krawędzi przy 532 nm |
| Mikroskop | Leica | DMRBE | Mikroskop badawczy trójnoczny (NPP); |
| Cel | Leica | PL-FLUOTAR, 10x/0,30 | Cel wzbudzania i zbierania z powiększeniem 10x, 0,3 NA |
| Cel | Newport | M-10X | Soczewka obiektywu w ścieżce oświetlenia, z powiększeniem 10x, 0,25 NA |
| Rutile | Kronos | 2900 | Polimorfia białego TiO2 pigment |
| Filtr krótkprzepustowy | Thorlabs | FESH600 | Ø Filtr krótkoprzepustowy 25,0 mm z długością fali odcięciowej 600 |
| Slajdy | Marienfeld | 1000612 | Szkiełka mikroskopowe 76x26x1 mm |
Bibliografia
- Dicker, D. T., Lerner, J. M., El-Deiry, W. S. Hyperspectral image analysis of live cells in various cell cycle stages. Cell Cycle. 6 (20), 2563-2570 (2007).
- Sellar, R. G., Boreman, G. D. Classification of imaging spectrometers for remote sensing applications. Opt Eng. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
