Zastosowanie projektu Dixona góra-dół do oszacowania minimalnego stężenia sewofluranu w pęcherzykach płucnych u szczurów z udoskonaloną klasyfikacją ruchu

Podsumowanie

Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół ma na celu ocenę głębokości znieczulenia przy użyciu konstrukcji Dixona Góra-Dół u szczurów poddanych standaryzowanemu bodźcowi bólowemu. Ponadto nakreśla klasyfikację różnych obserwowanych wzorców ruchowych.

Streszczenie

W przypadku stosowania lotnych środków znieczulających standardową miarą siły działania jest minimalne stężenie pęcherzyków płucnych (MAC), zdefiniowane jako stężenie pęcherzyków płucnych, przy którym 50% badanych nie wykazuje reakcji motorycznej na bolesny bodziec. W badaniach klinicznych i eksperymentalnych obecny konsensus stwierdza, że tylko "rażące, celowe ruchy" liczą się jako pozytywna reakcja motoryczna i dlatego mogą wskazywać na zbyt łagodne uspokojenie. Jednak odpowiedni poziom znieczulenia, zarówno u ludzi, jak i zwierząt, różni się indywidualnie w zależności od różnych czynników wpływających, takich jak inne podawane leki. Przeprowadzono dwa badania na szczurach w celu zbadania wpływu tetrahydrokannabinolu i etanolu na sewofluran, jeden z najczęściej stosowanych lotnych środków znieczulających. Aby oszacować MAC, zastosowano projekt Dixona Góra-Dół. Dla pierwszego zwierzęcia wybrano z góry ustaloną dawkę sewofluranu. Po okresie równowagi wynoszącym 15 minut, standaryzowany bodziec bólowy został nałożony na dystalną trzecią część ogona szczura za pomocą zacisku chirurgicznego. Reakcja zwierzęcia na bodziec została udokumentowana jako pozytywna lub negatywna. Jeśli wystąpiła dodatnia reakcja motoryczna, dawkę dla następnego zwierzęcia zwiększano. I odwrotnie, jeśli szczur nie wykazywał odpowiedzi motorycznej, dawka dla następnego zwierzęcia była zmniejszana. Do oszacowania MAC i 95% przedziałów ufności wykorzystano regresję izotoniczną i metodę bootstrap. W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół oceny głębokości znieczulenia u szczurów przy użyciu konstrukcji góra-dół. Dostarcza również nowatorskiego i szczegółowego opisu i kategoryzacji wzorców ruchowych u szczurów w stanie uspokojenia, gdy zastosowano standaryzowany bodziec bolesny w celu zwiększenia odtwarzalności dla przyszłych badań.

Wprowadzenie

Sewofluran jest jednym z najczęściej stosowanych lotnych wziewnych środków znieczulających¹. Jego siłę działania ocenia się za pomocą minimalnego stężenia pęcherzyków płucnych (MAC), które definiuje się jako stężenie w pęcherzykach płucnych, przy którym 50% pacjentów nie wykazuje reakcji motorycznej na bodziec bolesny ^2,3,4. Aby ustalić MAC, szczury mogą być używane jako modele zwierzęce ze względu na ich większą jednorodność w porównaniu z ludźmi. Bodziec bólowy jest zwykle stosowany za pomocą zacisku chirurgicznego na dystalnej jednej trzeciej ogona szczura². Stosowanie alternatywnych metod badania bólu nie gwarantowałoby porównywalności z wcześniej przeprowadzonymi badaniami, a zatem mogłoby prowadzić do rozbieżnych wyników. Ze względu na dużą różnorodność wzorców ruchowych w odpowiedzi na bodziec, obecny konsensus stwierdza, że tylko "rażące celowe ruchy" należy uznać za^{pozytywne reakcje} motoryczne3. W definicji tej brakuje jednak dalszego doprecyzowania w odniesieniu do tego, które konkretne kategorie kwalifikowałyby się jako "rażące celowe" i w jakim stopniu ruch powinien spełniać to kryterium. Ma to ogromne znaczenie, ponieważ reakcja motoryczna na bodziec może wskazywać, w warunkach klinicznych, na niewystarczającą głębokość sedacji.

Na stan znieczulenia wpływają różne czynniki, w tym wiek⁵ lat, choroby współistniejące6, upośledzona czynność ^wątroby7 czy hipotermia⁸. Co więcej, leki podawane wraz ze środkami znieczulającymi znacząco wpływają na głębokość znieczulenia. Na przykład fentanyl i propofol, często stosowane w fazie indukcji, zmniejszają wymaganą ilość sewofluranu ^9,10. Dodatkowo wykazano, że lidokaina lub pregabalina mogą obniżać MAC sewofluranu^11,12. Co więcej, niedawne spożycie alkoholu lub substancji, takich jak tetrahydrokannabinol (THC), może również zmniejszyć MAC, zwiększając w ten sposób głębokość znieczulenia ^13,14. I odwrotnie, zasugerowano, że leki sympatykomimetyczne mogą łagodzić sedację poprzez stymulację ośrodkowego układu nerwowego¹⁵.

Aby zwiększyć odtwarzalność dla przyszłych badań, udostępniono szczegółowy protokół i opisy wideo do oceny MAC u szczurów przy użyciu projektu Dixona z podziałem na góra-dół¹⁶ . W przeciwieństwie do poprzednich badań MAC, niniejszy protokół określa szczegółowe kroki proceduralne mające na celu zapewnienie odtwarzalności w różnych laboratoriach. Co więcej, ponownie przeanalizowano materiał wideo z dwóch wcześniej opublikowanych badań, a reakcje motoryczne sklasyfikowano na podstawie ich zakresu i wzorca (ruchy skoordynowane - toczenie, rozciąganie, solenie i zwijanie ruchów nieskoordynowanych). W związku z tym badanie to oferuje również innowacyjny i dokładny opis i klasyfikację wzorców ruchowych u szczurów w sedacji w odpowiedzi na standaryzowany bodziec bolesny, mając na celu poprawę odtwarzalności dla przyszłych badań.

Protokół

Wszystkie badania eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Wewnętrzną Komisję ds. Doświadczeń na Zwierzętach Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu oraz właściwy organ regulacyjny (austriackie Federalne Ministerstwo ds. Kobiet, Nauki i Badań). Eksperymenty prowadzono w stale utrzymywanej narkozie. Zwierzęta nie odczuwają świadomie bólu, nawet jeśli wystąpi ruch¹⁷. Wykorzystano dorosłe szczury rasy Wistar w wieku od 81 do 95 dni.

1. Badaj zwierzęta i pomieszczenia

1. Trzymaj zwierzęta według wagi i płci. Oddziel samce i samice i trzymaj je w domu przez co najmniej 14 dni przed rozpoczęciem eksperymentu, aby umożliwić aklimatyzację. Umieścić maksymalnie trzy szczury powyżej 400 g lub cztery szczury poniżej 400 g na klatkę.
2. Utrzymuj warunki środowiskowe dzięki 12-godzinnemu cyklowi światła/ciemności, temperaturze otoczenia 22 °C i wilgotności powietrza od 45% do 65%.
3. Regularnie waż każde zwierzę i zapisuj masę ciała przed każdym zabiegiem.
4. Zwierzęta są transportowane pojedynczo z pomieszczenia do placówki przeprowadzającej testy. Przykryj każdą klatkę szmatką, aby zmniejszyć stres wzrokowy, i trzymaj niebadane zwierzęta w osobnym pomieszczeniu, aby uniknąć narażenia na procedury eksperymentalne.

2. Konfiguracja sprzętu

1. Przed rozpoczęciem eksperymentu sprawdź, czy cały wymagany sprzęt jest sprawny i dostępny. Wykonuj kontrole sprzętu zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi lub standardowymi procedurami operacyjnymi, w tym testami szczelności, kalibracją i testami funkcji zasilania, jeśli ma to zastosowanie.
2. Do umieszczenia szczura użyj szczelnej, przezroczystej komory (15 cm × 20 cm × 9 cm). Upewnij się, że komora jest wyposażona w otwór 15 mm, aby zewnętrznie poprowadzić ogon, jednocześnie minimalizując wyciek gazu.
3. Podłącz przewód dopływowy do waporyzatora sewofluranu i źródła tlenu.
4. Podłącz przewód odpływowy po przeciwnej stronie komory zarówno do systemu ekstrakcji gazu, jak i do monitora anestezjologicznego, aby rejestrować stężenia sewofluranu.
5. Upewnij się, że termometr doodbytniczy, koc grzewczy i ogrzewanie na podczerwień lamp działają. Przetestuj termometr w stosunku do urządzenia referencyjnego, sprawdź, czy koc grzewczy osiąga docelowe zakresy temperatur i sprawdź, czy podczerwień lamp włącza się i utrzymuje stabilną moc. Umieść lampę bezpośrednio nad komorą testową w bezpiecznej odległości zgodnie z lokalnymi procedurami bezpieczeństwa.
6. Przygotuj zacisk tętniczy o średnicy 25 cm, który będzie używany do standaryzowanego bodźca bólowego.

3. Przygotowanie leku

1. Przygotowanie THC (opcjonalnie)
   1. Stosuj preparat THC o stężeniu 25 mg/ml. Obliczyć wymaganą objętość dla każdego zwierzęcia, mnożąc masę ciała w kilogramach przez (10 mg/kg/25 mg/ml), co daje 0,4 ml na kg masy ciała.
   2. Użyj pipety wyporowej, aby narysować dokładną obliczoną objętość dla każdego zwierzęcia. Nie podawać na tym etapie. Przygotować pipetę i odłożyć ją na bok do późniejszego podania na etapie podawania leku (patrz krok 4.6).
   3. Użyj końcówki do pipet odpowiedniej do zgłębnika, takiej jak taka, która może bezpiecznie pomieścić do 0,3 ml płynu. Wykonaj zgłębnik doustny bezpośrednio za pomocą załadowanej pipety. Wyrzuć końcówkę pipety po każdym użyciu, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
2. Przygotowanie etanolu (opcjonalnie):
   1. Przygotować etanol w wymaganym stężeniu dozowania 1 g/kg lub 2 g/kg. Jako bazę należy użyć wysoce skoncentrowanego preparatu etanolu (np. 96-100%) i rozpuścić go w 0,9% soli fizjologicznej do całkowitej objętości 10 ml/kg masy ciała dla każdego zwierzęcia. Należy użyć tej samej objętości soli fizjologicznej, co odpowiadające jej placebo. Przestrzegaj wszystkich instytucjonalnych wytycznych dotyczących bezpieczeństwa, szczególnie tych związanych z obchodzeniem się z substancjami łatwopalnymi i ich przechowywaniem.
   2. Użyć odpowiedniej strzykawki (5 ml lub 10 ml, w zależności od masy ciała zwierzęcia), aby sporządzić dokładną obliczoną objętość dla każdego zwierzęcia. Na tym etapie nie należy podawać substancji. Przygotować strzykawkę i odłożyć ją na bok do wstrzyknięcia dootrzewnowego na etapie podawania leku (patrz krok 4.6). Założyć igłę 23 G do podania i przykryć ją odpowiednią nasadką, aby zapobiec obrażeniom do czasu użycia.

4. Stosowanie leków

1. Wywołaj znieczulenie do podania leku, umieszczając szczura w komorze i zalewając go 3,5% obj. sewofluranu w 100% tlenu w tempie 3 l/min.
2. Odczekaj około 3-5 minut, aż zwierzę straci przytomność.
3. Wykonaj test odruchu prostującego, delikatnie przechylając komorę, aby przetoczyć zwierzę na grzbiet. Jeśli nie spróbuje się wyprostować w ciągu 10 sekund, załóż odpowiednią głębokość znieczulenia.
4. Tymczasowo zmniejsz stężenie sewofluranu do 0 i przepłucz komorę 100% tlenem przez 15 sekund, aby zminimalizować narażenie eksperymentatora na gaz znieczulający.
5. Wyjąć zwierzę z komory i umieścić je przed rurką doprowadzającą gaz o tym samym stężeniu sewofluranu, aby utrzymać znieczulenie podczas podawania. Pomiń ten krok, jeśli podanie substancji badanej jest wystarczająco krótkie, aby uniknąć powrotu do zdrowia po znieczuleniu.
6. Podawać substancje zgodnie z planem eksperymentalnym: Dostarczyć 10 mg/kg THC przez zgłębnik żołądkowy lub podać 1 g/kg lub 2 g/kg etanolu dootrzewnowo. Patrz punkt 3, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat przygotowania i postępować zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi wykonywania procedur podawania zarówno przez zgłębnik, jak i dootrzewnowe.
7. Zwróć zwierzę do klatki, aby wyzdrowiało.
8. Odczekaj 1 godzinę w przypadku etanolu i 2 godziny w przypadku THC przed kontynuowaniem procedury.

5. Indukcja znieczulenia do badania MAC

1. Po okresie oczekiwania umieść szczura z powrotem w hermetycznej komorze testowej i zalej go określoną mieszaniną sewofluranu i tlenu. Zapewnić stały przepływ tlenu na poziomie 3 l/min. Oznaczyć indywidualne stężenie sewofluranu (krok 9.1) dla każdego zwierzęcia, zaczynając od 2,6% obj. (lub innego wcześniej ustalonego punktu wyjścia opartego na planowaniu statystycznym) dla pierwszego zwierzęcia w każdej grupie. Szczegółowy opis konstrukcji góra-dół znajduje się poniżej.
2. Włącz ogrzewanie na podczerwień lamp.
3. Odczekaj około 3-5 minut, aż zwierzę straci przytomność.
4. Wykonaj test odruchu prostującego, delikatnie przechylając komorę, aby przetoczyć zwierzę na grzbiet. Jeśli nie spróbuje się wyprostować w ciągu 10 sekund, załóż odpowiednią głębokość znieczulenia.
5. Tymczasowo zmniejsz stężenie sewofluranu do 0 i przepłucz komorę 100% tlenem przez 15 sekund, aby zminimalizować narażenie eksperymentatora na gaz znieczulający.
6. Szybko otwórz komorę i włóż termometr doodbytniczy. Monitoruj temperaturę ciała przez cały czas trwania zabiegu i odpowiednio dostosuj intensywność ogrzewania na podczerwień lamp i koc grzewczy.
7. Wyprowadź ogon na zewnątrz przez mały otwór w komorze.
8. Szybko zamknij komorę.
9. Przed przystąpieniem do dalszych czynności należy natychmiast przywrócić pożądane stężenie sewofluranu.

6. Czas równowagi

1. Odczekaj 15 minut na wyrównanie.
2. Stale monitoruj temperaturę ciała zwierzęcia (37,2 °C ± 0,3 °C) i odpowiednio dostosuj urządzenia grzewcze, aby utrzymać normotermię.

7. Bodziec bólowy

1. Zidentyfikuj dystalną trzecią część ogona.
2. Zastosuj bodziec bólowy, blokując zacisk w trzeciej pozycji (około 50 N siły).
3. Pozostaw zacisk zablokowany w trzeciej pozycji, aż szczur wykaże pozytywną reakcję ruchową, ale maksymalnie na 1 minutę.
4. Zapisz w protokole obecność lub brak reakcji motorycznej. Podaj krótki opis obserwowanego ruchu pod względem jego wzorca i zakresu. Patrz punkt 11 w celu zapoznania się z klasyfikacją wzorców ruchu.

8. Powrót do zdrowia

1. Wyłącz waporyzator i lampę grzewczą i umieść szczura z powrotem w klatce.

9. Konstrukcja góra-dół

1. Określ stężenie sewofluranu dla następnego eksperymentu, korzystając z projektu Dixona w górę i w dół. Jeśli poprzednie zwierzę wykazywało reakcję motoryczną na bodziec, zwiększ stężenie dla następnego zwierzęcia o 0,2% pkt. I odwrotnie, jeśli poprzednie zwierzę nie wykazywało żadnej reakcji motorycznej, zmniejsz stężenie o 0,2% pkt.

10. Eutanazja (jeśli dotyczy)

UWAGA: Eutanazja nie jest z natury konieczna częścią eksperymentów. Należy skonsultować się z właściwym Komitetem Wewnętrznym ds. Doświadczeń na Zwierzętach. W przypadku dwóch przywołanych badań zdecydowano się na wykonanie wewnątrzsercowego pobrania krwi, a następnie eutanazję zwierząt. Zwierzęta nie zostały ponownie umieszczone w klatce, jak opisano w kroku 8.1, ale zamiast tego procedura była kontynuowana bezpośrednio od kroku 9.1.

1. Przygotuj roztwór do eutanazji, rozpuszczając 300 mg pentobarbitalu w 1 ml soli fizjologicznej. Pobrać roztwór do strzykawki i przechowywać go w gotowości do natychmiastowego użycia po pobraniu krwi.
2. Wyjmij szczura z pudełka i umieść go przed rurką oddechową dostarczającą 3,5% obj. sewofluranu w 100% tlenu, aby utrzymać stałe znieczulenie. Ułóż zwierzę na grzbiecie, aby umożliwić swobodny dostęp do klatki piersiowej.
3. Pobrać krew dosercowo za pomocą igły 23 G i strzykawki o pojemności 5 ml. Delikatnie dotykaj bicia serca palcem, aby zlokalizować serce. Włóż igłę doogonowo do wyrostka mieczykowatego, nieco na lewo od linii środkowej i pod płytkim kątem.
4. Delikatnie zasysać, regulując położenie igły, aż do zaobserwowania przepływu krwi. Zbierz wymaganą objętość.
5. Po zakończeniu pobierania krwi ostrożnie wyjąć strzykawkę z igły i założyć wstępnie załadowaną strzykawkę zawierającą roztwór pentobarbitalu. Podać cały 1 ml roztworu dosierdziowo, aby zapewnić eutanazję zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi.

11. Kontynuacja eksperymentów

1. Powtórz eksperyment, zaczynając od kroku 3, dla każdego badanego zwierzęcia z osobna.

12. Klasyfikacja wzorców ruchowych (opcjonalnie)

1. Podziel odpowiedzi behawioralne na następujące kategorie:
   1. Toczenie: Klasyfikuj jako toczenie, gdy reakcja behawioralna obejmuje osiowy obrót ciała, zwykle wzdłuż osi podłużnej.
   2. Rozciąganie: Klasyfikuj jako rozciąganie, gdy reakcja behawioralna charakteryzuje się obustronnym, symetrycznym przedłużeniem kończyn i ciała na zewnątrz.
   3. Ruch solny: Klasyfikuj jako ruch solny, gdy reakcja behawioralna składa się z nagłych, skoncentrowanych na tylnych kończynach kopnięć lub szarpnięć przypominających krótkie, przypominające podskakiwanie wybuchy całego ciała.
   4. Curling: Klasyfikuj jako zwijanie się, gdy reakcja behawioralna obejmuje nieskoordynowany, skierowany do wewnątrz ruch o różnej intensywności, powodujący zginanie ciała w kierunku środka.

Wyniki

W badaniu THC oszacowanie MAC metodą bootstrap wynosiło 2,8% obj. w grupie kontrolnej (95% CI: 2,7-2,9 obj.) i 2,1 obj. w grupie 10 mg/kg THC (95% CI: 1,8-2,4 obj.)¹³.

W badaniu etanolu szacowany MAC wynosił 2,24% obj. w grupie kontrolnej (95% CI: 1,97-2,94 obj.). W grupie 1 g/kg etanolu było to 1,65% obj. (95% CI: 1,40-1,98 obj.), a w grupie 2 g/kg etanolu 1,08 obj. (95% CI: 0,73-1,42 obj.)¹⁴. Różna liczba miejsc po przecinku odzwierciedla pierw...

Dyskusja

Badanie to udoskonala protokół oznaczania MAC sewofluranu u szczurów, szczegółowo opisując krytyczne kroki metodologiczne i rozwiązując typowe wyzwania, aby przyczynić się do bardziej ustandaryzowanego i powtarzalnego podejścia do oceny głębokości znieczulenia.

Dokładne oznaczanie MAC jest niezbędne zarówno w eksperymentalnych, jak i klinicznych praktykach anestezjologicznych. Praca ta stanowi wkład do istniejącej literatury, dostarczając jasnej i powtarzalnej metody oceny siły działania sewof...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hermetyczna przezroczysta komora	N/A	N/A	Rodzajowy
Zacisk tętniczy	KLS Martin	13-410-22-07	25 cm
Drä ger Primus	Drä ger Austria GmbH	Primus
Drä ger Vapor 2000	Drä ger Austria GmbH	Para 2000
Jednostka sterująca kocem homeotermicznym	Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, Stany Zjednoczone	50-7137	230 V
Ręczny mobilny podgrzewacz dla niemowląt	Fisher/Paykle, Auckland, Nowa Zelandia	IW9210/920