Artykuł metodologiczny

Metody in vitro Rekonstrukcja sieci cytoszkieletu w oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych (GUV)

DOI:

10.3791/68530

⸱

20 czerwca 2025

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia prostą jednoetapową rekonstrukcję sieci cytoszkieletu wewnątrz oddzielonych fazowo gigantycznych pęcherzyków. Metodę tę można uogólnić i zastosować do enkapsulacji lub uwięzienia szerokiego zakresu biomolekuł.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomimetyczne błony lipidowe w postaci gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV) są powszechnie używane do naśladowania zachowania błony komórkowej ze względu na łatwość rekonstytucji białek wewnątrz GUV, wizualizację, a także zrozumienie dynamiki błony komórkowej i białka. Jednak błony komórkowe składają się z tratw lipidowych (lub domen) powstałych w wyniku obecności różnych lipidów w błonie komórkowej. Taka zwiększona złożoność w systemach modelowych może zostać wykorzystana do powstania oddzielonych fazowo GUV, w których skład lipidowy może być precyzyjnie dostrojony. Podczas gdy metody enkapsulacji do generowania jednorodnych GUV są powszechnie znane, metody enkapsulacji białek w oddzielonych fazowo GUV są ograniczone. W tym przypadku protokół ten przedstawia uproszczoną, jednoetapową produkcję oddzielonych fazowo GUV, składających się z domen nieuporządkowanych cieczowo(LD) i uporządkowanych cieczy (LO), skutecznie otaczających różne białka cytoszkieletu, tj. FtsZ i aktynę, dzięki czemu metoda ta jest wszechstronnym narzędziem do minimalnej produkcji komórek. W szczególności podejście to wykorzystuje protokół transferu emulsji do produkcji GUV o wysokiej wydajności enkapsulacji. W tej metodzie monowarstwa lipidowa jest najpierw generowana przez emulgowanie roztworu białkowego w mieszaninie lipidów i olejów, w której wybiera się lipidy o różnych temperaturach przemian fazowych, aby uzyskać separację faz w powstałych GUV. Emulsja ta jest delikatnie przenoszona na wierzch roztworu lipidów w oleju w innej probówce, w wyniku czego powstaje granica faz woda-olej. Roztwór jest następnie odwirowywany w podwyższonych temperaturach (najlepiej w temperaturze 37 °C w celu zachowania aktywności białka), po czym pobiera się GUV do obrazowania. Metoda ta upraszcza rekonstytucję in vitro białek cytoszkieletu w oddzielonych fazowo GUV bez użycia kłopotliwej konfiguracji laboratoryjnej, a tym samym służy jako wygodna metoda badania mechaniki interakcji cytoszkielet-błona w zamknięciu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gigantyczne pęcherzyki służą jako systemy modelowe do zrozumienia funkcji komórkowych1,2. Łatwość produkcji, wizualizacji, przestrajania i odtwarzania biomolekuł in vitro sprawia, że te modele biomimetyczne są systemem wybieranym w wielu badaniach naukowych3,4,5. Istnieje kilka znanych metod wytwarzania GUV, takich jak electroformation6, cDICE7,8, transfer emulsji i inne metody oparte na mikroprzepływach9,10. Produkcja GUV przy użyciu takich metod jest opisana w literaturze3,11. Co więcej, in vitro, rekonstrukcja sieci cytoszkieletu wewnątrz GUV została wcześniej opisana przy użyciu metody transferu emulsji ze względu na łatwość tej metody tworzenia w jednym garnku, która nie wymaga żadnej skomplikowanej konfiguracji12. Jednak taka rekonstytucja jest bardzo często zgłaszana w jednorodnych GUV, systemie, który nie naśladuje w pełni złożoności błon komórkowych.

Ten protokół opisuje in vitro rekonstrukcję sieci cytoszkieletu wewnątrz oddzielonych fazowo GUV, wykazując złożoność błony lipidowej. Podczas gdy wcześniej donoszono, że takie sieci wiążą się na powierzchni membrany (na zewnątrz), ale nie są zamknięte w gigantycznych pęcherzykach13,14, obecna technika transferu emulsji koncentruje się na protokole separacji faz, a także na zachowaniu aktywności tworzenia sieci cytoszkieletu. Jednym z głównych wyzwań w tej technice jest temperatura. Standardowe metody produkcji do wytwarzania GUV z separacją fazową wymagają zastosowania podwyższonych temperatur, które różnią się w zależności od temperatury przemiany fazowej lipidów składowych. Jednak białka cytoszkieletu nie są w stanie polimeryzować do struktur wyższego rzędu w tak wysokich temperaturach15,16,17. W ten sposób protokół ten nie tylko wykorzystuje kompozycję lipidową w celu uzyskania separacji faz w GUV w temperaturze pokojowej, ale także optymalizuje warunki, aby uzyskać dobrą wydajność GUV w temperaturach fizjologicznych.

Innym aspektem do rozważenia przy produkcji odtworzonych systemów GUV jest wymagana objętość zamkniętych w kapsułkach biomolekuł. W przypadku większości białek produkcja większych ilości może być kosztowna i czasochłonna, obejmując kilka rund oczyszczania. Co więcej, eksperymenty z rekonstytucją in vitro na ogół wymagają początkowej fazy eksploracyjnej, w której najpierw testuje się stężenia biomolekuł, skład itp., aby uzyskać zoptymalizowaną zawartość roztworu wewnętrznego. W ten sposób protokół ten optymalizuje protokół produkcji GUV dla dwóch różnych testów, które dostosowują się do wyżej wymienionych przesłanek. Z jednej strony protokół ten opisuje jeden test, który optymalizuje standardowy protokół odwróconej emulsji, który obejmuje stosunkowo większe objętości białek i generuje wysokowydajną produkcję GUV w probówkach, które są następnie przenoszone na obrazowanie na płytki 96-dołkowe. Z drugiej strony, opisane tutaj podejście optymalizuje również protokół do produkcji GUV z separacją fazową bezpośrednio w płytkach dołków obrazowych, który wykorzystuje mniejsze objętości biomolekuł (~1/4 ilości wymaganych do produkcji w probówkach) i umożliwia szeregowe wytwarzanie GUV, osiągając wiele warunków zamkniętych w kapsułkach w jednym kroku wirowania. W związku z tym przedstawiony tutaj protokół pokazuje jedną metodę enkapsulacji, ale pozwala użytkownikowi wybrać dowolną konfigurację w oparciu o swoje wymagania.

Ponadto, ten protokół opisuje zoptymalizowaną metodę enkapsulacji dla dwóch różnych sieci cytoszkieletu: FtsZ i aktyny. Ponieważ te dwa białka wymagają różnych warunków buforowania i stłoczenia, protokół odnosi się do kolejnych niezbędnych zmian w celu osiągnięcia optymalnej rekonstytucji sieci. W związku z tym przedstawione tutaj podejście może być wykorzystane i uogólnione do enkapsulacji dowolnych wymaganych biomolekuł w oddzielonych fazowo GUV.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie mieszaniny lipidów

  1. Pobrać 0,5 ml chloroformu do szklanej fiolki o pojemności 5 ml. Dodać 17,5 μl DOPC, 7,4 μl DOPG, 29,6 μl DPPC (wszystkie z 25 g/l lipidów przygotowanych w chloroformie), 32,2 μl 10 g/L DPPG i 20,6 μl 18 g/L cholesterolu. Dodać 1,2 μl 1 g/l barwnika Atto655-DOPE. Delikatnie zwirować mieszaninę lipidów i odparować chloroform pod przepływem azotu i ponownie zawiesić cienką warstwę w sumie 400 μl chloroformu.
  2. Do enkapsulacji FtsZ przygotowana końcowa mieszanina lipidów jest w stosunku DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol (stosunek 17.499: 7.5: 31.5: 13.5: 30 mol) znakowany 0.001% mol% Atto655-DOPE. Do produkcji GUV z kapsułkowaną wiązką aktyny, mieszanina lipidów zawiera biotynylowane lipidy i jest przygotowywana w proporcji DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol: Biotinyl CAP PE (17.499: 7.5: 30.5: 13.5: 30: 1) znakowany 0,001% mol% Atto655-DOPE.
  3. Mieszaninę lipidów (32 mM, 50 μL) rozpuścić w chloroformie i wysuszyć w szklanej fiolce pod przepływem gazuN2 przez ~15 min.
  4. Szklana fiolka jest następnie przechowywana w próżni w eksykatorze przez ~30 minut, aby pozbyć się wszelkich śladów pozostałości chloroformu.
  5. Rozproszyć wysuszoną folię w mieszaninie dekanu (20 μL) i oleju mineralnego (500 μL) w szklanej fiolce, aby uzyskać końcowe stężenie 3,2 mM i sonikować w podwyższonych temperaturach (~50 °C) przez ~30 minut za pomocą sonikatora do kąpieli.
  6. Przenieś mieszaninę lipidów w oleju do probówki i inkubuj probówkę w temperaturze 37 °C przez ~10 minut przed przejściem do następnych kroków.
  7. Przygotuj wewnętrzną mieszankę kapsułkującą dla białek.

2. Przygotowanie roztworów wewnętrznych do enkapsulacji

  1. Mieszanka filamentów FtsZ
    1. Przygotować mieszaninę białek FtsZ o łącznej objętości 10 μl w mikroprobówce. W przypadku sieci nitkowatej FtsZ dodać 0,87 μl z 23 μM FtsZ-YFP-mts, 1,31 μl z 381 g/L Ficoll70, 1,11 μl z 271 g/L BSA i 1 μl 25 mM GTP do 5,71 μl buforu reakcyjnego FtsZ (RB). Całkowita objętość roztworu wynosi 10 μL zawierającego 2 μM FtsZ-YFP-mts, 50 g/L Ficoll70, 30 g/L BSA i 2,5 mM GTP w roztworze końcowym. Trzymaj go na lodzie przed użyciem do enkapsulacji w GUVs.
      UWAGA: Bufor reakcyjny FtsZ (RB) zawiera 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM GluK, 5 mM GluMg.
  2. Mieszanina aktyny i pęczka
    1. Do kapsułkowania wiązek aktyny należy najpierw przygotować 10 μl głównej mieszanki aktynowej (A-Mix) zawierającej 86% G-aktyny, 10% Atto488-aktyny i 4% biotynylowanej aktyny w wodzie. Na tym etapie należy przygotować roztwory białkowe zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, aby uzyskać końcowe stężenie 35,42 μM A-Mix, dodaj 6,39 μ l 2 g/l G-aktyny, 1,48 μl 1 g/l Atto488-aktyny, 1,19 μl 0,5 g/l biotynylowanej aktyny i 0,9 μl H2O. Trzymaj na lodzie i przykryj przed światłem.
    2. Aby zapobiec wstępnej polimeryzacji i wiązaniu aktyny na zewnątrz GUV, należy przygotować końcowy roztwór aktyny na kilka minut przed enkapsulacją. Końcowy roztwór składa się z 7% jodiksanolu, 0,01 g/l neutrawidyny, 2,4 μM A-Mix, 0,6 μM fascinu, 10 g/L BSA, 20 g/L Ficoll70 i 5 mM ATP w buforze polimeryzacyjnym aktyny.
      1. Aby przygotować ten końcowy roztwór, który musi być cały czas przechowywany na lodzie, dodaj w następującej kolejności: 2,92 μl 60% jodiksanolu, 10,25 μlH2O, 2,5 μl 0,1 g/l neutrawidyny, 0,92 μl z 271 g/L BSA, 1,31 μL z 381 g/L Ficoll70, 2,5 μl 10x buforu polimeryzacji aktyny, 1,69 μl z 35,42 μM A-Mix, 1,65 μl z 9 μM Faszyny i 1,25 μL ze 100 mM ATP. Dobrze wymieszaj i szybko weź 5 μl potrzebne do kapsułkowania.
        UWAGA: zmierz osmolarność tego wewnętrznego roztworu za pomocą osmometru (~430 mOsm/kg). Dopasowana mieszanina roztworu zewnętrznego o tej samej osmolarności musi być przygotowana przez rozcieńczenie glukozy w wodzie aż do osiągnięcia tej samej wartości osmolarności (patrz krok 3.2). 10x Bufor polimeryzacyjny aktyny zawiera 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM KCl i 50 mM MgCl2.

3. Produkcja GUV i enkapsulacja in vitro

  1. Produkcja GUV w tubach: enkapsulacja FtsZ
    1. W celu enkapsulacji FtsZ dodaj 500 μl buforu reakcyjnego FtsZ (RB) do plastikowej probówki o pojemności 1,5 ml i delikatnie dodaj 200 μl mieszaniny lipidów w oleju (przygotowanej w kroku 1.6 powyżej), aby umożliwić utworzenie granicy faz olej-woda i osadzenie monowarstwy lipidowej na tym interfejsie.
    2. Aby utworzyć emulsję, najpierw weź kolejną tubkę o pojemności 1,5 ml i dodaj 200 μl lipidu w oleju. Inkubować tę probówkę w temperaturze 37 °C przez ~10 minut przed utworzeniem emulsji.
    3. Po inkubacji dodać 5 μl mieszanki białkowej FtsZ (przygotowanej w 2.1.1) do tej probówki. Białko o objętości 5 μl w roztworze wodnym opada na dno probówki w postaci kropelki.
    4. Przygotuj emulsję, delikatnie stukając w dno probówki 5-6 razy, aż roztwór stanie się widocznie mętny.
    5. Delikatnie odpipetować tę emulsję i umieścić ją na granicy faz olej-woda (przygotowanych w kroku 3.1.1 powyżej).
    6. Odwirować to przy 6000 x g przez 30 minut w temperaturze podgrzanej do 37 °C i utrzymywać tę temperaturę do końca produkcji pęcherzyków.
    7. Pozwól próbce ostygnąć do temperatury pokojowej przez prawie 30 minut przed obrazowaniem.
    8. Usuń wierzchnią warstwę oleju, delikatnie pipetując od górnej części probówki, pozostawiając prawie 100-200 μl roztworu do obrazowania.
    9. Odetnij końcówkę pipety pod kątem nożyczkami i delikatnie nabierz 50-100 μl roztworu GUV z dna probówki. To rozwiązanie będzie wykorzystywane do obrazowania.
  2. Produkcja GUV bezpośrednio w płytkach 96-dołkowych: enkapsulacja aktyny
    1. Do enkapsulacji aktyny należy najpierw przygotować zewnętrzną mieszaninę roztworu (glukoza w wodzie) o takiej samej osmolarności jak wewnętrzna mieszanina aktyny. Aby dopasować ~ 430 mOsm/kg wewnętrznej mieszanki, przygotuj zewnętrzną mieszaninę roztworu, dodając 198 μL 2 M glukozy w 802 μL H2O.
    2. Aby przygotować pęcherzyki bezpośrednio na płytce dołka, najpierw pasywuj jeden dołek z płytki 96-dołkowej. Dodać 100 μl 10 g/L BSA do dołka i inkubować przez 10-15 minut. Następnie przemyć studzienkę 100 μl roztworu zewnętrznego pięć razy, uważając, aby nie dotknąć końcówką pipety pasywowanego szklanego dna. Po zakończeniu mycia pozostawić 100 μl mieszanki roztworu zewnętrznego w studzience.
    3. Delikatnie dodaj 50 μl mieszanki lipidów w oleju do studzienki, aby przygotować monowarstwę lipidów na wierzchu roztworu zewnętrznego. Aby zapewnić prawidłowe osadzanie się oleju na wierzchu fazy wodnej, oprzyj końcówkę pipety po jednej stronie studzienki i pozwól, aby olej zsunął się ze ściany studzienki.
    4. Aby utworzyć emulsję, najpierw weź tubkę o pojemności 1,5 ml i dodaj 100 μl lipidu w oleju. Inkubować tę probówkę w temperaturze 37 °C przez ~10 minut przed utworzeniem emulsji.
    5. Dodać 2,5 μl końcowego roztworu aktyny (z kroku 2.2.2) do probówki zawierającej 100 μl mieszanki lipidów w oleju (krok 1.6 powyżej). Białko o objętości 2,5 μl w roztworze wodnym opada na dno probówki w postaci kropelki.
    6. Przygotuj emulsję, delikatnie stukając w dno probówki 10-20 razy, aż roztwór stanie się widocznie mętny.
    7. Delikatnie odpipetować tę emulsję i umieścić ją na powierzchni styku olej-woda (przygotowanym w kroku 3.2.3 powyżej). Ostrożnie zanurz końcówkę pipety w środku monowarstwy oleju i nałóż emulsję. Emulsja tworzy mętną chmurę zamkniętą w fazie monowarstwy oleju.
    8. Odwirować 96-dołkową płytkę o masie 200 x g przez 20 minut w temperaturze podgrzanej do 37 °C i utrzymywać tę temperaturę aż do końca produkcji pęcherzyków.
      UWAGA: Wirować przy 400 x g przez 10 minut, aby skrócić czas produkcji pęcherzyków. Jednak trzymaj się tych parametrów wirowania, aby uzyskać najlepsze wyniki. Wirowanie powyżej 400 x g powoduje powstanie zagęszczonych pęcherzyków z agregatami lipidowymi gromadzącymi się na dnie płytki obrazowej.
    9. Pozostaw próbkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez prawie 30 minut przed obrazowaniem.
      UWAGA: Bezpośrednie obrazowanie można przeprowadzić na studzience bez konieczności usuwania wierzchniej warstwy oleju lub przenoszenia pęcherzyków do innej komory/studzienki.

4. Obrazowanie i rekonstrukcja obrazu 3D

  1. Weź płytkę z 96 dołkami obrazowymi i pasywuj ją BSA przez ~10 minut przed przeniesieniem próbki do płytki dołka obrazowego (patrz krok 3.2.2).
  2. Przenieść roztwór GUV na pasywowaną płytkę studzienną.
  3. Ustaw płytkę studzienki na stoliku odwróconego mikroskopu konfokalnego na 40-krotnym obiektywie wodnym.
  4. Skoncentruj się na dowolnym obszarze zainteresowania (ROI) i utwórz sekwencję obrazów z-stack z wybranego ROI ze stałymi interwałami kroku z. Protokół daje GUV o wielkości 5-30 μm, więc interwał można ustalić na 0,5-1 μm, w zależności od potrzeb.
  5. Zapisz każdą sekwencję obrazów z-stack w .tiff formacie.
  6. Otwórz interesującą sekwencję obrazów w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów (ImageJ/Fiji). Zidentyfikuj obraz o największej intensywności. Przytrzymaj ctrl+shift+c, aby otworzyć okno Jasność i kontrast i kliknij Auto.
  7. Z menu ImageJ/Fiji przejdź do opcji Analizuj > ustaw skalę i wprowadź znaną odległość fizyczną oraz jej jednostkę dla każdego piksela obrazu.
  8. Z menu ImageJ/Fiji przejdź do pozycji Image > Stacks > Z project, aby zrekonstruować obraz 3D ze stosu z. Ustaw Typ rzutowania jako Odchylenie standardowe. Opcji domyślnych można użyć dla pozostałych ustawień (Plasterek początkowy i Plasterek końcowy).
    UWAGA: należy uważać na artefakty projekcji odchylenia standardowego wynikające z nakładających się na siebie stosów z podczas rekonstrukcji 3D. Aby upewnić się, że nie ma żadnych artefaktów, usuń stosy z w dolnej półkuli sfery, aby obserwować tylko projekcję górnej połowy.

5. Analiza statystyczna częstotliwości GUV na podstawie rozmiaru

  1. Uzyskaj obrazy stosu Z interesujących GUV, jak wyjaśniono w krokach 4.4 i 4.5. Aby zobrazować jak najwięcej GUV w szerokim polu widzenia, uzyskaj stosy konfokalne przy 1- lub 2-krotnym powiększeniu.
  2. Otwórz sekwencje stosu Z w oprogramowaniu do przetwarzania obrazu (w tym przypadku ImageJ/Fiji), jak wyjaśniono w 4.6.
  3. Wybierz kanał wyświetlania, w którym został uzyskany sygnał fluorescencji membranowej, klikając pasek oznaczony jako c pod obrazem. Dostosuj jasność i kontrast obrazu, jak wyjaśniono w 4.6.
  4. Poruszaj się po różnych płaszczyznach uzyskanych, klikając pasek z pod otwartym obrazem. Wybierz płaszczyznę, w której średnica analizowanego pęcherzyka jest największa.
  5. Otwórz menedżera zwrotu z inwestycji w ImageJ/Fiji, klikając Analizuj narzędzia > > Menedżera zwrotu z inwestycji.
  6. W narzędziach dostępnych w panelu głównym ImageJ/Fiji kliknij owalne zaznaczenie.
  7. Narysuj okrąg pasujący do GUV, podążając za intensywnością fluorescencji membrany GUV. Aby narysować zaznaczenie okręgu, naciśnij Shift i przeciągnij myszą, aby rozszerzyć okrąg do rozmiaru pęcherzyka. Zaznaczenie okręgu można przesuwać, klikając jednocześnie lewym przyciskiem myszy na środku pęcherzyka i przeciągając mysz w żądane miejsce.
  8. Zapisz wybór okręgu narysowany w Menedżerze ROI, klikając przycisk Dodaj [t], znajdujący się w panelu opcji Menedżera ROI.
  9. Aby uzyskać wielkość pęcherzyka w mikronach, kliknij na Measure znajdujący się na panelu ROI Manager. Pojawi się nowe okno. Weź wartość wyświetlaną w kolumnie Główna lub Pomocnicza (obie kolumny muszą mieć taką samą wartość, ponieważ odnoszą się do osi elipsy) jako miarę średnicy pęcherzyka.
  10. Użyj oprogramowania do kreślenia (Excel, Origin, Prism), aby utworzyć wykres słupkowy, w którym określony jest ułamek GUV dla różnych zakresów rozmiarów.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwszym krokiem było wyprodukowanie GUV z membranową separacją faz zgodnie ze zmodyfikowanym podejściem odwróconej emulsji (Rysunek 1A). Skutkuje to wysoką wydajnością GUV, które wykazują membranę zdemieszaną na domeny Ld i Lo, reprezentowane przez etykietę Atto 655-DOPE na domenie Ld i ciemnych obszarach odpowiadających nieznakowanym domenom Lo (Rysunek 1B). Metoda ta pozwala uzyskać rozdzielane fazowo GUV o rozmiarach od 5 do 30 μm (Rysunek 1C) w podwyższonych temperaturach (wszystkie etapy wykonywane w temperaturze 37 °C i obrazowane w temperaturze RT). Ponadto dostosowano prędkości wirowania, aby zapewnić włączenie pierwotnych lipidów składowych do GUV, a także uniknąć nadmiernego przeludnienia.

Ponadto, aby zademonstrować udaną enkapsulację biomolekuł przy użyciu metody emulsji opisanej w obecnym protokole, zarówno sieci FtsZ, jak i aktyny zostały odtworzone w indywidualnych eksperymentach. Sieci FtsZ są rekapitulowane wewnątrz GUV, które wyłaniają się jako włókna preferencyjnie wiążące się z domenami Ld poprzez sekwencję celowania błony (MTS) w obecności 2,5 mM GTP i 50 g/L Ficoll70 (jak pokazano na Rysunek 2). Sieci obserwowano około 1 godzinę po etapie enkapsulacji. Jednak sieci aktomiozyny pojawiają się jako cienkie wiązki (w przeciwieństwie do grubych sieci FtsZ) po rekonstytucji w GUV (Ryc. 3). Należy zauważyć, że biotynylowane lipidy odgrywają kluczową rolę w wiązaniu sieci aktomiozyny z błoną GUV. Bez biotynylowanych lipidów wiązki aktomiozyny nie mogą przyjąć zakrzywionej konfiguracji i pozostają jako proste, krótkie i sztywne wiązki w świetle, zamiast przylegać do błony jako splątana siatka długich wiązek (Rysunek 4).

W zmodyfikowanym protokole emulsji, prędkość wirowania jest dostosowywana w celu uzyskania oddzielonych fazowo GUV, jak wspomniano wcześniej. Rzeczywiście, wyższe prędkości wirowania z próbkami zawierającymi sieci aktomiozyny (600 x g przez 15 minut) powodują agregację pęcherzyków w konfigurację podobną do tkankowej wewnątrz dołka produkcyjnego. Tak więc, we wszystkich standardowych eksperymentach rekonstytucji sieci aktomiozyny, optymalna prędkość wirowania została ustawiona na 200 x g, aby uzyskać niezagregowane GUV (Rysunek 5).

figure-results-1
Rysunek 1: Jednogarnkowa generacja oddzielonych fazowo GUV wykorzystująca metodę podwójnego transferu emulsji. (A) Eksperymentalny schemat kluczowych etapów produkcji pęcherzyków oddzielonych fazowo w jednym garnku poprzez podwójny transfer emulsji. (B) Konfokalny obraz projekcji Z otrzymanych GUV wygenerowany metodą opisaną w A. Podziałka skali wynosi 50 μm. (C) Wykres słupkowy z udziałem GUV oddzielonych fazowo wygenerowanych zgodnie z ich średnicą. Eksperymenty przeprowadzone n = 3, całkowita liczba GUV przeanalizowanych w jednym eksperymencie = 100. Dane pokazane jako wartości średnie, poszczególne punkty danych to trzy niezależne eksperymenty. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe trzech eksperymentów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Oddzielone fazowo pęcherzyki z zamkniętymi sieciami FtsZ. (A) Konfokalne obrazy projekcyjne 3D wykonane na w pełni nabytym stosie z oddzielonego fazowo GUV zawierającego sieć FtsZ. (B) Konfokalne obrazy projekcji Z wykonane tylko na górnej połowie pęcherzyka. Ze względu na niejednorodne tworzenie domen na powierzchni GUV, rekonstrukcja 3D nabytych warstw konfokalnych pokazuje nakładanie się domen lipidowych z górnych i dolnych obszarów pęcherzyka. Aby zapobiec nakładaniu się na siebie i ułatwić wizualną inspekcję domen, dolna połowa uzyskanych stosów z jest usuwana z pliku. Wynikowa górna połowa jest następnie wykorzystywana do projekcji 3D za pomocą odchylenia standardowego. Podziałka skali ma wymiary 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Oddzielone fazowo pęcherzyki z zamkniętymi sieciami aktomiozyny. (A) Konfokalne obrazy projekcji Z całego nabytego stosu z pomniejszonym widokiem studni po wytworzeniu pęcherzyków. Wysoka wydajność uzyskanych pęcherzyków pozwala na badanie różnych struktur aktomiozyny w obrębie pęcherzyków. Pasek skali wynosi 50 μm. (B) Obrazy z projekcją konfokalną wykonaną na górnej połowie pęcherzyka. Aby ułatwić wizualną analizę domen lipidowych, do wykonania projekcji 3D używana jest tylko górna połowa wycinków obrazu. Podziałka skali wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Znaczenie biotynylowanych lipidów dla generowania związanych z błoną sieci aktomiozyny wewnątrz oddzielonych fazami pęcherzyków. Konfokalne projekcje 3D przedstawiające oddzielone fazowo pęcherzyki z nieprzyłączonymi sieciami aktomiozyny. Jeśli biotynylowane lipidy nie zostaną włączone do mieszanki, struktury aktomiozyny tworzą się w świetle i nie uzyskują zakrzywionej konfiguracji na wewnętrznej wlotce pęcherzyków (prawy panel, aktyna znakowana Atto488). Podziałka wynosi 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Wpływ prędkości wirowania na produkcję pęcherzyków oddzielonych fazowo poprzez transfer emulsji. Konfokalne obrazy 2D przedstawiające próbkę GUV wygenerowaną przy użyciu siły wirowania 600 x g przez 15 minut. Zastosowana prędkość wirowania, wyższa niż zoptymalizowana 200 x g, powoduje agregację pęcherzyków w konfigurację podobną do tkankowej wewnątrz studzienki. Podziałka wynosi 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych wyzwań związanych z odtworzeniem in vitro systemów modelowych opartych na błonach jest enkapsulacja białek wewnątrz oddzielonych fazowo GUV dzięki ich przygotowaniu w wysokich temperaturach. Rzeczywiście, wytwarzanie tego typu pęcherzyków oddzielonych fazowo poprzez syntezę jednogarnkową może prowadzić do trudności wynikających z degradacji białek w podwyższonych temperaturach. W związku z tym protokół ten opisuje zoptymalizowane warunki obserwacji separacji faz błonowych zgodnie z metodą podwójnej emulsji w celu produkcji GUV w temperaturach fizjologicznych, przy jednoczesnym utrzymaniu aktywności otoczonych białek. Takie podejście wprowadza ładunek ujemny do obu domen, aby ułatwić wiązanie dowolnych pożądanych białek, gdy warunkiem wstępnym są oddziaływania elektrostatyczne. W przypadku enkapsulacji FtsZ, pomimo obecności ładunku ujemnego w obu domenach, sieci cytoszkieletowe rozwijają się i wiążą preferencyjniez domenami LD, co wskazuje, że wraz z ładunkiem ujemnym płynność błony jest niezbędnym wymogiem wiązania białek18. Ponadto, w przypadku enkapsulacji aktyny, sieci rozwijają się nad regionami błony, w których włączone są biotynylowane lipidy19.

Chociaż test transferu emulsji jest szeroko stosowany w literaturze, zastosowano go tylko do produkcji jednorodnych GUV. Protokół ten składa się zatem z kilku zmodyfikowanych aspektów testu, które pozwalają na obserwację powstawania domen w błonie. Jednym z głównych aspektów w tym zakresie jest temperatura. Aby obserwować domeny, a także utrzymać funkcjonalność białek (w szczególności tworzenie sieci cytoszkieletu), protokół ten wykorzystuje 37 °C do produkcji GUV. Z jednej strony, gdy GUV są wytwarzane w wyższej temperaturze, kapsułkowane białka tracą swoją funkcjonalność, przebywając w świetle i nie polimeryzując w struktury wyższego rzędu. Z drugiej strony, jeśli GUV są wytwarzane w niższej temperaturze, separacja faz nie jest obserwowana w membranie. W ten sposób 37 °C staje się optymalną temperaturą dla produkcji GUV w eksperymentach.

Należy zauważyć, że protokół ten przewiduje dwa możliwe systemy testowe do wytwarzania GUV zgodnie z tą samą zasadą przenoszenia emulsji: w probówkach i płytkach studzienkowych. Oba prezentują zalety i wady, które użytkownik może być zmuszony wziąć pod uwagę w fazie planowania eksperymentalnego, aby określić, który system najlepiej odpowiada jego potrzebom. Rzeczywiście, probówki z tworzywa sztucznego nie wymagają wirówki wyposażonej w wirnik do płytek studzienkowych, są łatwiejsze w obsłudze i umożliwiają kontrolę współczynnika rozcieńczenia pęcherzyków po produkcji i przed obrazowaniem. Wymagają one jednak większych objętości (zarówno w przypadku fazy olejowej, jak i wodnej) oraz usunięcia warstwy oleju po produkcji w celu ekstrakcji GUV, co może pozostawić resztki oleju w studni obrazowania, jeśli ten etap nie zostanie starannie wykonany. Alternatywnie, płytki studzienne wymagają użycia mniejszej objętości próbki, umożliwiają enkapsulację różnych warunków wewnętrznych szeregowo i jednocześnie i nie wymagają ekstrakcji GUV, ponieważ pęcherzyki można obrazować bezpośrednio po produkcji w tym samym dołku produkcyjnym. Główną wadą płytek studzienkowych jest agregacja pęcherzyków i konieczność dostosowania parametrów wirowania w celu osiągnięcia podobnej wydajności produkcji pęcherzyków do obserwowanej w probówkach.

Niezależnie od zastosowanego systemu enkapsulacji (probówki lub płytki studzienkowe), podejście to pokazuje, że do wytworzenia GUV, a także do ułatwienia polimeryzacji otoczkowanych białek, wymagane są optymalne warunki stłoczenia. W szczególności, zgodnie z tym protokołem, najlepsze warunki dla GUV z kapsułkowanym FtsZ zaobserwowano przy 30 g/L BSA i 50 g/L Ficoll7018; natomiast w przypadku aktyny wymagana była mieszanina 10 g/l BSA, 7% jodiksanolu i 20 g/l Ficoll7019.

Innym ważnym aspektem produkcji GUV jest szybkość i czas wirowania. W celu utworzenia sieci FtsZ w wyżej wymienionych stężeniach stłoczenia, wirowanie przy 6000 x g przez 30 minut tworzy populację GUV, które są dobrze rozmieszczone i oddzielone na płycie studzienki obrazowej. I odwrotnie, w przypadku aktyny, 200 x g przez 20 minut umożliwia uzyskanie wysokiej wydajności produkcji GUV. Jeśli prędkość lub czas wirowania zostanie zmniejszony, wpłynie to na wydajność GUV, podczas gdy zwiększenie jej powyżej tych wartości prowadzi do agregacji GUV. W tych warunkach protokół ten generuje GUV o maksymalnej wydajności enkapsulacji, a także poszczególne GUV, które nie sklejają się ze sobą.

Chociaż protokół ten można uogólnić na dowolne lipidy i biomolekuły kapsułkowane, pożądany skład błony i zawartość pęcherzyków dyktują parametry wirowania, które umożliwiają wytwarzanie pęcherzyków oddzielonych fazowo. Dlatego protokół ten służy jako wskazówka umożliwiająca produkcję różnorodnych pęcherzyków z domenami błonowymi.

Takie metodologie rekonstytucji in vitro w rozdzielonych fazowo GUV mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia skomplikowanej dynamiki białko-błona, w której pośredniczą domeny lipidowe, przy jednoczesnym uwzględnieniu złożoności błon komórkowych14. Niewielki rozmiar i wysoce dynamiczny charakter tych domen lipidowych utrudniają charakterystykę interakcji międzyfazowych in vivo. W związku z tym GUV służą jako istotne narzędzie ze względu na ich względną łatwość przygotowania i modulację fizykochemiczną, a także ich przydatność do analizy za pomocą mikroskopii świetlnej20.

Ponadto enkapsulacja funkcjonalnych cząsteczek w heterogenicznych biointerfejsach stanowi obiecujące zastosowania w dziedzinie nanomedycyny. W szczególności rozwój funkcjonalizowanych systemów dostarczania leków o różnych właściwościach wynikających z asymetrycznego rozmieszczenia i podziału biomolekuł na zamknięte obszary na ich powierzchni21. Interakcje lek-lipid odgrywają znaczącą rolę we właściwościach farmakokinetycznych leków, takich jak ich transport, dystrybucja i akumulacja, co ostatecznie wpływa na skuteczność stosowanych leków22. Dlatego zrozumienie roli tych interakcji we właściwościach farmakokinetycznych leków ma kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych leków. Można badać modelowe błony lipidowe, aby zrozumieć ich mechanizmy interakcji z peptydami, polimerami i nanonośnikami23. W związku z tym zmiany w składzie lipidowym komórek i tkanek w niektórych stanach chorobowych mogą zmieniać interakcje biofizyczne, które można zbadać w celu opracowania leków specyficznych dla celu i systemów dostarczania leków24.

Podsumowując, opisany tutaj protokół zapewnia łatwą strategię generowania oddzielonych fazowo GUV z kapsułkowanymi białkami zakotwiczonymi w ich wewnętrznej ulotce lipidowej. Wytwarzanie tych systemów pęcherzykowych ma obiecujące zastosowanie w dziedzinach takich jak biotechnologia i biologia syntetyczna, gdzie wieloskładnikowe zespoły o złożonych funkcjach naśladujących funkcje podobne do komórek mogą przynieść innowacyjne rozwiązania i nowe zastosowania.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować MPIB Core Facility za pomoc w oczyszczaniu białek, Michaeli Schaper za klonowanie plazmidów, Kerstin Röhrl za oczyszczanie białek i Sandrze Ortmeier za preparaty lipidowe. Autorzy chcieliby również podziękować Adriánowi Merino-Salomónowi i Shunshi Kohyamie za pomocne dyskusje na temat warunków panujących w tłumie i enkapsulacji białek. M.R.-L. jest częścią IMPRS-ML i projektu ONE MONACHIUM wspieranego przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Badań Naukowych (BMBF) oraz Wolne Państwo Bawaria w ramach Strategii Doskonałości rządu federalnego i krajów związkowych. Autorzy pragną również podziękować za wsparcie ze strony Centrum Nanonauki (CeNS) w Monachium.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-(1'-rac-glicerol) (sól sodowa) (DOPG)Avanti Polarne lipidy840475W chloroformie
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC)Avanti Polarne lipidy850375W chloroformie
1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-(kap biotynyl) (sól sodowa) (18:1 Biotinyl Cap PE)Avanti Polarne lipidy870273In chloroform
1,2-dipalmitoilo-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sól sodowa) (DPPG)Avanti Polar lipids840455W chloroformie
1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DPPC)Avanti Polarne lipidy850355 W chloroformie
96-dołkowa mikropłytka płaskodenna (SensoPlate)
Aktyna (alfa-aktyna mięsień szkieletowy, królik)HYPERMOL8101-01
Atto488-Actin (alfa-aktyna mięśnie szkieletowe, królik)HYPERMOL8153-01
Atto655-DOPEATTO-TECAD 655-16Proszek
do kąpieli SonikatorBranson 1510R-MTHMyjka ultradźwiękowa Bransonic
Biotyna-aktyna (alfa-aktyna mięśnie szkieletowe, królik)HYPERMOL8109-01
BSASigma AldrichA6003
WirówkaEppendorf5424R
WirówkaEppendorf5804 R
ChloroformSigma Aldrich67-66-3
Cholesterol (owiec)Avanti Polarne lipidy700000W chloroformie
DecaneTCI Deutschland GmbHD0011
Faszyna (ludzka, rekombinowana)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)CS-FSC01-A
Ficoll70Sigma AldrichF2878
Jodixanol (OptiPrep)Sigma AldrichD1556
LSM800 laser konfokalny mikroskop skaningowyCarl ZeissC-Apochromat 40  &czasy;  /1.2 Obiektyw zanurzeniowy w wodzie. Lasery na ciele stałym pompowane diodami: 488  nm oraz 640  Nm.
Olej mineralnySigma Aldrich8042-47-5
Myosin II (mięśnie szkieletowe królika)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)MY02-A
NeutravidinThermo Fisher Scientific Inc.31000
OsmometrFiske AssociatesFiske Mikroosmometr model 120
Greiner Bio-One  Sp. z o.o07-000-109
.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  2. Imai, M., Walde, P. Giant unilamellar vesicles: From protocell models to the construction of minimal cells. The Giant Vesicle Book. , (2019).
  3. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Res Lett. 8 (1), 102(2013).
  4. Litschel, T., Schwille, P. Protein Reconstitution Inside Giant Unilamellar Vesicles. Annu Rev Biophys. 50 (1), 100620-114132 (2021).
  5. Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  6. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss Chem Soc. 81 (0), 303-311 (1986).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  8. Dürre, K., Bausch, A. R. Formation of phase separated vesicles by double layer cDICE. Soft Matter. 15 (47), 9676-9681 (2019).
  9. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  10. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nat Commun. 7 (1), 10447(2016).
  11. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  12. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the Inverted Emulsion Method for High-Yield Production of Biomimetic Giant Unilamellar Vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  13. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys J. 91 (11), 4064-4070 (2006).
  14. Lopes dos Santos, R., Malo, M., Campillo, C. Spatial Control of Arp2/3-Induced Actin Polymerization on Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. ACS Synth Biol. 12 (11), 3267-3274 (2023).
  15. Sun, Q., Fu, Y., Wang, W. Temperature effects on hydrophobic interactions: Implications for protein unfolding. Chem. Phys. 559, 111550(2022).
  16. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of temperature on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 25 (21), 6432-6438 (1986).
  17. Concha-Marambio, L., Maldonado, P., Lagos, R., Monasterio, O., Montecinos-Franjola, F. Thermal adaptation of mesophilic and thermophilic FtsZ assembly by modulation of the critical concentration. PLoS One. 12 (10), e0185707(2017).
  18. Kanwa, N., Kohyama, S., Fröhlich, L., Desai, A., Schwille, P. Mutual dependence between membrane phase separation and bacterial division protein dynamics in synthetic cell models. Angew Chem Int Ed Engl. 64 (6), e202417800(2025).
  19. Reverte-López, M., et al. Self-organized spatial targeting of contractile actomyosin rings for synthetic cell division. Nat Commun. 15 (1), 10415(2024).
  20. dos Santos, R. L., Campillo, C. Studying actin-induced cell shape changes using Giant Unilamellar Vesicles and reconstituted actin networks. Biochem Soc Trans. 50 (5), 1527(2022).
  21. Staufer, O., et al. Microfluidic production and characterization of biofunctionalized giant unilamellar vesicles for targeted intracellular cargo delivery. Biomaterials. 264, 120203(2021).
  22. Lopes, D., Jakobtorweihen, S., Nunes, C., Sarmento, B., Reis, S. Shedding light on the puzzle of drug-membrane interactions: Experimental techniques and molecular dynamics simulations. Prog Lipid Res. 65, 24-44 (2017).
  23. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: applications in drug discovery and drug delivery. Mol Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  24. Schulz, M., Werner, S., Bacia, K., Binder, W. H. Controlling Molecular Recognition with Lipid/Polymer Domains in Vesicle Membranes. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (6), 1829-1833 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

GUV y z rozdzia em fazenkapsulacja bia ektratwy lipidowetransfer emulsyjnydomeny lipidowebia ko FtsZenkapsulacja aktynydynamika bia ek b onowych

Powiązane artykuły