Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie cech anatomicznych komórek zwojowych siatkówki pod wpływem ekscytotoksyczności wywołanej kwasem N-metylo-D-asparaginowym (NMDA)

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68537

⸱

19 września 2025

 ,  , 
1Ruiz Department of Ophthalmology and Visual Science, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center at Houston (UTHealth)

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu opisujemy zastosowanie metody znakowania genetycznie ukierunkowanej fosfatazy alkalicznej (AP) do badania cech anatomicznych i fenotypów siatkówki myszy w warunkach ekscytotoksyczności wywołanej przez NMDA. W połączeniu z kilkoma liniami reporterowymi specyficznymi dla podtypu komórek zwojowych siatkówki (RGC), odkrywamy nowe fenotypy u umierających RGC w całym procesie zwyrodnieniowym.

Streszczenie

Komórki zwojowe siatkówki (RGC) są neuronami wyjściowymi siatkówki, odpowiedzialnymi za przekazywanie informacji wizualnych do mózgu. W dojrzałej siatkówce myszy zidentyfikowano ponad 40 typów RGC na podstawie cech genomicznych, morfologicznych i funkcjonalnych. Zwyrodnienie RGC jest cechą charakterystyczną różnych wyniszczających chorób siatkówki, w tym jaskry i pourazowej neuropatii nerwu wzrokowego. Uzyskanie głębszego wglądu w mechanizmy komórkowe i molekularne leżące u podstaw zwyrodnienia, przeżycia i odporności RGC w różnych stanach chorobowych ma kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych interwencji terapeutycznych. Aby zbadać zwyrodnienie RGC, zastosowaliśmy prostą, ale potężną technikę, która była wcześniej szeroko stosowana w badaniach rozwoju siatkówki dla morfologii RGC i projekcji centralnej. Tutaj stosujemy tę metodę do oceny anatomicznych fenotypów RGC w warunkach ekscytotoksyczności wywołanej przez NMDA. Takie podejście umożliwia wizualizację dużej liczby degenerujących się RGC w czasie, co pozwala nam zmapować sekwencję zdarzeń zwyrodnieniowych, zidentyfikować charakterystyczne fenotypy umierających RGC i rozróżnić RGC, które są odporne na uszkodzenia wywołane przez NMDA.

Wprowadzenie

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) to nagły uraz, który powoduje uszkodzenie neuronów w mózgu. W ciężkich postaciach TBI, takich jak te spowodowane wypadkami samochodowymi lub kolizjami sportowymi oraz obrażeniami spowodowanymi wybuchem w wyniku eksplozji, siły mechaniczne mogą zakłócać architekturę komórki, prowadząc do stanu zapalnego, stresu oksydacyjnego, ekscytotoksyczności i ostatecznie śmierci neuronów 1,2.

Siatkówka, najbardziej dostępna część ośrodkowego układu nerwowego (OUN), posłużyła jako modelowy system TBI do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw ekscytotoksyczności i opracowania strategii interwencji terapeutycznej 3,4,5. Najbardziej istotnymi modelami siatkówki do badań TBI są model zmiażdżenia nerwu wzrokowego i ekscytotoksyczność siatkówki wywołana kwasem N-metylo-D-asparaginowym (NMDA). W modelu siatkówki ekscytotoksyczności indukowanej przez NMDA, komórki zwojowe siatkówki (RGC) zostały zidentyfikowane jako najbardziej podatny typ neuronów siatkówki, ponieważ RGC wykorzystują glutaminian jako główny neuroprzekaźnik pobudzający i różne typy receptorów glutaminianu, w tym receptory AMPA (AMPAR), receptory KAPA (KAPAR) i receptory NMDA, do wyzwalania potencjału aksonów6. Oprócz RGC, leczenie NMDA może również wpływać na inne komórki siatkówki i obwody nerwowe 7,8,9. Doszkliste podanie NMDA powoduje przedłużone otwarcie receptora NMDA, co prowadzi do nadmiernego napływu wapnia do komórek, powodując nadmierną pobudzającą aktywność neuronalną i niezrównoważoną homeostazę wapnia 10,11,12,13.

Receptor NMDA jest heteromerycznym kompleksem złożonym z trzech podjednostek: GluN1, GluN2 i GluN3 14,15,16,17,18. GluN1, kodowany przez Grin1, zawiera osiem izoform u myszy z powodu alternatywnego splicingu Grin1. Istnieją cztery różne podjednostki GluN2 (a-d), które są kodowane przez cztery oddzielne geny: Grin2a-2d. Istnieją dwie różne podjednostki GluN3 (a i b), które są kodowane przez Grin3a i 3b. Zgodnie z danymi scRNA-seq19,20, Grin1 jest wysoce eksprymowany w większości podtypów RGC (Figura 1A), a także w kilku podtypach komórek amakrynowych (AC) o słabych lub umiarkowanych poziomach ekspresji (Figura 1B). Grin2a jest wzbogacony w mniej podtypów RGC i AC, podczas gdy Grin2b ulega umiarkowanej ekspresji w większości RGC i wielu podtypach AC (ryc. 1A,B). Poziomy ekspresji Grin2c, Grin2d i Grin3b w RGC i AC są bardzo niskie (ryc. 1A,B). Ekspresję Grin3a można zaobserwować w kilku podtypach RGC i słabo w kilku AC (ryc. 1A,B). Oprócz roli receptorów NMDA, ekscytotoksyczność wywołana napływem wapnia przez przepuszczalne dla wapnia AMPAR została opisana w wielu modelach choroby21. Ekspresja podjednostek receptora NMDA może dostarczyć wskazówek, dlaczego ekscytotoksyczność wywołana przez NMDA jest ukierunkowana głównie na RGC, a także AC 9,10,14,22,23.

Konwencjonalne metody oceny poważnych fenotypów siatkówki wywołanych NMDA obejmują barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu wykrycia nieprawidłowości histologicznych, test TUNEL na śmierć komórki oraz barwienie immunofluorescencyjne (IF) przy użyciu biomarkera specyficznego dla typu komórki 8,10,24,25,26 . Na poziomie komórkowym wykorzystano obrazowanie konfokalne i techniki wypełniania barwnikiem w celu zbadania sekwencji zdarzeń w umierających RGC w modelu siatkówki indukowanym przez NMDA. Metody te dostarczyły cennych informacji na temat subkomórkowych przedziałów umierających RGC i pozwoliły na identyfikację typów odpornych RGC, które przeżywają w warunkach NMDAinsult 27,28.

Tutaj stosujemy barwienie genetycznie aktywowaną fosfatazą alkaliczną (AP) w celu zbadania cech anatomicznych i fenotypów neuronów siatkówki myszy pod wpływem ekscytotoksyczności wywołanej przez NMDA 29,30,31. Uzasadnieniem wyboru tej metody jest jej prostota, opłacalność i możliwość uzyskania kompleksowego przeglądu cech anatomicznych podtypów neuronów w całej siatkówce, co sprawia, że dobrze nadaje się ona do ocen ogólnych i analiz porównawczych na dużą skalę. Podejście to dostarcza nowych informacji na temat tego, jak odrębne, genetycznie oznaczone neurony siatkówki reagują na NMDA zarówno na poziomie ogólnym, jak i subkomórkowym. Przewidujemy, że strategia ta będzie miała szerokie zastosowanie do oceny zmian morfologicznych w różnych modelach chorób, które wpływają na architekturę neuronów i organizację synaptyczną 4,26,32,33.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z polityką amerykańskiej służby zdrowia publicznego dotyczącą humanitarnej opieki i wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt w The University of Texas McGovern Medical School w Houston. Składy roztworów są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Wstrzyknięcie tamoksyfenu

  1. Zmieszać 30 mg tamoksyfenu z 30 μl etanolu. W wodzie poniżej wrzenia podgrzej 1 ml oleju z nasion słonecznika i mieszaninę tamoksyfenu i etanolu.
  2. Po rozpuszczeniu tamoksyfenu w etanolu należy szybko dodać 1 ml podgrzanego oleju z nasion słonecznika do roztworu tamoksyfenu. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.
  3. Wykorzystano myszy obu płci w różnym wieku, od 2 do 6 miesięcy. Roztwór tamoksyfenu należy wstrzyknąć dootrzewnowo w dawce 100 μg/g masy ciała za pomocą strzykawki insulinowej. Określić liczbę wstrzyknięć tamoksyfenu na podstawie linii myszy. W tym protokole tamoksyfen podawano raz na dobę przez cztery kolejne dni.
    UWAGA: Ponieważ roztwór tamoksyfenu jest zmieszany z gęstym olejem, trudno jest obchodzić się z nim za pomocą strzykawki z odłączaną igłą. Dlatego do wstrzykiwań tamoksyfenu preferowana jest strzykawka insulinowa z dołączoną igłą.
  4. Trzymaj mysz w grupach nie większych niż 5 sztuk w indywidualnie wentylowanych klatkach. do momentu wstrzyknięcia NMDA.

2. Wstrzyknięcie roztworu NMDA do oczu myszy

  1. Przygotować 20 mM roztworu NMDA w sterylnym 1x PBS. Umyj nano-wtryskiwacz igłą 35G dołączoną przy użyciu 100% etanolu 20x, a następnie umyj sterylną ultraczystą wodą dodatkowe 20x. Napełnij nano-wstrzykiwacz 1 μl roztworu NMDA.
  2. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny w mieszaninie roztworu 1X PBS (80/10 mg na kg masy ciała). Oceń utratę przytomności na podstawie odruchowej reakcji wycofania się na szczypanie ogona i palców u nóg.
  3. Umieść znieczuloną mysz na mikroskopie stereoskopowym. Ustaw mysz tak, aby prawe oko było skierowane do góry, a nos skierowany w prawą stronę. Nałóż kroplę 0,5% roztworu chlorowodorku proparakainy na prawą gałkę oczną w celu znieczulenia miejscowego.
  4. Użyj sterylnej igły do wstrzykiwań 30G, aby nakłuć rąbek w pozycji godziny 7, tworząc mały otwór. Monitorować położenie i kierunek igły pod mikroskopem stereoskopowym. Upewnij się, że rozmiar igły do wstrzykiwań jest nieco większy niż igła do wstrzykiwań nano, aby umożliwić łatwe wprowadzenie.
  5. Ostrożnie wyjąć igłę do wstrzykiwań z gałki ocznej i odpowiednio ją zutylizować. Użyj mikroskopu stereoskopowego do orientacji, wprowadź igłę nanoiniekcji do ciała szklistego przez rąbek pod kątem 45°.
  6. Powoli wstrzyknąć 1 μl roztworu NMDA do ciała szklistego. Po wstrzyknięciu należy trzymać igłę do nanoiniekcji w ciele szklistym przez około 10 sekund, aby zapobiec wypływowi wstrzykniętego roztworu.
  7. Ostrożnie i powoli wyjąć igłę do wstrzykiwań nano z oka. Nałóż 0,5% maści okulistycznej z erytromycyną na rogówkę wstrzykniętego oka.
  8. Umieść mysz w klatce na poduszce grzewczej. Monitoruj mysz co 15 minut, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia. Trzymaj mysz przez jeden do dwóch tygodni, aż do pobrania tkanki.

3. Pobieranie tkanek i barwienie fosfatazą alkaliczną (AP)

  1. Poddaj mysz eutanazji z uduszeniem CO2, a następnie zwichnięciem szyjki macicy. Ostrożnie przetnij mięśnie łączące się z gałką oczną i nerwem wzrokowym za pomocą nożyczek Vanna.
  2. Gałka oczna została następnie pobrana za pomocą kleszczy i przeniesiona do oddzielnych oznakowanych probówek o pojemności 2,0 ml.
  3. Umocuj gałki oczne w 10% neutralnej buforowanej formalinie na 10 minut w temperaturze pokojowej. Zamontuj siatkówki płasko na filtrze membranowym z azotanu celulozy, jak opisano poniżej.
    1. Przenieś gałki oczne na 10-centymetrowe szalki Petriego zawierające 1x PBS. Przytrzymaj dowolną tkankę mięśniową przyczepioną do gałki ocznej za pomocą kleszczy. Utworzyć otwór w rąbku za pomocą igły iniekcyjnej 30G. Włóż końcówkę nożyczek Vanna do otworu i przetnij wokół ora serrata. Zdejmij soczewkę z muszli ocznej za pomocą kleszczy.
    2. Wykonaj 3-4 nacięcia na muszli ocznej i użyj kleszczyków, aby przytrzymać RPE i delikatnie usuń RPE z siatkówki.
    3. Wytnij mały kawałek filtra membranowego z azotanu celulozy i namocz go w 1x PBS. Umieść izolowaną siatkówkę na filtrze. Delikatnie popchnij peryferyjny obszar siatkówki końcówką cienkiego pędzla, aby przymocować krawędź siatkówki do filtra.
    4. Przytrzymaj krawędź filtra i powoli wyciągnij go z 1x PBS, upewniając się, że siatkówka pozostaje przymocowana i spłaszcza się na filtrze. Umieść siatkówkę/filtr na ręczniku papierowym na 1 minutę, aby przymocować przymocowaną siatkówkę do filtra.
    5. Przenieś siatkówkę/filtr z powrotem na szalkę Petriego z 1x PBS. Ostrożnie usuń wszelkie zanieczyszczenia, włosy i ciało szkliste z siatkówki za pomocą kleszczy i/lub cienkiego pędzla, tak bardzo, jak to możliwe. Aby odróżnić siatkówki z wtryskiem i bez iniekcji, przycinaj filtry w różnych kształtach.
  4. Przenieś siatkówkę/filtr z powrotem na szalkę Petriego. Utrwal siatkówkę w 10% neutralnej buforowanej formalinie przez 5 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  5. Przygotować łaźnię wodną o temperaturze 65 °C. Rozgrzej 30 ml 1x PBS w szklanej zlewce o pojemności 50 ml. Przenieś siatkówkę/filtry bezpośrednio do podgrzanego 1x PBS. Inkubować siatkówki w temperaturze 65°C przez 30 minut.
    UWAGA: Obróbka cieplna dezaktywuje endogenną aktywność AP, co powoduje barwienie tła w siatkówce. Bardzo ważne jest, aby leczyć siatkówkę w podgrzanym roztworze, aby skutecznie wyeliminować to tło.
  6. Po obróbce cieplnej przenieść siatkówki na szalkę Petriego o średnicy 30 mm zawierającą bufor AP (100 mM Tris, pH 9,5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2).
  7. Inkubować siatkówki w buforze AP w temperaturze pokojowej przez 5 minut, delikatnie mieszając.
    UWAGA: Ten krok powoduje wymianę buforu w siatkówce z 1x PBS na bufor AP, zapobiegając wytrącaniu się substancji chemicznych podczas opracowywania koloru.
  8. Zastąp bufor AP roztworem barwiącym (30 μl 10 mg/ml BCIP i 60 μl 10 mg/ml NBP w 10 ml buforu AP).
  9. Umieść szalkę Petriego w pudełku z wyłączeniem światła. Rozwijać reakcję AP w temperaturze pokojowej przez 1 do 2 dni z delikatnym mieszaniem, aż intensywność barwienia AP będzie zadowalająca do obrazowania.
  10. Zatrzymaj reakcję, przemłukując siatkówki 1x PBS przez 5 minut, 2x, w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  11. Utrwalaj siatkówki 10% neutralną buforowaną formaliną przez 10 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  12. Myj siatkówki 1x PBS przez 5 minut, 3x, w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Odwodnić siatkówki, inkubując je w 30% etanolu, a następnie w 50% etanolu przez 30 minut każda w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  13. Za pomocą cienkiego pędzla delikatnie usuń siatkówki z bibuły filtracyjnej. Odwodnić siatkówki bez filtra w 70% etanolu przez 30 minut, a następnie dwie 30-minutowe inkubacje w 100% etanolu w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem.
  14. Oczyść siatkówki w szklanej szalce Petriego roztworem oczyszczającym benzylanu benzylu/alkoholu benzylowego (2:1, v/v) przez 30 minut do 2 godzin w temperaturze pokojowej, delikatnie mieszając.
    UWAGA: Ta procedura oczyszczania nie powinna być wykonywana przez noc, ponieważ długotrwała inkubacja może często powodować utratę barwienia AP. Roztwór czyszczący może stopić plastik, dlatego zabieg należy wykonać w szklanym pojemniku.
  15. Aby zamontować siatkówki na szkiełku podstawowym, należy przykleić do szkiełka taśmę dwustronną, aby stworzyć platformę dla szkiełka nakrywkowego i siatkówki. Umieść siatkówki na szkiełku, wypełnij przestrzeń roztworem czyszczącym, nałóż szkiełko nakrywkowe i uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci, aby zabezpieczyć siatkówkę i szkiełko nakrywkowe.
  16. Zobrazuj siatkówki barwione AP za pomocą mikroskopu Zeiss Apotome.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie NMDA w ciele szklistym indukuje śmierć RGC, która tradycyjnie była wykrywana za pomocą barwienia histologicznego lub barwienia immunofluorescencyjnego (IF) markerami RGC. W naszych warunkach eksperymentalnych, stosując konwencjonalną strategię IF z markerem RBPMS pan-RGC, potwierdziliśmy, że liczba RGC zmniejszyła się o około 65%, 1 tydzień po wstrzyknięciu NMDA (Figura 2E-G). Wcześniejsze badania wykazały, że RGC wykazujące ekspresję Tbr2 są rzeczywiście ipRGC<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu wykorzystaliśmy genetycznie ukierunkowany rzadki system znakowania AP w połączeniu z wieloma genetycznie zmanipulowanymi liniami myszy w celu zbadania zdarzeń zwyrodnieniowych wywołanych przez NMDA w różnych podtypach RGC i AC i odkryliśmy kilka charakterystycznych fenotypów 29,31,39. Najbardziej zauważalnym fenotypem jest znaczna redukcja RGC i AC w siatkówkach, którym wstrzyknięto NMDA (Figur...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health-National Eye Institute dla C.A.M. (EY024376) oraz częściowo przez National Eye Institute Vision Core Grants P30EY028102 (UTHealth). Dziękujemy również za wsparcie finansowe ze strony Stephen Lasher Endowment (UTHealth) i Raye White Endowment (UTHealth).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5% maść okulistyczna z erytromycyną Bausch+Lomb24208-910-55
0,5% chlorowodorek proparakainy Bausch+Lomb24208-730-06
10% neutralna buforowana formalina Firma VWR89370-094
10 cm PetrydisaCorning430167
10 kanałów PBSFisher NaukowyZobacz materiał BP399Rozcieńczyć w wodzie, aby utworzyć 1x PBS i autoklaw.
Tubka 2,0 mlFirma VWR525-1136
Igła iniekcyjna o rozmiarze 30EXELINT Międzynarodowa26437
30 mm PetrydisaSokół35208
Alchohol benzylowy Acros Organics447000010
Benzan benzyluAcros Organics105860010
Filtr membranowy z azotanu celulozyCytiva (Cytiwa)7188-002
Szkiełko nakrywkoweNauki o mikroskopii elektronowej72204-01
Taśma dwustronnaScotch597020
EtanolLaboratoria Decon2716Unikaj bioodczynników Fisher (Cat#: BP2818) do odhydtrowania po barwieniu AP. Ten odczynnik zniekształca siatkówki.
KleszczeTED PELLA505
Poduszka grzewczaRaczej710298-001
Strzykawka insulinowaBD329424
KetaminaDechra (Głuch)17033010110
MikroskopZeissAxio Imager 2 (Kamera Axio Imager 2)
Lakier do paznokciNauki o mikroskopii elektronowej72180
Wtryskiwacz NanofilŚwiatowe instrumenty precyzyjneNANOFIL
Igła NanofilŚwiatowe instrumenty precyzyjneNF25BL powiedział:
Zestaw odczynników NBT/BICPInvitrogenNumer katalogowy N6547
Certyfikat NMDA (Międzynarodowa TSigma-AldrichZobacz materiał M3262 TGL
PędzlemSztuka królewska6650
Szkło przesuwneFisher Naukowy12-550-15
Mikroskop stereoskopowyMoticDM143 powiedział:
Olej z nasion słonecznikaSigma-AldrichZobacz materiał S5007 powiedział:
TamoksyfenSigma-AldrichZobacz materiał T5648 TGLRoztwór tamoksyfenu należy przechowywać w temperaturze 4 stopni C w szczelnym pudełku. Roztwór tamoksyfenu należy zużyć w ciągu jednego tygodnia.
Nożyczki Vanna Narzędzia naukowe15000-00
Kąpiel wodnaLinia laboratoryjna18052
KsylazynaDechra (Głuch)17033-0099-05Nazwa produktu: Rompun

Bibliografia

  1. Blennow, K., et al. Traumatic brain injuries. Nat Rev Dis Primers. 2, 16084(2016).
  2. Zetterberg, H., Blennow, K. Fluid biomarkers for mild traumatic brain injury and related conditions. Nat Rev Neurol. 12 (10), 563-574 (2016).
  3. Mohan, K., Kecova, H., Hernandez-Merino, E., Kardon, R. H., Harper, M. M. Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (5), 3440-3450 (2013).
  4. Lund, B. J., Rule, G. T. Pressure wave dosimetry for "Retinal ganglion cell damage in an experimental rodent model of blast-mediated traumatic brain injury". Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (3), 1348-1349 (2014).
  5. Peterson, S. L., et al. Retinal Ganglion Cell Axon Regeneration Requires Complement and Myeloid Cell Activity within the Optic Nerve. J Neurosci. 41 (41), 8508-8531 (2021).
  6. Boccuni, I., Fairless, R. Retinal Glutamate Neurotransmission: From Physiology to Pathophysiological Mechanisms of Retinal Ganglion Cell Degeneration. Life. 12 (5), 638(2022).
  7. Shen, Y., Luo, X., Liu, S., Nawy, S. Rod bipolar cells dysfunction occurs before ganglion cells loss in excitotoxin-damaged mouse retina. Cell Death Dis. 10 (12), 905(2019).
  8. Lambuk, L., et al. Dose-dependent effects of NMDA on retinal and optic nerve morphology in rats. Int J Ophthalmol. 12 (5), 746-753 (2019).
  9. Asami, Y., et al. Age-dependent changes in the severity of capillary degeneration in rat retina following N-methyl-D-aspartate-induced neurotoxicity. Curr Eye Res. 40 (5), 549-553 (2015).
  10. Siliprandi, R., et al. N-methyl-D-aspartate-induced neurotoxicity in the adult rat retina. Vis Neurosci. 8 (6), 567-573 (1992).
  11. Chidlow, G., Osborne, N. N. Rat retinal ganglion cell loss caused by kainate, NMDA and ischemia correlates with a reduction in mRNA and protein of Thy-1 and neurofilament light. Brain Res. 963 (1-2), 298-306 (2003).
  12. Shi, J. M., Jiang, Y. Q., Liu, X. Y. Morphological changes of retina after N-methyl-D-aspartate induced damage in rats. Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 29 (3), 287-291 (2004).
  13. Nakazawa, T. Mechanism of N-methyl-D-aspartate-induced retinal ganglion cell death. Nippon Ganka Gakkai Zasshi. 113 (11), 1060-1070 (2009).
  14. Shen, Y., Liu, X. L., Yang, X. L. N-methyl-D-aspartate receptors in the retina. Mol Neurobiol. 34 (3), 163-179 (2006).
  15. Bai, N., et al. NMDA receptor subunits have different roles in NMDA-induced neurotoxicity in the retina. Mol Brain. 6, 34(2013).
  16. Cull-Candy, S., Brickley, S., Farrant, M. NMDA receptor subunits: diversity, development and disease. Curr Opin Neurobiol. 11 (3), 327-335 (2001).
  17. Wang, J. X., Furukawa, H. Dissecting diverse functions of NMDA receptors by structural biology. Curr Opin Struct Biol. 54, 34-42 (2019).
  18. Chou, T. H., Kang, H., Simorowski, N., Traynelis, S. F., Furukawa, H. Structural insights into assembly and function of GluN1-2C, GluN1-2A-2C, and GluN1-2D NMDARs. Mol Cell. 82 (23), 4548-4563.e4 (2022).
  19. Tran, N. M., et al. Single-Cell Profiles of Retinal Ganglion Cells Differing in Resilience to Injury Reveal Neuroprotective Genes. Neuron. 104 (6), 1039-1055.e12 (2019).
  20. Yan, W., et al. Mouse Retinal Cell Atlas: Molecular Identification of over Sixty Amacrine Cell Types. J Neurosci. 40 (27), 5177-5195 (2020).
  21. Guo, C., Ma, Y. Y. Calcium Permeable-AMPA Receptors and Excitotoxicity in Neurological Disorders. Front Neural Circuits. 15, 711564(2021).
  22. Lucas, D. R., Newhouse, J. P. The toxic effect of sodium L-glutamate on the inner layers of the retina. AMA Arch Ophthalmol. 58 (2), 193-201 (1957).
  23. Karl, M. O., et al. Stimulation of neural regeneration in the mouse retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19508-19513 (2008).
  24. DeParis, S., Caprara, C., Grimm, C. Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells are resistant to N-methyl-D-aspartic acid excitotoxicity. Mol Vis. 18, 2814-2827 (2012).
  25. Fogo, G. M., Shuboni-Mulligan, D. D., Gall, A. J. Melanopsin-Containing ipRGCs Are Resistant to Excitotoxic Injury and Maintain Functional Non-Image Forming Behaviors After Insult in a Diurnal Rodent Model. Neuroscience. 412, 105-115 (2019).
  26. Cui, Q., Ren, C., Sollars, P. J., Pickard, G. E., So, K. F. The injury resistant ability of melanopsin-expressing intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. Neuroscience. 284, 845-853 (2015).
  27. Christensen, I., et al. The Susceptibility of Retinal Ganglion Cells to Glutamatergic Excitotoxicity Is Type-Specific. Front Neurosci. 13, 219(2019).
  28. Yang, N., Young, B. K., Wang, P., Tian, N. The Susceptibility of Retinal Ganglion Cells to Optic Nerve Injury is Type Specific. Cells. 9 (3), 677(2020).
  29. Badea, T. C., Nathans, J. Quantitative analysis of neuronal morphologies in the mouse retina visualized by using a genetically directed reporter. J Comp Neurol. 480 (4), 331-351 (2004).
  30. Badea, T. C., Nathans, J. Morphologies of mouse retinal ganglion cells expressing transcription factors Brn3a, Brn3b, and Brn3c: analysis of wild type and mutant cells using genetically-directed sparse labeling. Vision Res. 51 (2), 269-279 (2011).
  31. Jamal, L., Kiyama, T., Mao, C. A. Genetically Directed Sparse Labeling System for Anatomical Studies of Retinal Ganglion Cells. Methods Mol Biol. 2092, 187-194 (2020).
  32. Hinds, J. W., Hinds, P. L. Early ganglion cell differentiation in the mouse retina: an electron microscopic analysis utilizing serial sections. Dev Biol. 37 (2), 381-416 (1974).
  33. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  34. Mao, C. A., et al. T-box transcription regulator Tbr2 is essential for the formation and maintenance of Opn4/melanopsin-expressing intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 34 (39), 13083-13095 (2014).
  35. Chen, C. K., et al. Characterization of Tbr2-expressing retinal ganglion cells. J Comp Neurol. 529 (15), 3513-3532 (2021).
  36. Zhang, X. M., et al. Highly restricted expression of Cre recombinase in cerebellar Purkinje cells. Genesis. 40 (1), 45-51 (2004).
  37. Kiyama, T., et al. Essential Roles of Tbr1 in the Formation and Maintenance of the Orientation-Selective J-RGCs and a Group of OFF-Sustained RGCs in Mouse. Cell Rep. 27 (3), 900-915.e5 (2019).
  38. Kiyama, T., Chen, C. K., Zhang, A., Mao, C. A. Differential Susceptibility of Retinal Neurons to the Loss of Mitochondrial Biogenesis Factor Nrf1. Cells. 11 (14), 2203(2022).
  39. Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J Neurosci. 23 (6), 2314-2322 (2003).
  40. Mao, C. A., et al. Eomesodermin, a target gene of Pou4f2, is required for retinal ganglion cell and optic nerve development in the mouse. Development. 135 (2), 271-280 (2008).
  41. Shi, M., et al. Genetic interactions between Brn3 transcription factors in retinal ganglion cell type specification. PLoS One. 8 (10), e76347(2013).
  42. Muzyka, V. V., Brooks, M., Badea, T. C. Postnatal developmental dynamics of cell type specification genes in Brn3a/Pou4f1 Retinal Ganglion Cells. Neural Dev. 13 (1), 15(2018).
  43. Liu, S., Aldinger, K. A., Cheng, C. V., Kiyama, T., Dave, M., McNamara, H. K., Zhao, W., Stafford, J. M., Descostes, N., Lee, P., et al. NRF1 association with AUTS2-Polycomb mediates specific gene activation in the brain. Mol Cell. 81 (22), 4663-4676.e8 (2021).
  44. Kiyama, T., Altay, H. Y., Badea, T. C., Mao, C. A. Pou4f1-Tbr1 transcriptional cascade controls the formation of Jam2-expressing retinal ganglion cells. Front Ophthalmol. 3, 1175568(2023).
  45. Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322 (5903), 963-966 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekscytotoksyczność NMDAdegeneracja RGCsiatkówka myszymorfologia komórekprzeżywalność komórekodporność komórekchoroby siatkówkifenotypy anatomiczneznakowanie komórek
Badanie cech anatomicznych komórek zwojowych siatkówki pod wpływem ekscytotoksyczności wywołanej kwasem N-metylo-D-asparaginowym (NMDA)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.