Artykuł metodologiczny

Analiza behawioralna dysfunkcji narządu ruchu u Drosophila melanogaster jako odczyt neurotoksyczności

DOI:

10.3791/68517

⸱

18 lipca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Center of Biotechnology of Azores (CBA), University of the Azores, 2Mesosystem Investigação & Investimentos by Spinpark

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej poprzez kwantyfikację dysfunkcji lokomotorycznej jako alternatywę dla tradycyjnych modeli ssaków. Ma na celu ocenę neurotoksycznego wpływu związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia wysokoprzepustową, opłacalną metodę oceny neurotoksyczności u muszki owocowej (Drosophila melanogaster) poprzez ilościowe określenie dysfunkcji lokomotorycznej. Tradycyjne modele ssaków, choć skuteczne, wymagają dużych zasobów i są ograniczone etycznie, co podkreśla potrzebę alternatywnych modeli in vivo . Obecne podejście integruje klasyczny test wspinaczkowy z platformą monitorowania w czasie rzeczywistym w celu wychwycenia zaburzeń motorycznych u poszczególnych much. Ten połączony system zwiększa czułość, automatyzację i odtwarzalność, zapewniając skalowalną strategię badań neurotoksykologicznych. Krytyczne kroki proceduralne obejmują ustandaryzowane warunki hodowli, staranne znieczulenie i obchodzenie się z nimi w celu zminimalizowania śmiertelności much lub zmian w zachowaniu oraz właściwą kalibrację systemu. Żywienie oparte na mikrokapilarnach umożliwia opcjonalną integrację kwantyfikacji spożycia, uzupełniając analizę lokomotoryczną i umożliwiając ocenę spożycia związków w razie potrzeby. Metoda wspiera monitorowanie zachowań w czasie rzeczywistym i długoterminowe, zmniejsza stronniczość obserwatora i umożliwia codzienną ocenę postępów bez przerywania eksperymentu. Testowanie preferencji świetlnych można włączyć za pomocą pomiarów bezpośrednich. Platforma zapewnia znaczące korzyści w zakresie rozdzielczości behawioralnej, przepustowości i spójności danych. Chociaż brakuje mu możliwości fluorescencji w czasie rzeczywistym, które można znaleźć w niektórych alternatywnych systemach, pozostaje bardzo skuteczny w badaniach behawioralnych na dużą skalę. Protokół ten jest szczególnie cenny dla laboratoriów dążących do oceny neurotoksycznych skutków związków farmaceutycznych, czynników środowiskowych lub modyfikacji genetycznych przy użyciu czułego, powtarzalnego i etycznie korzystnego modelu in vivo .

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena neurotoksyczności ma kluczowe znaczenie dla oceny potencjalnego niekorzystnego wpływu związków środowiskowych i farmaceutycznych na rozwijający się układ nerwowy1. Tradycyjne badania neurotoksyczności opierają się na modelach ssaków, takich jak gryzonie, które są drogie, czasochłonne i etycznie ograniczone2. W związku z tym konieczne są alternatywne modele, które umożliwiają szybkie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe neurotoksyczności3. Badania podkreślają, że muszka owocowa stała się potężnym organizmem modelowym do badania neurotoksyczności ze względu na dobrze scharakteryzowaną genetykę, konserwatywne szlaki neurorozwojowe i krótki cykl życiowy 4,5. Wśród behawioralnych punktów końcowych dysfunkcja motoryczna służy jako czuły i mierzalny biomarker upośledzenia neurorozwojowego, umożliwiając wczesne wykrycie efektów neurotoksycznych, które mogą korelować z zaburzeniami neurologicznymi u ludzi6.

Testy lokomotoryczne u much dostarczają wymiernej miary neurotoksyczności i umożliwiają ocenę dawka-odpowiedź, co czyni je istotnymi dla zmniejszenia ryzyka neurotoksyczności u ludzi7. Negatywny test geotaksji (wspinaczka) jest szeroko stosowanym podejściem, w którym muchy instynktownie wspinają się po stuknięciu w dno fiolki, co odzwierciedla ich poziom rozwoju motorycznego, koordynacji i równowagi 8,9. Chociaż metoda ta jest prosta, opłacalna i przydatna do oceny poważnych nieprawidłowości lokomotorycznych i jawnych zaburzeń, zapewnia tylko jednowymiarową ocenę ruchu i może nie mieć czułości w wykrywaniu subtelnych zaburzeń motorycznych, wyrafinowanych zmian i długoterminowego monitorowania behawioralnego objawów wywołanych przez neurotoksyny8. Aby zaradzić tym ograniczeniom, opracowano bardziej zaawansowane technologie śledzenia ruchu, takie jak system Ethoscope10. Ten zautomatyzowany system rejestracji jest wysokowydajnym urządzeniem do śledzenia wideo, zaprojektowanym specjalnie do analizy zachowania much z wysoką precyzją i powtarzalnością11. W przeciwieństwie do konwencjonalnych testów lokomotorycznych, system ten zapewnia ciągłe monitorowanie ruchu w czasie rzeczywistym, wychwytując subtelne nieprawidłowości behawioralne, które tradycyjne testy wspinaczkowe mogą przeoczyć 11,12,13. Technologia ta obejmuje zautomatyzowane śledzenie wideo za pomocą systemu kamer oświetlonych podczerwienią, który w sposób ciągły rejestruje ruchy muchy w wysokiej rozdzielczości, eliminując stronniczość obserwatora i poprawiając odtwarzalność eksperymentów13. Dodatkowo wykrywa mikroruchy, różnicując chodzenie, odpoczynek i drobne ruchy, takie jak pielęgnacja, karmienie lub drgawki, zapewniając bardziej szczegółową analizę zachowań motorycznych13. Możliwe jest długoterminowe monitorowanie behawioralne, co pozwala na ciągłe śledzenie przez dłuższy czas, dzięki czemu idealnie nadaje się do oceny postępujących skutków neurotoksycznych10. Skalowalność i wysoka przepustowość systemu rejestracji wideo umożliwiają równoległe śledzenie wielu much, ułatwiając jednoczesne badania przesiewowe wielu związków neurotoksycznych i chorób genetycznych10. Co więcej, system integruje oprogramowanie typu open source, umożliwiając naukowcom dostosowywanie potoków analiz w oparciu o potrzeby eksperymentalne, w tym cykle snu i czuwania, rytmy okołodobowe i szczegółowe wskaźniki lokomotoryczne10,14. Ostatnie osiągnięcia, takie jak integracja Ethoscopy, frameworka opartego na języku Python, usprawniły analizę danych, poprawiając dostępność i odtwarzalność w badaniach behawioralnych14. Ramy te umożliwiają naukowcom przeprowadzanie bardziej złożonych analiz lokomocji przy jednoczesnym zmniejszaniu barier dla użytkowników niebędących ekspertami. Laboratorium etoskopowe, środowisko oparte na Jupyter, dodatkowo ułatwia bezproblemowe przetwarzanie danych, promując wspólne badania i zapewniając odtwarzalność eksperymentalną14.

Wykorzystując wysokoprzepustową platformę śledzenia wideo wraz z tradycyjnymi testami wspinaczkowymi, badanie to zapewnia kompleksową i czułą ocenę dysfunkcji motorycznej po ekspozycji na neurotoksyczne czynniki rozwojowe. Zdolność do analizy drobnych wad ruchowych sprawia, że jest to potężne narzędzie do badań przesiewowych związków, które zaburzają rozwój neuronalny i koordynację ruchową. Wykorzystanie muszek owocowych do badań przesiewowych pod kątem neurotoksyczności ma kilka zalet, w tym opłacalność i wysoką przepustowość w porównaniu z modelami kręgowców, w przypadku których badania przesiewowe na dużą skalę są często ograniczone ze względu na ograniczenia kosztowe15. Model muchy umożliwia szybkie manipulacje genetyczne w celu naśladowania stanów chorobowych i identyfikacji szlaków molekularnych dotkniętych neurotoksynami16. Chociaż jest prostszy niż układ nerwowy ssaków, muchy zachowują kluczowe konserwatywne szlaki zaangażowane w rozwój neuronalny i kontrolę motoryczną17. Metody śledzenia o wysokiej rozdzielczości, takie jak system nagrywania wideo w czasie rzeczywistym, zwiększają dokładność i odtwarzalność danych, umożliwiając wczesne wykrywanie deficytów motorycznych spowodowanych narażeniem na działanie substancji toksycznych11.

Integracja technologii śledzenia i tradycyjnych testów wspinaczkowych pozwoliła na ciągłe monitorowanie zachowania w wysokiej rozdzielczości, zapewniając solidną i skalowalną metodę wykrywania subtelnych zaburzeń lokomotorycznych wywołanych ekspozycją na neurotoksyny. Połączenie narzędzi genetycznych, krótkiego cyklu życia i zaawansowanej analizy behawioralnej pozycjonuje muszkę owocową jako potężną alternatywę dla modeli kręgowców do badań przesiewowych neurotoksyczności, ostatecznie przyczyniając się do bezpieczniejszego opracowywania leków i lepszej oceny ryzyka środowiskowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na przykład protokół ten został wykorzystany do oceny potencjału neurotoksycznego frakcji jadu pęcherzycy pęcherzycowej . Grupa kontrolna otrzymała tylko bufor fizjologiczny i roztwór sacharozy bez badanego związku. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na szczepie W118 . W przypadku eksperymentów z Drosophila nie jest wymagane zezwolenie etyczne, ponieważ nie są one objęte przepisami dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Odczynniki i przygotowanie próbek

  1. Przygotować bufor biologiczny, taki jak PBS (10 mM, pH 7,0) lub HEPES (10 mM, pH 7,0), w zależności od wymagań konkretnego testu, oraz 10 M roztwór podstawowy sacharozy. Obliczyć objętość próbki na podstawie liczby powtórzeń i czasu trwania eksperymentu.
  2. Rozcieńczyć próbkę do pożądanego stężenia za pomocą buforu biologicznego, uzupełnionego roztworem sacharozy do końcowego stężenia 1 M. Jeśli próbka jest przezroczysta, można dodać odpowiedni barwnik spożywczy (np. 0,1 mg/ml niebieskiego lub czerwonego barwnika), aby wizualnie ocenić zachowanie żywieniowe. W niniejszym badaniu frakcję jadu pęcherzycy rozcieńczono za pomocą PBS do końcowego stężenia 10 μg/μL, a następnie uzupełniono roztworem sacharozy i barwnikiem spożywczym.
  3. Przygotować roztwór kontroli ujemnej zawierający tylko bufor i uzupełnić roztwór sacharozą do końcowego stężenia 1 M oraz barwnikiem spożywczym. W niniejszym badaniu jako roztwór kontroli ujemnej zastosowano PBS uzupełniony sacharozą i barwnikiem spożywczym.
  4. W przypadku pożywki dla muszek owocowych należy postępować zgodnie z protokołem podanym wpunkcie 18.

2. Utrzymanie materiału biologicznego

  1. Przenieś zdrowe, dojrzałe płciowo dorosłe muchy do butelki zawierającej świeżo przygotowane podłoże spożywcze. Aby kontynuować, postukaj muchami na dno butelki, otwórz ją i przenieś je przez odwrócenie butelki do nowej butelki zawierającej pożywkę muchową. Umieścić butelkę w inkubatorze nastawionym na temperaturę 25 °C z 12-godzinnym cyklem światło/ciemność i wilgotnością 50%. Pozwól muchom złożyć jaja przez noc (około 16-22 godzin), aby zebrać wystarczającą ilość zsynchronizowanych jaj.
  2. Po złożeniu jaj użyj nowej butelki zawierającej 70% etanolu, aby pozbyć się dorosłych much. Zapobiega to dodatkowemu składaniu jaj i zapewnia synchronizację wieku, co ma kluczowe znaczenie dla uzyskania kohorty dorosłych o minimalnej zmienności wieku.
  3. Aby zapewnić równomierny rozwój, utrzymuj butelki w tych samych kontrolowanych warunkach (25 °C, 12 godzin cyklu światła/ciemności, 50% wilgotności). Dorosłe osobniki zaczynają pojawiać się około 9 lub 10 dnia. Monitorowanie postępów rozwojowych może pomóc w przewidywaniu czasu pojawienia się dorosłych osobników.
  4. Utrzymuj zebrane muchy w tych samych kontrolowanych warunkach, aż osiągną pożądany wiek do testu. Zużyć je w ciągu 24-48 godzin po wschodach. Ten kontrolowany proces starzenia zapewnia minimalizację zmienności i zwiększa wiarygodność wyników eksperymentalnych.

3. Ujemny test geotaksji

UWAGA: Schematyczne przedstawienie ujemnego testu geotaksji przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1.

  1. W dniu eksperymentu delikatnie przenieś muchy do pustej butelki.
  2. Muchy muszą być krótko znieczulone na lodzie przed transferem, aby zminimalizować stres związany z ruchem i obsługą. W tym celu umieść butelkę zawierającą muchy w pudełku z lodem, przykrywając całą butelkę.
  3. Po 1 minutach delikatnie postukaj w butelkę, aby sprawdzić, czy wszystkie muchy są znieczulone. Utrzymuj je na lodzie jeszcze przez 1 minutę, aby zapewnić pełne znieczulenie bez wywoływania stresu lub wpływu na ich zdolność do wspinania się.
    UWAGA: Należy pamiętać, że niektóre środki znieczulające, takie jak CO2, mogą wpływać na późniejsze zachowania, w tym upośledzone zachowanie podczas wspinaczki, i wpływać na wyniki negatywnego testu geotaksji.
  4. Podczas gdy muchy są znieczulane, przygotuj mniejszy pojemnik wypełniony lodem i umieść szalkę Petriego lub płaską, czystą powierzchnię na wierzchu lodu, aby stworzyć schłodzoną platformę. Taka konfiguracja pomaga utrzymać znieczulenie podczas sortowania i minimalizuje ruchy much po powrocie do zdrowia.
  5. Oceń znieczulenie, potwierdzając całkowite unieruchomienie much po 2 minutach na lodzie. Po całkowitym znieczuleniu delikatnie przenieś muchy, odwracając rurkę nad schłodzoną szalką Petriego i delikatnie stukając w nie, aby je uwolnić. Zimna powierzchnia pomoże utrzymać muchy w stanie unieruchomionym podczas przenoszenia.
  6. Za pomocą cienkiego pędzla i pod mikroskopem stereoskopowym (przy powiększeniu 10x i 20x, jeśli jest dostępny), delikatnie oddziel samce i samice much na podstawie cech wyróżniających, takich jak rozmiar i wzory pigmentacji. Samce są na ogół mniejsze z szerokimi czarnymi paskami, podczas gdy samice są większe i mają jaśniejsze, wydłużone odwłoki. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować wpływ znieczulenia na muchy.
    UWAGA: Jeśli w eksperymencie nie ma potrzeby różnicowania płci, pomiń etap segregacji. Zminimalizuj czas ekspozycji i delikatnie obchodź się z muchami, aby zmniejszyć stres i potencjalne zmiany w zachowaniu.
  7. Ostrożnie przenieść posortowane muchy do pustych fiolek z odpowiednim przypisaniem. Pozwól im dojść do siebie po znieczuleniu przez około 30 minut w kontrolowanym środowisku (25 °C, 12 godzin/12 godzin cykl jasny/ciemny, 50% wilgotności) przed przystąpieniem do testu.
  8. Do przygotowania paszy mikrokapilarnej należy użyć pipety, aby ręcznie załadować 10 μl roztworu testowego do każdej probówki mikrokapilarnej. Upewnij się, że objętość jest spójna we wszystkich próbkach, aby ustandaryzować warunki karmienia.
  9. Za pomocą pipety dodaj 3-5 μl oleju mineralnego do otwartego końca mikrokapilary. Zapobiega to parowaniu i wyciekaniu próbki podczas eksperymentu.
  10. Włóż wstępnie napełnione mikrokapilary przez otwory w bawełnianych zatyczkach fiolek, upewniając się, że są bezpiecznie umieszczone. W razie potrzeby użyj wcześniej przyciętych końcówek, aby ściśle przylegać do bawełny, nie utrudniając przepływu powietrza.
  11. Umieścić fiolki zawierające muchy w inkubatorze nastawionym na temperaturę 25 °C w cyklu 12 h/12 h światło/ciemność. Pozostaw je na czas eksperymentu i ręcznie wymieniaj mikronaczynia włosowate na świeżo przygotowane jedzenie codziennie, aby zapewnić stałą ekspozycję. Okres narażenia zależy od toksyczności i charakteru próbki i zwykle wynosi od 2 do 7 dni.
  12. W odstępach 12 godzin przenieś muchy do czystej, pustej fiolki, aby ocenić aktywność lokomotoryczną.
  13. Odmierzyć i zaznaczyć linię w odległości 7 cm od dna fiolki za pomocą markera permanentnego. Ta wysokość posłuży jako cel wspinaczkowy.
  14. Ustaw kamerę lub telefon w stabilnym miejscu, aby zarejestrować zachowanie podczas wspinaczki. Zadbaj o odpowiednie oświetlenie i przezroczyste tło do analizy. Upewnij się, że konfiguracja eksperymentalna jest zgodna z polem widzenia kamery.
  15. Delikatnie postukaj w fiolkę, aby sprowadzić muchy na dno, a następnie natychmiast rozpocznij nagrywanie. Unikaj nadmiernej siły, która mogłaby zranić lub zdezorientować muchy.
  16. Przejrzyj nagrania i zmierz czas potrzebny każdej muchie na dotarcie do zaznaczonej linii o długości 7 cm. Ustaw maksymalny limit czasu (np. 30 s); Przypisz ten czas każdej muchy, która nie dotrze do linii.
  17. Zwróć szczególną uwagę na wszelkie nietypowe zachowania, takie jak nieskoordynowane ruchy, opóźniona inicjacja wspinaczki lub nieregularne wzorce wspinaczkowe. Objawy te mogą świadczyć o neurotoksycznym działaniu badanego związku.
    UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania paszy można znaleźć w protokole19 testu podajnika kapilarnego (CAFE). Metoda ta dostarcza precyzyjnych wskazówek dotyczących przygotowywania płynnych źródeł pokarmu dla muszek owocowych, zapewniając dokładne określenie ilościowe spożycia pokarmu i minimalizując zmienność w eksperymentach żywieniowych.

4. Testy monitorowania w czasie rzeczywistym

UWAGA: Aby zapoznać się z konfiguracją, w tym schematycznym przedstawieniem komponentów systemu śledzenia i protokołem kalibracji, należy postępować zgodnie z wcześniejszymi publikacjami11,12. Ogólny przegląd doświadczeń przedstawiono na rysunku uzupełniającym 2.

  1. Test lokomocji w czasie rzeczywistym (test śledzenia)
    1. Powtórzyć kroki 3.8-3.9, aby przygotować mikrokapilary zasilające z próbką i uszczelką oleju mineralnego.
    2. Przygotuj indywidualne komory lokomocji za pomocą przezroczystych plastikowych słomek, każda o długości około 6 cm. Słomki te służą jako ekonomiczne i przezroczyste obudowy odpowiednie do nagrań. Rurki powinny być kompatybilne z areną snu11, która mieści 20 rurek do wysokoprzepustowych badań behawioralnych.
    3. Uszczelnij jeden koniec każdej słomki przezroczystą folią, zapewniając hermetyczne zamknięcie. W pobliżu uszczelnionego końca utwórz mały otwór, aby pomieścić wprowadzenie mikrokapilary zasilającej. Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby bezpiecznie utrzymać mikrokapilarę, nie powodując wycieków lub ruchu podczas testu.
    4. Powtórz kroki 3.1-3.6 w celu znieczulenia, opcjonalnie segreguj i delikatnie umieść jedną znieczuloną muchę w każdej tubce za pomocą cienkiego pędzla. Uszczelnij otwarty koniec każdej rurki przezroczystą folią lub bawełnianą zatyczką, zapewniając przepływ powietrza i ochronę przed muchami.
    5. Umieść zmontowane probówki na arenie, upewniając się, że każda mikrokapilara pozostaje dostępna na zewnątrz w celu codziennej wymiany. Włóż wstępnie napełnioną mikrokapilę do każdej probówki. Pozwól muszkom zregenerować się i zaaklimatyzować przez około 30 minut przed rozpoczęciem testu.
    6. Umieść urządzenie w komorze o kontrolowanych warunkach środowiskowych (np. 25 °C, 12 h/12 h cykl światła/ciemności, 50% wilgotności). Podłącz urządzenie do sieci lub lokalnego systemu śledzenia.
    7. Uzyskaj dostęp do platformy i znajdź urządzenie przypisane do eksperymentu. Upewnij się, że system dokładnie śledzi każdą muchę, zgodnie ze wskazaniami znaczników. Wprowadź wszystkie odpowiednie metadane eksperymentalne i rozpocznij rejestrowanie testu. Do zaawansowanej analizy danych użyj struktury rethomics, pakietu R przeznaczonego do analizy danych behawioralnych o wysokiej przepustowości11,12.
    8. Codziennie zastępuj pokarm w mikronaczyniach włosowatych świeżo przygotowanymi roztworami. Codziennie sprawdzaj wzrokowo każdą muchę, aby zapewnić jej przeżycie i prawidłowe zachowanie przez cały okres eksperymentalny, który zwykle trwa od 3 do 5 dni.
  2. Ocena rytmu okołodobowego
    1. Aby zbadać rytm okołodobowy much i ich potencjalne zmiany, upewnij się, że eksperyment rozpoczyna się zsynchronizowany z określonym cyklem światła/ciemności. Utrzymuj 12 godzin światła/12 godzin ciemnego fotoperiodu przez całą fazę nagrywania, aby uniknąć zakłóceń rytmów endogennych. Po ustawieniu warunków powtórz kroki 4.1.1-4.1.8, upewniając się, że wszystkie procedury są wykonywane konsekwentnie w fazach jasnych/ciemnych.
  3. Ocena zachowania preferencji jasnego/ciemnego
    1. Powtórz kroki 3.1-3.11, aby przygotować muchy i karmić mikronaczynia włosowate.
    2. Po przygotowaniu fiolek do karmienia umieścić je w inkubatorze, aby umożliwić muchom żerowanie na badanej próbce przez 2 godziny (lub inny czas określony na podstawie wcześniejszych danych dotyczących aktywności lokomotorycznej).
    3. Aby ocenić zachowanie preferencji świetlnych, przygotuj indywidualne komory lokomocji pokrywające 50% każdej rurki folią aluminiową, aby stworzyć zdefiniowany ciemny obszar. Zapewnij spójne pokrycie we wszystkich rurach, aby umożliwić ustandaryzowane porównanie.
    4. Powtórzyć kroki 4.1.2-4.1.4 w celu przeniesienia much pojedynczo do komór lokomocyjnych, pomijając wprowadzanie mikronaczyń włosowatych.
    5. Umieść przygotowane rurki na arenie i pozwól muchom zaaklimatyzować się przez około 30 minut.
    6. Powtórz kroki 4.1.6-4.1.7 i rejestruj zachowanie much przez 60 minut. Rury, w których rejestrowany jest ograniczony ruch, mogą wskazywać na ciemną preferencję, ponieważ system śledzenia nie wykrywa much znajdujących się w obszarze pokrytym folią, aby zasygnalizować przeszkodę.

5. Analiza danych

  1. Przygotuj szablon metadanych, uwzględniając wszystkie niezbędne informacje, takie jak identyfikator, leczenie, szczegóły związku, czas trwania testu i inne istotne zmienne. Przykładowy szablon i odpowiadający mu potok przetwarzania danych znajdują się w tabeli uzupełniającej 1.
  2. Zapisz ukończony plik metadanych w formacie CSV. Aby zapewnić zgodność, otwórz plik CSV w edytorze tekstu, aby sprawdzić, czy nie zawiera niepotrzebnych znaków lub problemów z formatowaniem. Usuń wszystkie zbędne znaki, jeśli są obecne.
  3. Przed przystąpieniem do analizy danych utwórz kopię zapasową danych. Otwórz terminal i wykonaj następujące polecenie: sudo python backup_tool.py. Ten krok zabezpiecza dane przed potencjalną utratą lub uszkodzeniem podczas analizy.
  4. Zidentyfikuj i zanotuj lokalizację plików danych odpowiadających eksperymentowi. Upewnij się, że te pliki są dostępne do analizy.
  5. Analizowanie danych za pomocą Rethomics. Otwórz program RStudio i załaduj niezbędne pakiety Rethomics do analizy danych behawioralnych. Szczegółowe instrukcje i samouczki są dostępne na stronie internetowej Rethomics: https://rethomics.github.io/scopr.html

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na przykład protokół ten został wykorzystany do oceny potencjału neurotoksycznego frakcji jadu pęcherzycy pęcherzycowej . Grupę badaną stanowiły muszki karmione fizjologicznym buforem uzupełnionym roztworem sacharozy (do końcowego stężenia 1 M) i badaną frakcją jadu. Grupa kontrolna otrzymała tylko bufor fizjologiczny i roztwór sacharozy bez badanego związku. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na szczepie W118 .

W opisanej metodzie muchy nieleczone, grupa kontrolna, wyka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przede wszystkim, ustalenie dawki nieśmiertelnej (subletalnej) jest krytycznym krokiem początkowym do przeprowadzenia eksperymentów neurotoksyczności. Gwarantuje to, że muszki pozostają żywotne przez cały czas trwania badania, co pozwala na obserwację efektów behawioralnych i lokomotorycznych bez zakłócającego czynnika śmiertelności. W naszym badaniu ustalono subletalną dawkę frakcji jadu pęcherzycy Physalis na 10 μg/μL. W celu zapewnienia wiarygodnych i powtarzalnych wyników zaleca się co najmniej trzy kontrpró...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorka Zuzanna Tomkielska była zatrudniona w Mesosystem S.A., a autorka Ana Casas jest również związana z Mesosystem S.A. Pozostali autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania zostały sfinansowane w ramach projektu MOD. PN. FRM.059.PT.V03 – Pęcherzyca pęcherzyca: innowacyjne i niewykorzystane źródło produktów kosmetycznych o wysokiej wartości dodanej; przez "Pacto da Bioeconomia Azul" (projekt nr C644915664-00000026) w ramach WP5 – Algae Vertical, finansowany przez Next Generation EU European Fund oraz portugalski plan odbudowy i zwiększania odporności (PRR); oraz przez Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) za pośrednictwem CBA (UIDB/05292/2020 i UIDP/05292/2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Folia aluminiowa --
Niebieski barwnik   RAYNERA-Niebieski barwnik Rayners 28ml
Moduł kamery 2 NoIRMalina Pi 096-4062Dostarczony w dniu Mauser.pt
Bawełniany niedoprzędSigma-AldrichBR28205
Butelki magazynowe DrosophilaFirma VWRVWRI734-1249Butelka Fly Round 60Z
Fiolki DrosophilaFirma VWRWRI734-2255 powiedział:
Szklana szalka PetriegoSigma-AldrichBR455701
Mikro naczynia włosowate hematokrytuSigma-AldrichBR749321
Karta microSD--Producent zaleca używanie karty SD z co najmniej 32 GB pamięci do instalacji Raspberry Pi OS
Zasilacz Micro-USBMalina Pi 096-4585Dostarczony w dniu Mauser.pt
Olej mineralny BIO-RAD#1632129
Pędzlem--
Salina buforowana fosforanami (PBS)komponenty pochodzące od różnych firm-bufor stosowany do przygotowywania pokarmu dla grupy kontrolnej i stosowany do rozcieńczania próbki; 10 mM pH 7
Zatyczki do fiolek i butelek DrosophilaFirma VWRVWRI734-2875
Zatyczki do fiolek i butelek DrosophilaFirma VWRVWRI734-2673
Folia uszczelniającaSigma-AldrichHS234526C
Komputer jednopłytkowy  (3 Wzór B)Malina Pi 096-5700Dostarczony w dniu Mauser.pt
SakrozaSigma-AldrichZobacz materiał S9378
Przezroczysta plastikowa słomka--Dowolna, która jest kompatybilna z etoskopową areną snu (6,5 cm x 0,5 cm)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  2. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).
  3. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 74-83 (2010).
  4. Gupta, S. C., et al. Chlorpyrifos induces apoptosis and DNA damage in Drosophila through generation of reactive oxygen species. Ecotoxicol Environ Saf. 73 (6), 1415-1423 (2010).
  5. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. Lancet Neurol. 13 (3), 330-338 (2014).
  6. Bal-Price, A., et al. International STakeholder NETwork (ISTNET): creating a developmental neurotoxicity testing roadmap for regulatory purposes. Arch Toxicol. 89 (2), 269-287 (2015).
  7. Cabrita, R., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541(2022).
  8. Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Márka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild-type and sensory deprived Drosophila melanogaster. Elife. 2, e00231(2013).
  9. Dubovický, M., et al. Evaluation of developmental neurotoxicity: some important issues focused on neurobehavioral development. Interdiscip Toxicol. 1 (3-4), 206-210 (2008).
  10. Pereira, T. D., Shaevitz, J. W., Murthy, M. Quantifying behavior to understand the brain. Nat Neurosci. 23 (12), 1537-1549 (2020).
  11. Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: an open platform for high-throughput ethomics. PLoS Biol. 15 (10), e2003026(2017).
  12. Geissmann, Q., Garcia Rodriguez, L., Beckwith, E. J., Gilestro, G. F. Rethomics: an R framework to analyse high-throughput behavioural data. PLoS One. 14 (1), e0209331(2019).
  13. Blackhurst, L., Gilestro, G. F. Ethoscopy and ethoscope-lab: a framework for behavioural analysis to lower entrance barrier and aid reproducibility. Bioinform Adv. 3 (1), vbad132(2023).
  14. gilestrolab/ethoscopy. , https://github.com/gilestrolab/ethoscopy (2025).
  15. Bilder, D., Irvine, K. D. Taking stock of the Drosophila research ecosystem. Genetics. 206 (3), 1227-1236 (2017).
  16. Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
  17. Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the Drosophotoxicology model. Methods Mol Biol. 1965, 139-153 (2019).
  18. Frias, J., Simoes, N. Fruit Fly Potato Culture Media. protocols.io. , (2020).
  19. Diegelmann, S., et al. The Capillary Feeder (CAFE) Assay measures food intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), e55024(2017).
  20. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  21. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 7 (5), 995-1007 (2012).
  22. Ardekani, R., et al. Using GFP Video to Track 3D Movement and Conditional Gene Expression in Free-Moving Flies. PLoS One. 7 (7), e40506(2012).
  23. Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482, 173-178 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Neurotoksyczno u Drosophilatest wspinaniaprzesiew behawioralnymonitorowanie w czasie rzeczywistymnegatywna geotaksjakarmienie mikrokapilarnezaburzenia motoryczneledzenie aktywno cipreferencja wiat a

Powiązane artykuły